CN101177662A - 遗传基因序列分析系统 - Google Patents

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CN101177662A CNA2007101851171A CN200710185117A CN101177662A CN 101177662 A CN101177662 A CN 101177662A CN A2007101851171 A CNA2007101851171 A CN A2007101851171A CN 200710185117 A CN200710185117 A CN 200710185117A CN 101177662 A CN101177662 A CN 101177662A
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Abstract

以往的大规模并列焦磷酸测序装置，由于测定粒子导入时时间和顺序较多，生产率降低以及试剂置换精度降低导致分析精度退化。本发明的遗传基因序列分析系统的结构为：具有含多个微反应槽的流槽以及与之相对的相机，测定对象的DNA固定在比重4以上的粒子、最好是氧化锆粒子表面。流槽，在粒子导入流槽内时为水平，测定伸长反应时与相机的光轴相对，相机的光轴相对于水平方面有倾斜度。

Description

遗传基因序列分析系统
技术领域
本发明是关于核酸分析中使用的箱、装置、系统以及分析遗传基因碱基序列的装置。具体来说，是关于能够进行遗传基因序列分析、遗传基因多型分析、遗传基因变异分析及遗传基因发现分析的装置。
使用了凝胶电泳和荧光检测的方法，广泛应用于DNA碱基序列决定。该方法中，首先制作多个将进行序列分析的DNA片断的拷贝。以DNA的5’末端为起点，制作各种长度的荧光标识片断。并且根据这些DNA片断3’末端的碱基种类，事先附加波长不同的荧光标识。由凝胶电泳将长度差异以1碱基的差识别出，检测出各片断群发出的光。从发光波长色中得知测定中的DNA片断群的DNA末端碱基种类。DNA从短的片断群开始依次通过荧光检测部，所以，通过计测荧光色，能够从短的DNA中依次得知末端碱基种类。由此，进行序列决定。这样的荧光式DNA定序器广泛普及，还活跃在人体基因组分析中。此方法中公开了下述技术：使用多根内径50μm左右的玻璃细管，并利用末端检测等方法，增加每一台的分析处理数。(例如非专利文献1)
另外，由焦磷酸测序所代表的、由阶段化学反应进行的序列决定法(例如专利文献1及专利文献2)，由于其操作的简便性，得到广泛关注。大概如下。将引物混合到作为目标的DNA链中，一种一种地依次向反应液中添加4种互补结合核酸基质(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，进行互补结合反应。互补结合反应发生时，DNA互补链伸长，作为副产物，生成焦磷酸(PPi)。焦磷酸因共存的酶的作用，转换为ATP，在荧光素和荧光酶素的共存下，发生反应后发光。通过对此光进行检测，得知添加的互补合成基质已进入到DNA链中，得知互补链的序列信息，进而得知作为目标的DNA链的序列信息。
此方法可以应用于流过型分析，并报告有下述技术：应用上述方法，大幅度增加了分析处理数(例如非专利文献2)。本技术使用1个面上有多个微小反应槽的流过式单元。将目标DNA链中混合了引物的同一种类的多个分子，固定在1个直径约35μm的琼脂糖凝胶制粒子表面，将此粒子和固定了生物发光用酶(荧光酶素)等的粒子，填充在流槽内的同一微小反应槽中。另外，为了使这些粒子不流出，填充直径0.8μm的微粒(microparticle)。这些粒子的填充是将粒子含有溶液导入流槽后用离心器沉淀来进行的。另外，分析是，从流槽上游，依次导入伸长反应用的4种互补链合成核酸基质(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，观测这时产生的生物发光。这些技术，首先在光纤板的1个端面上固定锚固探头，使其与环状核酸模板(Circular nucleicacid templates)结合，通过生物发光进行序列决定和多型分析(例如专利文献3)。另外，利用上述光纤板，制作微滴板，用于流槽的一部分(例如非专利文献3)。另外，文献(例如专利文献4)中公开了在该微滴板内的各反应凹部内附加了薄膜等的板，该薄膜用于减少生成物质、具体来说是焦磷酸等横向扩散引起的污染。
另外，还公开了作为能够应用于焦磷酸测序反应的试剂、与上述技术不同的反应类的例子(例如专利文献5)。该以往技术中，使用酶丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)的逆反应，将AMP和PPi合成为ATP，测定AMP浓度。
[非专利文献1] Anal.Chem.2000，72，3423-3430
[非专利文献2]Margulies M，et al.，“Genome sequencing inmicrofabricated high-density picolitre reactors.”，Nature，Vol.437，Sep.15；2005，pp376-80及Supplementary Information s1～s3
[非专利文献3] Electrophoresis 2003，24，3769-3777
[专利文献1]国际公开手册第98/13523号
[专利文献2]国际公开手册第98/28440号
[专利文献3]国际公开手册第01/020039号
[专利文献4]国际公开手册第03/004690号
[专利文献5]特开平第09-234099号公报
发明内容
使用了并列多个微小反应槽的流过型检测器的焦磷酸测序分析技术，与以往的凝胶电泳相比，具有较好的生产率。但是，其能够分析的碱基长度较短，是现在的主要课题。因此，此技术中，分析碱基长度的扩大是一个重要目标。
能够分析的碱基长度受限制的原因之一是由聚合酶伸长反应的精度引起的。如上所述，本技术是利用聚合酶伸长反应，将4种碱基依次伸长，通过该伸长反应是否发生，来得到碱基序列信息。这时，伸长反应的精度依赖于作为伸长材料导入的试剂成分到达微小反应槽内的准确度和之后导入的其他种类的试剂导入时、残留的之前试剂成分的残留量。作为具体例子，使用图14来说明。首先，假设同种类的测定对象DNA1401～1403在与引物1411～1413互补结合的状态下，固定在粒子上图14(a)]。本图中，为了简单，只表示了3个分子。从引物的3’侧末端开始进行伸长分析，本例中是从“dCTP”开始伸长，这一点比较容易理解。这里假定将伸长基质按C→G→T→A→C(重复)导入。首先导入以与碱基G互补的dCTP为主成分的试剂，分析伸长反应的有无。于是，一般来说，如1421及1422，碱基C追加到引物3’末端。但是，假设dCTP的供给不足时，如1423，产生未进行伸长反应的分子。然后，使用合适的洗净试剂，使导入的dCTP成分排出，作为下一种试剂，导入以dGTP为主成分的试剂。于是，正常伸长后的分子1431及1432能够取入下一个G，但未伸长的分子1433就不能伸长。然后T时发生伸长，A时不发生伸长图14(d)]。结果，正确伸长的分子成为1441及1442这样。但最初未伸长的分子，成为1443这样。实际上，由于粒子上的分子有一部分未伸长，所以是1441与1443混合的状态。接着再次注入dCTP，本来是不发生伸长。但是，之前未伸长的分子1453，发生了伸长。因此，分析者鉴定出作为假的序列信息“GCAG”，第4个碱基为G。这叫做伸长移相为主要原因的假信号成分。
另外，试剂导入间的洗净不充分时，会发生残留成分引起的过伸长。与之前相同的情况中，考虑鉴定为C→G→T的情况图15(a)]。导入dTTP1511后，假设之前导入的dGTP1501～1504有一部分残留时，作为伸长反应，有时会有TG这2个碱基伸长。这种情况称为过伸长。这时，接下来的A中，本不会发生的伸长却发生了2个碱基。因此，分析者鉴定出作为假的序列信息“GCATT”，第4个碱基及第5个碱基为T。
任何情况都成为之后分析中假伸长信号的发生原因，难以与真伸长进行判别。以往技术中，粒子填充时，使用微粒和薄膜等，所以容易发生试剂导入不完全和洗净不完全引起的残留，容易发生假信号的增加。
另外，以往技术中，向微小反应槽导入粒子时使用了离心器，结果发生测定所需时间增加以及步骤的增加，导致测定生产率降低。因此，需要试料固定粒子简便且高速的填充方法。
如上述，要实现分析生产率高、试剂导入精度、洗净引起的残留试剂降低的、能够分析的碱基长度长的大规模并列化碱基序列分析装置，必须克服这些问题。
要解决上述课题，需要将试料固定粒子“自动地”插入微反应槽的技术以及试剂流入时粒子不易流出的技术。作为该课题的对策，我们考虑利用高比重的粒子。以往，生物领域中使用的粒子大多比重不到4。特别是上述以往技术中的琼脂糖凝胶粒子中，比重只比1重一点，与周围存在的溶液比重几乎没有差别，所以即使想要将颗粒设置在规定区域，也容易流出。因此，必须有微粒等的捆包，于是发生试剂导入不足的课题和试剂置换时不完全性的发生。实施例中也进行了叙述，比重4以上粒子，因其自重，能容易被捕捉到微反应槽内。特别是比重为6的氧化锆粒子，耐腐蚀性好，也有强度，容易操作。并且，因其自重，只需要从外部向流槽内部导入的操作，就容易地捕捉到反应槽中。为了自动地捕捉到反应槽中，可以利用其重力。这时，试剂水平流动时，反应槽的开口部必须在垂直方向上实质上朝上设置。这时适合粒子的捕捉，但流槽内混入气泡时，有可能会停留。发生气泡混入时会影响之后的测定。本发明的实施技术中，必须将4种基质试剂和洗净它们的试剂等依次流入流槽内，流入的通路中，在这些试剂间使用“气隙”是有效的。使用“气隙”时，可以避免送液中发生前后试剂的混合，能够以高精度进行试剂置换。“气隙”的利用，是向流槽内积极地导入气泡，但会伴随着难以排出气泡。气泡排出时，试剂的流动在垂直方向中由下至上是比较有效的。这时，事先将流槽的角度设为可变，并将反应测定时试剂的流向与垂直偏离，由此能够解决。通过该结构，即使是试剂的流动在垂直方向中由下至上的结构，也能够防止粒子从反应槽中脱落。特别是5度到30度左右的偏离，适合于气泡排出和粒子保持这两个目的达成。
本发明中，比重4以上、例如比重6的粒子例，使用氧化锆粒子。氧化锆粒子，可以是由二氧化锆(ZrO2)构成，也可以是在氧化锆中添加了氧化钇进行强化的物质。
通过本发明，在核酸分析，特别是遗传基因序列分析中，实现分析生产率提高和分析精度的提高。特别是分析精度的提高，能够达到与以往技术的荧光式DNA定序器对抗的水平。
附图说明
图1是装置结构图。
图2是流槽的概略图。
图3是试料固定粒子的说明图。
图4是说明测定时的流程图。
图5是流槽内的微反应槽的例子。
图6是粒子沉降到反应槽内的机理的说明图。
图7是表示比重与能够利用流速区域的图。
图8是表示微反应槽设置的图。
图9是表示微反应槽设置的图。
图10是表示微反应槽设置的图。
图11是表示微反应槽设置的图。
图12是说明焦磷酸测序的反应机理的图。
图13是测定的生物发光像。(实验结果)
图14是说明作为课题的未伸长现象的图。
图15是说明作为课题的过伸长现象的图。
图16是光路中使用反射板的装置结构图。
图17是控制流槽倾斜度的机构的说明图。
图18是控制流槽倾斜度的机构的说明图。
图19是控制流槽倾斜度的机构的说明图。
具体实施方式
下面由实施例来说明本发明。这里，测定对象的遗传基因序列，使用焦磷酸测序法的原理来决定。本实施例的装置结构例，如图1所示。本实施例的装置具有：流过型的单元(流槽)101；检测发光图像的冷却型CCD相机等的、作为检测部的2维拍摄装置102；试剂槽103～106，为了依次向单元内分别注入而分别容纳4种核酸基质(dATP、dCTP、dGTP、dTTP4种等)；洗净试剂槽107，容纳用于伸长反应测定后洗净流槽内的洗净试剂；调节试剂槽108，容纳用于洗净后冲洗单元内洗净试剂成分残留的调节试剂；注入部(选择阀109、用于输送试剂的泵110)，用于将上述试剂选择地注入到流槽侧；废液瓶111等。另外，表面上固定了试料(测定对象核酸)的粒子，在搅拌到液体中的状态下，容纳在粒子槽112中。系统具有导入切换机构113，用于切换粒子导入和试剂导入。
这里，说明上述流槽的结构例。图2是流槽的展开图。流槽，为了保持后述的试料固定粒子，具有：表面上有多个微反应槽(凹部)201的基板202、试剂流入口203、试剂排出口204、有根据需要设定的试料投入口(未图示)的上板205、形成通路的间隔件206。
基板的1例，如图5所示。基板的中央部分具有多个微反应槽501。图5(b)为虚线部分的剖面图。微反应槽501的形状例如可以是圆柱状。此形状根据基板原材料和制作方法来选择。我们研究了作为基板，使用不锈钢材、由切削加工来制作的例子，使用硅晶片、利用掩模和湿法蚀刻来制作的例子，使用载波片等玻璃、由使用了粒子的喷砂加工来制作的例子，使用聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯等、由模具的注射成形来制作的例子。本实施例不构成对于本发明所使用的材料和制作方法的限制。
回到图1的装置结构说明。设置上述流槽，使2维拍摄装置102的拍摄面为上述流槽的微反应槽分布区域。虚线121通过与2维拍摄装置102的拍摄相关的光轴、即拍摄装置的拍摄面中心，表示与拍摄面实质上垂直的法线。而虚线122表示流槽的基板面。该基板面是拍摄装置所拍摄的像面。虚线124是通过线121与面122的交点的垂直方向的线。这里，角度123表示流槽基板面与垂直方向的倾斜度。此角度也是光轴121与水平面的倾斜度。本图中，水平的台图示为130，与光轴平行设置的台图示为131。因此，台130与台131构成的角度也是角度123。流槽的试剂流入口141、试剂排出口142分别如图所示，设置在流槽中，位置关系为，垂直方向上试剂流入口141在下面、试剂排出口142在上面。因此，试剂的流动在垂直方向中是由下至上的。这是流入单元内的气泡随着试剂的排出、有效地排出的设置。
下面说明作为本装置测定对象的试料固定粒子。图3是试料固定粒子的例子。作为粒子，例如粒子301使用比重约6的氧化锆粒子。这里，比重是指对水的比重。氧化锆粒子，其原材料大多记载为二氧化锆(ZrO2)，作为一般例，是氧化锆中添加了氧化钇等进行强化的物质。其比重因制造工序和混合比等而不同，一般来说5.5～6的情况较多。粒子可以是以二氧化锆为原材料的物质，也可以是以氧化锆中添加了二氧化钇等添加物的物质为原材料的物质。这时，由于对试剂的耐腐蚀性好、比重高，适用于本装置。但使用比重4以上的粒子是有效的。其原因及效果将后述。
粒子表面上，测定对象的单链DNA302与作为序列分析开始位置的引物303互补结合的多个分子被固定。图3中，为了简单，只表示了1组。这里，固定在1个粒子表面的分子是1种，即必须是相同种类。在1个粒子表面放大多个单一种类分子的方法，例如可以是以往公开的“乳滴PCR”等(例如非专利文献2)。其形态，如图示，将测定对象DNA固定在粒子表面、或者放大后再固定、使引物互补结合的情况图3(b)]，将引物固定在粒子表面后与测定对象DNA互补结合的情况图3(c)]等，都可以利用。本实施例中，对粒子直径约20～100μm进行实验、确认了效果。粒子直径的差异成为表面积的差异，涉及到1个粒子表面上固定的分子数、即后述的测定灵敏度差异，但相机使用电子倍增型冷却CCD时，对于上述所有情况，都能测定。但是，流槽的微反应槽的直径和深度，必须根据使用的粒子大小来选择。一般来说，微反应槽的直径和深度是使用的粒子的1.2倍～1.5倍较好。即，使用约50μm的粒子时，直径和深度为60～75μm左右较好。这是能够满足进入1个反应槽的粒子最多为1个的合适条件。
本实施例的分析顺序流程如图4。本实施例中，事先准备由各种方法将测定对象DNA和引物组固定在表面的粒子。分析顺序如下。
(1)粒子的导入
向流槽的微反应槽内导入固定了测定对象的氧化锆粒子。这时，流槽的角度可以变动，粒子导入时为水平或接近水平的角度有效果。即，流槽基板面对于垂直方向的角度是可变动的，粒子导入时与水平方向实质上平行、或者在其附近。图5说明了粒子导入时的流槽内部。502是流槽基板的剖面，微反应槽由503、504表示。箭头510、511表示含有粒子的试料溶液的流动。粒子从上游流入，像510这样进入微反应槽，被捕捉。一旦被捕捉，由于粒子与试料溶液相比，比重高，所以不会从反应槽中流出。另外，已经捕捉到1个粒子的反应槽，不会再捕捉更多的粒子。因此，其他粒子，例如511所示，流入还未捕捉到粒子的其他反应槽，在该处被捕捉。本图中，试料溶液由左至右流动，实际上为了使粒子捕捉到反应槽内，可以交替向往返方向流动，提高捕捉率。粒子捕捉到反应槽内的机理，可以由粒子自重、浮力、参与沉降时溶液的粘性力来简单记叙。其关系如下述。图6说明粒子捕捉到反应槽时和未捕捉而流动时的条件。601的粒子沿箭头602的方向流动时，在反应槽的开口部开始沉降，成为603的样子。这时，如图示，当粒子中心沉降到开口部以下时，该粒子被捕捉；未沉降到此位置时，粒子从反应槽的开口部中跳出。因此，被捕捉的条件，大致可以由开口部直径、粒子比重和直径、流速来决定。为了找出此条件，根据以下假设进行了计算。该理论计算的前提条件如下述。如图6所示，粒子比重比溶液大，所以几乎与板的上面接触，并以规定速度(Vflow)移动。此速度与流槽内的流速成比例。粒子重心到达凹部的端部后(图6的601)，由重力开始沉降，沉降距离(d)在粒子半径(r)以上时，粒子603填充到凹部中。现在，粒子比重为6、溶液比重为ρ＝1、粒子体积为V、粒子半径为r、溶液中粒子所受到的阻力系数为f、重力加速度为g，以粒子与板上表面接触时粒子重心为原点，相对板垂直向下为x轴，用粒子重心位置表示粒子位置。粒子上施加了重力、浮力和阻力，所以粒子的运动方程式表示为[式1]。
[式1]
x · · = σ - 1 σ g - f σV x ·
这里[式2][式3]是x的时间t的1次及2次微分。
[式2]
Figure S2007101851171D00092
[式3]
Figure S2007101851171D00093
该微分方程式在t＝0的初始条件下解方程后变成[式4](1)。
[式4]
x = σ - 1 σ g { σV f l - ( σV f ) 2 ( 1 - exp ( - f σV t ) ) }
另外，电阻率f从斯托克斯的公式中、将η作为溶液粘度，表示为[式5](2)。
[式5]
f＝6πrη
接着，如图6的虚线所示，粒子要填充到凹部中，[式6](3)中，必须沉降距离r以上。
[式6]
T＝(2R-r)/vRow
为此，其条件为[式7](4)
[式7]
r ≤ σ - 1 σ g { σV f T - ( σV f ) 2 ( 1 - exp ( - f σV T ) ) }
这里，向(4)的等号条件中代入(3)、(2)式和[式8]所表示的V，r＝30μm、R＝40μm、g＝9.8msec-2，代入[式9]所表示的η(水在40℃时的粘度)，得到图7所示的比重阈值与Vflow的关系。
[式8]
V＝4/3m3
[式9]
η＝6.5×10-4Pa·sec
此结果可以导出以下结论。首先，要提高试料的流速，比重越大越好。比重4左右之前，随着比重的增加，上限流速也增加。要提高流槽内粒子的捕捉率，在该上限流速的范围内，流速越高越有效。其原因是，流速越大，单位时间的粒子移动量越大，与反应槽相遇的概率增加。但根据本图，比重4以上时，即使比重增加，上限流速也不会上升很多。所以，比重4以上的粒子中，其捕捉率没有增加。因此，使用比重4以上的粒子时，其捕捉率的差异很小。其结果，从捕捉率的观点看来，可以说比重4以上较好。
这里说明改善粒子捕捉率的几个实施例。在粒子流过流槽基板表面时，如果提高粒子与微反应槽相遇的概率，就能改善捕捉率。例如，图8表示将微反应槽2维设置的情况，包括4个微反应槽的设置方格的最小单位是正方形或者长方形810的方格状设置情况。可以设置为，微反应槽在流槽长轴方向上形成多个列地设置，相邻的多个列的各微反应槽的开口面的中心点的位置，不在与流槽的长轴方向实质上垂直的短轴方向的直线上。如箭头801的轨迹所示，与方格最小单位的正方形和长方形的角接触的粒子，大多能够遇到其延长线上设置的反应槽，如箭头802的轨迹所示，与方格最小单位的正方形和长方形的角没有接触的粒子，不会遇到反应槽。作为改善方法，简单说来，比如提高反应槽的分布密度。但是，相邻的微反应槽距离小时，反应槽间的发光成分的污染可能会发生，所以重要的是保持距离同时提高粒子与反应槽的交叉效率。例如，如图9所示，相对于试料溶液的流动方向901，反应槽斜着分布。这时，微反应槽2维设置，包括4个微反应槽的设置方格的最小单位是菱形910而不是长方形。这时，能够在保持反应槽间的距离同时提高粒子与反应槽相遇的概率，能够提高粒子捕捉率。另外，如图10所示，在反应槽间设置用于改变粒子流动方向的突起物1001也是有效的。该突起物的制作，在使用了树脂材料的模具进行的注射成形中，很容易实现。突起的形状可以是图示的点，但如图11所示，实质上设置在倾斜分布的作为反应槽设置方格的最小单位的、菱形而非长方形的边的位置上，或者实质上与之平行(1101)，更加有效。本例中，突起物1101设置在反应槽与反应槽的连线上。其结果，在反应槽与反应槽中间移动的粒子1110，与突起物相遇时，沿着突起物移动，所以会引导至其延长线上的反应槽。另外，同样被引导的粒子1111的引导目的地的反应槽，即使已经被其他粒子占有(1112)，被引导的粒子被引导至存在反应槽的流动上，所以能够与其流动的延长线上的空反应槽(本图中为1113)相遇。因此，提高了粒子的捕捉率。另外，上述凸状结构物，不在基板侧、而设置在面对流槽基板的上板的通路侧时，也能得到同样的效果。
通过以上实施例，可以仅通过控制试料溶液，就能将试料固定粒子捕捉到流槽内的微反应槽。这对装置的自动化是有效的，还有利于分析生产率的提高。
另外，本装置的一个特征是，粒子导入时以及后述的反应测定时，改变流槽的倾斜度。这是将依次混入流槽内的气泡从试剂排出口中有效排出，解决气泡残留引起的反应现象，即生物发光的观测中发生恶性影响的事态。另外，流槽是不垂直于垂直方向的结构。其原因是为了防止测定中，反应槽内粒子流出或者落下。流槽的角度可动时，其角度的重现性是很重要的。特别是测定时流槽面需要实质上与图像装置的光轴垂直。这时的偏离会发生测定像的变形。图17是流槽倾斜控制机构的一例。虚线1701是水平，1702是垂直，1703是相机的光轴，1704是实质上垂直于光轴的线。1710是装置的基部，由此来固定流槽的水平支持臂1711及测定位置臂1712。流槽1720由电机等旋转机构1713来控制倾斜度。1721是试剂流入口，1722是试剂排出口，1723是反应槽的位置。本图表示插入粒子时固定在水平位置的情况。粒子插入到流槽内，插入到反应槽中。粒子的插入结束后，如图18，以动旋转机构为轴，将流槽移动至测定位置。由此，流槽相对于水平方向有倾斜度。这时，测定位置臂1712决定流槽上部位置，所以流槽能够固定在实质上与光轴垂直的位置上。图19是从光轴侧观察流槽的图。测定位置臂1712左右有2根，其间固定了流动部分。
(2)背景发光成分的除去
接着进行背景发光成分的除去(流槽的预置)(参照图4的流程)。本实施例的遗传基因序列分析技术利用生物发光。反应机理如图12。由碱基的伸长反应产生的焦磷酸(PPi)，在丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)的存在下，与AMP反应生成ATP。这时，生物发光酶的荧光素酶及发光基质的荧光素共存时，产生生物发光，其光量与ATP产生量成比例。如果定量地检测出该生物发光，就能够决定碱基伸长的有无和伸长时的伸长碱基数。该反应类中，伸长反应以前存在的ATP作为背景发光，会有影响。ATP广泛应用于普通的生物活动中，所以因细菌等污染，很容易混入，其一部分附着在单元内，仅仅用洗净液的流水有时不能除去。另外，试料通常要经过PCR等方法进行的增加过程，所以也要考虑到焦磷酸等的残留、混入。因此，在伸长反应之前，必须分解从外部进入的ATP成分、焦磷酸成分。分解除去可以通过含有三磷酸腺苷双磷酸酶及焦磷酸酶(PPase)等分解酶的水溶液来洗净流槽内部。该水溶液容纳在分解酶水溶液槽中，由和选择注入4种核酸基质的机构相同的机构注入到流槽中。本实施例中，使用将三磷酸腺苷双磷酸酶及焦磷酸酶分别以0.1mU/μL的浓度调制的洗净用试剂。并且，焦磷酸测序是计测ATP存在量的方法，可以使用专利文献1所述的反应类，即硫酸化酶等。但本实施例中使用的PPDK的反应类，背景发光较低，比较好。
(3)核酸序列测定
下面根据焦磷酸测序原理进行序列决定。首先，使用的试剂如下。
[1]试剂A：生物发光用试剂+dATP+聚合酶(或者用dATPαS代替dATP)
[2]试剂C：生物发光用试剂+dCTP+聚合酶
[3]试剂G：生物发光用试剂+dGTP+聚合酶
[4]试剂T：生物发光用试剂+dTTP+聚合酶
[5]洗净试剂：三磷酸腺苷双磷酸酶0.1mU/μL、焦磷酸酶0.1mU/μL
[6]调节试剂：与生物发光用试剂相同的成分。
这里，生物发光用试剂是具有荧光素酶、荧光素、PPDK、PEP、AMP的试剂。另外，为了使化学反应稳定，有时会添加几种成分，只要对反应类不产生阻碍，对于这些添加没有限制。
将这些试剂进行“试剂A～T中任一种→洗净试剂→调节试剂→试剂A～T中任一种”的重复导入以及结果评价，由此进行生物发光检测。图13模式地表示由本实施例的装置进行遗传基因序列分析的例子。现在关注3个反应槽1301～1303进行说明。1310表示1个碱基由伸长发光时的发光，1311表示2个碱基伸长发光时的发光。(1)～(4)分别表示导入试剂A～T时的发光图像。(1)中，1301与1302观测到伸长引起的发光，特别是1302有2个碱基发生了伸长。而1303没有观察到发光，所以可以说没有发生伸长。从这4次测定中可以作为(5)及(6)来得出试料的遗传基因序列。另外，核酸伸长反应时的流槽温度在摄氏32度～40度比较适合。因此，可以事先将流槽设定为上述温度范围的任意条件。本实施例中设定为37度或40度进行实验。
生物发光的发光量与伸长碱基数成比例。因此，计算反应槽的发光量，能够确定碱基伸长的有无及其碱基数。反应槽表示1个粒子引起的发光，并且其位置不会变化，所以如上述，依次导入反应试剂，并将得到的生物发光图像位置和发光信号强度在时序上积累，由此能够并列地得到试料的遗传基因序列信息。这时的并列度是流槽内微反应槽的数与反应槽的粒子捕捉率的乘积。
由上述，对于固定了试料的粒子，能够按每个粒子并列地分析试料核酸序列。通过使用比重大的粒子、特别是氧化锆粒子，以及使用控制角度的流槽，能够容易实现从粒子插入流槽中的微反应槽、到利用核酸伸长进行的分析为止的处理自动化。另外，本结构中，反应槽内的粒子，在之后的试剂溶液和洗净溶液等注入时，因其自身重量，能够稳定地留在反应槽内。其结果，不需要使用以往技术中必需的微粒填充状态结构和薄膜等，操作容易且能够进行高精度的分析。并且，能以高精度、高速地进行试剂置换。即，焦磷酸测序中，向反应槽内切实地导入4种试剂(A～T)、洗净试剂等，并切实地排出这些试剂，这一点是很重要的。本结构中，反应槽内只捕捉1个粒子，所以能够很容易且高速地进行上述试剂的置换。这也有利于装置生产率的提高和精度提高。
流槽相对于水平方向是有倾斜度地进行实验，具体来说，本实施例中，垂线(垂直方向)与流槽的倾斜度为10度进行实验。这是因为本实施例中使用的粒子是比重为6的氧化锆粒子，所以10度的倾斜度就足以防止从反应槽中流出。该角度小时，如前所述，气泡的排出很顺畅，但粒子容易流出。另一方面，角度大时，防止了粒子流出，但增加了流槽内气泡停留的错误发生率。如本发明，使用比重6的粒子、角度为10度时，能够同时防止粒子流出和气泡停留，所以是合适的条件。只要倾斜度在6度至30度的范围，同时防止粒子流出和气泡停留的效果就很显著，但也可以在这个范围外。并且，如图16所示，可以通过用镜面等反射板1601的折射相机的光轴，来保持相机自身水平，只调整流槽的角度。一般来说，由于相机重量大，使流槽的垂线与相机光轴一致的调整伴随着一定程度的困难。但如上述，在中间设置反射板时，只需要调节该板的角度，能够容易实现合适的光学位置。

Claims (20)

1.一种箱，具有：
一个面有多个凹部的容器，和
相对于水的比重为4以上的多个粒子。
2.根据权利要求1所述的箱，其特征在于，上述粒子是含有氧化锆的粒子。
3.根据权利要求1所述的箱，其特征在于，上述多个凹部以二维布置的方式布置，上述二维布置的布置方格的最小单位不是长方形而是菱形。
4.根据权利要求1所述的箱，其特征在于，上述凹部以在上述容器的长轴方向上形成多个列的方式布置，且布置成相邻的多个列的各自的上述凹部的开口面的中心点的位置，不在上述容器的与上述长轴方向实质上垂直的短轴方向的直线上。
5.根据权利要求1所述的箱，其特征在于，上述一个面上还有多个突起部。
6.根据权利要求3所述的箱，其特征在于，上述一个面上还有多个突起部，上述突起部实质上布置在上述菱形的边的位置上。
7.根据权利要求3所述的箱，其特征在于，上述一个面上还有多个突起部，上述突起部实质上与上述菱形的边的位置平行地布置。
8.一种装置，其特征在于，具有：
单元，其具备：具有多个凹部的第一构件和与上述第一构件的上述凹部相对、且具有导入部和导出部的第2构件；
液流控制部，从上述导入部导入含有粒子的液体，并从上述导出部导出液体；以及
检测部，对上述凹部进行光学检测，其中
上述液流控制部向上述导入部导入含有相对于水的比重为4以上的上述粒子的液体。
9.根据权利要求8所述的装置，其特征在于，具有单元控制部，其移动上述单元，使其相对于水平方向有斜度。
10.根据权利要求9所述的装置，其特征在于，在上述液流控制部将含有上述粒子的液体导入上述导入部时，上述单元控制部实质上水平地布置上述单元，在上述检测部进行上述光学检测时，上述单元控制部将上述单元布置为相对于上述水平方向有斜度。
11.根据权利要求8所述的装置，其特征在于，还具有：用于分别容纳4种核酸基质的第1试剂槽、第2试剂槽、第3试剂槽及第4试剂槽，和将上述4种核酸基质选择性地注入上述单元的注入部。
12.根据权利要求8所述的装置，其特征在于，上述凹部的直径及深度是上述粒子的1.2倍以上、1.5倍以下。
13.根据权利要求8所述的装置，其特征在于，上述液流控制部在将含有上述粒子的液体导入上述导入部时，控制含有上述粒子的液体，使其在往返方向上流动。
14.根据权利要求8所述的装置，其特征在于，还具有：容纳用于分解ATP和焦磷酸中至少一者的溶液的第5试剂槽，和将上述用于分解的溶液选择性地注入上述单元的注入部。
15.根据权利要求8所述的装置，其特征在于，上述液流控制部将含有含有氧化锆的上述粒子的液体导入上述导入部。
16.根据权利要求9所述的装置，其特征在于，在上述检测部进行上述光学检测时，上述单元控制部将上述单元布置为相对于垂直方向有6度到30度范围的斜度。
17.一种系统，具有：
单元，其具备：具有多个凹部的第一构件，和与上述第一构件的上述凹部相对、且具有导入部和导出部的第2构件；
粒子，相对于水的比重为4以上，容纳在上述凹部中；
液流控制部，从上述导入部导入含有上述粒子的液体，并从上述导出部导出液体；
检测部，对上述凹部进行光学检测；以及
单元控制部，移动上述单元，使其相对于水平方向有斜度。
18.根据权利要求17所述的系统，其特征在于，还具有容纳上述粒子的粒子槽。
19.一种使用粒子的分析方法，向一个面有多个凹部、实质上水平地设置的容器导入含有多个粒子的第1液体，上述粒子相对于水的比重为4以上，
将由于上述第1液体的流动而移动的上述粒子容纳在上述凹部中。
20.根据权利要求19所述的使用粒子的分析方法，其特征在于，
将上述粒子容纳在上述凹部后，将上述容器移动至相对于水平方向有斜度的位置上，
向移动后的上述容器导入含有反应用试剂的第2液体，
并对上述凹部进行光学检测。
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