CN101180307A - 离子液体支载的合成 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于化学应用以及能够提供溶剂和液体载体双重功能的离子液体。该离子液体适用于合成低聚物的方法，所述低聚物选自：寡肽、寡糖和寡核苷酸，所述方法包括在反应条件下将第一种单体单元与离子液体接触以产生离子液体结合的单体单元；和在反应条件下将离子液体结合的单体单元与至少另一种单体单元接触以产生离子液体结合的包含2－30个单体单元的低聚物。该方法适用于寡肽、寡糖和寡核苷酸的大规模生产。

Description

离子液体支载的合成
发明领域
本发明涉及离子液体支载的合成。更具体地，本发明涉及离子液体支载的寡肽、寡糖和寡核苷酸的合成。更具体地，本发明涉及离子液体支载的生物活性寡肽的合成。
发明背景
寡肽、寡糖和寡核苷酸的有效合成代表当代导致一些新颖途径的发展的挑战。使用液相合成制备结构明确的寡糖的常规方法是费力的并且在每步后需要通过色谱法纯化反应产物1。
在过去几十年中，科学界对于合成寡核苷酸的要求已经迅速增长。幸运的是，丰富的DNA寡核苷酸引物源已经满足了基因序列测定、功能基因组学、和基于聚合酶链反应(PCR)的检测方法的巨大的需求。而且，寡核苷酸已经广泛用于治疗和诊断应用的研制，包括芯片DNA微阵列。伴随着DNA和RNA化学的进展，结构生物学和生物化学已经取得了重大的进展2-6。例如，如果没有对RNA合成的改进4，在包括晶体结构的核酶和siRNA研究中，本领域的当前状态是不可能的。
自从Merrifield7和Letsinger等人8，9引入了分别用于合成寡肽和寡核苷酸的聚合物载体的使用后，不溶性载体的使用已经成为用于有机合成的重要工具，特别是在合成生物聚合物中，例如寡核苷酸、肽以及近来的糖类10-12。简易的纯化方法包括通过过滤除去过量的试剂和副产物使得直接产物分离，并且使自动化成为可能。虽然非常成功，但是由于不溶性聚合物的非均相的性质，固相合成存在着缺点，所述缺点一般与非均相的反应条件有关，且固相载体本身高额的成本，使得对这些化合物的大量合成非常昂贵。
近来，在聚合物支载的固相合成13-15的进展已经提供了合成复杂寡糖的较简单的方法，由于它通过简单洗涤树脂使得过量试剂移除，且因此使所需的色谱步骤的数量最小化16，17。这已经产生了令人惊叹的成功自动合成的实例14，18。然而，固相合成的缺点是通常要求大量过量昂贵的糖类单元使得进行多相反应而完成，而且通过常规的表征方法如TLC、NMR和质谱监测糖-糖偶联过程是比较困难的。而且，尽管固相方法提供了许多益处，但是不溶性聚合物的非均相的性质和反应条件通常导致一系列的问题，包括非线性反应动力学、反应位点的不均匀分布和/或不均匀达到反应位点、溶剂化作用问题和不足的偶联率。
为了建立均匀反应条件且克服一些固相合成的缺点，对于其它方法学的研究已经导致了可溶性聚合物载体的研制。近年来，使用可溶性聚合物载体已经受到相当的关注，因为“液相”合成保留许多常规溶液化学的优点，同时有利于产物的简单的纯化。可溶性聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇和其它聚合物已经都成功地用于合成寡肽19和核苷酸11。而且，可溶性聚乙二醇(PEG)聚合物已经用作寡糖12，20-23和小分子合成24的载体。然而，使用可溶性聚合物载体有下述缺点：低负载能力、寡糖附着的聚合物的选择性沉淀困难、合成较长肽时有限的溶解度、低水溶性、在醚溶剂中的溶解度差24、以及对于纯化需要能量强烈冷却。
近来，提出了基于氟化(含氟)可溶载体的新的液相合成25。此方法基于在含氟溶剂(即全氟烃类)中含氟载体和氟化试剂的良好的溶解度。通过含氟有机溶剂分隔26a-d或基于含氟硅胶的固相提取(SPE)26e-h，可以容易地将非氟化试剂从支载的产物上分离。该方法需要使用不能常规容易得到的氟化化合物。通过温度改变能够实现纯化，温度改变引起先前易混合的含氟溶剂和有机溶剂之间的相分离，因此容易分开。用于有机合成的含氟相方法的用途已经证明用于合成寡肽27、寡糖28、和小分子25。在合成寡糖时，已经证明，含氟溶剂中固定糖的载体的溶解度依赖于氟含量28b，当糖单元数量增加时氟含量下降。，全氟烷溶剂、对特殊氟化试剂的需要和与温度改变有关的能量成本的费用可能限制了含氟相有机合成的广泛应用。
近年来，离子液体(ILs)作为用于有机反应的合乎环境要求的良性反应介质29已经受到广泛的关注。离子液体的实际定义是熔点温度低于水的沸点(通常比水的沸点低很多)的盐。离子液体的共同特点是大多数含有有机阳离子和无机阴离子。离子液体的非限制性的实例是烷基咪唑和吡啶的卤化物盐、四氟硼酸盐和六氟磷酸盐。大量化学反应，包括一些酶催反应可以在离子液体中进行30。作为电化学技术31、化学提取32和其它工业方法33的介质，室温离子液体也已经得到广泛研究。这是由于离子液体的一些吸引人的化学和物理性质：高热稳定性和化学稳定性、不易燃、无可测量的蒸汽压、以及高承载能力。大多数情况下，可以容易地将离子液体循环。通过改变阳离子或阴离子的结构，可以容易地调整离子液体的溶解度使得它们能够从有机和含水介质中相分离，由此方便的分离和纯化。这提供了离子液体能够作为用于有机合成适用的可溶功能载体的潜力。也可以调整底物的溶解度34。近来的报道已经成功地证明了ILSS(离子液体支载的合成)用于小分子35，37，38和小肽39的功效。发展可回收和可循环的离子液体支载的催化剂的可能性也已经得到研究36。
Vaultier等人(WO2004/029004)已经在先前描述了离子液体作为用于有机反应介质(即溶剂)的用途。使用作为可溶性载体的官能化盐(也称为盐)可以进行此有机反应。离子液体确保功官能盐的增溶使得在均相条件下进行此反应。Vaultier等人(WO2005/005345)也已经在先前描述了溶解于至少一种有机溶剂中的盐(即离子液体)作为用于有机反应的可溶性载体的用途，并编撰了“盐支载的有机合成”。
因此还有对用于寡聚体合成的改进方法的需要，所述寡聚体包括但不限于寡肽、寡糖和寡核苷酸，其中这些方法组合了固相合成和液相合成二者的优点，该方法包括均匀液相条件且该方法能容易地纯化产物。
本发明力求满足这些和其它的需要。
本说明书涉及大量文献，将其内容整体在此引用作为参考。
发明简述
本发明涉及离子液体支载的合成。
在一实施方案中，本发明涉及通过离子液体支载的寡肽、寡糖和寡核苷酸的合成。
在一实施方案中，本发明涉及用于合成寡聚体的离子液体支载的方法，所述寡聚体包括但不限于寡肽、寡糖和寡核苷酸。
在一实施方案中，本发明涉及合成寡聚体的方法，所述寡聚体选自寡肽、寡糖和寡核苷酸，所述方法包括在反应条件下将第一种单体单元与离子液体接触以产生离子液体结合的单体单元；和在反应条件下将离子液体结合的单体单元与至少另一种单体单元接触以产生离子液体结合的包含2-30个单体单元的寡聚体。然后将此离子液体结合的寡聚体从离子液体上切下(cleave)以产生游离的寡聚体。
在另一实施方案中，本发明涉及合成寡聚体的方法，所述寡聚体选自寡肽、寡糖和寡核苷酸，所述方法包括对单体单元如此施用离子液体以产生含有2-30个单体单元的寡聚体。
在另一实施方案中，本发明涉及用于化学合成且能提供溶剂和液体载体的双重功能的离子液体。在具体实施方案中，离子液体为有机盐，包括含有杂环或取代杂环季氮的有机阳离子、含有杂环或取代杂环季鏻的有机阳离子、或含有杂环或取代杂环三价锍的有机阳离子；以及平衡有机阳离子上电荷的阴离子。在更具体的实施方案中，有机阳离子选自N-取代吡啶和1，3-二取代咪唑。平衡有机阳离子上电荷的阴离子可以选自Cl-、Br-、BF4 -、PF6 -、SbF6 -、CuCl2 -、和AlCl4 -。其它合适的阴离子也可以使用，这完全在技术人员能力范围内。
在具体实施方案中，本发明涉及离子液体支载的寡肽的合成。在更具体的实施方案中，本发明涉及五肽Leu5-脑啡肽的合成，其结构如下所示。
Leu-脑啡肽
本发明上述和其它的目的、优点和特点将在阅读下述其例示性实施方案的非限制性描述后更加清楚，所述例示性实施方案仅参考附图通过实施例的方式给出。
发明详述
在附图中：
图1为根据本发明的一般概念的离子液体支载的合成的实施方案的说明；
图2为根据本发明的一般概念的离子液体支载的合成的另一实施方案的说明；
图3为对可信(authentic)的Leu5-脑啡肽41和合成Leu5-脑啡肽14的TFA盐的1H NMR波谱的说明；
图4为对通过ILSS合成的粗品Leu5-脑啡肽14的HPLC分析的说明；
图5为对离子液体支载的肽2a、4a、7、9和11的1H NMR波谱的说明；
图6为对离子液体支载的肽2a、4a、7、9和11的质谱的说明；及
图7为对去保护基的寡核苷酸的不同HPLC色谱的说明。
说明性实施方案详述
为了对本说明书中所用的术语给出清晰且一致的理解，下面给出许多定义。而且，除另外定义外，在此所用的所有技术和科学术语与本发明属于的领域的普通技术人员的共同理解有相同的含义。
词语“a”或“an”的使用，当在权利要求书和/或说明书中与术语“包括(comprising)”结合使用时可以指“一(one)”，但是它也可以与“一种或多种(oneor more)”、“至少一种(at least one)”和“一种或多于一种(one or more than one)”的含义一致。相似地，词语“another”可以指第二个或另外的。
在说明书和权利要求书中使用的，词语“包括(comprising)”(和comprising的其它形式，如“comprise”和“comprises”)，“有(having)”(和having的其它形式，如“have”和“has”)，“包括(including)”(和including的其它形式，如“include”和“includes”)或“含有(containing)”(和containing的其它形式，如“contain”和“contains”)，为包含或末端开放式且不排除其它未引用的要素或方法步骤。
术语“约”用于表示包括对于所使用的设备或方法的测定值的误差变化内的值。
在此使用的术语“氨基酸”，可以理解为包括天然存在的氨基酸的L和D型异构体，以及在肽化学中用于制备肽的合成类似物的其它非蛋白质性氨基酸(non-proteinaceous)。天然存在的氨基酸的实例包括但不限于甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸和苏氨酸。非蛋白质性氨基酸包括但不限于正亮氨酸、正缬氨酸、环己基丙氨酸、联苯丙氨酸、高苯基(homophenyl)丙氨酸、萘基丙氨酸、吡啶基丙氨酸、以及取代的苯基丙氨酸(以一个或多个取代基取代，所述取代基包括但不限于烷氧基、卤素和硝基)。β和γ氨基酸也在术语“氨基酸”的范围内。通过在肽合成中共同使用的标准保护基保护的氨基酸也在术语“氨基酸”的范围内。这些化合物对于肽化学领域中的技术人员是已知的。
在此使用的术语“核苷酸”，可以理解为指个体核苷酸或核苷酸变种(variety)，是指分子或大核酸分子中的个体单元，包括嘌呤或嘧啶、核糖或脱氧核糖的糖部分、和在寡核苷酸或多核苷酸中核苷酸的磷酸酯基或磷酸二酯键(linkage)。在此使用的术语“核苷酸”也包括“修饰的核苷酸”，其包括至少一种修饰，所述修饰选自(a)其它连接基团，(b)嘌呤的类似形式，(c)嘧啶的类似形式，或(d)类似糖。通过在寡核苷酸合成中共同使用的标准保护基保护的核苷酸也在术语“核苷酸”的范围中。这些化合物对于核苷酸化学领域的技术人员是已知的。
在此使用的术语“糖类”，可以理解为指碳水化合物，其为多羟基醛或酮，或其衍生物，具有经验式(CH2O)n，其中n为整数，一般大于3。单糖(monosaccharides)，或单糖(simple sugars)由单个多羟基醛或酮单元组成。单糖包括但不限于核糖、2-去氧-核糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、半乳糖、岩藻糖、果糖等。二糖含有两个通过糖苷键连接的单糖单元。二糖包括，例如蔗糖、乳糖、麦芽糖、纤维二糖等。寡糖一般含有2-10个通过糖苷键连接的单糖单元。多糖(polysaccharides)(多糖(glycans))一般含有10个以上的这种单元，且包括但不限于下述分子，例如肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素及其多糖衍生物。术语“糖”一般是指单糖、二糖或寡糖。糖类可以被取代，例如葡萄糖胺、半乳糖胺、乙酰基葡萄糖、乙酰基半乳糖、N-乙酰基葡萄糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖基-N-乙酰基葡萄糖胺、N-乙酰基神经氨酸(唾液酸)等。糖类也可以作为大分子的组成部分存在，例如，作为核苷、核苷酸、多核苷酸、DNA、RNA等的糖部分。在此使用的术语“糖类”也可理解为包括修饰的糖类，如那些包括至少一种修饰的糖，所述修饰选自(a)通过取代基替代一个或多个OH基团，所述取代基包括但不限于H、NH2、卤素、烷基、芳基；(b)一个或多个OH基团氧化成为官能基团，包括醛、酮、酸、酯、及其衍射物。通过在寡糖合成中共同使用的标准保护基保护的糖类也在术语“糖类”的范围内。这些化合物是肽化学领域中的技术人员已知的。
在此使用的术语“增长的寡肽链”、“增长的寡糖链”和“增长的寡核苷酸链”是指已经通过依序加入任选适当被保护的氨基酸、糖类或核苷酸制备的链。每一个反应周期后，增长的寡肽、寡糖或寡核苷酸在长度上增长至少一个氨基酸、糖或核苷酸，且成为下个反应周期的起始物料。在此使用的此术语可以指起始物料或产物，且在具体上下文中，本领域的普通技术人员将识别出什么由此术语表示的。
在此使用的术语“烷基”理解为是指饱和的、一价直链或支链的烃链。烷基的实例包括但不限于(C1-C6)-烷基。(C1-C6)-烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、2-甲基-1-丙基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-3-丁基、2，2-二甲基-1-丙基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、2，2-二甲基-1-丁基、3，3-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、和己基。
在此使用的术语“芳基”可以理解为是指在环中可以含有0-4个杂原子的5-、6-和7-元芳香基团，例如苯基、吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、唑基、噻唑基、三唑基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、哒嗪基、和嘧啶基等。环结构中含有杂原子的这些芳香基也可以指“芳香杂环”或“杂芳香环”。芳香环可以在一个或多个环位置取代。芳香基团也可以是多环基团部分。例如，芳香基团包括稠合的芳香部分，如萘基、蒽基(anthracenyl)、喹啉基、吲哚基等。
在此使用的术语“卤素”可以理解为是指氟、氯、溴或碘。相应地，术语“卤代”可以理解为包括氟代、氯代、溴代或碘代。
本发明的保护基用于寡肽的合成、寡核苷酸的合成和寡糖的合成中。保护基团阻断单体末端的反应性，所述单体无论是氨基酸、糖或核苷酸。化学合成的性质将决定那些反应基团将需要保护基团。不考虑特殊用途，保护基团用于保护分子上与另外试剂反应的部分。本发明所用的保护基团有下述特性：它们防止选择的试剂改变与它们连接的基团；它们对于合成反应条件是稳定的(即它们与分子保持相连)；以及可以在一些条件下将它们移除，所述条件对其余结构没有不利的影响。当然，对合适的保护基的选择依赖于单体单元和寡聚体，以及它们将保护某基团以抑制具体试剂的化学性质。对于给定的反应序列，在技术人员的能力范围内很好地选择合适的保护基团。
本说明书涉及许多本领域技术人员使用的化学术语和缩写。然而，为了清晰和一致，提供所选术语的定义。
缩写：DCC：二环己基碳二亚胺；DMAP：4-(N，N-二甲氨基)吡啶；EDC：盐酸1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺；HOBt：1-羟基苯并三唑水合物；HATU：O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐；PyBOP：(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐；DCU：二环己基脲；DIPEA(Hunig’s base)：二异丙基乙胺；DCI：4，5-二氰基咪唑；DMSO：二甲基亚砜；DMSO-d6：氘代二甲基亚砜；DCM：二氯甲烷；NMI：N-甲基咪唑；TEA：三乙胺：TEAA：乙酸三乙基铵；THF：四氢呋喃；CE：氰乙基；PEG：聚乙二醇；Py：吡啶；Succ：琥珀酰；CPG：可控多孔度玻璃；IL：离子液体；ILSS：离子液体支载的合成；DMT：二甲氧基三苯甲基(dimethoxytrityl)；LCAA：长链烷基胺；EEDQ：2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉；IIDQ：2-异丁氧基-1-异丁氧基羰基-1，2-二氢喹啉；TFA：三氟乙酸；AcOH：乙酸；NMR：核磁共振；MS：质谱；m/z：质荷比；m.p.：熔点；FAB：快原子轰击；TLC：薄层色谱；ESI：电喷雾离子化；FTMS：傅立叶变换质谱；LCMS：液体色谱-质谱；J：耦合常数；s：单峰；t：三重峰；m：多重峰；P-III：三价磷；P-V：五价磷。
根据本发明的一般概念的离子液体支载的合成在图1和2中说明。锚定在离子液体部分上的底物(反应物)在极性有机溶剂中可溶且可以进行液相反应。反应完成且溶剂蒸发之后，通过较小极性有机溶剂除去过量的试剂，锚定于离子液体的产物在所述较小极性有机溶剂中不可溶。可以通过沉淀或通过用水性溶液洗涤除去无机试剂和/或副产物。可以重复反应过程以得到更复杂的结构。最终，可以通过有机溶剂萃取将产物从离子液体部分分开且然后分离。希望锚定在离子液体载体上的底物大量地保留它们类似于传统液相反应的反应活性。可以通过标准分光技术容易地监测和分析在离子液体载体上进行的发应过程。
在此描述通过离子液体支载的用于合成寡肽、寡糖和寡核苷酸的新颖的液相方法。
在一实施方案中，本发明涉及用于合成寡聚体的离子液体支载的方法，所述寡聚体包括但不限于寡肽、寡糖和寡核苷酸。在另一个实施方案中，本发明涉及用于寡聚体的化学合成的离子液体，所述寡聚体包括但不限于寡肽、寡糖和寡核苷酸，所述离子液体能够提供溶剂和液体载体的双重功能。所述离子液体与一般用于有机合成的多种合成方法是兼容的。更具体地，所述离子液体与一般用于合成寡聚体的多种合成方法是兼容的，所述寡聚体包括但不限于寡肽、寡糖和寡核苷酸。而且，尤其但不排他地，在合成寡肽时，离子液体由于它们固有的离子性质不会引起肽构件的外消旋作用或差向异构作用。而且离子液体载体的溶解度不会受增长的寡肽、寡糖或寡核苷酸链影响，使得分离和纯化过程变得相当复杂。分离和纯化过程非常简单且一般包括用含水和有机溶剂洗涤步骤。
在本发明的一个实施方案中，离子液体为有机盐，包括含杂环或取代杂环季氮的有机阳离子和平衡有机阳离子上电荷的阴离子。在一具体实施方案中，有机阳离子选自N-取代吡啶和1，3-二取代咪唑且阴离子选自Cl-、Br-、BF4 -、PF6 -、SbF6 -、CuCl2 -、和AlCl4 -。其他离子液体在本领域中是已知的，和在技术人员的能力范围内。而且，在技术人员的能力范围内，阴离子也可以是有机阴离子，其非限制性实例包括CH3CO2 -、CF3CO2 -、CH3SO4 -和CF3SO2 -。
通过下述例示性实施方案的非限制性描述进一步详细说明本发明。
实施例1
与离子液体载体的连接和对外消旋的检测(图解1)
选择从1-甲基咪唑和2-溴乙醇[35a，d]反应容易获得的3-羟乙基-(1-甲基咪唑)-四氟硼酸盐(1)作为适合的离子液体载体的非限制性实例，以说明本发明关注的离子液体支载的寡肽的合成。根据本发明可以使用其它本领域中已知和在技术人员能力范围内的离子液体载体。
Figure S2006800168129D00091
图解1
考察用于将第一种氨基酸，Boc-亮氨酸负载到1上的不同偶联反应条件。这些偶联反应的效果见于下表1。
表1
    负载第一种氨基酸(Boc-Leu-OH)到离子液体载体1上.
    试验     偶联试剂a     条件     转化(％)b
    12345678     EDC(2eq.)/HOBtHATU(2eq.)/HOBtPyBOP(2eq.)/DIPEAEEDQ(1.5eq.)EEDQ(1.5eq.)EEDQ(5eq.)IIDQ(2eq.)DCC(2eq.)/DMAP     CH3CN/rt/48hCH3CN/rt/48hCH3CN/rt/48hCH3CN/35℃/18hCH3CN/35℃/72hCH3CN/60℃/18hCH3CN/35℃/48hCH3CN/rt/48h     45535571778687100
a对于Boc-Leu-OH的偶联试剂的当量；b使用1H NMR分析测定
在所试验的偶联条件中，DCC/DMAP组合(试验(entry)8)得到最好的结果。其它所研究的偶联条件包括EDC/HOBt组合；HATU/HOBt组合；PyBOP/DIPEA组合；EEDQ或IIDQ。然而，后面这些条件都不足以使偶联反应(酯化反应)定量转化。即使包括额外的加帽(capping)步骤，对于DCC/DMAP途径可替代的且有用的偶联途径包括用乙酸酐加帽未反应的1。通过随后的乙醚和含水酸洗涤除去过量的Boc-亮氨酸、DMAP和副产物DCU。通过NMR波谱验证得到高分离的产率(91％)和良好纯度的离子液体支载的Boc-亮氨酸2。使用L-Leu-Boc和D-Leu-Boc进行偶联反应分别得到2a和2b。
考察2a和2b的不同去Boc的保护反应条件，其结果见于表2。1H NMR波谱表明四氟硼酸和三氟乙酸都能引发非常完全的去保护作用。即使不那么有效，也可以使用酸性离子交换树脂如DowexTM 50W×8-100或AmberlystTM15进行去Boc的保护。根据本发明也可以使用其它去保护方法如“ProtectiveGroup in Organic Synthesis”(Greene等人，John Wiley和Sons，Inc，NY，1991)中说明的方法，并且这些方法在技术人员的能力范围内。
表2
                 离子液体支载的Leu-Boc 2a和2b与Boc-Phe-OH的去保护和偶联
    试验  去保护/中和  偶联条件a     转化(％)b
    123456789  TFA/不中和TFA/不中和TFA/NaHCO3TFA/Et3NTFA/NaHCO3TFA/Et3NTFA/DIPEAHBF4/OH-树脂HBF4/NaHCO3  EEDQ(2.5eq.)/CH3CN/35℃/48hDCC(2eq.)/DMAP/CH3CN/rt/48hEEDQ(2.5eq.)/CH3CN/35℃/48hIIDQ(2eq.)/CH3CN/35℃/48hDCC(2eq.)/DMAP/CH3CN/rt/48hDCC(2eq.)/DMAP/CH3CN/rt/48hPyBOP(1.5eq.)/DIPEA(3eq.)/CH3CN/35℃/30hEEDQ(2.5eq.)/CH3CN/35℃/48hEEDQ(2.5eq.)/CH3CN/35℃/48h     5560608585951002560
a对于Boc-Leu-OH的偶联试剂的当量；b使用1H NMR分析测定
下一个氨基酸构件即Boc-Phe-OH的偶联(图解2)之前优选进行中和步骤(表2)。可以用NaHCO3、Et3N、DIPEA或碱性离子交换树脂如DowexTM550AOH中和任何先前用于去Boc保护的过量TFA或HBF4。根据本发明和技术人员的能力范围内可以使用其它适合的中和试剂。另人惊奇的是，当使用PyBOP/DIPEA条件进行下一个氨基酸构件即Boc-Phe-OH的偶联反应时，在没有任何中间体分离和纯化步骤下，都可以顺序进行去保护/中和以及随后的偶联反应。
Figure S2006800168129D00111
图解2
以基本定量的产率40得到肽4a。本发明的离子液体支载的方法的优点是不需要大量过量的试剂。偶联反应仅用1.2eq.的PyBOP和Boc-Phe-OH就能完成。
为了评价离子液体负载的合成中，更具体地在使用DCC/DMAP条件负载步骤中，对映异构或差向异构的潜能，合成了一系列的离子液体负载的二肽4a-d。随后，使用氨水/甲醇将这些肽分离以得到二肽5a-d。随后对5a(L，L)和5b(D，L)的HPLC分析表明没有可检测量的其它异构体(＜0.5％)，表明在负载步骤和随后的二肽合成中，没有明显的外消旋化或差向异构化发生。而且，这些结果也说明在分离步骤使用碱性条件(氨水/甲醇)不会发生外消旋化和差向异构化。
实施例2
寡肽的合成以及从离子液体载体上分离
使用先前说明的偶联和去保护条件，将继之以酪氨酸部分的两个连续的甘氨酸部分(都以Boc保护的形式)紧接着偶联到增长的肽链4a上，以得到泡沫状淡黄色固体的离子液体支载的五肽11(图解3)。在合成顺序中，通过本领域技术人员已知的标准方法将所有的中间体，为Boc保护形式(7，9，11)或去保护形式(6，8，10)，分离并纯化。这些方法一般包括依序的有机溶剂和水清洗，在此描述的是非限制性的实例。
Figure S2006800168129D00121
图解3
通过常规的谱学方法，如1H、13C NMR和MS进行结构确证和纯度分析。在1H NMR波谱中，有或无Boc基团的叔丁基质子分别为偶联或去保护步骤的特征。离子液体支载的寡肽(2a、4a、7、9和11)的质谱进一步帮助结构表征；最强的信号对应于离子液体支载的寡肽的阳离子。
评估释放来自离子液体载体的五肽产物Leu5-脑啡肽14的两个途径(图解3)。第一个途径包括在碱性水溶液条件下，将五肽14从离子液体载体上切下，然后使用TFA/苯甲醚移除Boc和叔丁基保护基。第二途径包括首先用TFA/苯甲醚除去Boc和t-Bu保护基，然后在碱性水溶液条件下将五肽14从离子流体载体上切下。在从离子液体载体上切下并酸化反应介质后，第一途径提供保护的五肽12，并以良好的收率和纯度(产率84％)从溶液中沉淀出来。
分析由此制备的Leu5-脑啡肽14的纯度。在没有进行任何重结晶和色谱方法下，以总产率50％从1中得到相应的五肽14的TFA盐[m.p.148-152℃且[α]20 D＝25.0(c：0.8，95％AcOH)]。14的可信样品的熔点范围为150-153℃，且比旋光为[α]20 D＝25.6(c：0.9，95％AcOH)41。14的1H NMR波谱与可信样品(图3)的波谱基本上相同。使用HPLC分析(图4)证明，Leu5-脑啡肽五肽14的纯度超过约90％。这个纯度水平优于一般通过固相肽合成在色谱纯化之前得到的纯度水平。
离子液体支载的合成，具体是Leu5-脑啡肽五肽14的合成，提供了优于许多肽合成的现有方法的一些潜在的优点(表3)。
表3
                         常规的和各种支载的肽合成方法的比较a
    方面     CSPPS     SPPS     SPSPS     FPPS     ILSPS
    一般方法匀相合成高负载能力低过量试剂简单纯化常规谱学分析相对低的成本     -+n/a+-++/-     +---+--     ++-+++/--     ++++++-     +++++++
aCSPPS：常规液相肽合成；SPPS：固相肽合成；SPSPS：可溶聚合物支载的肽合成；FPPS：含氟相肽合成；ILSPS：离子液体支载的肽合成。
首先，与其他液相方法相同，相对于固相肽合成(SPPS)可以避免使用大量过量的反应试剂。当计划合成含有非天然氨基酸(如D-氨基酸)或当需要用于大量合成肽时，这是一个重要的考虑因素。第二，在离子液体支载的合成时，可以通过反复的溶剂洗涤(液/液相分离)容易地纯化每个中间体。在这个方面，ILSS与FPPS(含氟相肽合成)以及SPSPS(可溶聚合物支载的肽合成)相似。
在ILSS情况下，分离方法不象SPPS的情况下一样容易自动化，所述SPPS涉及固/液相分离。然而，由于一般仅需要约1摩尔当量的低分子量的离子液体1，ILSS的承载能力高于SPPS。而且，离子液体载体的成本一般低于含氟载体或甚至固体聚合物载体的成本，其在计划大规模合成肽时是更重要的考虑。最后，在ILSS的情况，通过常规的谱学方法(即1H、13C NMR和MS)方便地证实合成中每个中间体的结构和纯度。
实施例3
离子液体支载的寡糖的合成
如下述图解4，通过使用简单的相分离且不需要色谱方法纯化产物方便地实现使用离子液体支载的方法合成寡糖。
Figure S2006800168129D00151
图解4
将β-硫代葡萄糖苷(β-thioglycoside)15在室温下用溴乙酸/DCC/DMAP在CH2Cl2中酰化得到溴乙酸酯16a(x＝Br)(图解4)，所述β-硫代葡萄糖苷15由苯基-2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷起始，通过改进的文献方法43制备。
在室温下，16a(x＝Br)与1-甲基咪唑和四氟硼酸钠在丙酮中反应以98％的产率得到离子液体锚定的糖16b(x＝[mim][BF4])。通过用乙醚第一次洗涤粗产物纯化化合物16b以移除过量的1-甲基咪唑。然后将产物溶解于CH2Cl2中，且简单地通过过滤移除反应中产生的不可溶的无机NaBr盐。通过NMR(1H、13C、COSY和HMQC)波谱确证16b的结构，其清楚地表明咪唑部分和作为β-端基异构体的异头碳的存在。16b的电喷雾离子化质谱(ESI-MS)表明作为唯一分子离子的阳离子的存在。
然后通过间氯过氧苯甲酸在CH2Cl2中在-78℃下将单糖16b氧化20分钟以97％的产率得到非对映体混合物(由于亚砜的手性)的亚砜17b(x＝[mim][BF4])。通过用异丙醚洗涤从粗产物中移除反应的其它产物，间氯苯甲酸。
然后以17b作为糖基供体，以15作为受体(3当量)使用亚砜糖基化反应作为糖-糖装配的方法44-46。因为糖基供体和受体在低温下，在二氯甲烷中都有良好的溶解性，所以在-78℃下无水CH2Cl2中使用2，6-二叔丁基-4-甲基吡啶(4当量)和Tf2O(1当量)进行偶联反应。使用TLC监测反应过程。
通过洗涤除去过量的糖基乙醇(glycosyl alcohol)15、酸清除剂的碱、以及其它带有正戊烷及异丙醚的副产物得到产物二糖18b(x＝[mim][BF4])。通过向粗18b的CH2Cl2溶液中加入正戊烷，然后冷却溶液使17b从溶液中相分离，而从18b中除去质子化的酸清除剂，三氟甲磺酸(triflate)2，6-二叔丁基-4-甲基吡啶。HMQC NMR波谱表明以高纯度得到离子液体连接的二糖18b，表明二个异头碳的存在。而且，ESI-MS不仅证实了二糖结构，还表明没有任何未反应的单糖。重复相同顺序的反应得到亚砜19b以及离子液体连接的三糖20b(x＝[mim][BF4])。通过HMQC NMR波谱证实了三糖形成，表明三异头碳的存在，且通过ESI-MS清楚地表明没有任何单糖和二糖混入的三糖阳离子。
通过使用1当量的Cs2CO3的甲醇溶液将离子液体部分和连接基从20b上容易地切下，以定量得到产物21。通过蒸发甲醇溶剂容易地分离三糖21并将粗产物溶解于CH2C12中，然后过滤以除去咪唑盐。发现由此得到的没有经任何色谱或其它纯化方法分离的三糖21是NMR和TLC纯的。发现它的HMQC NMR波谱和ESI-MS(M+Na+＝1429.7)与可信样品21等同，所述可信样品21以16c(x＝H)起始通过经典的液相合成独立地制备，所述制备根据图解4中所示的相同反应顺序但每步反应后都进行色谱纯化。与通过16c的经典液相合成相比，通过ILSS方法得到的21的高纯度表明可将对经典液相合成研究的偶联条件和立体选择性移到(translate)ILSS。本实施例也表示与固相合成不同，所述固相合成中一般在终产物从固相载体上切下后需要色谱法以纯化终产物47。
实施例4
离子液体支载的寡核苷酸的合成
使用亚磷酰胺法2-6的寡核苷酸的固相合成是重复过程(interativeprocess)，其中通过移除不稳定的保护基团，在末端解离附着核苷酸的固体载体，由此释放亲核的羟基。然后在活化剂存在下将末端亲核试剂偶联到保护的亚磷酰胺单体上。然后将新生成的亚磷酸三酯键氧化以产生所需的且更稳定的磷酸三酯。重复此过程直至得到所需长度和组成的寡聚体核。当使用可溶载体时也可以使用相同的重复方法。
选择由1-甲基咪唑和2-溴乙醇[35a，d]反应容易得到的3-羟基乙基-(1-甲基咪唑)-四氟硼酸盐(1)作为合适的离子液体支载的非限制性实例以说明本发明关注的离子液体支载的寡核苷酸合成。根据本发明，可以使用本领域已知和在技术人员能力范围内的其它离子液体载体。
使用二环己基碳二亚胺(DCC)和催化量的4-二甲基氨基吡啶(DMAP)，在乙腈中，将琥珀酰化的5’-MMT-脱氧核苷2348偶联到离子液体1上，以得到离子液体支载的核苷24(图解5)。将反应混合物过滤以移除在反应中形成的不可溶的二环己基脲(DCU)副产物。然后通过将反应混合物滴加到搅拌的乙醚-乙酸乙酯溶液中将化合物24分离和纯化。将所得的由未衍生化的离子液体1和所需产物24组成的沉淀溶解于氯仿中，并用水萃取。由于在胸苷的5’位连接的单甲氧基三苯甲基的疏水性，用水相将离子液体1移除，同时将所需的产物24保留在有机相中。虽然在这里使用5’-单甲氧基三苯甲基(MMT)胸苷衍生物，但在此步骤中更普遍使用的5’-二甲氧基三苯甲基(DMT)胸苷衍生物可以被容易地取代。移除溶剂以合理的产率得到离子液体衍生的核苷24。通过1H NMR和电喷雾离子化质谱(ESI-MS)确证24的结构。
通过加入3％的三氟乙酸的乙腈溶液并在室温下搅拌20分钟实现化合物24的去三苯甲基化。通过向搅拌的乙醚-乙酸乙酯溶液中滴加反应混合物并收集沉淀将产物快速分离并纯化。有时需要在酸溶液中再次溶解且第二次沉淀以完成去保护并完全移除残余的三苯甲醇。得到浅褐色泡沫状的化合物25，产率96％，通过1H NMR和ESI-MS验证它的结构和纯度。
Figure S2006800168129D00181
a)吡啶、DMAP、琥珀酸酐，室温下2天，b)DCC、DMAP、乙腈，室温下3大，c)3％三氟乙酸的二氯甲烷或乙腈溶液。
使用4，5-二氰基咪唑(DCI)作为活化剂，通过将离子液体支载的核苷25与1.5倍过量的适当亚磷酰胺衍生物(26a-d)在THF或乙腈中反应并搅拌1-2小时，以250μmol的量制备二核苷磷酸三酯ApT、CpT、GpT和TpT(27a-d)49(图解6)。反应完成后，通过加入过量的无水乙醇并进一步搅拌10分钟使过量的活性的亚磷酰胺猝灭。猝灭亚磷酰胺促进了它们在纯化中的移除。然后在氧化前，室温下通过从乙酸乙酯∶乙醚(1∶9)中沉淀，将二核苷亚磷酸三酯中间体简单地分离。发现在乙酸乙酯/醚中猝灭的过量的单核苷3’-O-亚磷酰胺与偶联的产物相比有高得多的溶解度，因此使它可能从二核苷亚磷酸三酯中移除。一般，为了提高所需产物的纯度，使用乙腈或甲醇将沉淀在过滤器外直接溶解并再次从1∶9的乙酸乙酯∶乙醚中沉淀。
为进行亚磷酸三酯中间体的氧化反应，将收集的沉淀再次溶解在少量的乙腈中，然后加入少量过量的吡啶和大量过量的0.1M碘的2∶1的四氢呋喃(THF)∶水溶液。一旦持续产生颜色(由于碘)，加入亚硫酸氢钠水溶液(5％)以还原过量的碘。然后用氯仿稀释反应混合物并用水萃取。水层包括得到的盐(NaI、Na2SO4、过量的亚硫酸氢盐、碘化吡啶等)以及由于缺少末端三苯甲基而使其有水溶性的任何未偶联的离子液体负载的核苷(酸)。减压下除去有机溶剂得到浅褐色泡沫状产物(27a-d)，高产率(表4)且高纯度，消除了对加帽步骤的需要。通过加入3％的三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷或乙腈溶液同时搅拌20分钟并在乙酸乙酯∶乙醚(1∶9)中沉淀，实现27a-d的去三苯甲基化。这时所得物料可能含有由此步骤中(ROH+DMT+＝DMT-OR)建立的平衡而产生的最高5％的三苯甲基化的起始物料。用乙醇猝灭以捕获DMT的阳离子似乎不能消除此问题。然而，如果反复用TFA处理(即在3％的三氟乙酸溶液中再次溶解，然后第二次沉淀)，纯度明显提高(在大量产物中通过低分辨的ESI-MS观察不到三苯甲基化的产物)。将纯化的产物简单滤出，以高产率得到白色到浅黄色的粉末状固体(表4)。将收集的固体(28a-d)准备用于另一轮的偶联，或如果所需序列完成，则去保护基。
Figure S2006800168129D00191
图解6
除了上述二聚体28a-d，还以50-100μmol的量合成了胸苷三聚体(29，30)和四聚体(31，32)。通过31P-NMR和低分辨和高分辨的ESI-MS确证了离子液体支载的化合物的同一性(表4)。对于二聚体类的31P NMR数据(表4)显示出对应于两个可能的Rp和Sp非对映异构体磷酸三酯的两个信号。当除去β-氰乙基磷酸(β-cyanoethyl phosphate)保护基时，核苷酸间键合变为无手性的且观察到单一信号。同样，当仍连接有三苯甲基保护基时，对三聚体类的31PNMR数据(表4)显示出8个信号(4个非对映异构体各显示2个信号)。一旦将三苯甲基移除，就不再能分辨出这些信号。对于四聚体也是这样，其中可预期的非对映异构体的数量是8(23×3＝24个峰)。事实上分离的化合物作为非对映异构体对的存在也使1H NMR峰的确定复杂化。然而，使用31P调整的CIGAR实验，使能够观察到所预期的通过磷酸三酯键的3’-5’连接50。
表4
         离子液体支载的寡核苷酸的回收率和物理数据
    化合物   序列     ％回收率   31P NMR(ppm)    m/z(实验值)     m/z(计算值)
    27a   DMTApT     89   -1.324，-1.477    1223.4     1223.4
    27b   DMTCpT     91   -1.545，-1.754    1199.4     1199.4
    27c   DMTGpT     90   -1.149，-1.194    1205.6     1205.4
    27d   DMTTpT     91   -1.494，-1.584    1110.4     1110.4
    28a   HOApT     93   -1.176，-1.516    921.4     921.3
    28b   HOCpT     95   -1.381，-1.613    897.3     897.3
    28c   HOGpT     96   -1.047，-1.064    903.4     903.3
    28d   HOTpT     78   -1.188，-1.284    808.3     808.3
    29   DMTTpTpT     92   -1.081至-1.477    1467.5     1467.8
    30   HOTpTpT     98   -1.157至-1.531    1165.2     1165.3
    31   DMTTpTpTpT     89   -1.169至-1.859    1824.2     1824.5
    32   HOTpTpTpT     100   -1.142至-1.51    1522.4     1522.4
将上述合成的寡核苷酸与在通常使用的固体载体，可控孔度玻璃(CPG：规格1μmol)上合成的那些相比，使用相同的序列且两个系统平行去保护。通过使用浓氢氧化铵/乙醇在室温下处理48小时或在60℃下处理16小时，实现所需寡核苷酸的完全去保护。这些条件确保氰基乙基保护基、离子液体部分、碱基(Ade、Cyt和Gua)环外氨基的任何保护基和单琥珀酸连接基的完全去除。通过在真空下移除乙醇和氢氧化铵溶液，再溶解于水中(通过离心CPG负载的寡聚体简单沉降固体载体)分离寡核苷酸，然后通过离子对反相HPLC、离子交换HPLC或聚丙稀酰胺凝胶电泳进行色谱纯化。通过LCMS将ILSS方法的产物与通过标准基因仪合成技术得到的那些比较。图7表示在离子液体(IL)载体上增长的寡聚体和在CPG上增长的寡聚体的比较。
LCMS数据总结在下表5中。
表5
                         去保护的寡核苷酸的HPLC/MS分析
序列 合成的载体 保留时间(min) ％总面积     低分辨MS(-ve mode)
    ApT     IL     26.3     93.8     554.2
    CPG     26.3     96.1     554.2
    CpT     IL     16.7     87.8     530.2
CPG     16.8     89.5     530.2
    GpT     IL     19.0     89.1     570.2
CPG     18.9     95.1     570.2
TpT     IL     25.3     88.1     545.2
    CPG     25.3     92.5     545.2
    TpTpT     IL     29.9     92.1     849.1
CPG 29.5     94.0     849.2
    TpTpTpT     IL     32.4     85.5     1153.2
CPG     31.9     90.5     1153.2
在所有情况下，IL产生的寡核苷酸物质的保留时间与CPG产生的寡聚体的保留时间有很好的相关性。IL寡聚体的主峰的面积百分比总是比CPG得到的寡聚体的面积百分比高几个百分点。然而，这是离子液体本身(保留时间11.2min；λmax 217nm)在用于监测寡聚体的波长处的弱吸收引起的误解。忽略由于离子液体的峰的面积使IL产生的寡聚体的值与CPG上合成的寡聚体的值相符。在一些HPLC记录仪上的谱图上可见的胸苷来自于在加帽步骤开始以前，固体载体的不完全偶联或部分去三苯甲基化，且在大约19分钟洗脱出来。虽然通常存在于CPG上合成的物质中，但是氧化后提取将该物质从IL作为媒介而产生的产物中大量移除(图1)。如上所述，在三聚体和四聚体(所谓的“n-1”峰)中的错误序列的存在可能不是由于不完全的偶联而是由于偶联以前的不完全的去三苯甲基化。在提取中该物质不会被移除，且在偶联后的去三苯甲基化后将被去封闭(deblock)(即三聚体合成后，去三苯甲基化会产生所需的三聚体和不希望的来自于先前步骤的二聚体)。因此在每次偶联步骤之前确保完全的去三苯甲基化是重要的。
实验
总述。除非另有说明所有试剂都是市售的且使用时没有进一步纯化。溶剂是试剂级的，且视需要通过标准方法干燥。除有特殊说明，反应在无水条件下进行，且通过在硅胶60F-254聚酯基片(厚度250μm)上的薄层色谱法(TLC)监测反应，紫外光下(254nm)检测或用高锰酸钾水溶液炭化(charring)。20℃下在Varian Mercury-300(300MHz)或Mercury-400(400MHz)波谱仪上记录1H NMR和13C NMR波谱(寡肽合成)。在装配有Sun工作站的Unity500、Varian Mercury400和Varian Mercury300波谱仪上记录1H和13C NMR、HMQC NMR、COSY NMR波谱(寡糖合成)。以δ值即百万分之几报道化学位移，参考下列残余溶剂的的δ值为：对于1H NMRCHCl3 7.24ppm，H2O4.67ppm，丙酮2.06或甲醇3.30，且对于13C NMRCHCl3 77.0ppm，甲醇49.0ppm和丙酮29.8ppm。通过标准gHMQC和gCOSY实验得到质子和碳的分布。通过没有校正温度计的熔点议测得熔点。在KRATOS MS25RFA质谱议上记录电喷雾离子化(ESI)质谱。在VG MICROMASS ZAB 2F HS波谱议(FAB)上进行高分辨质谱分析。以带有IonSpec 7.0 tesla FTMS(用聚乙二醇300、600和1000校准)的正离子电喷雾方式进行寡核苷酸的高分辨质谱检测。使用DIP-140(JASCO)数字旋光议检测旋光性。使用Diacel Chiralcel OD-H、OD-J手性分析柱(2-丙醇的己烷溶液作为洗脱液)和Zorbax SB-CN半制备柱(CH3CN/H2O/TFA作为洗脱体系)，通过分析HPLC测定外消旋程度和终产物的纯度。
寡核苷酸的合成、纯化和同一性确证。将寡核苷酸从它们各自的载体上切下后，使用反相高效液相色谱(HPLC)纯化寡核苷酸。使用加热到60℃的Polymerex 10μ RP-1柱(Phenomenex，10mm×250mm，10μ packing)进行分离，使用Waters 1525二元HPLC泵产生流动相流速为1mL/min。初始流动相由100mM乙酸三乙铵缓冲液(pH7.0，80∶20(v/v)水∶甲醇)恒溶剂流组成(2分钟)，然后将梯度改变为100mM三乙铵乙酸酯缓冲液(pH7.0，70∶30(v/v)水∶甲醇)35分钟，然后恒溶剂流洗脱1分钟，然后将梯度变回初始条件14分钟，且最后恒溶剂流洗脱5分钟。在Waters 2487二重吸收检测器(260nm和217nm)上监测洗脱。收集洗脱峰部分并在真空下除去流动相。将样品再溶解于10％甲醇-水中，且随后在ThermoQuest Finnigan LCQ Duo质谱议上以负离子方式通过低分辨电喷雾离子化质谱检测分子量。在500长链烷基胺衍生可控多孔度玻璃(LCAA-CPG)上使用上述Applied Biosystems 3400 DNA/RNA合成器使用标准条件6，以1μmol的量进行寡核苷酸的固相合成。
酯化(负载)步骤。向离子液体1(1.07g，5mmol)、Boc-亮氨酸(L-或D-型2.31g，10mmol)和二甲基氨基吡啶(0.25g，2mmol)在无水乙腈(25mL)中的混合物中加入二环己基碳二亚胺(DCC，1M的CH2Cl2溶液，10mL，10mmol)。在室温下，氮气氛中将混合物剧烈搅拌18h，并通过CeliteTM填料过滤。用乙腈冲洗CeliteTM填料并在真空下浓缩合并的有机相。首先用乙醚(20mL×3)洗涤粗残余物，然后将其溶解在CH2Cl2中并用2M的HCl(10mL×3)洗涤。用Na2SO4干燥有机相并浓缩得到离子液体支载的淡黄色油状的Boc-亮氨酸2a(L-型异构体)或2b(D-型异构体)1.95g(91％)。1H NMR(300MHz，丙酮-d6)δ9.08(s，1H)、7.80(s，1H)、7.71(s，1H)、6.41(d，br，J＝7.8Hz，1H)、4.66-4.64(m，2H)、4.60-4.43(m，2H)、4.20-4.13(m，1H)、4.04(s，3H)、1.68-1.53(m，3H)、1.39(s，9H)、0.91(d，J＝6.0Hz，3H)、0.89(d，J＝6.0Hz，3H)；13C NMR(100MHz，丙酮-d6)δ173.2、156.4、138.0、124.4、123.6、79.3、63.4、53.0、49.3、40.7、36.6、28.5(3C)，25.4，23.1，21.6；HRMS(FAB)对于C17H30N3O4(M+)计算值340.2237，实测值340.2236。
肽的形成；偶联和去保护步骤。向离子液体支载的Boc-肽(2mmol)的CH2Cl2溶液中(10mL)加入TFA(10mL)。在室温氮气氛下搅拌反应混合物0.5h。减压浓缩后，将残余物用乙醚洗涤两次并在真空下干燥，得到去保护离子液体支载的肽TFA盐。然后将残余物与下一个Boc-保护的氨基酸(3mmol)和PyBOP(3mmol)一起溶解在CH3CN(35mL)。滴加入DIPEA(6mmol)并将所得反应混合物在35℃氮气氛下搅拌8h。真空下移除溶剂并首先用乙醚(20mL×3)洗涤残余物，然后将其溶解于CH2Cl2中并用水(10mL×3)洗涤。用Na2SO4干燥有机相并浓缩得到离子液体支载的Boc-肽(产率90％)，其纯度足够直接用于下一周期的肽合成。视需要，通过将化合物溶解于丙酮中、通过小型硅胶填料过滤并蒸发溶剂，可以进一步纯化产物。
离子液体支载的亮氨酸TFA盐3a：1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ9.20(s，0.55H)、9.12(s，0.45H)、7.85(s，1H)、7.68(s，1H)、5.02-4.98(m，0.45H)、4.75-4.58(m，4H)、4.27-4.25(m，0.55H)、4.05(s，3H)、1.90-1.87(m，2H)、1.73-1.70(m，1H)、0.95(d，J＝6.0Hz，3H)、0.93(d，J＝6.0Hz，3H)；13C NMR(100MHz，丙酮-d6)δ 169.4(0.55C)、167.7(0.45C)、138.0(0.55C)、137.8(0.45C)、124.4、123.6(0.45C)、123.5(0.55C)、65.1(0.45C)、64.9(0.55C)、52.2、48.9、39.8 (0.55C)、39.4(0.45C)、36.4、25.1(0.45C)、24.8(0.55C)、22.7(0.45C)、22.3(0.55C)、22.1(0.55C)、21.6(0.45C)；HRMS(FAB)对于C24H44N6O4BF4(2M++BF4 -)计算值567.3450，实测值567.3453。
离子液体支载的Leu-Boc-苯丙氨酸4a：泡沫状淡黄色固体；1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ9.04(s，1H)、7.81(s，1H)、7.70(s，1H)、7.67(d，br，J＝6.8Hz，1H)、7.29-7.20(m，5H)、6.20(d，br，J＝8.0Hz，1H)、4.69-4.66(m，2H)、4.64-4.52(m，2H)、4.44-4.37(m，2H)、4.08(s，3H)、3.19-2.91(m，2H)、1.72-1.58(m，3H)、1.35(s，9H)、0.92(d，J＝6.0Hz，3H)、0.89(d，J＝6.0Hz，3H)；13CNMR(100MHz，丙酮-d6)δ172.9、172.4、156.5、138.2、132.6、129.9(2C)、128.8(2C)、127.0、124.5、123.5、79.4、63.4、56.6、51.6、49.4、40.4、38.3、36.7、28.4(3C)、25.2、23.2、21.6；HRMS(FAB)对于C26H39N4O5(M+)计算值487.2920，实测值487.2920。用三氟乙酸处理得到离子液体支载的Leu-苯丙氨酸TFA盐6：1H NMR(300MHz，丙酮-d6)δ9.33(s，br，0.6H)、9.25(s，br，0.4H)、7.87(s，br，1H)、7.72(s，br，0.6H)、7.67(s，br，0.4H)、7.28-7.25(m，5H)、5.38-5.33(m，0.4H)、4.70-4.50(m，4H)、4.40-4.34(m，1.6H)、4.07(s，1.8H)、4.00(s，1.2H)、3.55-3.26(m，2H)、1.82-1.70(m，2H)、1.58-1.53(m，1H)、0.92(d，J＝6.0Hz，3H)、0.87(d，J＝6.0Hz，3H)；13C NMR(75MHz，丙酮-d6)δ172.2、172.0、138.7(0.6C)、138.5(0.4C)、136.5(0.6C)、135.6(0.4C)、130.5(0.8C)、130.4(1.2C)、129.3(1.2C)、129.2(0.8C)、128.0(0.6C)、127.9(0.4C)、124.5、123.6(0.4C)、123.5(0.6C)、63.6(0.4C)、63.5(0.6C)、54.9、52.1(0.6C)、52.0(0.4C)、49.5(0.6C)、49.4(0.4C)、40.3(0.4C)、39.9(0.6C)、38.2(0.6C)、37.4(0.4C)、36.6、25.2(0.6C)、25.1(0.4C)、23.1、21.6(0.4C)、21.5(0.6C)；HRMS(FAB)对于C21H31N4O3(M+)计算值387.2395，实测值387.2396。
离子液体支载的Leu-Phe-Boc-甘氨酸7：泡沫状淡黄色固体；1H NMR(300MHz，丙酮-d6)δ9.04(s，1H)、7.78(t，J＝1.8Hz，1H)、7.66(t，J＝1.8Hz，1H)、7.62(d，J＝7.5Hz，1H)、7.55(d，J＝8.1Hz，1H)、7.30-7.18(m，5H)、6.46(m，1H)、4.73-4.65(m，3H)、4.54-4.51(m，2H)、4.45-4.38(m，1H)、4.06(s，3H)、3.78-3.61(m，2H)、3.24-3.00(m，2H)、1.71-1.56(m，3H)、1.39(s，9H)、0.90(d，J＝6.0Hz，3H)、0.88(d，J＝6.0Hz，3H)；13C NMR(75MHz，丙酮-d6)δ171.7(2C)、170.3、156.7、137.7、137.5、129.4(2C)、128.6(2C)、126.8、124.1、123.0、79.3、63.1、54.9、51.3、48.9、44.4、39.9、37.4、36.2、28.0(3C)、24.7、22.7、21.2；HRMS(FAB)对于C28H42N5O6(M+)实验值544.3134，实测值544.3135。用三氟乙酸处理得到离子液体支载的Leu-Phe-甘氨酸盐8：1H NMR(300MHz，丙酮-d6)δ9.13(s，1H)、7.80(s，1H)、7.68(s，1H)、7.32-7.20(m，5H)、4.66-4.50(m，7H)、4.41-4.39(m，1H)、4.06(s，3H)、3.25-2.96(m，2H)、1.77-1.68(m，2H)、1.59-1.54(m，1H)、0.92(d，J＝6.0Hz，3H)、0.87(d，J＝6.0Hz，3H)；13C NMR(75MHz，丙酮-d6)δ172.4、172.3、172.2、138.4(0.5C)、138.3(0.5C)、138.2(0.5C)、138.0(0.5C)、130.0(2C)、128.94(1C)、128.91(1C)、127.22(0.5C)、127.17(0.5C)、124.57(0.5C)、124.54(0.5C)、123.44(0.5C)、123.40(0.5C)、63.4、56.8(0.5C)、56.6(0.5C)、51.6(0.5C)、51.5(0.5C)、49.5(0.5C)、49.3(0.5C)、42.8、39.9(0.5C)、39.8(0.5C)、38.4(0.5C)、38.3(0.5C)、36.6、25.2(0.5C)、25.16(0.5C)、23.17(0.5C)、23.15(0.5C)、21.5(0.5C)、21.4(0.5C)；HRMS(FAB)对于C23H34N5O4(M+)计算值444.2609，实测值444.2611。
离子液体支载的Leu-Phe-Gly-Boc-甘氨酸9：泡沫状淡黄色固体；1HNMR(300MHz，丙酮-d6)δ9.09(s，1H)、8.12(m，br，1H)、7.80(t，J＝1.8Hz，1H)、7.68(t，J＝1.8Hz，1H)、7.64(m，1H)、7.61(m，1H)、7.30-7.21(m，5H)、6.57(m，1H)、4.76-4.59(m，3H)、4.54-4.51(m，2H)、4.40-4.33(m，1H)、4.08(s，3H)、3.82-3.75(m，4H)、3.33-2.95(m，2H)、1.89-1.55(m，3H)、1.43(s，9H)、0.94(d，J＝6.0Hz，3H)、0.89(d，J＝6.0Hz，3H)；13C NMR(100MHz，丙酮-d6)δ171.9、171.8、171.6、169.8、156.9、138.0、137.8、129.1(2C)、128.6(2C)、126.7、124.1、123.0、79.4、63.1、55.6、51.4、48.9、44.6、43.8、39.9、37.3、36.3、28.2(3C)、24.7、22.9、21.2；HRMS(FAB)对于C30H45N6O7(M+)计算值601.3348，实测值601.3350。用三氟乙酸处理得到离子液体支载的Leu-Phe-Gly-甘氨酸TFA盐10：1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ9.10(s，1H)、7.81(s，1H)、7.70(s，1H)、7.28-7.20(m，5H)、4.75-4.67(m，5H)、4.58-4.50(m，2H)、4.43-4.38(m，1H)、4.08(s，3H)、3.89-2.87(m，2H)、3.23-3.04(m，2H)、1.65-1.58(m，3H)、0.92(d，J＝6.0Hz，3H)、0.87(d，J＝6.0Hz，3H)；13C NMR(100MHz，丙酮-d6)δ171.9、171.7、137.9、129.4、129.3(2C)、128.4(2C)、126.7、124.0、123.0、63.0、55.8、50.8、49.3、48.9、43.5、39.7、37.3、36.3、24.8、22.7、21.2；HRMS(FAB)对于C25H37N6O5(M+)计算值501.2826，实测值501.2825。
离子液体支载的Leu-Phe-Gly-Gly-Boc-酪氨酸11：泡沫状淡黄色固体；1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ9.08(s，1H)、8.21(s，br，1H)、8.07(s，br，1H)、7.80(s，1H)、7.68(d，J＝7.2Hz，1H)、7.67(s，1H)、7.56(d，J＝7.2Hz，1H)、7.34-7.20(m，5H)、7.15(d，J＝8.0Hz，2H)、6.90(d，J＝8.0Hz，2H)、6.49(d，J＝7.2Hz，1H)、4.76-4.56(m，3H)、4.54-4.51(m，2H)、4.40-4.33(m，2H)、4.08(s，3H)、3.96-3.66(m，4H)、3.31-2.91(m，4H)、1.85-1.70(m，2H)、1.62-1.55(m，1H)、1.36(s，9H)、1.30(s，9H)、0.94(d，J＝6.0Hz，3H)、0.89(d，J＝6.0Hz，3H)；13C NMR(100MHz，丙酮-d6)δ174.0、171.9、171.7、171.3、169.8、156.4、154.5、138.1、137.8、132.2、129.9(2C)、129.3(2C)、128.6(2C)、126.7、124.1、124.0(2C)、122.9、79.6、77.9、63.2、57.2、56.0、51.4、48.5、44.0、43.8、39.8、37.4、37.0、36.3、28.6(3C)、28.1(3C)、24.8、22.9、21.2；HRMS(FAB)对于C43H62N7O9(M+)计算值820.4605，实测值820.4609。
测定在负载和形成肽步骤中的外消旋度(视需要)。
制备离子液体支载的Leu-Phe-Boc 4a-d：使用上述的一般方法，将离子液体支载的亮氨酸2a-b(L型和D型对映异构体)与Boc-L-苯丙氨酸和Boc-DL-苯丙氨酸反应制备4a-d。4a：L，L-差向异构体，4b：D，L-差向异构体，4c：L，DL-差向异构体，和4d：D，DL-差向异构体。
N-(叔丁氧基羰基)-苯丙氨酸-亮氨酸甲酯5a-d：将上述步骤得到的4a(0.1mmol)溶解于氨饱和的甲醇(2mL)中。然后将所得溶液在室温下搅拌过夜。减压下移除溶剂后，通过快速柱色谱(硅胶230-400目，己烷-乙酸乙酯梯度洗脱)纯化残余物得到二肽产物MeO-Leu(L)-Phe(L)-Boc 5a-(L，L)。用相同的方法也制备二肽MeO-Leu(D)-Phe(L)-Boc 5b-(D，L)、MeO-Leu(L)-Phe(DL)-Boc 5c-(L，DL)和MeO-Leu(D)-Phe(DL)-Boc5d-(D，DL)。HPLC分析：Diacel Chiralcel OD-H柱，5％异丙醇的己烷溶液，0.5mL/min，λ＝220nm，tR(L，L-差向异构体)：13.3min，tR(D，L-差向异构体)：13.4min；tR(L，D-差向异构体)：15.7min；tR(D，D-差向异构体)：22.2min；Diacel Chiralcel OD-J柱，5％异丙醇的己烷溶液，0.3mL/min，λ＝220nm，tR(L，L-差向异构体)：16.0min，tR(D，L-差向异构体)：17.4min。
MeO-Leu(L)-Phe(L)-Boc 5a-(L，L)51：白色固体，m.p.101-103℃(lit.17：m.p.101-104℃)。1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ7.52(d，J＝7.6Hz，1H)、7.26-7.18(m，5H)、6.07(d，J＝8.0Hz，1H)、4.56-4.50(m，1H)、4.42-4.38(m，1H)、3.68(s，3H)、3.20-2.88(m，2H)、1.75-1.68(m，1H)、1.62-1.58(m，2H)、1.35(s，9H)、0.92(d，J＝6.4Hz，3H)、0.91(d，J＝6.4Hz，3H)。HPLC分析表明没有可检测量的D，L-差向异构体、L，D-差向异构体和D，D-差向异构体。
MeO-Leu(D)-Phe(L)-Boc 5b-(D，L)51：无色晶体，m.p.136-138℃。1HNMR(400MHz，丙酮-d6)δ7.44(d，J＝7.2Hz，1H)、7.28-7.18(m，5H)、6.06(d，J＝8.0Hz，1H)、4.48-4.42(m，1H)、4.41-4.35(m，1H)、3.66(s，3H)、3.11-2.93(m，2H)、1.55-1.52(m，3H)、1.36(s，9H)、0.88(d，J＝6.4Hz，3H)、0.87(d，J＝6.4Hz，3H)。HPLC分析表明没有可检测量的L，L-差向异构体、L，D-差向异构体和D，D-差向异构体。
肽的释放(切下)步骤。向离子液体支载的五肽11(180mg，0.2 mmol)的THF/H2O(1∶2，v/v，3.0mL)溶液中加入1M NaOH水溶液(0.2mL)。将混合物在室温下搅拌5h。减压下移除挥发性成分并将残余溶液酸化到pH5-6。用蒸馏水洗涤沉淀两次并减压干燥得到120mg(85％)的Boc-五肽12，泡沫状淡黄色固体。1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ8.01(s，br，1H)、7.80(s，br，1H)、7.65(d，J＝6.8Hz，2H)、7.30-7.15(m，5H)、7.17(d，J＝8.0Hz，2H)、6.89(d，J＝8.0Hz，2H)、6.43(d，J＝7.2Hz，1H)、4.76-4.74(m，1H)、4.52-4.47(m，1H)、4.42-4.39(m，1H)、4.01-3.74(m，4H)、3.28-2.90(m，4H)、1.79-1.65(m，3H)、1.35(s，9H)、1.30(s，9H)、0.94(d，J＝6.0Hz，3H)、0.92(d，J＝6.0Hz，3H)；13C NMR(100MHz，丙酮-d6)δ173.5、173.2、171.4、170.0、169.0、156.1、154.3、138.0、132.6、130.0(2C)、129.6(2C)、128.4(2C)、126.5、124.0(2C)、79.2、77.8、56.8、54.9、51.1、43.5、43.1、40.8、37.9、37.3、28.7(3C)、28.2(3C)、25.0、23.0、21.5；HRMS(FAB)对于C37H53N5O9Na(M+Na)计算值734.3741，实测值734.3742。
将Boc-五肽12(117mg，0.16mmol)溶解于CH2Cl2(1.5mL)，然后加入TFA(1.5mL)和几滴苯甲醚。在环境温度氮气氛下将反应混合物搅拌0.5h。蒸发并用乙醚洗涤得到Leu5-脑啡肽的TFA盐14(109mg，99％)，淡黄色固体，m.p.148-152℃(可信样品m.p.150-153℃)；[α]20 D＝25.0(c0.8，95％AcOH)，可信样品[α]20 D＝25.6(c0.9，95％AcOH)；HPLC tR＝16.0min，(可信样品tR＝15.7min)，Agilent Zorbax SB-CN半制备柱；洗脱液，0-5min，H2O-0.05％TFA(v/v)、6-15min，0-60％CH3CN/H2O-0.05％TFA(v/v/v)、16-23min，60-100％CH3CN/H2O-0.05％TFA(v/v/v)；后时间(post time)，7min；流速，3.0ml/min；1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ7.24-7.21(m，4H)、7.18-7.15(m，1H)、7.08(d，J＝8.4Hz，2H)、6.77(d，J＝8.4Hz，2H)、4.71-4.67(m，1H)、4.42-4.39(m，1H)、4.07(t，J＝7.2Hz，1H)、3.96-3.72(m，4H)、3.19-2.92(m，4H)、1.71-1.61(m，3H)、0.94(d，J＝6.0Hz，3H)、0.90(d，J＝6.0Hz，3H)；13CNMR(100MHz，甲醇-d6)δ175.1、173.1、171.0、170.6、170.4、158.0、138.0、131.3(2C)、130.2(2C)、129.2(2C)、127.5、125.8、116.8(2C)、56.2、55.6、52.3、43.9、43.4、41.7、39.0、37.7、26.0、23.2、22.0；HRMS(FAB)对于C28H37N5O7Na(M+Na)计算值578.2592，实测值578.2591。
苯基2，3，4-三-O-苄基-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷(15)：向装有苯基2，3，4-三-O-苄基-6-O-三甲基乙酰基-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷(3.02g，4.82mmol)的烧瓶中加入NaOCH3/HOCH3溶液(50mL)和CH2Cl2(15mL)(pH＝13)。在室温下搅拌该溶液48小时，蒸发除去溶剂并在真空中干燥。将无水CH2Cl2加入到粗产物残余物中并通过装有过滤试剂CeliteTM 521的布氏漏斗过滤出不溶性盐。收集滤液并通过旋转蒸发除去溶剂并在真空中干燥以得到白色固体产物(2.61g，产率100％)；m.p.127～129℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ7.5l(m，2H)、7.40-7.27(m，18H)、4.94-4.85(m，4H)、4.77(d，J＝10Hz，1H)、4.73(d，J＝9.6Hz，1H)、4.66(d，J＝10.8Hz，1H)、3.89(dd，J＝2.8Hz，14.8Hz，H6a，1H)、3.77-3.69 (m，2H)、3.59(t，J＝8.8Hz，1H)、3.50(t，J＝8.8Hz，1H)、3.40(m，1H)；13C NMR (400MHz，CDCl3)，δ138.49、138.09、138.02、133.67、132.06、129.25、128.73-127.89(m)、87.82、86.84、81.41、79.61、77.90、76.13、75.85、75.43、62.48；ESI-MS，对于C33H34SO5(M+Na+)：计算值m/z＝565，实测值565。
苯基2，3，4-三-O-苄基-6-O-溴代乙酰基-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷(16a)：向苯基2，3，4-三-O-苄基-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷(15)(0.988g，1.82mmol)和溴代乙酸(0.308g，2.21mmol)的CH2Cl2(40mL)溶液中加入1.0M的DCC(2.20mL，2.20mmol)的CH2Cl2溶液和小量的DMAP(对于糖＜5％当量)。在室温下搅拌2小时后，将混合物过滤以除去副产物1，3-二环己基脲。将滤液蒸发至干并将残余物进行快速柱色谱分离(硅胶60A，230-400目)，使用己烷和乙酸乙酯(7∶1，V/V)作为洗脱液，得到纯产物(1.08g，产率89％)；m.p.85～87℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ7.54(m，2H)、7.41-7.25(m，18H)、4.95-4.84(m，4H)、4.75(d，J＝10Hz，1H)、4.67(d，J＝9.6Hz，1H)、4.61(d，J＝10.8Hz，1H)、4.45(dd，J＝11.2Hz，0.8Hz，1H)、4.28(m，1H)、3.79s，2H)、3.73(m，1H)、3.55(m，2H)、3.51(t，J＝18.4Hz，1H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)、δ166.91、138.29、138.02、137.70、133.51、132.39、129.14、128.76-127.94(m)、87.81、86.96、81.06、77.49、77.36、76.19、75.79、75.38、65.07、25.90；ESI-MS，对于C35H35SO6Br(M+Na+)：计算值m/z＝685，实测值685。
苯基2，3，4-三-O-苄基-6-O-[2-(3-甲基-咪唑)]乙酰基-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷四氟硼酸盐(16b)：向苯基2，3，4-三-O-苄基-6-O-溴代乙酰基-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷(16a)(0.890g，1.34mmol)的丙酮(25mL)溶液中加入1.0M的1-甲基咪唑(1.61mL，1.61mmol)的CH2Cl2溶液并且然后加入NaBF4(0.182g，1.66mmol)。在室温下搅拌72小时后，滤除沉淀并将滤液蒸发至干且在真空中干燥过夜。用乙醚(15mL)洗涤产物残留物3次并弃去上层溶剂。在真空中干燥固体并加入15mL无水CH2Cl2进一步纯化残余物且然后滤出沉淀。将滤液蒸发至干并在真空中干燥以得到白色泡沫的纯产物(0.989g，产率98％)；m.p.42～44℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ8.74(s，1H)、7.46(m，2H)、7.36-7.23(m，18H)、7.17(m，2H)、5.01-4.82(m，6H)、4.72(d，J＝10.0Hz，1H)、4.71(d，J＝9.6Hz，1H)、4.58(d，J＝11.2Hz，1H)、4.50(dd，J＝11.6Hz，2.4Hz，1H)、4.24(dd，J＝6.4Hz，12Hz，1H)、3.82(s，3H)、3.73(m，1H)、3.58(m，1H)、3.52-3.43(m，2H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)，δ165.90、138.33、138.07、138.02、137.83、133.65、131.58、129.37、128.76-127.92(m)、123.69、123.25、87.41、86.79、81.02、77.53、76.74、76.01、75.70、75.15、65.51、50.03、36.81；ESI-MS对于C39H41SO6N2(M+)阳离子：计算值m/z＝665，实测值665。
苯基2，3，4-三-O-苄基-6-O-[2-(3-甲基-咪唑)]乙酰基-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖基亚砜四氟硼酸盐(17b)：在-78℃下，向16b(50.0mg，0.066mmol)的CH2Cl2(2mL)溶液中，用5分钟滴加入间-氯过氧苯甲酸(m-CPBA)(15.0mg，0.066mmol)的CH2Cl2(1mL)溶液。在-78℃下搅拌20分钟后，将混合物倒入NaHCO3的饱和水溶液(10mL)和15mL的CH2Cl2中。分离有机相，用NaHCO3的饱和水溶液(10mL)洗涤并通过无水Na2SO4干燥。真空下通过旋转蒸发除去溶剂。通过使用己烷和异丙醚洗涤进一步纯化产物残余物(以TLC监测)以得到白色固体的糖基亚砜，其包括两种非对映体(49.5mg；产率97％；以NMR检测两种非对映异构体的比例为60∶40)。1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ9.08(s，1H)、7.54(m，2H)、7.40-7.16(m，20H)、5.11-4.20(m，11H)、3.97(m，2H)、3.91(s，2H)、3.90(s，1H)、3.85-3.26(m，2H)；ESI-MS对于C39H41SO7N2(M+)阳离子：计算值m/z＝681，实测值681。
苯基2，3，4-三-O-苄基-6-O-[2-(3-甲基-咪唑)]乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-2，3，4-三-O-苄基-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷四氟硼酸盐(18b)：在-78℃下，向连接离子液体的单糖亚砜17b(51.8mg，0.067mmol；糖基供体)、苯基2，3，4-三-O-苄基-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷(15，114mg，0.21mmol；糖基受体)和2，6-二-叔丁基-4-甲基吡啶(58.8mg，0.286mmol；酸清除剂)的CH2Cl2(5mL)溶液中，通过注射器用10分钟逐渐加入Tf2O(12μL，0.067mmol)。在-78℃搅拌20分钟后，用1小时将混合物缓慢温热至0℃。通过加入正戊烷(5mL)猝灭反应，出现白色沉淀。将混合物冷却倒-78℃，并通过离心迅速除去白色沉淀。向液相中加入另一部分的正戊烷(5mL)，然后冷却到-78℃。再次通过离心除去所得沉淀。蒸发液相，并用正戊烷洗涤残余物几次，且然后用异丙醚进一步洗涤直到TLC分析显示残余物为纯品。得到白色固体产物(39mg，产率50％)；m.p.45～47℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ9.10(s，1H)、7.51(m，2H)、7.41-7.13(m，35H)、5.10(d，J＝10.4Hz，1H)、5.00-4.52(m，15H)、4.41(m，1H)、4.19(dd，J＝12.4Hz，4.0Hz，1H)、3.99(t，J＝8.8Hz，1H)、3.90-3.75(m，6H)、3.73-3.62(m，2H)、3.55(m，2H)、3.42(t，J＝8.8Hz，1H)、3.29(t，1H)；13C NMR(400MHz，CDCl3)，δ＝165.79、138.78、138.60、138.41、138.38、138.20、138.11、138.03、134.18、131.78、129.32、128.73-127.69(m)、123.65、123.24、97.30、88.25、86.88、81.82、81.31、80.30、79.06、77.76、77.57、75.99、75.89、75.81、75.25、75.09、72.83、68.68、66.89、65.49、50.51、37.16；ESI-MS对于C66H69SO11N2(M+)阳离子：计算值m/z＝1097，实测值1097。
苯基2，3，4-三-O-苄基-6-O-[2-(3-甲基-咪唑)]乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-2，3，4-三-O-苄基-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖基亚砜四氟硼酸盐(19b)：向二糖硫化物18b(56.1mg，0.047mmol)的CH2Cl2(2.5mL)溶液中，于-78 ℃用5分钟滴加入间-氯过氧苯甲酸(m-CPBA)(8.1mg，0.047mmol)的CH2Cl2(1mL)溶液。在-78℃下，在氮气氛保护下搅拌20分钟后，将混合物倒入饱和NaHCO3水溶液(10mL)和CH2Cl2(15mL)中。分离有机相，再次用饱和NaHCO3水溶液(10mL)洗涤并通过无水Na2SO4干燥。真空中通过旋转蒸发除去溶剂。通过用己烷和异丙醚进一步纯化产物残余物(以TLC监测)，以得到所需的白色固体的糖基亚砜，其包括两种非对映异构体(54.0mg，产率95％，用NMR检测两种非对映异构体的比例为60∶40)。1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ9.48(s，1H)、7.58-7.13(m，37H)、5.00-4.40(m，18H)、3.95-3.25(m，13H)；ESI-MS对于C66H69SO12N2(M+)阳离子：计算值m/z＝1113，实测值1113。
苯基2，3，4-三-O-苄基-6-O-[2-(3-甲基-咪唑)]乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-2，3，4-三-O-苄基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-2，3，4-三-O-苄基-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷四氟硼酸盐(20b)：向连接离子液体的二糖亚砜(19b；45.1mg；0.038mmol；糖基供体)、苯基2，3，4-三-O-苯基-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷(15；62.1mg；0.114mmol；糖基受体)和2，6-二-叔丁基-4-甲基吡啶(30.8mg；0.150mmol；酸清除剂)的CH2Cl2(5mL)溶剂中，于-78℃下用10分钟通过注射器逐渐加入Tf2O(6μL，0.036mmol)。在-78℃下搅拌20分钟后，用1小时将混合物缓慢温热至0℃。通过加入正戊烷(5mL)猝灭反应混合物，结果出现白色沉淀。将反应混合物冷却到-78℃且通过离心立即移出沉淀。向液相中加入另一部分的正戊烷(5mL)，然后冷却到-78℃。再次通过离心移出沉淀。蒸发液相，且用正戊烷洗涤残余物几次，且然后用异丙醚进一步洗涤直到TLC分析表明残余物为纯品。得到白色固体的所需产物(34mg，产率56％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ9.04(s，1H)、7.51(m，2H)、7.42-7.17(m，48H)、7.05(d，J＝10.2Hz，2H)、5.00-4.50(m，25H)、4.39(d，J＝8.0Hz，1H)、4.15(m，1H)、4.00(m，2H)、3.89-3.72(m，6H)、3.70-3.30(m，8H)、3.25(t，J＝8.8Hz，1H)；13C NMR(400MHz，CDCl3)，δ165.77、138.95-138.09(m)、134.22、131.87、131.31、129.29、128.74-127.36(m)、123.72、123.76、123.01、103.91、97.47、97.26、88.33、87.74、86.85、84.88、82.66-80.14(m)、79.21、79.06、78.67、77.54、75.93-75.85(m)、75.22-75.00(m)、72.79、72.72、72.51、70.86、68.90、69.58、68.31、66.44、65.81、65.53、50.01、36.90；ESI-MS对于C93H97SO16N2(M+)阳离子：计算值m/z＝1529：实测值1529。
从20b上切下离子液体部分以得到三糖21：向装有连接离子液体的三糖(20b，30.0mg，0.018mmol)的烧瓶中加入Cs2CO3(6.1mg，0.018mmol)和甲醇(5mL)。在室温下搅拌12小时后，旋转蒸发除去溶剂且残余物在真空中干燥。向残余物中加入无水CH2Cl2(3mL)并将不溶性盐滤出。蒸发滤液至干并在真空中干燥以得到所需产物21(26.1mg，yield 100％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ7.54(m，2H)、7.43-7.14(m，48H)、5.16(d，J＝3.2Hz，1H)、5.00-4.93(m，3H)、4.91-4.86(m，4H)、4.85-4.74(m，5H)、4.71-4.53(m，9H)、4.40(d，J＝8.0Hz，1H)、4.12(d，J＝10.0Hz，1H)、3.99(m，2H)、3.86-3.38(m，12H)、3.26(m，1H)；13C NMR(400MHz，CDCl3)，δ138.94-138.22(m)、134.33、132.01、131.55、129.19、129.10、128.59-127.44(m)、103.91、97.54、97.31、88.31、87.79、86.93、84.81、82.62、81.95、81.85、81.75、81.44、81.33、80.73、80.63、80.49、79.23、79.00、78.12、77.91、77.75、77.51、75.95-75.80(m)、75.45-75.25(m)、72.75、72.61、72.57、71.24、68.65、66.02、65.52、62.30；ESI-MS对于C87H90SO15Na(M+Na+)：计算值m/z＝1429，实测值1429。
苯基2，3，4-三-O-苄基-6-O-乙酰基-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷(16c)：向苯基-2，3，4-三-O-苄基-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷(15，0.801g，1.48mmol)、无水吡啶(0.45mL)和DMAP(对于糖少于5％当量)的CH2Cl2(9mL)溶液中加入乙酸酐(0.21mL，2.22mmol)。在室温氮气氛保护下搅拌4小时后，将反应混合物转移到150mL的CH2Cl2中，分别用0.2M HCl水溶液(30mL)、H2O(30mL)、饱和NaHCO3水溶液(30mL)及然后盐水(30mL)洗涤。有机相用无水Na2SO4干燥，且通过旋转蒸发移除溶剂以产生粗产物残余物，将粗产物残余物进行快速柱色谱分离(硅胶60A，230-400目)，使用己烷和乙酸乙酯(5∶1，V/V)作为洗脱液，得到纯产物(0.845g，产率98％)；1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ7.55(m，2H)、7.40(m，2H)、7.36-7.25(m，16H)、4.95-4.84(m，4H)、4.75 (d，J＝10Hz，1H)、4.67(d，J＝9.6Hz，1H)、4.58(d，J＝10.8，1H)、4.37(d，J＝11.6Hz，1H)，4.22(m，1H)、3.73(t，J＝8.4Hz，1H)、3.55(m，2H)、3.50(t，J＝9.6Hz，1H)、2.11(s，3H)；ESI-MS对于C35H36SO6Na(M+Na+)：计算值m/z＝607，实测值607。
苯基-2，3，4-三-O-苄基-6-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基亚砜(17c)：向16c(1.01g，1.73mmol)的CH2Cl2(5mL)溶液中，于-78℃用5分钟滴加入间氯过氧苯甲酸(m-CPBA)(0.387g，1.73mmol)的CH2Cl2(7mL)溶液。在-78℃，氮气氛保护下搅拌20分钟后，将混合物倒入饱和NaHCO3水溶液(100mL)与CH2Cl2(50mL)中。分离有机相，再次用饱和NaHCO3溶液(50mL)洗涤，并用无水Na2SO4干燥。真空中旋转蒸发除去溶剂以得到粗产物残余物，将粗产物残余物进行快速柱色谱分离(硅胶60A，230-400目)，使用己烷和乙酸乙酯(3∶1，V/V)作为洗脱体系，得到两种非对应异构体混合物的纯产物(0.984g，产率95％，用NMR检测两种非对应异构体的比例为3∶1)；1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ7.62-7.16(m，20H)、5.06-4.78(m，6H)、4.59-4.36(m，2H)、4.19-3.30(m，8H)；SI-MS对于C35H36SO7Na(M+Na+)：计算值m/z＝623实测值623。
苯基2，3，4-三-O-苄基-6-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-2，3，4-三-O-苄基-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷(18c)：向亚砜17c(0.302g，0.503mmol)、苯基-2，3，4-三-O-苄基-1-硫代-β-D-葡萄糖苷(15，0.406g，0.754mmol)和2，6-二叔丁基-4-甲基吡啶(0.315g，1.53mmol)的CH2Cl2(10mL)溶液中，于-78℃用10分钟通过注射器逐渐加入Tf2O(0.09mL，0.503mmol)的CH2Cl2(5mL)溶液。在-78℃下搅拌20分钟，用1.5小时将混合物缓慢温热至-5℃。通过加入饱和NaHCO3水溶液(6mL)猝灭反应，且在CH2Cl2(35mL)和饱和NaHCO3水溶液(20mL)之间分层。分离有机相，且进一步用饱和NaHCO3水溶液(40mL)洗涤。用无水Na2SO4干燥后，将有机相蒸发至干并将残余物进行快速柱色谱分离(硅胶60A，230-400目)，使用己烷和乙酸乙酯(6∶1，5∶1，4∶1，V/V)作为洗脱液，得到无色浆状的纯产物(0.414g，产率81％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ7.54(m，2H)、7.42(m，2H)、7.38-7.24(m，31H)、5.05(m，2H)、4.94-4.56(m，12H)、4.25(m，2H)、4.02(t，J＝9.2Hz，1H)、3.92(m，1H)、3.86(d，J＝4.8Hz，1H)、3.80(m，1H)、3.75(m，1H)、3.70(t，1H)、3.62-3.46(m，3H)、3.28(t，J＝8.4Hz，1H)、2.03(s，3H)；ESI-MS对于C62H64SO11Na(M+Na+)：计算值m/z＝1039，实测值1039。
苯基2，3，4-三-O-苄基-6-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-2，3，4-三-O-苄基-β-D-吡喃葡萄糖基亚砜(19c)：向二糖硫化物18c(0.202g，0.199mmol)的CH2Cl2(12mL)溶液中，于-78℃用5分钟滴加入间氯过氧苯甲酸(m-CPBA)(0.045g，0.199mmol)的CH2Cl2(6mL)溶液。在-78℃，氮气氛保护下搅拌20分钟后，将混合物倒入饱和NaHCO3水溶液(30mL)与CH2Cl2(60mL)中。分离有机相，再次用饱和NaHCO3水溶液(30mL)洗涤，并用无水Na2SO4干燥。真空中通过旋转蒸发除去溶剂以得到粗产物残余物，将粗产物残余物进行快速柱色谱分离(硅胶60A，230-400目)，使用己烷和乙酸乙酯(2∶1，V/V)作为洗脱体系，得到两种异构体混合物的产物。(0.197g，总产率96％，通过NMR波谱检测两种异构体的比例4∶1)。第一种异构体，Rf＝0.27(2∶1，己烷/乙酸乙酯，V/V)；1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ7.60(m，2H)、7.46(m，4H)、7.42-7.22(m，29H)、5.05(d，J＝3.6Hz，1H)、5.00-4.66(m，12H)、4.60(d，J＝10.8Hz，1H)、4.27(m，2H)、3.87(m，3H)、3.74(m，4H)、3.59-3.47(m，3H)、3.35(m，1H)2.07(s，3H)；第二种异构体，Rf＝0.12(2∶1，己烷/乙酸乙酯，V/V)；1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ7.51(m，2H)、7.39-7.19(m，3 1H)、7.06(m，2H)、4.98-4.88(m，3H)、4.82-4.52(m，10H)、4.43(d，J＝8.8Hz，2H)、4.25(m，2H)、4.39(t，J＝9.6Hz，1H)、3.90-3.69(m，6H)、3.60(m，1H)、3.49(m，2H)、2.05(s，3H)。ESI-MS对于C62H64SO12Na(M+Na+)：计算值m/z＝1055，实测值1055。
苯基-2，3，4-三-O-苄基-6-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-2，3，4-三-O-苄基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-2，3，4-三-O-苄基-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷(19c)：向亚砜19c(0.110g，0.107mmol)、苯基2，3，4-三-O-苄基-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷(15，0.088g，0.161mmol)和2，6-二叔丁基-4-甲基吡啶(0.070g，0.34mmol)的CH2Cl2(6mL)溶液中，于-78℃下用10分钟通过注射器逐渐加入Tf2O(0.018mL，0.107mmol)的CH2Cl2(3mL)溶液。在-78℃下搅拌20分钟后，用1小时将混合物缓慢温热至-15℃。通过加入饱和NaHCO3水溶液(6mL)猝灭反应混合物，且然后在饱和NaHCO3水溶液(15mL)和CH2Cl2(30mL)之间分层。分离有机相，并用饱和NaHCO3水溶液(20mL)进一步洗涤。用无水Na2SO4干燥后，蒸发有机相至干，并将粗残余物进行快速柱色谱分离(硅胶60A.230-400目)，使用己烷和乙酸乙酯(4∶1，V/V)作为洗脱体系，得到无色浆状的产物(0.132g，产率85％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ7.53(m，2H)、7.44-7.14(m，48H)、5.12(d，J＝3.2Hz，1H)、5.04-4.52(m，21H)、4.40(m，1H)、4.24-4.12(m，2H)、4.00(m，1H)、3.90-3.36(m，12H)、3.28(m，1H)，2.00(s，3H)；13C NMR(400MHz，CDCl3)，δ170.85、138.99-138.14(m)、134.27、134.17、132.06、131.66、129.24、129.15、128.64、128.61-127.48(m)、103.74、97.51、97.23、88.37、87.77、86.91、86.86、84.79、82.59、81.95、81.86、81.41、81.23、80.67、80.36、80.25、79.16、78.99、78.02、77.56、75.88(m)、75.25(m)、72.71、72.49、72.37、71.02、69.04、68.30、66.39、65.94、65.67、63.47、63.36、21.34；ESI-MS对于C89H92SO16Na(M+Na+)：计算值m/z＝1471，实测值1471。
苯基-2，3，4-三-O-苄基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-2，3，4-三-O-苄基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-2，3，4-三-O-苄基-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷(21)：向装有苯基-2，3，4-三-O-苄基-6-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-2，3，4-三-O-苄基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-2，3，4-三-O-苄基-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷20c(101mg，0.069mmol)的烧瓶中加入Cs2CO3(22.4mg，0.069mmol)和甲醇(6mL)。室温下搅拌14小时后，通过旋转蒸发移除溶剂并在真空中干燥粗残余物。然后向残余物中加入无水CH2Cl2(3mL)并滤出不溶性盐。蒸发滤液至干并在真空中干燥以得到纯产物(96.1mg，产率98％)；Rf＝0.28(2∶1，己烷/乙酸乙酯，V/V)；1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ7.54(m，2H)、7.43-7.14(m，48H)、5.16(d，J＝3.2Hz，1H)、5.00-4.93(m，3H)、4.91-4.86(m，4H)、4.85-4.74(m，5H)、4.71-4.53(m，9H)、4.40(d，J＝8.0Hz，1H)、4.12(d，J＝10.0Hz，1H)、3.99(m，2H)、3.86-3.38(m，12H)、3.26(m，1H)；13C NMR(400MHz，CDCl3)，δ138.94-138.22(m)、134.33、132.01、131.55、129.19、129.10、128.59-127.44(m)、103.91、97.54、97.31、88.31、87.79、86.93、84.81、82.62、81.95、81.85、81.75、81.44、81.33、80.73、80.63、80.49、79.23、79.00、78.12、77.91、77.75、77.51、75.95-75.80(m)、75.45-75.25(m)、72.75、72.61、72.57、71.24、68.65、66.02、65.52、62.30；通过硅胶过滤质谱符合的样品以除去铯离子；ESI-MS对于C87H90SO15Na(M+Na+)：计算值m/z＝1429，实测值1429。
5，-O-单甲氧基三苯甲基-3’-O-琥珀酰-胸苷(23)：在通入氢气的烘箱干燥的50mL烧瓶中，将化合物22(2.86g，5.56mmol)、琥珀酸酐(1.67g，16.7mmol)和DMAP(0.34g，2.78mmol)溶解于无水吡啶(20mL)中。反应物在室温下搅拌2天。TLC分析(二氯甲烷∶甲醇9∶1)表明起始物料完全消失且生成单一的极性更高的产物。真空下移除吡啶。然后将深褐色残余物溶解在CH2Cl2(100mL)中并用饱和盐水洗涤。用Na2SO4干燥有机相然后在真空下移除溶剂；以高产率得到浅褐色泡沫产物(3.14g，产率92％)。1H NMR(DMSO-d6)δ11.39和8.30 (1H，s，NH)、7.50(1H，s，CH)、7.37-7.21(14H，m，Ar-H)、6.18(1H，t，J＝8Hz，CH，H1’)、5.28(1H，d，J＝6Hz，CH，H3’)、4.03(1H，宽s，CH)、3.73(3H，s，CH3)、3.32-3.19(2H，m，CH2，H5’和5”)、2.62-2.61(4H，不能分辨m，2CH2)、2.51-2.27(2H，m，CH2)、1.41(3H，s，CH3)；C34H34N2O9Na+低分辨ESI-MS计算值637.2，实测值637.1。
MMTTsucc-IL(24)：将化合物23(1g，1.63mmol)、取代的四氟硼酸咪唑1(0.38g，1.76mmol)和DMAP(0.052g，0.41mmol)置于干燥、通入氮气的100mL的圆底烧瓶中。向混合物中加入二环己基碳二亚胺(DCC)(0.68g，3.3mmol)，然后加入无水乙腈(20mL)。在室温下搅拌反应混合物3天。TLC分析(氯仿∶甲醇9∶1)表明生成更高极性的产物，所述产物没有从基线中移出。反应过程中生成白色固体的副产物二环己基脲(DCU)。反应停止时，使DCU沉淀并通过烧结玻璃漏斗过滤反应混合物，并用乙腈洗涤几次。通过将滤液滴加到搅拌的乙醚-乙酸乙酯溶液中实现进一步的纯化。所得沉淀由未衍生的离子液体1和所需产物24组成，然后将所得产物溶解在氯仿中并用水萃取。用硫酸钠干燥有机相，并蒸发溶剂，并在真空下干燥产物。得到浅褐色泡沫产物24(1.1g，产率83％)。1H NMR(丙酮-d6)δ10.03(1H，s，NH)、9.10(1H，s，CH)、7.83(1H，s，CH)、7.71(1H，s，CH)、7.60(1H，s，CH)、7.50-6.92(14H，m，Ar-H)、6.33(1H，t，J＝8Hz，CH，H1’)、5.50(1H，d，J＝6Hz，CH，H3’)、4.55-4.51(2H，m，CH2)、4.70-4.66(2H，m，CH2)、4.15(1H，宽s，CH)、4.05(3，s，CH3)、3.80(3H，s，CH3)、3.50-3.40(2H，m，CH2，H5’和5”)、2.70(4H，宽s，2CH2)、2.61-2.40(2H，m，CH2)、1.42(3H，s，CH3)；C40H43N4O9 +低分辨ESI-MS计算值723.3，实测值723.4。
HOTsucc-IL(25)：向24(2.96g，3.65mmol)的二氯甲烷(200mL)溶液中加入3％三氟乙酸的二氯甲烷或乙腈溶液(100mL)。加入TFA时，溶液变成橙红色并保持搅拌20分钟。产物从10％乙酸乙酯/乙醚中沉淀出来，过滤，并将产物再溶解于最小量得酸溶液中，再次沉淀并过滤。用10％乙酸乙酯/乙醚冲洗沉淀，从过滤器中回收沉淀然后将其溶解于乙腈中，并减压蒸发，产生浅褐色泡沫化合物25(1.88g，产率96％)。1H NMR(DMSO-d6)δ11.40和11.39(总数1H，2s，NH)、9.10(1H，s，CH)、7.76(1H，s，CH)、7.72和7.45(1H，s，CH)、7.70(1H，s，CH)、6.15(1H，m，CH，H1’)、5.27和5.19(1H，m，CH，H3’)、4.60和3.60(2H，m，CH2，H5’和5”)、4.45(2H，宽s，CH2)、4.39(2H，宽s，CH2)、4.24-3.93(1H，m，CH)、3.86(3，s，CH3)、2.61-2.60(4H，不能分辨m，2CH2)、2.40-2.16(2H，m，CH2)、1.77(3H，s，CH3)；C20H27N4O8 +高分辨ESI-MS计算值451.18289，实测值451.18234。
DMTApTSucc-IL(27a)：将化合物25(0.12g，0.22mmol)、腺苷亚磷酰胺26a(0.33g，0.38mmol)和二氰基咪唑(0.33g，2.8mmol)转移到50mL烘箱干燥的通入氮气的圆底烧瓶中。向混合物中加入无水THF或乙腈(5mL)，并将所得溶液在室温下搅拌1-2小时。将产物从10％乙酸乙酯/乙醚中沉淀2次。这时，将沉淀再次溶解于乙腈且加入2，4，6-三甲基吡啶或吡啶(约300μl)，然后加入碘水溶液(0.1M THF溶液/水2∶1，过量)以氧化亚磷酸三酯中间体。5分钟后，用硫酸氢钠水溶液(9mL)猝灭反应混合物，用90mL CHCl3稀释并用50mL水萃取。通过无水Na2SO4干燥有机相并减压蒸发以得到泡沫体27a(0.259g，89％)。31P NMR(乙腈-d3)δ-1.324、-1.477；C61H64N10O16P+低分辨ESI-MS计算值1223.4，实测值1223.4。
DMTCpTSucc-IL(27b)：将化合物25(0.11，0.20mmol)、胞苷亚磷酰胺26b(0.35g，0.41mmol)和二氰基咪唑(0.37g，3.1mmol)转移到50mL烘箱干燥过的通入氮气的圆底烧瓶中。没有溶剂时不发生任何反应。通过将无水THF或乙腈(5mL)注射到烧瓶中使反应开始，并在室温下搅拌溶液1-2小时。使用与27a相同的处理方法，且以高产率得到泡沫产物27b(0.234g，91％)。31PNMR(乙腈-d3)δ-1.545，-1.754；C60H64N8O17P+低分辨ESI-MS计算值1199.4，实测值1199.4。
DMTGpTSucc-IL(27c)：将化合物25(0.13g，0.24mmol)、鸟苷亚磷酰胺26c(0.35g，0.42mmol)和二氰基咪唑(0.38g，3.2mmol)转移到50mL烘箱干燥过的通入氮气的圆底烧瓶中。没有溶剂时不发生任何反应。通过将无水THF或乙腈(5mL)注射到烧瓶中使反应开始，并在室温下搅拌溶液1-2小时。使用与27a相同的处理方法，且以高产率得到泡沫产物27c(0.214g，90％)。31PNMR(乙腈-d3)δ-1.149，-1.194；C58H66N10O17P+低分辨ESI-MS计算值1205.4，实测值1205.6。
DMTTpTSucc-IL(27d)：将化合物25(0.24g，0.45mmo1)、胸苷亚磷酰胺26d(0.57g，0.77mmo1)和二氰基咪唑(0.66g，5.6mmol)转移到50mL烘箱干燥过的通入氮气的圆底烧瓶中。没有溶剂时不发生任何反应。通过将无水THF或乙腈(5mL)注射到烧瓶中使反应开始，并在室温下搅拌溶液1-2小时。使用与27a相同的处理方法，且以高产率得到泡沫产物27d(0.492g，91％)。31P NMR(乙腈-d3)δ-1.494，-1.584；C54H61N7O17P+低分辨ESI-MS计算值1110.4，实测值1110.4。
HOApTSuccIL(28a)：将化合物27a(0.26g，0.20mmol)溶解于乙腈(1-2mL)中并加入3％三氟乙酸的乙腈(2-3mL)溶液。根据与25相同的方法处理反应混合物，以高产率得到泡沫体28a(0.185g，93％)。1H NMR(乙腈-d3)δ6.47-6.51(Ade H1’)、6.17-6.22(Thy H1’)、5.25-5.30(Ade和Thy H3’)、2.82-3.09 (Thy H5’和5”)；31P NMR(乙腈-d3)δ-1.176、-1.516；C40H46N10O14P+高分辨ESI-MS计算值921.29326，实测值921.29271。
HOCpTSuccIL(28b)：向27b(0.26g，0.18mmol)的乙腈溶液(1-2mL)中加入3％三氟乙酸的乙腈溶液(2-3mL)以产生28b。根据与25相同的方法处理反应混合物，以高产率得到泡沫体28b(0.167g，95％)。1H NMR(乙腈-d3)δ6.09-6.24(Cyt和Thy H1’)、5.21-5.33(Thy H3’)、5.06-5.14(Cyt H3’)、2.82-2.88(Thy H5’和5”)；31P NMR(乙腈-d3)δ-1.381、-1.613；C39H46N8O15P+高分辨ESI-MS计算值897.28203，实测值897.28148。
HOGpTSucc-IL(28c)：向27c(0.21g，0.17mmol)的乙腈溶液(1-2mL)中加入3％三氟乙酸的乙腈溶液(2-3mL)。根据与25相同的方法处理反应混合物，以高产率得到泡沫28c(0.157g，96％)。1H NMR(乙腈-d3)δ6.08-6.25(Gua和Thy H1’)、5.26-5.30(Gua H3’)、5.17-5.22(Thy H3’)、2.81-3.05(Thy H5’和5”)；31P NMR(乙腈-d3)δ-1.047、-1.064；C37H48N10O15P+高分辨ESI-MS计算值903.30382，实测值903.30328。
HOTpTSucc-IL(28d)：向27d(0.21g，0.18mmol)的乙腈溶液(1-2mL)中加入3％三氟乙酸的乙腈溶液(2-3mL)。根据与25相同的方法处理反应混合物，以良好产率得到泡沫体28d(0.123g，78％)。1H NMR(乙腈-d3)δ6.16-6.24(5’-Thy和3’-Thy H1’)、5.22-5.30(3’-Thy H3’)、5.07-5.12(5’-Thy H3’)、2.30-2.86(3’-Thy H5’和5”)；31P NMR(乙腈-d3)δ-1.188、-1.284；C33H43N7O15P+高分辨ESI-MS计算值808.25548，实测值808.25493。
DMTTpTpTSucc-IL(29)：室温下，将化合物28d(0.065g，0.073mmol)与3’-亚磷酰胺26d(0.233g，0.31mmol)和二氰基咪唑(0.31g，2.6mmol)在无水乙腈(5mL)中混合。搅拌2h后，将产物从10％乙酸乙酯/乙醚中沉淀2次，用与化合物27a-d相同的方法氧化并提取，以高纯度得到29(104mg，产率92％)。31P NMR(乙腈-d3)-1.081、-1.194、-1.233、-1.262、-1.381、-1.403、-1.448、-1.477；C67H77N10O24P2 +低分辨ESI-MS计算值1467.5，实测值1467.8。
HOTpTpTSucc-IL(30)：向29(97mg，0.06mmol)的乙腈溶液(1-2mL)中加入3％三氟乙酸的乙腈溶液(2-3mL)。根据与25相同的方法处理反应混合物，得到玻璃状固体30(77mg，产率98％)。31P NMR(乙腈-d3)-1.157至-1.531(重叠的宽峰)；C46H59N10O22P2 +高分辨ESI-MS计算值1165.32807，实测值1165.32752。
DMTTpTpTpTsucc-IL(31)：室温下，将化合物30(170mg，0.136mmol)与3’-亚磷酰胺26d(0.160g，0.215mmol)和二氰基咪唑(0.21g，1.8mmol)的无水乙腈溶液(5mL)混合。搅拌2h后，将产物从10％乙酸乙酯/乙醚中沉淀2次，用与化合物27a-d相同的方法氧化并提取，以高纯度得到化合物31(231mg，产率89％)。31P NMR(乙腈-d3)-1.169至-1.859(重叠的宽峰)；C80H93N13O31P3 +低分辨ESI-MS计算值1824.5，实测值1824.2。
HOTpTpTpTsucc-IL(32)：向31(190mg，0.122mmol)的乙腈溶液(1-2mL)中加入3％三氟乙酸的乙腈溶液(2-3mL)。根据与25相同的方法处理反应混合物，得到化合物32(160mg，产率99.9％)。31P NMR(乙腈-d3)-1.142至-1.51(重叠的宽峰)；C59H75N13O29P3 +高分辨ESI-MS计算值1522.40066，实测值1522.40011.
寡核苷酸的去保护(33a-f)：通过用1.5mL的3∶1的浓氢氧化铵与无水乙醇处理1-5mg的化合物28a-d，以及化合物30和32，于60℃下16小时或室温下48小时，实现移除氰乙基保护基、碱基保护基(对于a-c)和连接到离子液体载体的琥珀酰基键。将样品冷却后，蒸发氨溶液并将残余物再次溶解于水中，用离子对反相HPLC纯化以得到33a-f。
应该理解，本发明不限于应用于上述组成和要素的细节。本发明能够用于其它实施方案且能以不同的方法实现。也可以理解，在此所用的表述和术语是为了描述而不是为限制。因此，虽然在此通过其例示性实施方案描述本发明，但在不脱离附加权利要求限定的本发明的精神、范围和实质内可以对本发明进行改进。
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27)a)Mizuno，M.；Goto，K.；Miura，T.；Hosaka，D.；Inazu，T.Chem.Commun.2003，972-973；b)Mizuno，M.；Goto，K.；Miura，T.；Matsuura，T.；Inazu，T.Peptide Synthesis on Fluorous Support.Tetrahedron Lett.2004，45，3425-3428.
28)a)Miura，T.；Hirose，Y.；Ohmae，M.；Inazu，T.Org.Lett.2001，3，3947-3950；b)Miura，T.；Inazu，T.Tetrahedron Lett.2003，44，1819-1821；c)Miura，T.；Goto，K.；Hosaka，D.；Inazu，T.Angew.Chem.Int.Ed.2003，42，2047-2051.
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30)a)Sheldon，R.Chem.Commun.2001，2399-2407；b)Sheldon，R.A.；Lau，R.M.；Sorgedrager，M.J.；Rantwijk，F.V.；Seddon，K.R.Biocatalysis inIonic Liquids.Green Chem.2002，4，147-151.
31)a)Fuller，J.，Carlin，R.T.，Osteryoung，R.A.J.Electrochem.Soc.1997，144，3881-3886；b)Fuller，J.，Breda，A.C.，Carlin，R.T.(1998)J.Electroanal.Chem.，1998，459，29-34.
32)a)Huddleston，J.G.，Rogers，R.D.Chem.Commun.1998，1765-1766；b)
Boesmann，A.，Datsevich，L.，Jess，A.，Lauter，A.，Schmitz，C.，Wasserscheid，P.Chem.Commun.2001，2494-2495.
33)Ye，C.，Liu，W.，Chen，Yu，Yu，L.Chem.Commun.2001，2244-2245.
34)Kimizuka，N.；Nakashima，T.Spontaneous Self-Assembly of GlycolipidBilayer membranes in Super-Phylic Ionic Liquid and Formation of Ionogel.Langmuir2001，17，6759-6761；b)For other ionic liquids containing PEG，seeLeone，A.M.；Weatherly，S.C.；Williams，M.E.；Thorp，H.H.；Murray，R.W.J.Am.Chem.Soc.2001，123，218-222.
35)a)Fraga-Dubreuil，J.；Bazureau，J.P.Tetrahedron Lett.2001，42，6097-6100；b)Fraga-Dubreuil，J.；Bazureau，J.P.Tetrahedron 2003，59，6121-6130；c)Handy，S.T.；Okello，M.Tetrahedron Lett.2003，44，8399-8402；d)Miao，W.；Chan，T.H.Org.Lett.2003，5，5003-5005；e)Anjaiah，S.；Chandrasekhar，S.；R.Gree，Tetrahedron Lett.2004，45，569-571；f)de Kort，M.；Tuin，A.W.；Kuiper，S.；Overkleeft，H.S.；van der Marel，G.A.；Buijsman，R.C.Tetrahedron Lett.2004，45，2171-2175；g)Law，M.C.；Wong，K.-Y.；Chan，T.H.J.Org.Chem.2005，70，10434.
36)a)Audic，N.；Clavier，H.；Mauduit，M.；Guillemin，J.-C.J.Am.Chem.Soc.2003，125，9248-9249；b)Yao，Q.；Zhang，Y.Angew.Chem.Int.Ed.2003，42.3395-3398.
37)Peptide synthesis using ionic liquids as reaction media has been reported.See：Vallette，H.；Ferron，L.；Coquerel，G.；Gaumont，A.-C.；Plaquevent，J.-C.Tetrahedron Lett.2004，45，1617-1619.
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41)An authentic sample of Leu5-enkephalin was purchased fromSigma-Aldrich Canada Ltd.and was reported to be 97％pure.
42)HPLC conditions：column，Agilent Zorbax SB-CN Semi-prep(9.4×250mm)；eluent，0-5min，H2O-0.05％TFA(v/v)，6-15min，0-60％CH3CN/H2O-0.05％TFA(v/v/v)，16-23min，60-100％CH3CN/H2O-0.05％TFA(v/v/v)；post time，7min；flow rate，3.0ml/min.
43)Jiang，L.；Chan，T.H.J.Org.Chem.1998，63，6035.
44)a)Kahne，D.；Walker，S.；Cheng，Y.；Van，D.E.J.Am.Chem.Soc.1989，111，6881.b)Yan，L.；Kahne，D.J.Am.Chem.Soc.1996，118，9239.c)Gildersleeve，J.；Pascal，Jr.R.A.；Kahne，D.J.Am.Chem.Soc 1998，120，5961.d)Gildersleeve，J.；Smith，A.；Sakurai，K.；Raghavan，S.；Kahne，D.J.Am.Chem.Soc.1999，121，6176.e)Liang，R.；Yan，L.；Leobach，J.；Ge，M.；Uozumi，Y.；Sekanina，K.；Horan，N.；Gildersleeve，J.；Thompson，C.；Smith，A.；Biswas，K.；Still，W.C.；Kahne，D.Science 1996，274，1520.
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46)a)Garcia，B.；Poole，J.L.；Gin，D.Y.J.Am.Chem.Soc.1997，119，7597.b)Honda，E.；Gin，D.Y.J.Am.Chem.Soc.2002，124，7342.c)Wipf，P.；Reeves，J.T.J.Org.Chem.2001，66，7910.
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Claims (31)

1.合成寡聚体的方法，所述寡聚体选自寡肽、寡糖和寡核苷酸，所述方法包括：
a)在反应条件下将第一种单体单元与离子液体接触以产生离子液体结合的单体单元；和
b)在反应条件下将离子液体结合的单体单元与至少另一种单体单元接触以产生离子液体结合的包含2-30个单体单元的寡聚体。
2.权利要求1的方法，还包括以选择的次数重复步骤b)以产生所需的离子液体结合的寡肽、寡糖或寡核苷酸。
3.权利要求2的方法，还包括从离子液体上分离寡聚体。
4.权利要求1的方法，其中所述离子液体为有机盐，包括：
含有杂环或取代杂环季氮的有机阳离子、含有杂环或取代杂环季鏻的有机阳离子、或含有杂环或取代杂环三价锍的有机阳离子，和
平衡所述有机阳离子上电荷的阴离子。
5.权利要求4的方法，其中所述有机阳离子选自N-取代的吡啶和1，3-二取代的咪唑。
6.权利要求4的方法，其中所述阴离子选自Cl-、Br-、BF4 -、PF6 -、SbF6 -、CuCl2 -、和AlCl4 -。
7.权利要求1的方法，其中所述单体单元为氨基酸。
8.权利要求1的方法，其中所述单体单元为核苷酸。
9.权利要求1的方法，其中所述单体单元为糖类。
10.权利要求7-9中任一项的方法，其中所述寡聚体包含2-15个单体单元。
11.权利要求7-9中任一项的方法，其中所述寡聚体包含2-10个单体单元。
12.权利要求7-9中任一项的方法，其中所述寡聚体包含2-5个单体单元。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述离子液体既为溶剂又为可溶载体。
14.合成寡聚体的方法，所述寡聚体选自寡肽、寡糖和寡核苷酸，所述方法包括对单体单元施用离子液体以产生2-30个单体单元的寡聚体。
15.权利要求14的方法，包括在反应条件下将第一种单体单元与离子液体接触以产生离子液体结合的单体单元；和在反应条件下将离子液体结合的单体单元与至少另一种单体单元接触以产生离子液体结合的寡聚体。
16.权利要求15的方法，其中将所述与另一种单体单元的接触重复所选择的次数以产生所需的离子液体结合的寡肽、寡糖或寡核苷酸。
17.权利要求16的方法，还包括从离子液体上分离寡聚体。
18.权利要求14的方法，其中所述离子液体为有机盐，包括：
含有杂环或取代杂环季氮的有机阳离子、含有杂环或取代杂环季鏻的有机阳离子、或含有杂环或取代杂环三价锍的有机阳离子，和
平衡所述有机阳离子上电荷的阴离子。
19.权利要求18的方法，其中有机阳离子选自N-取代的吡啶和1，3-二取代的咪唑。
20.权利要求18的方法，其中所述阴离子选自Cl-、Br-、BF4 -、PF6 -、SbF6 -、CuCl2 -和AlCl4 -。
21.权利要求14的方法，其中所述单体为氨基酸。
22.权利要求14的方法，其中所述单体为核苷酸。
23.权利要求14的方法，其中所述单体为糖类。
24.权利要求21-23中任一项的方法，其中所述寡聚体包含2-15个单体单元。
25.权利要求21-23中任一项的方法，其中所述寡聚体包含2-10个单体单元。
26.权利要求21-23中任一项的方法，其中所述寡聚体包含2-5个单体单元。
27.权利要求14-26中任一项的方法，其中所述离子液体既为溶剂又为可溶载体。
28.试剂盒，包括至少一种如权利要求4或18中任一项定义的离子液体，和选自氨基酸、糖类和核苷酸的单体单元。
29.权利要求28的试剂盒，其适用于制备包含至少2个单体单元的寡肽、寡糖或寡核苷酸。
30.制品，包括至少一种权利要求4或18中任一项定义离子液体，且还包括选自氨基酸、糖类和核苷酸的单体单元。
31.权利要求30的制品，其适用于制备包含至少2个单体单元的寡肽、寡糖或寡核苷酸。
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