CN101173029A - 带双重识别基团聚合物链的蛋白质印迹树脂制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

带双重识别基团聚合物链的蛋白质印迹树脂的制备方法及应用。本发明为了提高识别目标蛋白质的专一性，引入了限制长度的带有随机双重识别基团的辅助识别链。采用丙烯腈和4－乙烯吡啶反应的无规共聚物作为辅助识别链的骨架，识别基团为羧基和吡啶基团，并选用进行过双键修饰的80－100目的聚乙烯醇树脂微球作为辅助识别链的载体。根据蛋白质的识别的需要，将识别基团在短链上所占的比例定为各10％。本发明使用克隆的猪亲环素18(pCyP18)蛋白质为模板。本发明能够对蛋白质多方位多角度的识别，增加了识别位点，提高了识别的专一性，更好的对目标蛋白质进行大量的高浓度富集的特异生的识别。对目标蛋白的吸附量为600ng/g，在总蛋白质中含量提高了200倍以上。

Description

带双重识别基团聚合物链的蛋白质印迹树脂制备方法及应用

【技术领域】：本发明属于蛋白质印迹聚合物的合成及其应用技术领域，特别涉及带有双重识别基团的蛋白质印迹树脂的合成及其应用，以克隆蛋白质为模板用辅助识别的限长聚合物链合成蛋白质印迹聚合物，具体地应用于天然微量蛋白质的分离、富集。

【背景技术】：分子印迹技术是聚合物通过“记忆”印迹分子的立体空间而具有的分子水平上的专一性识别能力。由于蛋白质结构的特殊性及生物活性的要求，近年来印迹蛋白质成为分子印迹领域研究的热点。利用非共价作用是印迹蛋白质最简单方法。常用的弱分子间作用力有：氢键、静电力、电荷转移、疏水作用以及范德华力等。

印迹蛋白质的方法主要有包埋法、表面印迹法、抗原决定基的方法。目前，印迹蛋白质的方法单一，单体聚合发生在有机溶剂中，用以印迹的蛋白质种类少且均为常见的、在生物体内含量很大或很容易得到的蛋白质，这限制了蛋白质印迹聚合物的应用的实际意义。因此开发印迹蛋白质的新方法，尤其是用以吸附、富集天然微量蛋白质的分子印迹聚合物是迫切需要解决的问题。

最近，宓怀风和郭敏杰等发明的分子印迹树脂和制备方法及其分离提纯蛋白质的应用(申请专利号200510013356.X，公开号CN 1687167A)，利用限长的聚合物短链上随机分布的吡啶基团作为识别位点，有效地分离纯化了目标蛋白质；宓怀风和赵琢等发明了一种新的表面印迹蛋白质的方法(申请专利号200610013329.7，公开号CN1844174)利用限制长度的聚合物短链即辅助识别链上随机分布的羧基酸性识别基团，并用大肠杆菌中克隆蛋白质作为模板来识别天然微量蛋白质，取得了很好的富集效果。由此可见，羧基和吡啶基团对蛋白质都有识别的作用，故本专利中我们合成了一种辅助识别聚合物链上同时有羧基和吡啶的双重识别基团的蛋白质印迹聚合物，提高了对目标蛋白质识别的专一性。

【发明内容】：本发明目的是克服现有技术存在的上述不足，提供一种带双重识别基团聚合物链的蛋白质印迹树脂制备方法。

本发明为了提高识别目标蛋白质的专一性，我们引入了限制长度的带有随机双重识别基团的辅助识别链。采用丙烯腈和4-乙烯吡啶反应的无规共聚物作为辅助识别链的骨架，识别基团为羧基和吡啶基团，并选用进行过双键修饰的80-100目的聚乙烯醇树脂微球作为辅助识别链的载体。根据蛋白质的识别的需要，将识别基团在短链上所占的比例定为各10％。本实验我们使用克隆的猪亲环素18(pCyP18)蛋白质为模板。

本发明提供的带双重识别基团聚合物链的蛋白质印迹树脂的制备方法，包括：

第一、辅助识别链的制备：在80℃下，以偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，丙烯腈和4-乙烯基吡啶为反应单体(丙烯腈和4-乙烯基吡啶投料量摩尔比为1∶99)，无水乙醇为溶剂，自由基聚合反应8h，制得聚合度为35-40的无规共聚物。在85％(W/W)的浓硫酸中，100℃水解4h，沉淀，洗涤，分离，室温下真空干燥24hr。再在30℃下，在N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基苯并三氮唑(HOBT)的作用下，将烯丙醇缓慢滴加至水解后的无规共聚物的二甲基亚砜(DMSO)溶液中，反应48hr，用乙醇沉淀，反复洗涤数次，得到辅助识别链。其中DIC、HOBT和烯丙醇的摩尔比为1∶1∶1。烯丙醇和水解后的无规共聚物的摩尔比为32∶1，即合成的丙烯腈和4-乙烯基吡啶的无规共聚物链上有90％的羧基发生酯化反应，酯化后的侧基上由于带有双键，可以被引发聚合从而锚定到也带有悬挂双键的大孔微球表面，故称为锚定基团，通过溴加成-紫外分光光度法测定双键的含量，结果证明有约10％的羧基未发生酯化反应，这些未酯化的羧基侧链可以和蛋白质表面带正电荷的酸性氨基酸基团作用；通过紫外分光光度法测定吡啶环的含量，辅助识别链上有约10％的吡啶基团，这些吡啶基团可以和蛋白质表面∏-∏共轭的氨基酸基团作用，所以羧基和吡啶基团被称为识别基团；

第二、对载体进行修饰：取80-100目在二甲基亚砜中溶胀后的聚乙烯醇微球10g，加入10ml吡啶及10ml丙烯酰氯，30℃下反应4h，使得微球上的羟基接枝上丙烯酰基，之后用乙醇洗涤并过渡到水相中，即得双键修饰后的聚乙烯醇微球载体。

第三、蛋白质印迹树脂的制备：将摩尔比300∶1的第一步制备的辅助识别链和克隆的猪亲环素18蛋白质(制备见实施例3)，在10mM Tris-HCl pH＝8.0的缓冲液中于4℃进行自组装8小时，加入质量为克隆猪亲环素18蛋白质1000/3的第二步制备的湿的经过双键修饰的聚乙烯醇微球载体吸附16小时，再在上述体系中加入30％的丙烯酰胺及N，N-亚甲基双丙烯酰胺混合溶液(29％的丙烯酰胺和1％的N，N-亚甲基双丙烯酰胺)、过二硫酸铵溶液，使得交联度为1％，室温通氮除氧2h，然后加入N，N，N′N′-四甲基二乙胺，交联聚合反应2小时，用2mol.L^-1KCl溶液洗涤树脂球至电泳检测无pCyP18条带，得到蛋白质印迹树脂。

按本发明方法制备的蛋白质印迹树脂在蛋白质分离中的应用，该应用方法包括下述步骤：

第一、4℃下，将计量的上述制备的蛋白质印迹树脂直接放入猪肝提取液中，吸附15h；

第二、上步吸附蛋白后的蛋白质印迹树脂依次用10mM Tris-HCl pH8.0的缓冲液洗5次，每次2mL，再用2mL含10mM Tris-HCl pH8.0和100mM氯化钾的缓冲溶液洗涤两次，含10mMTris-HCl pH8.0和300mM氯化钾的缓冲溶液洗涤三次，含10mM Tris-HCl pH8.0和500mM氯化钾的缓冲溶液洗涤树脂两次，得到洗涤液；

第三、应用Bradford法检测上步得到的氯化钾缓冲溶液的洗涤液，得出总蛋白含量；再取800μL洗涤液，用三氯乙酸/脱氧胆酸纳TCA/DOC方法沉淀蛋白，蛋白液制样后恒流走十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用猪亲环素18的抗体对其做免疫印迹检测，吸附蛋白中亲环素18的含量，从而得出在所吸附蛋白质中亲环素18与总蛋白质含量的比值。

本发明的优点和积极效果：

本发明引入了具有羧基和吡啶两种不同识别基团多识别位点的辅助识别链，能够对蛋白质多方位多角度的识别，增加了识别位点，提高识别的专一性，更好的对目标蛋白质进行大量的高浓度富集的特异性的识别。本发明使用克隆的蛋白质作为模板，克服了印迹天然微量蛋白质时模板无法得到的瓶颈，而这一点正是蛋白质印迹技术无法取得更多的应用价值的主要困难之一。

本发明得到的蛋白质印迹树脂在天然的细胞提取物中，能够更大量的和更高浓度的富集微量目标蛋白质，蛋白质印迹树脂对目标蛋白的吸附量为600ng/g，目标蛋白质在总蛋白质中含量提高了200倍以上。

本发明本发明可做成试剂盒，即包括：辅助识别聚合物链、丙烯酰胺单体及引发体系和经过双键修饰的大孔微球。

本发明实验中还对富集的天然猪亲环素18的肽脯氨酰顺反异构酶(PPIase)活性进行了测定，结果表明天然猪亲环素18的酶活性比克隆猪亲环素18的活性高。

【附图说明】：

图1是蛋白质印迹树脂的扫描电镜照片(SEM)。

图2是蛋白质印迹树脂对目标蛋白质的吸附效果的测定，A部分是银染法电泳图，B部分是用猪亲环素18的抗体对其做免疫印迹图。

图3是天然猪亲环素18和克隆猪亲环素18的肽脯氨酰顺反异构酶(PPIase)活性的测定对比图。

【具体实施方式】：

实施例1.

第一、辅助识别链的制备：取2.3g偶氮二异丁腈(AIBN)作为引发剂，0.5ml 4-乙烯基吡啶和30ml丙烯腈(AN)作为反应单体，200ml无水乙醇作为溶剂，依次加入到预先干燥的三颈圆底烧瓶中，丙烯腈和4-乙烯基吡啶的投料量摩尔比为1∶99。反应单体丙烯腈和引发剂偶氮二异丁腈的质量比为10.6∶1。通氮气保护，电磁搅拌，80℃水浴加热，回流冷凝，反应8hr。趁热将产物倒入无水乙醇中沉淀，反复洗涤，50℃下真空干燥24hr，得到无规共聚物PANVP。取精制后的丙烯腈和4-乙烯基吡啶的无规共聚物(PANVP)2g，加入到15ml 85％(w/w)的浓硫酸中，100℃水解4h，使腈基完全水解成羧基，溶液完全澄清后，降至室温，用无水乙醇和水混合物沉淀后4000rpm离心分离，多次反复洗涤后，真空烘箱中烘24h。取2g水解后产物，加入1.76ml的DIC，2.27g的HOBT和1.14ml的烯丙醇，再加入适量的DMSO做溶剂使反应物恰能溶解，30℃水浴摇床中反应48hr。DIC、HOBT和烯丙醇的摩尔比为1∶1∶1，烯丙醇和水解后的无规共聚物的摩尔比为32∶1，产物通过溴加成-紫外分光光度法测定双键的含量，结果证实，聚合度为40的丙烯腈和4-乙烯基吡啶的无规共聚物链上有90％的羧基发生酯化反应带上双键，其余10％的羧基未发生反应不带有双键。反应完了，用乙醇沉淀，反复洗涤数次，真空干燥24hr，得到辅助识别链。

第二、对载体进行修饰：取合成好的PVA干球10g，加入适量DMSO做溶剂，加入10ml吡啶(PY)，将水浴温度降至20℃，滴加丙烯酰氯10ml，滴完后缓慢将水浴温度升至30℃反应4h。反应完了，用乙醇洗涤，乙醇浸泡过夜，乙醇洗涤三次，乙醚洗涤两次，真空干燥24h，得到接枝后的聚乙烯醇小球。

第三、蛋白质印迹树脂的制备：取前述识别分子0.24g，溶于5ml的Tris-HCl(pH8.0)的印迹缓冲液里，加入4ml共含有4mg克隆猪亲环素18(pCyP18)的蛋白质溶液，于4℃旋转结合8hr。向溶液中加入2g接枝后的聚乙烯醇球(湿球)旋转吸附12hr。加入300μl的30％(W/V)丙烯酰胺和N，N-亚甲基双丙烯酰胺和混合液(29％的丙烯酰胺和1％的N，N-亚甲基双丙烯酰胺)旋转结合2hr，再加入90μl 10％(W/V)的过二硫酸铵溶液，常温下通氮气除氧2hr。加入3.6μl N，N，N′N′-四甲基二乙胺溶液，交联聚合反应2hr，4℃过夜保温。用含10mM Tris-HCl(pH8.0)的2mol.L^-1氯化钾溶液洗涤树脂球至SDS-PAGE电泳(硝酸银染色)检测无条带，得到分子印迹树脂。

实施例2、蛋白质印迹树脂在蛋白质分离中的应用

4℃下，将上述分子印迹树脂与2mL猪肝细胞提取物(cytosol)混合，旋转吸附15hr吸附蛋白后的树脂依次用10mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液洗5次，每次2mL，再用2mL含10mMTris-HCl(pH8.0)和100mM氯化钾的缓冲溶液洗涤两次，含10mM Tris-HCl(pH8.0)和300mM氯化钾的缓冲溶液洗涤三次，含10mM Tris-HCl(pH8.0)和500mM氯化钾的缓冲溶液洗涤树脂两次，得到洗涤液。应用Bradford法检测氯化钾溶液的洗涤液以及猪肝细胞提取物溶液，得出总蛋白含量；再取800μL洗涤液，用三氯乙酸/脱氧胆酸纳(TCA/DOC)方法沉淀蛋白，蛋白液制样后恒流走十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用猪亲环素18的抗体对其做免疫印迹检测吸附蛋白中亲环素18的含量，从而得出在所吸附蛋白质中亲环素18与总蛋白质含量的比值，同样的方法亦可测得猪白细胞提取物溶液中亲环素18的含量。结果如图1，2所示：

图1：分子印迹树脂的扫描电镜照片(SEM)。

图2：A部分是银染法电泳图，B部分是用猪亲环素18的抗体对其做免疫印迹图。A和B图的泳道是上下对应的。泳道1，2分别是100mM的KCl洗脱缓冲液的第一次，第二次洗脱；泳道3，4，5分别是300mM的KCl洗脱缓冲液的第一次，第二次，第三次洗脱；泳道6，7分别是500mM的KCl洗脱缓冲液的第一次，第二次洗脱。由图可以看出，在目标蛋白猪亲环素18出现峰值的地方，即在500mM洗脱缓冲液第一次洗脱的泳道6，猪肝细胞提取物中总蛋白量并不是最多的，经检测100μL的洗脱液中总共含有蛋白质728ng，其中有120ng的猪亲环素18，所以在1ml猪肝细胞提取物中亲环素18在总蛋白质中所占比例为64.7ng/80.85μg(即0.08％)，而在1ml洗脱液中亲环素18在总蛋白质中所占比例为1.2ng/7.28ng(即16.5％)，目标蛋白质在总蛋白质中的含量提高了200倍以上。

本实验还做了重复分子印迹树脂再生性的测定，使用过的分子印迹树脂用2mol.L^-1氯化钾溶液洗涤树脂球至电泳检测无条带。加入猪肝细胞提取物，用同样的方法吸附、洗脱和检测，结果和第一次吸附效果基本一致。

溴加成-紫外分光光度法测定双键含量：

1.配制溶液

取86mL48％的氢溴酸(密度1.49)、32mL水和882mL冰乙酸，充分混合制成“对照溶液”。取500mL对照溶液，加入3.25mL溴，配得“三溴溶液”。

2.以对照溶液为参比，在410nm处测量三溴溶液的吸光度值，稳定后加入100μL识别分子溶液，稳定1分钟后测量其吸光度值。

3.根据吸光度变化，换算可知溴的减少量，从而得到识别分子溶液中双键的含量。

实施例3、克隆蛋白质猪亲环素18的制备方法：

1.目的基因的克隆

本实验采用猪肝脏mRNA为模板进行反转录PCR(RT-PCR)，并将PCR产物与质粒载体pGEX-5X1进行限制性内切酶修饰，待连接后转化入大肠杆菌DH5α中并进行质粒鉴定。

(1)在200mL的薄壁PCR管中，按下例顺序依次加入所需各组分进行PCR反应：RNA酶抑剂1μL，猪肝细胞RNA100ng，反应缓冲液25μL，正向引物10pmol。反向引物10pmol，Taq混合酶1μL，双蒸水21μL。

(2)称取0.75g琼脂糖，加入50mL 1×TAE，混匀后加热至沸腾，取出后待稍冷时加入2μL溴化乙锭(EB)溶液(10mg/mL)，将胶液倒入电泳槽的胶台上，并插入梳子；从100μL的反应体系中，取出16μL样品，加4μL 5×加样缓冲液；将20μL样品全部加入电泳胶的齿孔中，倒入1×TAE直至没过胶面，在80V下进行电泳，结束后于紫外灯下观察结果。

(3)在PCR产物中加入1/10体积的NaAc溶液(3M，pH5.2)，混匀后加入2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀20min；于4℃、12,000rpm离心15min；弃去上清，用1mL 70％乙醇洗涤；再次于4℃、12,000rpm离心15min；弃去上清，真空干燥沉淀30min，DNA量多时在管壁上呈无色透明的膜状物；加1.4μL灭菌水，使之溶解，然后按照下列配比向管中依次加入两种限制性内切酶，建立酶切体系；取2μL浓度为450ng/mL的pGEX-5X1质粒，也加入同样的两种限制性内切酶，建立酶切体系。

(4)在20μL酶切产物中加5L 5×加样缓冲液，混匀、离心。灌制浓度为1.5％的琼脂糖凝胶，上样，80V下进行电泳。等染料前沿走至胶的一半时，在紫外灯下观察，迅速将目的条带切下；将凝胶块放入充满1×TAE电泳缓冲液的透析袋内一侧，放入电泳槽使凝胶一侧靠近负极，80V电泳，使DNA在电场的作用下从凝胶迁移到缓冲液中。电泳1h后，加反向电压100V，反洗脱60sec；将透析袋中的液体吸入一灭菌的1.5mL离心管中(约500μL)，加等体积的三合一酚，剧烈振荡10sec，室温离心15sec，将上层含DNA的水相转入另一新管中；加入等体积的氯仿，剧烈振荡10sec，离心15sec，将上层含DNA的水相转入另一新管中；加入1/10体积的NaAC(3M，pH5.2)溶液，稍振荡后加入2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀20min；于4℃、12,000rpm离心15min；弃去上清，加入1mL 70％无水乙醇，洗涤沉淀；再次于4℃、12,000rpm离心15min；弃去上清，真空干燥DNA沉淀30min；将干燥的沉淀溶于实验所需量的水中；pGEX-5X1质粒的酶切产物也做相同处理；取待插入的DNA和质粒DNA，建立连接体系。

(5)挑取E.Coli.DH5α原菌的单克隆菌落于2mL LB培养基中，37℃过夜培养；次日将菌液1∶100稀释到50mL新鲜的LB培养基中，37℃继续振荡培养至菌液的OD600值为0.3(约4-6小时)；将50mL菌液分装至两个灭菌的离心管中，在冰上放置10min，于4℃、4,000rpm离心10min；弃上清用10mL冰预冷的10mMNaCl重悬细菌沉淀；于4℃、4,000rpm离心10min；弃上清，用10mL冰预冷的50mM CaCl2重悬细菌并冰上放置20min；于4℃、4,000rpm离心10min；弃上清，加1mL冰预冷的50mM CaCl2重悬细胞，即为感受态细胞。可将制得的感受态细胞以200mL(含15％甘油)分装，-80℃冻存；

(6)取200μL感受态细胞，加5μL连接产物，轻旋混匀；同时另取200μL感受态细胞，完全不加DNA作为负对照，于冰上放置1hr；42℃水浴加热90sec后迅速转移至冰水中冷却1～2min；每管补加800mL的LB培养基，37℃温育45min使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素标记基因；取含目的DNA的菌液200μL涂于AMP(50μg/mL)固体培养基平皿上，剩余800μL涂于另一平皿上，而不加DNA的菌液取500μL涂于一平皿上作为对照；将平皿置于无菌洁净工作台中至液体完全被吸收，然后倒置平皿，于恒温培养箱中37℃培养12～16hr。

(7)挑取平板上某一单克隆，加入液体LB培养基2mL，过夜培养。将菌液在一新的平板上画线过夜培养后贮存于4℃。其余菌液取10μL Glutathione SepharoseTM 4B珠子混合后电泳进行小样蛋白检测。

2.目的蛋白的诱导表达及提纯

(1)挑取单菌落于20mL LB/AMP(5.0μg/mL)培养基中，37℃过夜培养。

(2)次日按1∶100稀释到2L新鲜的LB/AMP(5.0μg/mL)培养基中，37℃继续培养至OD600值为0.4～0.6(约7～8h)。

(3)达到确定的OD600值后，将培养温度调至20℃，继续培养30min。

(4)加IPTG至终浓度为0.1mM，20℃诱导1～2h。

(5)将培养物于4℃、5,000rpm离心15min，弃上清并倒置数分钟使残留液体流尽，用少量冰预冷的MTPBS洗涤细胞1～2次，离心去除洗涤液。

(6)用相当于1/50～1/100培养体积的MTPBS重悬细胞，加PMSF至终浓度为0.1mM并挑加少量溶菌酶，于液氮及37℃水浴中反复冻融3次以破碎细胞。

(7)挑加DNase，反复颠倒几次，以解离双链DNA，使细菌裂解液的粘度明显降低。

(8)按1∶100(v/v)的比例加入TritonX-100，4℃旋转混合30min，以促进蛋白溶解性。

(9)4℃，10,000rpm离心10min(可适当加大离心转速和时间，这有利于细胞的破碎)。

(10)收集上清，沉淀和上清分别取样待故电泳检测。

(11)上清中加入预溶胀过的亲和层析珠Glutathione SepharoseTM 4B 100～20.0μL(珠体积)，4℃旋转结合40～60min。

(12)自然沉降或稍做离心，去上清，珠子用预冷的MTPBS洗涤3～4次。

(13)珠子用预冷的50mMTris·Cl(pH8.0)平衡1～2次。

(14)将珠子小心地转移至1.5mL离心管中，定容后取样作蛋白含量测定。

(15)珠子用凝血因子Xa的缓冲液洗涤3～4次。

(16)根据电泳图估算珠子上融合蛋白的含量，加入5.0μL(0.5u/μL)凝血因子Xa和45.0μL凝血因子Xa缓冲液，4℃酶切16h。

(17)将珠子稍离心，上清转移至一干净离心管中；再离心，上清转移至另一干净管中；再一次离心，上清即为所要的蛋白溶液。这样反复离心是为了彻底除去蛋白溶液中残留的珠子。

(18)在珠子中加入50.0μL凝血因子Xa缓冲液，温和振荡洗涤珠子。如步骤3取上清。

(19)洗涤珠子6次，得到六个蛋白样品。从每个样品中各取出1.0μL加1.0μL2×SDS样品缓冲液，电泳检测切下的目的蛋白含量。

三氯乙酸/脱氧胆酸纳(TCA/DOC)沉淀蛋白质方法

材料：5％脱氧胆酸钠溶液

30％三氯乙酸溶液

3.2M氢氧化钠溶液

4.十二烷基磺酸钠(1×SDS)样品缓冲液组成：

Tris·Cl(pH6.8)        50mM

DTT(二硫苏糖醇)        100mM

SDS                    2％

溴酚蓝                 0.1％

甘油                   10％

步骤：1.向1mL上述各蛋白液中加入10μL 5％脱氧胆酸钠溶液后混匀，然后加480μL 30％三氯乙酸，混匀后于4℃放置2h或冰浴中放置30min。

2.4℃、10,000rpm离心25min，去上清。

3.10,000rpm离心25min，去尽残留液体。

4.沉积物中加入50μL一倍样品液重悬，如果呈黄色或有沉淀，则加1～2μL2M氢氧化钠溶液将颜色调至蓝色并使之完全溶解。

5.99℃煮沸5min，3000rpm离心10s后即可直接上样走电泳。

实施例4.

肽脯氨酰顺反异构酶(PPIase)活性的测定：用标准的糜蛋白酶法通过紫外测定克隆以及天然猪亲环素18的肽脯氨酰顺反异构酶活性。测定溶液为50mM Hepes，PH8.0，100mM NaCl，加入克隆以及天然猪亲环素18终浓度为40nM在比色皿中预冷到4℃。加入糜蛋白酶终浓度为30μM，然后加入多肽(Suc-Val-Pro-Phe-pNA)溶于LiCl/THF溶液中使终浓度为45μM引发反应，快速搅拌后测定在390nm处测定对硝基苯胺的产生，直到反应完成。

图3：由图中可以看出，▲代表天然猪亲环素18的肽脯氨酰顺反异构酶(PPIase)活性的测定结果；■克隆猪亲环素18肽脯氨酰顺反异构酶(PPIase)活性的测定结果；●代表空白对比实验。通过计算得出天然猪亲环素18的k_cat/K_M＝1.0×10⁵ M^-1s^-1；克隆的猪亲环素18的k_cat/K_M＝0.85×10⁵M^-1s^-1。由此可见，天然猪亲环素18的酶活性比克隆的猪亲环素18的活性高。

Claims (1)

1.一种带双重识别基团聚合物链的蛋白质印迹树脂的制备方法，其特征是该方法包括：

第一、辅助识别链的制备：在80℃下，以偶氮二异丁腈AIBN为引发剂，丙烯腈和4-乙烯基吡啶为反应单体，其中丙烯腈和4-乙烯基吡啶投料量摩尔比为1∶99，无水乙醇为溶剂，自由基聚合反应8h，制得聚合度为35-40的无规共聚物；在85％的浓硫酸中W/W，100℃水解4h，沉淀，洗涤，分离，室温下真空干燥24hr；30℃下，在N，N-二异丙基碳二亚胺DIC和1-羟基苯并三氮唑HOBT的作用下，将烯丙醇缓慢滴加至水解后的无规共聚物的二甲基亚砜DMSO溶液中，反应48hr，用乙醇沉淀，反复洗涤数次，得到辅助识别链；

第二、对载体进行修饰：取80-100目在二甲基亚砜中溶胀后的聚乙烯醇微球10g，加入10ml吡啶及10ml丙烯酰氯，30℃下反应4h，使得微球上的羟基接枝上丙烯酰基，之后用乙醇洗涤并过渡到水相中，即得双键修饰后的聚乙烯醇微球载体；

第三、蛋白质印迹树脂的制备：将摩尔比300∶1的第一步制备的辅助识别链和克隆的猪亲环素18蛋白质，在10mM Tris-HCl pH＝8.0的缓冲液中于4℃进行自组装8小时，加入质量为克隆猪亲环素18蛋白质1000/3的第二步制备的湿的经过双键修饰的聚乙烯醇微球载体吸附16小时，再在上述体系中加入丙烯酰胺及N，N-亚甲基双丙烯酰胺混合溶液、过二硫酸铵溶液，室温通氮除氧2h，然后加入N，N，N′，N′-四甲基二乙胺，交联聚合反应2小时，用2mol.L^-1KCl溶液洗涤树脂球至电泳检测无猪亲环素18蛋白质条带，得到蛋白质印迹树脂。

2、按权利要求1所述方法制备的蛋白质印迹树脂在蛋白质分离中的应用，其特征在于，

第一、4℃下，将计量的权利要求1制备的蛋白质印迹树脂直接放入猪肝提取液中，吸附15h；

第二、上步吸附蛋白后的蛋白质印迹树脂依次用10mM Tris-HCl pH8.0的缓冲液洗5次，每次2mL，再用2mL含10mM Tris-HCl pH8.0和100mM氯化钾的缓冲溶液洗涤两次，含10mMTris-HCl pH8.0和300mM氯化钾的缓冲溶液洗涤三次，含10mM Tris-HCl pH8.0和500mM氯化钾的缓冲溶液洗涤树脂两次，得到洗涤液；

第三、应用Bradford法检测上步得到的氯化钾缓冲溶液的洗涤液，得出总蛋白含量；再取800μL洗涤液，用三氯乙酸/脱氧胆酸纳TCA/DOC方去沉淀蛋白，蛋白液制样后恒流走十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用猪亲环素18的抗体对其做免疫印迹检测，吸附蛋白中亲环素18的含量，从而得出在所吸附蛋白质中亲环素18与总蛋白质含量的比值。

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