CN101181262A - 香豆素单体化合物在制备尿酸转运子urat1抑制药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及系列香豆素类单体化合物的新用途，具体是涉及具有相同结构单元的香豆素类单体化合物I、II、III、IV在制备尿酸转运子URAT1抑制药物中的应用。经动物试验结果表明：香豆素类化合物：I、II、III、IV对高尿酸血模型动物表达异常增高的尿酸转运子URAT1具有确切的抑制作用，而对正常动物的正常水平的尿酸转运子表达无显著抑制作用，具有很好的安全性。利于香豆素单体化合物配以相关辅料，用常规的制剂方法制成抑制尿酸转运子URAT1的药物，可用于治疗与尿酸转运子URAT1异常高表达相关的疾病。
Description
技术领域：本发明涉及系列香豆素类单体化合物的新用途，具体是：包含相同结构单元的香豆素类单体化合物(I、II、III、IV)在制备尿酸转运子URAT1抑制药物中的应用。
背景技术：尿酸排出减少或生成增加，可导致血液中尿酸浓度增高，直接或间接引起相关疾病。尿酸的排泄是一复杂过程，尿酸随血液循环流入肾小球时，游离型的尿酸将全部滤过；在近端肾小管有约99％尿酸盐被重吸收(Diamond HS，Meisel AD.Postsecretory reabsorption of urate in man.Arthritis And Rheumatism，1975，18(6)：805-809.)。位于近曲小管的尿酸转运子(蛋白)URAT1参与尿酸重吸收过程，通过与阴离子的交换将尿酸盐由管腔转运入细胞。URAT1蛋白主要分布于肾皮质近曲小管上皮细胞向腔膜，是一个电中性的尿酸转运蛋白。URAT1基因由Enomoto等于2002年首先从人肾脏克隆出来，位于染色体11q13，由SLC22A12基因编码，由10个内含子9个外显子组成，拥有12个跨膜结构域，其cDNA全长2642bp，编码区1659bp，编码含555个氨基酸的蛋白质。原发性肾低尿酸血症(hypouricemia)病人的SLC22A12基因缺陷病例进一步证明人的URAT1(hURAT1)参与尿酸的重吸收(Atsushi Enomoto，Hiroaki Kimura，ArthitChairoungdua，Yasuhiro Shigeta，et a1.Molecular identification of a renal urate-anionexchanger that regulates blood urate levels.Nature，2002，417(6887)：447-452)。
化合物I、II、III和IV为包含相同结构单元的香豆素类单体化合物，其常用名、结构式、分子式和美国化学文摘收录号(CAS No.)见下：
上述四种化合物可以由天然产物中分离纯化得到；例如有文献报道了由苦枥白蜡树树皮中分离得到了上述四种化合物单体：取苦枥白蜡树的干燥树皮2.5kg，粉碎后用95％乙醇回流提取3次，每次4h，过滤，合并滤液，浓缩至稠膏状。取上述提取稠膏，加水稀释，醋酸乙酯萃取，回收醋酸乙酯得醋酸乙酯干膏；将醋酸乙酯膏适量进行硅胶柱层析，用氯仿∶甲醇∶甲酸不同比例洗脱，分别回收至干，用50％乙醇溶解，过滤，析晶，可得到秦皮乙素和秦皮素。取上述提取稠膏，加水热溶，趁热抽滤，用醋酸乙酯萃取滤液4次，继续用正丁醇萃取水溶液4次，合并萃取液，减压回收萃取液得干膏；取5g干膏上聚酰胺柱，用稀醇洗脱，分部收集，析晶，可得到秦皮苷和秦皮甲素晶体。(刘丽梅，王瑞海，陈琳，吴萍，王丽.秦皮化学成分的研究.中草药2003；34(10)：889-890；刘丽梅，陈琳，王瑞海.秦皮化学成分的研究.中草药2001；32(12)：1073-1074)。上述香豆素类化合物也可由化学改构/合成得到(Kanho，Hideki；Yaoya，Sayaka；Itani，Tomio；Nakane，Takahisa；Kawahara，Nobuo；Takase，Yoichi；Masuda，Kazuo；Kuroyanagi，Masanori.Glucosylation of phenolic compounds byPharbitis nil hairy roots：I.Glucosylation of coumarin and flavonederivatives.Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry(2004)，68(10)，2032-2039.Butler，Warren L.；Siegelman，H.W.Conversion of caffeicacid to esculetin during paper chromatography.Nature(London，UnitedKingdom)(1959)，183：1813-14.Ramesh，C.；Mahender，G.；Ravindranath，N.；Das，Biswanath.A mild，highly selective and remarkably easy procedurefor deprotection of aromatic acetates using ammonium acetate as a neutralcatalyst in aqueous medium.Tetrahedron(2003)，59(7)，1049-1054.)
上述四种化合物已见有多种生理与药理活性的报道，包括抗病原微生物活性、抗炎、利尿(促进尿酸排泄)、抗凝和抗过敏、止咳祛痰平喘、中枢抑制作用、抗肿瘤等(李存红，徐燕 秦皮的研究进展 焦作大学学报2004；4(10)：34-35)。但上述四种香豆素类化合物单体用于制备针对尿酸转运子URAT1的抑制药物，则未见报道。
发明内容：本发明的目的是提供系列香豆素单体化合物的新用途，具体是包含相同结构单元的香豆素类单体化合物(I、II、III、IV)在制备尿酸转运子URAT1抑制药物中的应用。
本发明的技术解决方案是：提供包含相同结构单元的系列香豆素类单体化合物(I、II、III、IV)用于制备尿酸转运子URAT1抑制药物的新用途。该新用途包括了以本发明所述的香豆素类单体化合物(I、II、III、IV)，配以本领域的技术人员所熟知的药用辅料(赋形剂、助溶剂、控释剂等)，制成本领域的技术人员所熟知的剂型(包括口服液、注射剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、微囊剂等)，用于制备尿酸转运子URAT1抑制药物。
本发明的优点是，提供了对尿酸转运子URAT1具有确切抑制调节作用的系列香豆素类单体化合物，用于制备尿酸转运子URAT1抑制药物，可用于治疗与尿酸转运子URAT1异常高表达相关的疾病。与针对痛风或高尿酸血病症的发明比较，本发明提供的系列香豆素类单体化合物新用途具有3个明显的进步和优点：1、有效成分确切(单体化合物)；2、作用靶点明确(尿酸排泄过程中重吸收作用的尿酸转运子URAT1)；3、调节作用明确(抑制调节)。
本发明利用高尿酸血动物模型在基因转录水平和蛋白表达水平上科学地评价并确定了系列香豆素类单体化合物(I、II、III、IV)对尿酸转运子URAT1的抑制调控作用。
本发明所涉及的系列香豆素类单体化合物对模型动物表达异常增高的尿酸转运子URAT1具有确切的抑制作用；而对正常动物的正常水平的尿酸转运子表达无显著抑制作用，具有很好的安全性。
为了更好的理解本发明的实质，下面将用香豆素类单体化合物I、II、III、IV的药理实验及结果来说明其在制备尿酸转运子URAT1抑制药物中的应用。
具体实施方式：以下实施例仅作为进一步阐述发明之用，不能用来限制本发明。
实施例1：香豆素类单体化合物I对尿酸转运子URAT1的抑制调节作用
实验动物：昆明种小鼠，15-20克，雄性
药物配制：香豆素类单体化合物I均匀分散于生理盐水中，用于灌胃给药，给药剂量为15mg/kg
实验材料：Trizol Reagment(Invigen)，氯仿，异丙醇，无水乙醇，DEPC，M-MLV反转录酶，PCR试剂盒，RIPA裂解液等
实验仪器：高速冷冻离心机，高速匀浆机，Bio-rad垂直电泳槽，MBI-PCR仪、水平电泳槽等
实验模型：小鼠高尿酸血症模型。
实验方法：
1、模型的建立：动物适应环境1周后，灌胃给予氧嗪酸钾盐250mg/kg；对照给予等体积生理盐水，造模周期10天。
2、给药：造模期间同时给药，在给予氧嗪酸钾盐造模/生理盐水对照1h后，灌胃给予香豆素类单体化合物I 15mg/kg；对照给予生理盐水。
3、小鼠处死及组织的保存：小鼠于灌胃给予化合物I/生理盐水后1小时处死，冰台上分离肾脏组织，肾组织经液氮冷冻后保存于-80℃。
4、蛋白质印迹法(Western-blotting)：取组织约100mg加入1ml的RIPA裂解液匀浆提取，12000g 4℃离心15分钟，得肾脏组织总蛋白提取液，Bradford法测蛋白浓度，稀释蛋白样品至终浓度为5ug/ul。混合上样缓冲液变性上样，SDS-PAGE凝胶电泳后PVDF转膜，封闭液封闭1小时后加入mURAT1抗体(根据NCBI数据库mURAT1蛋白序列制备，使用浓度1∶4000)4℃孵育过夜，二抗(1∶4000)室温摇床孵育1小时，HRP-ECL发光，暗室曝光显影。胶片扫描后对图片进行灰度分析。
5、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)：提取小鼠肾脏总RNA，逆转录得到cDNA模板，根据NCBI数据库的mURAT1基因设计引物，进行mURAT1目的基因扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后UV成像，对图片进行灰度分析。
实验结果：
a.蛋白质印迹法Western-Blotting
| Groupn＝5 | 空白+生理盐水 | 空白+香豆素I | 模型+生理盐水 | 模型+香豆素I |
| 灰度值 | 64.5±11.2 | 57.5±16.6 | 118.1±18.7++ | 75.2±14.0** |
++P＜0.01与空白+生理盐水组比较 **P＜0.01与模型+生理盐水组比较
连续10天灌胃给予氧嗪酸钾盐250mg/kg造模造成小鼠肾组织中URAT1蛋白高水平表达，灰度值达到118.1，显著高于空白对照64.5。灌胃给予15mg/kg的香豆素类单体化合物I可显著抑制模型小鼠肾组织中URAT1蛋白的高水平表达，灰度值为75.2，接近空白对照水平。说明香豆素类单体化合物I具有显著抑制模型动物异常增高的尿酸转运子URAT1蛋白表达的药理活性。灌胃给予香豆素类单体化合物I对空白小鼠肾组织中URAT1蛋白表达水平无显著影响，说明香豆素类单体化合物I对小鼠肾组织正常水平的URAT1蛋白无显著抑制活性，具有较好的安全性。
b.逆转录聚合酶链反应RT-PCR
| Groupn＝5 | 空白+生理盐水 | 空白+香豆素I | 模型+生理盐水 | 模型+香豆素I |
| 灰度值 | 28.9±7.7 | 27.5±10.2 | 68.1±14.6+++ | 35.2±13.0** |
+++P＜0.001与空白+生理盐水组比较 **P＜0.01 与模型+生理盐水组比较连续10天灌胃给予氧嗪酸钾盐250mg/kg造模造成小鼠肾组织中URAT1 mRNA高水平表达，灰度值达到68.1，显著高于空白对照28.9。灌胃给予15mg/kg的香豆素类单体化合物I可显著抑制模型小鼠肾组织中URAT1 mRNA的高水平表达，灰度值为35.2，接近空白对照水平。说明香豆素类单体化合物I具有在转录水平上抑制异常增高的尿酸转运子URAT1 mRNA表达的药理活性。灌胃给予香豆素类单体化合物I的空白小鼠肾组织中URAT1 mRNA表达水平为27.5，相对于空白对照组无显著变化，说明香豆素类单体化合物I对小鼠肾组织正常水平的URAT1mRNA无显著抑制活性，具有较好的安全性。
实施例2：香豆素类单体化合物II对尿酸转运子URAT1的抑制作用实验动物模型和方法同实施例1，香豆素类单体化合物II均匀分散于生理盐水中，用于灌胃给药，剂量为15mg/kg
实验结果：
a.蛋白质印迹法Western-Blotting
| Groupn＝5 | 空白+生理盐水 | 空白+香豆素II | 模型+生理盐水 | 模型+香豆素II |
| 灰度值 | 73.8±19.3 | 88.2±10.7 | 161.1±25.2++ | 93.2±11.0** |
++P＜0.01与空白+生理盐水组比较 **P＜0.01与模型+生理盐水组比较连续10天灌胃给予氧嗪酸钾盐250mg/kg造模造成小鼠肾组织中URAT1蛋白高水平表达，灰度值达到161.1，显著高于空白对照73.8。灌胃给予15mg/kg的香豆素类单体化合物II可显著抑制模型小鼠肾组织中URAT1蛋白的高水平表达，灰度值为93.2。说明香豆素类单体化合物II具有显著抑制模型动物异常增高的尿酸转运子URAT1蛋白表达的药理活性。灌胃给予香豆素类单体化合物II对空白小鼠肾组织中URAT1蛋白表达水平无显著影响，接近于空白对照水平。说明香豆素类单体化合物II对小鼠肾组织正常水平的URAT1蛋白无显著抑制活性，具有较好的安全性。
b.逆转录聚合酶链反应RT-PCR
| Groupn＝5 | 空白+生理盐水 | 空白+香豆素II | 模型+生理盐水 | 模型+香豆素II |
| 灰度值 | 36.5±9.0 | 38.2±11.5 | 61.1±15.6+ | 33.2±12.0* |
+++P＜0.001与空白+生理盐水组比较 **P＜0.01 与模型+生理盐水组比较连续10天灌胃给予氧嗪酸钾盐250mg/kg造模造成小鼠肾组织中URAT1 mRNA高水平表达，灰度值达到61.1，显著高于空白对照36.5。灌胃给予15mg/kg的香豆素类单体化合物II可显著抑制模型小鼠肾组织中URAT1 mRNA的高水平表达，灰度值为33.2，达到空白对照水平。说明香豆素类单体化合物II具有在转录水平上抑制异常增高的尿酸转运子URAT1 mRNA表达的药理活性。灌胃给予香豆素类单体化合物II对空白小鼠肾组织中URAT1 mRNA表达水平无显著抑制，说明香豆素类单体化合物II对小鼠肾组织正常水平的URAT1 mRNA无显著抑制活性，具有较好的安全性。
实施例3：香豆素类单体化合物III对尿酸转运子URAT1的抑制作用实验动物模型和方法同实施例1，香豆素类单体化合物III均匀分散于生理盐水中，用于灌胃给药，剂量为15mg/kg
实验结果：
a.蛋白质印迹法Western-Blotting
| Groupn＝5 | 空白+生理盐水 | 空白+香豆素III | 模型+生理盐水 | 模型+香豆素III |
| 灰度值 | 53.8±16.3 | 48.1±10.6 | 101.7±15.0++ | 73.4±11.3* |
++P＜0.01与空白+生理盐水组比较 **P＜0.01与模型+生理盐水组比较连续10天灌胃给予氧嗪酸钾盐250mg/kg造模造成小鼠肾组织中URAT1蛋白高水平表达，灰度值达到101.7，显著高于空白对照53.8。灌胃给予15mg/kg的香豆素类单体化合物III可显著抑制模型小鼠肾组织中URAT1蛋白的高水平表达，灰度值为73.4。说明香豆素类单体化合物III具有显著抑制模型动物异常增高的尿酸转运子URAT1蛋白表达的药理活性。灌胃给予香豆素类单体化合物III的空白小鼠肾组织中URAT1蛋白表达水平48.1，接近空白对照水平。说明香豆素类单体化合物III对小鼠肾组织正常水平的URAT1蛋白无显著抑制活性，具有较好的安全性。
b.逆转录聚合酶链反应RT-PCR
| Groupn＝5 | 空白+生理盐水 | 空白+香豆素III | 模型+生理盐水 | 模型+香豆素III |
| 灰度值 | 24.5±11.2 | 21.5±6.6 | 58.1±8.6+ | 35.2±14.7* |
+P＜0.05与空白+生理盐水组比较 **P＜0.01与模型+生理盐水组比较连续10天灌胃给予氧嗪酸钾盐250mg/kg造模造成小鼠肾组织中URAT1 mRNA高水平表达，灰度值达到58.1，显著高于空白对照24.5。灌胃给予15mg/kg的香豆素类单体化合物III可显著抑制模型小鼠肾组织中URAT1 mRNA的高水平表达，灰度值为35.2，达到空白对照水平。说明香豆素类单体化合物III具有在转录水平上抑制异常增高的尿酸转运子URAT1 mRNA表达的活性。灌胃给予香豆素类单体化合物III的空白小鼠肾组织中URAT1 mRNA表达水平为21.5，接近空白对照水平，说明香豆素类单体化合物III对小鼠肾组织正常水平的URAT1 mRNA无显著抑制活性，具有较好的安全性。
实施例4：香豆素类单体化合物IV对尿酸转运子URAT1的抑制作用实验动物模型和方法同实施例1，香豆素类单体化合物IV均匀分散于生理盐水中，用于灌胃给药，剂量为15mg/kg
实验结果：
a.蛋白质印迹法Western-Blotting
| Groupn＝5 | 空白+生理盐水 | 空白+香豆素IV | 模型+生理盐水 | 模型+香豆素IV |
| 灰度值 | 60.4±16.3 | 58.6±14.1 | 111.3±30.2++ | 55.4±16.0** |
++P＜0.01与空白+生理盐水组比较 **P＜0.01与模型+生理盐水组比较连续10天灌胃给予氧嗪酸钾盐250mg/kg造模造成小鼠肾组织中URAT1蛋白高水平表达，灰度值达到111.3，显著高于空白对照60.4。灌胃给予15mg/kg的香豆素类单体化合物IV可显著抑制模型小鼠肾组织中URAT1蛋白的高水平表达，灰度值为55.4。说明香豆素类单体化合物IV具有显著抑制模型动物异常增高的尿酸转运子URAT1蛋白表达的药理活性。灌胃给予香豆素类单体化合物IV的空白小鼠肾组织中URAT1蛋白表达水平58.6，接近空白对照水平。说明香豆素类单体化合物IV对小鼠肾组织正常水平的URAT1蛋白无显著抑制活性，具有较好的安全性。
b.逆转录聚合酶链反应RT-PCR
| Groupn＝5 | 空白+生理盐水 | 空白+香豆素IV | 模型+生理盐水 | 模型+香豆素IV |
| 灰度值 | 31.5±7.2 | 30.5±9.3 | 66.0±10.6++ | 38.6±11.7** |
++P＜0.01与空白+生理盐水组比较 **P＜0.01 与模型+生理盐水组比较连续10天灌胃给予氧嗪酸钾盐250mg/kg造模造成小鼠肾组织中URAT1 mRNA高水平表达，灰度值达到66.0，显著高于空白对照31.5。灌胃给予15mg/kg的香豆素类单体化合物IV可显著抑制模型小鼠肾组织中URAT1 mRNA的高水平表达，灰度值为38.6，达到空白对照水平。说明香豆素类单体化合物IV具有在转录水平上抑制异常增高的尿酸转运子URAT1 mRNA表达的活性。灌胃给予香豆素类单体化合物IV的空白小鼠肾组织中URAT1 mRNA表达水平为30.5，接近空白对照水平，说明香豆素类单体化合物IV对小鼠肾组织正常水平的URAT1 mRNA无显著抑制活性，具有较好的安全性。
实施例5：
将香豆素类单体化合物(I、II、III、IV)按照常规制剂方法，加入水及适量增溶剂(聚乙二醇400)溶解，分装，灭菌，制备成规格为10mg/ml的香豆素口服液(I、II、III、IV)；
将香豆素类单体化合物(I、II、III、IV)按照常规制剂方法，软胶囊材质选用明胶和山梨醇，制备成规格为10mg/粒的香豆素胶囊(I、II、III、IV)；
将香豆素类单体化合物(I、II、III、IV)按照常规制剂方法，加入赋形剂环糊精，混合均匀，制粒，压片，制备成规格为10mg/片的香豆素片剂(I、II、III、IV)。
Claims (4)
1.香豆素类单体化合物I在制备尿酸转运子URAT1抑制药物中的应用。
2.香豆素类单体化合物II在制备尿酸转运子URAT1抑制药物中的应用。
3.香豆素类单体化合物III在制备尿酸转运子URAT1抑制药物中的应用。
4.香豆素类单体化合物IV在制备尿酸转运子URAT1抑制药物中的应用。
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