CN101171039B - 酶和受体调节 - Google Patents

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Abstract

将α氨基酸酯共价偶联于靶胞内酶或受体的活性调节物，其中该偶联物的酯基可被一种或多种胞内羧酸酯酶水解成相应酸，导致在细胞中累积此羧酸水解产物，并能相对于未偶联调节物提高或延长酶或受体的调节作用。

Description

酶和受体调节
本发明涉及提高或延长化合物活性的总方法，该方法通过将α氨基酸酯基序共价偶联于调节物调节胞内酶或受体的活性。本发明也涉及与α氨基酸酯基序共价偶联的调节物，以及相对于母体非偶联调节物具有更优特性的这种调节物的鉴定方法。本发明还涉及含有能够允许在单核细胞-巨噬细胞谱系的细胞内选择性累积氨基酸偶联物氨基酸酯基序的调节物的应用。
发明背景
许多胞内酶和受体是药学上有用的药物的靶点，这些药物能通过结合于胞内酶和受体的活性位点调节其活性。例子见下表1。为了到达靶酶和受体，调节化合物一定得由血浆/胞外液体穿过细胞膜。通常，与带电物质相比，电中性的调节物能更容易地穿过细胞膜。然后建立动态平衡，即调节物在血浆和细胞内部之间达到平衡。平衡的结果是，许多胞内酶和受体调节物的胞内停留时间和浓度常常非常低，尤其是在调节物从血浆中快速清除的情况下。因此，调节物的效力很差，尽管它们与靶酶或受体的亲和力高。
因此，需要了解一种方法是否可用于提高给定的胞内酶或受体调节物的胞内浓度。这会导致效力增加，并且通过延长调节物在细胞内的停留时间可导致药代动力学和药效学特性提高。可实现更一致的接触和减少给药频率。如果药物可靶向产生其治疗作用的特定靶细胞则可进一步获益，通过减少全身接触而减轻副作用。
发明概述
本发明提供了这种方法，并描述了掺入根据该方法所依据的结构原理的改进的调节物。它利用了亲脂性(低极性或电中性)分子能更容易地通过细胞膜并进入细胞、而亲水性(高极性、带电)分子则不的特性。因此，如果亲脂性基序连接于给定调节物，允许调节物进入该细胞，并且如果该基序在该细胞中转变为极性更高的部分，预计连接有极性更高的基序的调节物能在该细胞内累积。如果这种基序与该调节物的连接方式不能改变其与靶酶或受体的结合方式，预计连接有极性更高的基序的调节物的累积能导致活性延长和/或增加。
本发明利用了细胞内有羧酸酯酶的事实，这种酶可用于水解将给定调节物连接于母体酸的α氨基酸酯基序。因此，可以与α氨基酸酯的共价偶联物形式给予调节物，在这种形式下它能容易地进入细胞，在细胞中被一种或多种胞内羧酸酯酶有效水解，得到的α氨基酸-调节物偶联物在细胞内累积，从而提高总效力和/或活性停留时间。也发现，通过修饰α氨基酸基序或其偶联方式，调节物可靶向单核细胞和巨噬细胞。其中，除非具体说明“单核细胞”，术语巨噬细胞将用于指代巨噬细胞(包括肿瘤相关性巨噬细胞)和/或单核细胞。
发明详述
因此，在一个总的方面，本发明提供了一种α氨基酸酯和靶胞内酶或受体的活性调节物的共价偶联物(coniugate)，其中：该偶联物的酯基可用一种或多种胞内羧酸酯酶水解成相应酸；α氨基酸酯在远离该调节物和其靶酶或受体之间的结合界面的位置上共价偶联于该调节物，和/或与该调节物偶联时，该调节物和所述相应酸的偶联物(the conjugatedmodulator and the said corresponding acid)与靶酶或受体的结合模式与未偶联调节物相同。
另一方面，本发明提供了一种增加或延长靶胞内酶或受体的活性调节物的胞内效力和/或停留时间的方法，所述方法包括通过将α氨基酸酯在远离该调节物与其靶酶或受体的结合界面的位置上共价偶联于该调节物，对该调节物进行结构修饰，和/或以使该调节物和所述相应酸的偶联物与靶酶或受体的结合模式与未偶联调节物相同，所述偶联物的酯基可被一种或多种胞内羧酸酯酶水解成相应酸。
如上所述，本发明涉及修饰胞内酶或受体的调节物。虽然本发明的原理是通用的，不受调节物的化学种类或靶酶或受体的种类的限制，但该调节物强烈优选为通过可逆结合于靶酶或受体行使其作用的调节物，而不优选其作用是由于与靶酶或受体共价结合的调节物。
由于在实用性中，需要羧酸酯酶水解的偶联物保持母体调节物与其靶酶或受体的胞内结合活性，所以酯基序(ester motif)的连接必须考虑这个要求，如果将α氨基酸羧酸酯酶酯基序连接于调节物时，相应的羧酸酯酶水解产物(即相应酸)与靶点的结合方式与未偶联调节物基本相同，则满足了这个要求。通常，可通过将羧酸酯酶酯基序在远离该调节物其靶酶或受体的结合界面的位置上共价连接于该调节物实现此目的。以此方式，设计该基序使其延伸到溶剂中，而非可能干扰结合模式。
此外，如果氨基酸羧酸酯酶基序要被细胞内的羧酸酯酶水解，氨基酸羧酸酯酶基序显然必须是羧酸酯酶的底物。通常，胞内羧酸酯酶相当杂乱，因为它们的水解能力不取决于对氨基酸酯底物非常严格的结构要求。因此，氨基酸羧酸酯酶基序与调节物的大多数共价偶联方式都能被水解。通常通过柔性接头链连接来实现此目的。
应理解，药物的任何化学修饰都会在一定程度上改变其结合几何结构，连接羧酸酯酶酯基序的化学方案可引入与靶点的其它结合作用，或可取代一种或多种这种相互作用。因此，需要水解偶联物与靶点的结合方式与未偶联调节物相同可解释为需要对结合模式无显著影响，换言之，该结合模式与未偶联调节物基本相同。满足了这种要求时，母体调节物的主要结合特征被保留，修饰和未修饰的调节物的结合特征大体相同。“相同的结合模式”和“远端连接”的观点相似，因为如上所述，实现“相同的结合模式”要求的通常方式就是在该调节分子的远离抑制剂和靶酶或受体之间结合界面的点上连接羧酸酯酶基序。然而应注意，这些要求并不表示该偶联物和/或其相应酸的体外或体内调节效力一定要与母体调节物相同。然而通常优选的是，酯酶水解的羧酸在体外酶-或受体-结合实验中的效力不低于母体调节物在该实验中效力的十分之一，该酯在细胞活性实验中的效力至少与母体调节物在同一实验中的效力同样高。
虽然对结构-活性关系进行绘图的传统医学化学方法能够完美地鉴定能满足上述“相同的结合模式”和“远端连接”要求的连接方案，但现代技术如NMR和X-线结晶学已经发展到了解或测定酶或受体的已知调节物的结合模式非常普通的程度。这种信息大多数属于公共资源，或者可用计算机建模方法如配体停靠和同源性建模、根据结构上相似的调节物的已知结合模式或靶酶或受体的活性位点的已知结构进行建模。通过了解以这些技术获得的调节物结合模式，可鉴定羧酸酯酶酯基序的适当连接位置，通常(如上所述)在调节物的远离抑制剂和靶酶或受体之间的结合界面的点上。
能够将偶联的α氨基酸的酯基水解成相应酸的胞内羧酸酯酶包括三种已知的人羧酸酯酶(“hCE”)同种型hCE-1(也称为CES-1)、hCE-2(也称为CES-2)和hCE-3(DrugDisc.Today 2005，10，313-325)。虽然认为它们是主要的酶，但其它羧酸酯酶如联苯基水解酶(BPH)也可在水解该偶联物中起作用。
下述破碎细胞实验是验证给定的调节物和α氨基酸酯的偶联物或准备评价为可能的羧酸酯酶酯基序的给定的α氨基酸酯是否按需水解的简单方法。这些酶也不难用重组技术表达，该重组酶可用于测定或验证是否发生了水解。
本发明特征之一是所需偶联物在细胞内被羧酸酯酶水解时保留了共价连接的α氨基酸基序，因为该基序的极性羧基防止或减少水解偶联物从细胞中清除，从而使其在细胞内累积。事实上，修饰调节物的细胞效力主要是由于该酸的累积和它对靶点活性的调节(但未水解的酯也对靶点行使其活性，只要它还未水解)。由于细胞通常含有几种类型的肽酶，所以该偶联物、更具体是水解的偶联物(相应酸)优选不是这种肽酶的底物。具体说，强烈优选该α氨基酸酯基不应是该偶联物中二肽基序的C末端元件。然而，除了对共价连接模式的限制以外，α氨基酸酯基可通过其氨基或其α碳共价连接于该调节物。在一些情况下，该调节物具有与羧酸酯酶酯基序连接的方便的连接点，在其它情况下，设计一种用于连接的合成方案。
已发现，如果α氨基酸基团的氮未取代或直接连接于羰基，仅表达羧酸酯酶hCE-2和/或hCE-3和这些酶的重组形式的细胞仅能将氨基酸酯偶联物水解成其得到的酸，而含有hCE-1或重组hCE-1的细胞可水解氮上连有各种基团的氨基酸偶联物。在需要调节物仅靶向某些细胞类型中的酶或受体的情况下，hCE-2和hCE-3的这种选择性要求可转变为优点。已发现，这三种羧酸酯酶的相对量在不同细胞类型中不同(参见图1和http:/symatlas.gnf.org/SymAtlas的数据库(需要注意在这个数据库中hCE3/CES3用符号FLJ21736表示))。如果想让该调节物仅在发现hCE-1的细胞类型中起作用，连接其中氨基直接连接于不同于羰基的基团的羧酸酯酶酯基序导致水解的调节物偶联物优选在含有有效浓度的hCE-1的细胞中累积。如另一种方式所述，在表达hCE-1的细胞中实现衍生自调节物偶联物的酸的特定累积可通过将氨基酸酯基序连接于调节物时，使氨基酸酯的氮原子不直接连接于羰基、或使其不被取代而实现。
已知巨噬细胞通过释放细胞因子，具体是TNFα和IL-1在炎性疾病中起到关键作用(van Roon等，Arthritis and Rheumatism，2003，1229-1238)。在类风湿性关节炎中，它们是关节炎和关节损伤的罪魁(Conell，N.Eng J.Med.2004，350，2591-2602)。巨噬细胞也参与了肿瘤生长和发育(Naldini和Carraro，Curr Drug Targets InflammAllergy，2005，3-8)。因此，选择性靶向巨噬细胞的药物可能在癌症、炎症和自身免疫病的治疗中很有价值。预计靶向特定细胞类型能减轻副作用。本发明涉及将调节物靶向巨噬细胞的方法，该方法基于上述发现，即羧酸酯酶酯基序连接于调节物的方式决定了它能否被特定羧酸酯酶水解，因此决定了得到的酸能否在不同细胞类型中累积。具体说，已发现巨噬细胞含有人羧酸酯酶hCE-1，但其它细胞类型不含这种酯酶。在本发明的偶联物中，当酯基序的氮被取代而不直接连接于羰基部分时，该酯仅被bCE-1水解，因此酯酶水解的调节物偶联物仅在巨噬细胞中累积。
当然，有许多种可能的酯基可能主要存在于羧酸酯酶酯基序上，用于连接于调节物。同样，有许多种α碳上侧链不同的天然和非天然α氨基酸，它们可用作羧酸酯酶酯基序的酯。一些α氨基酸酯可被hCE-1、-2和-3同种型或含有这些酶的细胞中的一种或多种快速水解，而其它酯水解得较慢，或者水解程度非常小。通常，如果该羧酸酯酶能将游离的氨基酸酯水解成母体酸，那么根据上述hCE-2和hCE-3的N-羰基依赖性，它也能水解共价连接于调节物的酯基序。因此，本文所述破碎细胞实验和/或分离的羧酸酯酶实验能够直接、快速和简单地初次筛选具有所需水解特征的酯。然后，通过选择的偶联化学偶联于调节物时，在同一羧酸酯酶实验中再次测定以此方式选择的酯基序，以验证它仍然是背景中的羧酸酯酶底物。下面讨论合适的酯类型，但此时应注意，已发现α氨基酸的叔丁酯是相对较差的hCE-1、-2和-3的底物，而环戊酯被有效水解。下面也将更详细地讨论合适的α氨基酸，但此时应注意，苯丙氨酸、高苯丙氨酸、苯基甘氨酸和亮氨酸通常是合适的，优选仲醇的酯。
如上所述，α氨基酸酯可通过氨基酸酯的氨基或通过氨基酸酯的α碳(如通过其侧链)偶联于调节物。接头基团可存在于羧酸酯酶酯基序和调节物之间。例如，α氨基酸酯可作为式(IA)、(IB)或(IC)的基团偶联于调节物：
式中：
Figure S2006800149819D00051
R1是可被一种或多种胞内羧酸酯酶水解成羧酸基团的酯基；
R2的天然或非天然α氨基酸的侧链；
R4是氢；或任选取代的C1-C6烷基、C3-C7环烷基、芳基或杂芳基或-(C＝O)R3、-(C＝O)OR3或-(C＝O)NR3，其中R3是氢或任选取代的(C1-C6)烷基；
B是5或6个环原子的单环杂环，式中R1连接于与所示环氮相邻的环碳，环B任选稠合于5或6个环原子的第二个碳环或杂环，在这种情况下至L的键可来自所述第二个环的环原子；
Y是键、-C(＝O)-、-S(＝O)2-、-C(＝O)O-、-C(＝O)NR3-、-C(＝S)-NR3-、-C(＝NH)NR3-或-S(＝O)2NR3-，其中R3是氢或任选取代的C1-C6烷基；
Y1是键、-(C＝O)-、-S(O2)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-(C＝O)NR3-、-NR3(C＝O)-、-S(O2)NR3-、-NR3S(O2)-或-NR3(C＝O)NR5-，其中R3和R5独立地是氢或任选取代的(C1-C6)烷基，
L是式-(Alk1)m(Q)n(Alk2)p-的二价基团，其中：
m、n和p独立地是0或1，
Q是(i)含有5-13个环成员的任选取代的二价单环或双环碳环或杂环基团，或者(ii)在m和p都是0的情况下，是式-X2-Q1-或-Q1-X2-的二价基团，其中X2是-O-、-S-或NRA-，其中RA是氢或任选取代的C1-C3烷基，并且Q1是含有5-13个环成员的任选取代的二价单环或双环碳环或杂环基团，
Alk1和Alk2独立地代表任选取代的二价C3-C7环烷基，或任选取代的直链或支链的C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基或C2-C6亚炔基，它们可任选地含有或终止于醚(-O-)、硫醚(-S-)或氨基(-NRA-)键(link)，其中RA是氢或任选取代的C1-C3烷基；
X代表键、-C(＝O)-、-S(＝O)2-、-NR3C(＝O)-、-C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)NR5-、-NR3S(＝O)2-或-S(＝O)2NR3-，其中R3和R5独立地是氢或任选取代的C1-C6烷基；
z是0或1；
s是0或1；和
Alk3代表任选取代的二价C3-C7环烷基，或者任选取代的直链或支链的C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基或C2-C6亚炔基，它们可任选地含有或终止于醚(-O-)、硫醚(-S-)或氨基(-NRA-)键，其中RA是氢或任选取代的C1-C3烷基；
术语“酯”或“酯化羧基”指R9O(C＝O)-基团，其中R9是表征酯的基团，显然衍生自醇R9OH。
本文所用术语“(Ca-Cb)烷基”(a和b是整数)指含有a-b个碳原子的直链或支链烷基。因此，当a是1和b是6时，例如，该术语包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基和正己基。
本文所用术语“二价(Ca-Cb)亚烷基”(a和b是整数)指含有a-b个碳原子和两个未满足价态的饱和烃链。
本文所用术语“(Ca-Cb)烯基”(a和b是整数)指含有具有至少一个双键的a-b个碳原子的直链或支链烯基部分，如果可以，该基团可以是E或Z立体化学。该术语包括(例如)乙烯基、烯丙基、1-和2-丁烯基和2-甲基-2-丙烯基。
本文所用术语“二价(Ca-Cb)亚烯基”指含有具有至少一个双键的a-b个碳原子和两个未满足价态(unsatisfied valences)的烃链。
本文所用术语“Ca-Cb炔基”(a和b是整数)指含有2-6个碳原子和一个三键的直链或支链烃基。此术语应包括(例如)乙炔基、1-丙炔基、1-和2-丁炔基、2-甲基-2-丙炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基和5-己炔基。
本文所用术语“二价(Ca-Cb)亚炔基”(a和b是整数)指含有2-6碳原子和至少一个三键的二价烃链。
本文所用术语“碳环”至含有多达16个环原子的单、双或三环基团，这些环原子都是碳，所述碳环包括芳基和环烷基。
本文所用术语“环烷基”指含有3-8个碳原子的单环饱和碳环基团，包括例如：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。
本文所用绝对(unqualified)术语“芳基”指单环、双环或三环碳环芳基，包括含有两个通过共价键直接连接的单碳环芳环的基团。这种基团的例子是苯基、联苯基和萘基。
本文所用绝对术语“杂芳基”指含有一个或多个选自S、N和O的杂原子的单环、双环或三环芳基，包括含有两个这种单环、或一个这种单环和一个单芳环的基团，这些环通过共价键直接连接。这种基团的例子是噻吩基、苯并噻吩基、呋喃基、苯并呋喃基、吡咯基、咪唑基、苯并咪唑基、噻唑基、苯并噻唑基、异噻唑基、苯并异噻唑基、吡唑基、
Figure 2006800149819_0
唑基、苯并唑基、异唑基、苯并异
Figure 2006800149819_3
唑基、异噻唑基、三唑基、苯并三唑基、噻二唑基、
Figure 2006800149819_4
二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、吲哚基和吲唑基。
本文所用绝对术语“杂环基”或“杂环”包括上述“杂芳基”，在非芳族含义中，这些术语涉及含有一个或多个选自S、N和O的杂原子的单环、双环或三环非芳族基团，并涉及含有一个或多个这种杂原子的单环非芳族基团组成的基团，它共价连接于另一个这种基团或单碳环基团。这种基团的例子是吡咯基、呋喃基、噻吩基、哌啶基、咪唑基、
Figure 2006800149819_5
唑基、异
Figure 2006800149819_6
唑基、噻唑基、噻二唑基、吡唑基、吡啶基、吡咯烷基、嘧啶基、吗啉基、哌嗪基、吲哚基、吗啉基、苯并呋喃基、吡喃基、异
Figure 2006800149819_7
唑基、苯并咪唑基、亚甲基二羟苯基、亚乙基二羟苯基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺基。
除非文中出现时另有说明，用于本文所述任何部分的术语“取代”指用至多四个相容性取代基取代，各自独立地可以是(例如)(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、羟基、羟基(C1-C6)烷基、巯基、巯基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷硫基、苯基、卤素(包括氟、溴和氯)、三氟甲基、三氟甲氧基、硝基、腈(-CN)、氧代、-COOH、-COORA、-CORA、-SO2RA、-CONH2、-SO2NH2、-CONHRA、-SO2NHRA、-CONRARB、-SO2NRARB、-NH2、-NHRA、-NRARB、-OCONH2、-OCONHRA、-OCONRARB、-NHCORA、-NHCOORA、-NRBCOORA、-NHSO2ORA、-NRBSO2OH、-NRBSO2ORA、-NHCONH2、-NRACONH2、-NHCONHRB、-NRACONHRB、-NHCONRARB或-NRACONRARB，其中RA和RB独立地是(C1-C6)烷基、(C3-C6)环烷基、苯基或含有5或6个环原子的单环杂芳基。“任选的取代基”可以是上述取代基中的一种。
术语“天然或非天然α-氨基酸的侧链”指式NH2-CH(R1)-COOH的天然或非天然氨基酸中的R1基团。
天然α氨基酸的侧链的例子包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、5-羟基赖氨酸、4-羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、α-氨基己二酸、α-氨基-正丁酸、3，4-二羟基苯丙氨酸、高丝氨酸、α-甲基丝氨酸、鸟氨酸、哌可酸和甲状腺素的侧链。
其特征性侧链中含有官能取代基如氨基、羧基、羟基、巯基、胍基、咪唑基或吲哚基的天然α-氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、色氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸。当本发明化合物中的R2是这些侧链之一时，可任选地保护官能取代基。
提及天然α-氨基酸的侧链中的官能取代基时所用的术语“保护”指基本无功能的这种取代基的衍生物。例如，羧基可酯化(如酯化为C1-C6烷基酯)，氨基可转化为酰胺(如转化为NHCOC1-C6烷基酰胺)或氨基甲酸酯(如转化为NHC(＝O)OC1-C6烷基或NHC(＝O)OCH2Ph氨基甲酸酯)，羟基可转变为醚(如OC1-C6烷基或O(C1-C6烷基)苯基醚)或酯(如OC(＝O)C1-C6烷基酯)，巯基可转变为硫醚(如叔丁基或苄基硫醚)或硫酯(如SC(＝O)C1-C6烷基硫酯)。
非天然α氨基酸的侧链的例子包括以下在用于本发明化合物的合适R2基团的讨论中提及的侧链。
酯基R1
除了酯基必须能被一种或多种胞内酶水解的要求以外，对于某些应用(例如全身给予该偶联物)优选的可能是该酯基能抵抗血浆中羧酸酯-水解酶的水解作用，因为这能保证该偶联调节物在全身给药后存活足够长的时间，以作为酯穿过细胞。通过在血浆中培育检测任何给定偶联物以测定其作为酯的血浆半衰期很简单。然而已发现，与衍生自伯醇的酯相比，显然衍生自仲醇的酯对血浆羧酸酯水解酶更稳定。而且已发现，虽然显然衍生自叔醇的酯通常对血浆羧酸酯水解酶很稳定，但它们常常也对胞内羧酸酯酶相对稳定。考虑到这些发现，目前优选，上式(IA)、(IB)和(IC)中的R1是式-(C＝O)OR9的酯基，其中R9是(i)R7R8CH-，其中R7是任选取代的(C1-C3)烷基-(Z1)a-(C1-C3)烷基-或(C2-C3)烯基-(Z1)a-(C1-C3)烷基-，其中a是0或1，Z1是-O-、-S-或-NH-，R8是氢或(C1-C3)烷基-或R7和R8与它们连接的碳一起形成任选取代的C3-C7环烷基环或5-或6-个环原子的任选取代的杂环；或(ii)含有5或6个环原子的任选取代的苯基或单环杂环。在这些类别中，R9可以是(例如)甲基、乙基、正或异丙基、伯或仲丁基、环己基、烯丙基、苯基、苄基、2-、3-或4-吡啶基甲基、N-甲基哌啶-4-基、四氢呋喃-3-基或甲氧基乙基。目前优选的是R9为环戊基。
氨基酸侧链R2
关于酯基R1能被胞内羧酸酯酶水解的要求，侧链基团R2的选择可决定水解速率。例如，R2中与α氨基酸碳相邻的碳不含支链，例如，与R2有支链如异丙基或叔丁基时相比，R2为乙基、异丁基或苄基时，酯更易水解。
氨基酸侧链的例子包括C1-C6烷基、苯基、2-、3-或4-羟基苯基、2-、3-或4-甲氧基苯基、2-、3-或4-吡啶基甲基、苄基、苯乙基、2-、3-或4-羟基苄基、2-、3-或4-苄氧基苄基、2-、3-或4-C1-C6烷氧基苄基和苄氧基(C1-C6烷基)-；
天然α氨基酸的表征基团，其中任何官能团均可被保护；
基团-[Alk]nR6，其中Alk是任选插入了一个或多个-O-或-S-原子或-N(R7)-基团[其中R7是氢原子或(C1-C6)烷基]的(C1-C6)烷基或(C2-C6)烯基，n是0或1，R6是任选取代的环烷基或环烯基；
用式-OCH2COR8的基团在苯环中取代的苄基，其中R8是羟基、氨基、(C1-C6)烷氧基、苯基(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基氨基、二((C1-C6)烷基)氨基、苯基(C1-C6)烷基氨基、氨基酸或酰基卤残基，它们的酯或酰胺衍生物，所述残基通过酰胺键连接，所述氨基酸选自：甘氨酸、α或β丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；
未取代或用卤素、硝基、羧基、(C1-C6)烷氧基、氰基、(C1-C6)烷酰基、三氟甲基(C1-C6)烷基、羟基、甲酰基、氨基、(C1-C6)烷基氨基、二(C1-C6)烷基氨基、巯基、(C1-C6)烷硫基、羟基(C1-C6)烷基、巯基(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷基苯甲基在杂环中单取代或双取代的杂环(C1-C6)烷基；和
-CRaRbRc基团，其中：
Ra、Rb和Rc各自独立地是氢、(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、苯基(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基；或
Rc是氢，且Ra和Rb独立地是苯基或杂芳基如吡啶基；或
Rc是氢、(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、苯基(C1-C6)烷基或(C3-C8)环烷基，且Ra和Rb与它们连接的碳原子一起形成3-8元环烷基或5-6元杂环；或
Ra、Rb和Rc与它们连接的碳原子一起形成三环(例如金刚烷基)；或
Ra和Rb各自独立地是(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、苯基(C1-C6)烷基，或者是下述Rc中除氢以外的基团，或者Ra和Rb与它们连接的碳原子一起形成环烷基或杂环，Rc是氢、-OH、-SH、卤素、-CN、-CO2H、(C1-C4)全氟烷基、-CH2OH、-CO2(C1-C6)烷基、-O(C1-C6)烷基、-O(C2-C6)烯基、-S(C1-C6)烷基、-SO(C1-C6)烷基、-SO2(C1-C6)烷基、-S(C2-C6)烯基、-SO(C2-C6)烯基、-SO2(C2-C6)烯基或-Q-W基团，其中Q代表键或-O-、-S-、-SO-或-SO2-，W代表苯基、苯基烷基、(C3-C8)环烷基、(C3-C8)环烷基烷基、(C4-C8)环烯基、(C4-C8)环烯基烷基、杂芳基或杂芳基烷基，其中W基团可任选地用一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自：羟基、卤素、-CN、-CO2H、-CO2(C1-C6)烷基、-CONH2、-CONH(C1-C6)烷基、-CONH(C1-C6烷基)2、-CHO、-CH2OH、(C1-C4)全氟烷基、-O(C1-C6)烷基、-S(C1-C6)烷基、-SO(C1-C6)烷基、-SO2(C1-C6)烷基、-NO2、-NH2、-NH(C1-C6)烷基、-N((C1-C6)烷基)2、-NHCO(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、(C3-C8)环烷基、(C4-C8)环烯基、苯基或苄基。
具体R2基团的例子包括苄基、苯基、环己基甲基、吡啶-3-基甲基、叔丁氧基甲基、异丁基、仲丁基、叔丁基、1-苄硫基-1-甲基乙基、1-甲硫基-1-甲基乙基和1-巯基-1-甲基乙基、苯乙基。目前优选的R2基团包括苯基、苄基、叔丁氧基甲基、苯乙基和异丁基。
R4基团
如上所述，如果想让调节物仅作用于存在hCE-1的细胞类型如巨噬细胞，应取代羧酸酯酶酯基序的氨基，以使其直接连接于不同于羰基的基团。在这种情况下，R4可以任选地是取代的C1-C6烷基、C3-C7环烷基、芳基或杂芳基，如甲基、乙基、正丙基或异丙基、环丙基、环戊基、环己基、苯基或吡啶基。不需要巨噬细胞特异性时，R4可以是H、-(C＝O)R3、-(C＝O)OR3或-(C＝O)NR3，其中R3是氢或任选取代的(C1-C6)烷基，如甲基、乙基或者正丙基或异丙基，以及CH2CH2OH。
环或环系统B
环或环系统B可选自(例如)：
Figure S2006800149819D00111
基团-Y-L-X-[CH2]z-
当α氨基酸酯作为式(IA)基团偶联于抑制剂时，由选择的化学方案产生此基团(或键)，以将氨基酸酯基序R1CH(R2)NH-连接于调节物。很明显，这种偶联的化学方案多种多样，因此变量Y、L、X和z的多种组合都是可能的。
也应注意，最好在氨基酸酯基序和调节物之间的连接不是细胞内肽酶活性的底物时，实现上述氨基酸酯羧酸酯酶基序的好处(有助于进入细胞、细胞内的羧酸酯酶水解和细胞内累积活性羧酸水解产物)，因为如果是底物可导致从分子上切下氨基酸。当然，通过用破碎细胞内容物培育该化合物并分析这种切割，能容易地检测胞内肽酶的稳定性。
考虑到上述总体观察，依次说明组成-Y-L-X-[CH2]z-基团的变量：
z可以是0或1，以致于连接于调节物的亚甲基为任选。
Y的特定优选例子包括键、-(C＝O)-、-(C＝O)NH-和-(C＝O)O-。然而，就hCE-1特异性而言，当α氨基酸酯作为式(IA)基团偶联于抑制剂，Y应该是键。
基团L中，Alk1和Alk2基团(存在时)的例子包括：
-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-、-CH＝CH-、-CH＝CHCH2-、-CH2CH＝CH-、CH2CH＝CHCH2-、-C≡C-、-C≡CCH2-、CH2C≡C-和CH2C≡CCH2。Alk1和Alk2的其它例子包括-CH2W-、-CH2CH2W-、-CH2CH2WCH2-、-CH2CH2WCH(CH3)-、-CH2WCH2CH2-、-CH2WCH2CH2WCH2-和-WCH2CH2-，其中W是-O-、-S-、-NH-、-N(CH3)-或-CH2CH2N(CH2CH2OH)CH2-。Alk1和Alk2的其它例子包括二价环丙基、环戊基和环己基。
L中，n为0时，该基团是烃链(任选取代，并可能含有醚、硫醚或氨基键)。目前，L中优选没有任选取代基。m和p均为0时，L是含有5-13个环原子(任选取代)的二价单环或双环碳环或杂环基团。n是1且m和p中至少一个为1时，L是包含烃链和含有5-13个环原子(任选取代)的单环或双环碳环或杂环的二价基团。存在时，Q可以是(例如)二价的苯基、萘基、环丙基、环戊基或环己基，或含有5-13个环成员的单环或双环杂环基团，如哌啶基、哌嗪基、吲哚基、吡啶基、噻吩基或吡咯基，但目前优选1，4-亚苯基。
具体说，在本发明的一些实施方式中，m和p可以是0，n为1。在其它实施方式中，n和p可以是0，m为1。在其它实施方式中，m、n和p可以全是0。在其它实施方式中，m可以是0，n可以是1，Q为单环杂环基团，p可以是0或1。存在时，Alk1和Alk2可选自-CH2-、-CH2CH2-和-CH2CH2CH2-，Q可以是1，4-亚苯基。
基团-Y-L-X-[CH2]z-的具体例子包括-C(＝O)-和-C(＝O)NH-以及-(CH2)v-、-(CH2)vO-、-C(＝O)-(CH2)v-、-C(＝O)-(CH2)vO-、-C(＝O)-NH-(CH2)w-、-C(＝O)-NH-(CH2)wO-
Figure S2006800149819D00121
和
Figure S2006800149819D00122
其中v是1、2、3或4，w是1、2或3，如-CH2-、-CH2O-、-C(＝O)-CH2-、-C(＝O)-CH2O-、-C(＝O)-NH-CH2-和-C(＝O)-NH-CH2O-。
基团-L-Y1-
当α氨基酸酯作为式(IB)的基团偶联于抑制剂时，由选择的化学方案产生此基团(或键)，以将式(IB)或(IC)的氨基酸酯基序的α碳连接于调节物。(在后一种情况下，将-L-Y1-基团通过环系统B的居间环原子间接连接于α碳。)，很明显，这种偶联的化学方案多种多样，因此变量L和Y1的多种组合都是可能的。
例如，L可以如上述-Y-L-X-[CH2]z-基团中所述。例如，在一些实施方式中，m和n是1，p是0；Q是-O-；Alk1是任选取代的直链或支链C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基或C2-C6亚炔基，它们可任选地含有或终止于醚(-O-)、硫醚(-S-)或氨基(-NRA-)键，其中RA是氢或任选取代的C1-C4烷基。在其它实施方式中，m、n和p可能各自为1，在这种情况下，Q可以是(例如)1，4-亚苯基或环戊基、环己基、哌啶基或哌嗪基。在所有实施方式中，Y1可以是(例如)键，或者-(C＝O)-、-(C＝O)NH-和-(C＝O)O-。
就准备全身给药的本发明化合物而言，优选羧酸酯酶切割速率慢的酯，因为它们在全身分布前受代谢的影响较小。因此，增加了它们完整地到达各自靶组织的能力，在靶组织细胞内酯可以转化为酸产物。然而，对局部给药而言，当酯直接施用于靶组织或通过(例如)吸入导向靶组织时，常常需要该酯的酯酶切割速率快，以最大程度减少全身接触和后续的不良副作用。如上式(IA)所示，酯酶基序通过其氨基连接于调节物时，与α氨基酸酯的α碳相邻的碳是双取代或三取代，如R2是(例如)苯基或环己基的情况相比，如果与该碳为单取代，即R2是CH2Rz(Rz是单取代)，那么该酯的切割更迅速。相似地，当酯酶基序通过碳原子连接于调节物，如上式(IB)和(IC)所示，与R4NHCH(R1)-或R1-(环B)-酯酶基序连接的碳原子被取代或是环系统如苯基或环己基环的一部分时相比，如果该碳未取代，即R4NHCH(R1)-或R1-(环B)-连接于亚甲基(-CH2)-，那么该酯的切割更迅速。
胞内酶和受体的调节物
本发明的原理可应用于多种疾病涉及的各种胞内靶点的调节物。如上所述，了解调节物本身后，通常很快就能了解已知调节物与其靶点的结合方式。此外，现代技术如X-射线晶体学和NMR能够揭示这种结合的拓扑结构和几何结构，它们是表征结构-活性关系的传统药物化学方法。有了这些了解后，即可采用结构数据直接鉴定在给定调节物结构中的什么地方连接羧酸酯酶酯基序不会破坏该调节物与酶或受体的结合。例如，表1列出了公开过晶体结构数据的一些胞内酶或受体靶点。
表1
Figure 2006800149819A00800011
Figure 2006800149819A00800021
Figure 2006800149819A00800031
Figure 2006800149819A00800051
出于说明目的，参考了5种上述胞内靶点的已知抑制剂，它们与靶点的结合方式是已知的。这些例子表明，这些结构数据如何用于测定羧酸酯酶酯基序的合适连接位置。显示了活性位点与代表性抑制剂的示意图。通常，该位置远离调节物和靶点之间结合界面，因此从酶结合界面直向溶剂是羧酸酯酶酯基序的合适连接位置，图中显示了这些位置。
Figure S2006800149819D00181
相似方法也可用于表1所示的其它实施例。
用于提高靶胞内酶或受体的活性调节物的细胞效力和/或胞内停留时间的本发
明方法可包括几个步骤：
步骤1：鉴定与靶酶或受体的结合模式相同的一个或多个调节分子上远离调节物和靶酶或受体之间的结合界面的位置。
通常，通过检查结构，可从靶酶或受体与结合于酶或受体的已知调节物(或与其接近的结构类似物)的X-射线共结晶结构(或nmr得到的结构)鉴定这种位置。或者，用计算机图形法对靶酶或受体与停靠到酶或受体的活性位点中的调节物的X射线晶体结构建模，并检查该模型。假定在远离结合界面的位置上对调节物进行结构修饰不可能显著干扰调节物与酶或受体的活性位点的结合。合适位置通常从共结晶结构或停靠模型朝向溶剂。
步骤2：通过在步骤1中鉴定的一个或多个位置上连接α氨基酸酯基团或各种不同的α氨基酸酯基团共价修饰调节物。
可通过调节物上现有的共价偶联官能团，或通过为该目的特别引入的合适官能团连接α氨基酸酯基团(即可能的羧酸酯酶基序)。羧酸酯酶基序与分子主体之间可以间隔有间隔物或接头元件，使该基序深入溶剂，从而进一步减小该基序对调节物结合模式的小影响和/或通过减小可能由该调节物的分子主体产生的位阻影响保证羧酸酯酶可接近该基序。
进行步骤2能制备一种候选调节物或(更通常是)一个候选调节物的小文库，各候选调节物通过在步骤1中鉴定的一个或多个连接点上引入各种氨基酸酯基团相对于其母体抑制剂进行共价修饰。
步骤3：检测步骤2中制备的α氨基酸-偶联调节物，以测定其对靶酶或受体的活性。
如药物化学中常见的，优选在适合确定调节物活性的预计保留时间是否真地被保持、保持到何种程度和具有什么效力特征的实验中检测通过进行步骤1和2制备的母体调节物的羧酸酯酶基序偶联物。按照本发明的基本目的，即引起细胞中调节物活性累积，合适实验通常包括细胞系中评价细胞活性程度和修饰调节物的效力特征的实验。可用于步骤3的其它实验包括用于测定修饰调节物及其推定羧酸酯酶水解产物的不由活性的体外酶或受体调节实验；测定羧酸酯酶将修饰调节物转化为相应羧酸的速率的实验；测定羧酸酯酶水解产物(羧酸)在细胞中的累积速率或水平的实验。在这种实验中，可采用单核和非单核细胞和/或一系列分离羧酸酯酶来鉴定显示细胞选择性的化合物。
如果必需或需要，可用不同组的候选α氨基酸酯-母体调节物偶联物重复步骤3。
步骤4：从步骤3获得的数据中，选择能引起细胞内调节酶或受体活性的一种或多种检测的α氨基酸酯-母体调节物的偶联物，在细胞内将其转变为相应羧酸并累积，它能增加或延长细胞效力。
上述步骤1-4代表了实施本发明原理的通用算法。下述实施例A中描述了该算法的应用，应用于胞内酶二氢叶酸还原酶(DHFR)的已知抑制剂。
实施例A
叶酸(蝶酰谷氨酸)是作为生物合成的嘌呤和嘧啶核苷酸的关键组分的维生素。吸收后，食物中的叶酸被还原为二氢叶酸，然后被二氢叶酸还原酶(DHFR)进一步还原为四氢叶酸。抑制DHFR导致核苷酸的生物合成减少，从而抑制DNA生物合成并减少细胞分裂。DHFR抑制剂广泛用于治疗癌症(Bertino J，J.Cin.Oncol.11，5-14，1993)，细胞增殖性疾病如类风湿性关节炎(Cronstein N.，Pharmacol.Rev.57，163-1723)、牛皮癣和移植物排斥。DHFR抑制剂也可用作抗感染药物(Salter A.，Rev.Infect.Dis.4，196-236，1982)和抗寄生虫药(Plowe C.BMJ 328，545-548，2004)。
已经发现许多类型的DHFR抑制剂化合物，其中几种化合物可用作抗癌药、消炎药、抗感染药和抗寄生虫药。已知DHFR抑制剂的通用模板见下：
甲氨蝶呤(S)-2-(4-(((2，4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲基氨基)-苯甲酰氨基)戊二酸是最广泛使用的DHFR抑制剂，并含有谷氨酸官能团，这使其能主动转运到细胞中并保留下来。然而，通过修饰此主动运输机制，癌细胞可以变得对甲氨蝶呤产生耐受。而且，非哺乳动物细胞缺少主动运输系统，甲氨蝶呤作为抗感染剂的应用受限。因此，开发了可通过被动扩散吸收的亲脂性DHFR抑制剂如三甲曲沙(2，4-二氨基-5-甲基-6-[(3，4，5-三甲氧基苯胺基)甲基]喹唑啉)(2G＝CH)(GB专利1345502)和类似物如(2G＝N)(Gangjee等，J.Med.Chem.1993，36，3437-3443)，以规避癌细胞耐受，用作抗感染剂。
然而，被动扩散到细胞中的药物也容易退出细胞，难以保留在细胞内。因此，按照本发明修饰的、有亲脂性但其活性在细胞内累积的DHFR抑制剂可具有显著优势。而且，这两类DHFR抑制剂都有限制其临床应用剂量的副作用。其活性在巨噬细胞中选择性累积的DHFR抑制剂可能有价值，因为已知巨噬细胞通过产生细胞因子在炎性疾病中起到关键作用，它们在癌症中有负面作用的证据越来越多。
上述通用算法的步骤1
DHFR与停靠在活性位点的三甲曲沙(2G＝CH)的nmr结构已公开(Polshakov，V.I.等，Protein Sci.1999，8，467-481)，很明显，按照本发明附加羧酸酯酶基序的最合适位置是在下示苯环上。可推知，在已知三甲曲沙的结构接近的类似物如(2G＝N)的该点上连接也是合适的。图2显示停靠到DHFR中的(2G＝N)，证明合适的连接点是芳环的4位，因为此点远离该酶的活性位点。
上述通用算法的步骤2
如方案I和II所示，制备通过其α氨基酸氮连接羧酸酯酶基序的化合物。在这些系列中，制备含有或不含糖基的化合物以鉴定可能的巨噬细胞选择性化合物。
方案I
Figure S2006800149819D00221
方案II
也制备了通过α氨基酸侧链方案III和IV将酯酶基序连接于调节物的化合物。在这些系列中，也制备氮上被烷基取代的化合物，以鉴定巨噬细胞选择性化合物(方案IV)。
方案III
Figure S2006800149819D00241
方案IV
Figure S2006800149819D00251
上述通用算法的步骤3
在DHFR酶实验、细胞增殖实验、采用单核和非单核细胞系以及破碎细胞实验中检测包括三甲曲沙类似物(2G＝N)在内的化合物，以评价单核和非单核细胞系对该
酯的切割性。所有这些实验的详情见下。
上述通用算法的步骤4
如表2所示，鉴定到其酸对该酶的活性与三甲曲沙类似物(2G＝N)相当的化合物。也可观察到，与未修饰类似物(2G＝N)相比，通过改变酯酶基序的连接方式可导致化合物(6)在U937细胞中的效力高100倍，在HCT116中的效力高15倍。
此外，酯酶基序氮上的接头或取代基的修饰能够鉴定到在单核而非非单核细胞系中显示出选择性切割并且在单核细胞系中的抗增殖作用显著高于非单核细胞系的化合物4和5(见表2)。
表2
Figure 2006800149819A00800061
注：
1括号中的数字表示切割酯产生的酸的酶IC50
2在下述破碎细胞羧酸酯酶实验中培育该酯80分钟后的酸产量
采用相似方案，将该构思成功应用于多种胞内靶点，如下述实施例所示。
为了进一步说明本发明原理，提供了以下实施例。在下述化合物合成中：
市售试剂和溶剂(HPLC级)无需进一步纯化即可使用。
用CEM Discover聚焦微波反应器进行微波辐射。
用不加热的GeneVac I系列或装有30℃VacRamp的Genevac II系列去除溶剂。
采用获自Silicycle、粒度为40-63μm(230-400目)的硅胶通过快速色谱柱纯化化合物。在采用反相ThermoHypersil-Keystone Hyperprep HS C18柱(12μm，100×21.2mm)的Gilson系统上以梯度20-100％B(A＝水/0.1％TFA，B＝乙腈/0.1％TFA)进行制备型HPLC9.5分钟，其中流速＝30毫升/分钟，注射溶剂2∶1DMSO∶乙腈(1.6ml)，并在215nm进行UV检测，从而纯化化合物。
在Bruker400MHz AV光谱仪上用氘化溶剂记录1H NMR谱。化学位移(δ)以每百万份的份数计。用Kieselgel 60F254(Merck)平板进行薄层层析(TLC)分析，用UV光观察。
在采用反相Hypersil BDS C18柱(5μm，2.1×50mm)的Agilent HP1100、Waters600或Waters 1525 LC系统上以梯度0-95％B(A＝水/0.1％TFA，B＝乙腈/0.1％TFA)进行分析型HPLCMS 2.10分钟，流速＝1.0ml/分钟。用Gilson G1315A二极管阵列检测器、G1214A单波长UV检测器、Waters 2487双波长UV检测器、Waters2488双波长UV检测器或Waters2996二极管阵列UV检测器记录215nm处的UV谱。在m/z150-850的范围上以每秒扫描2次或每1.2秒扫描1次的采样率用装有Z-spray界面的Micromass LCT或者装有Z-spray或MUX界面的Micromass LCT获得质谱。数据用OpenLynx和OpenLynx浏览器软件进行积分并报告。
采用以下缩写：
MeOH＝MeOH
EtOH＝EtOH
EtOAc＝EtOAc
Boc＝叔丁氧基羰基
DCM＝DCM
DMF＝二甲基甲酰胺
DMSO＝二甲亚砜
TFA＝三氟乙酸
THF＝四氢呋喃
Na2CO3＝碳酸钠
HCl＝盐酸
DIPEA＝二异丙基乙胺
NaH＝氧化钠
NaOH＝氢氧化钠
NaHCO3＝碳酸氢钠
Pd/C＝碳载钯
TBME＝叔丁基甲醚
N2＝氮
PyBop＝六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧-三吡咯烷
Figure 2006800149819_8
Na2SO4＝硫酸钠
Et3N＝三乙胺
NH3＝氨
TMSCl＝三甲基氯硅烷
NH4Cl＝氯化铵
LiAlH4＝氢化铝锂
PyBrOP＝六氟磷酸溴-三吡咯烷
Figure 2006800149819_9
MgSO4＝MgSO4
nBuLi＝正丁基锂
CO2＝二氧化碳
EDCI＝盐酸N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺
Et2O＝二乙醚
LiOH＝氢氧化锂
HOBt＝1-羟基苯并三唑
ELS＝蒸发光散射
TLC＝薄层层析
ml＝毫升
g＝克
mg＝毫克
mol＝摩尔
mmol＝毫摩尔
LCMS＝高效液相色谱/质谱
NMR＝核磁共振
r.t.＝室温
min＝分钟
h＝小时
中间体
以下组成部分用于合成修饰的调节物：
Figure S2006800149819D00291
(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-        (S)-4-溴-2-叔丁氧基羰基氨基
羟基-丁酸环戊酯                           丁酸环戊酯
Figure S2006800149819D00292
(S)-2-氨基-4-甲基-戊酸           (S)-氨基-苯基-乙酸
环戊酯                                 环戊酯
Figure S2006800149819D00293
(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-          (S)-2-苄氧基羰基氨基-4-
戊二酸1-环戊酯                       溴-丁酸叔丁酯
Figure S2006800149819D00294
(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-
戊二酸1-叔丁酯
(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-羟基-丁酸环戊酯和(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-羟基- 丁酸1-叔丁酯的合成
Figure S2006800149819D00301
步骤1-合成(S)-2-氨基-4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁酸
Figure S2006800149819D00302
在0℃下将1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(1.32ml，8.8mmol，1.05当量)加入L-高丝氨酸(1g，8.4mmol)在乙腈(10ml)中的悬液中。然后，用5分钟分批加入叔丁基-二甲基-甲硅烷基氯(1.33g，8.8mmol，1.05当量)，使反应混合物升温到室温并搅拌16小时。形成白色沉淀，滤除该沉淀，并用乙腈洗涤，然后真空干燥。分离到白色固态标题化合物(1.8g，92％)。1H NMR(500MHz，DMSO)，δ：7.5 (1H，bs)，3.7(1H，m)，3.35(4H，bm)，1.95(1H，m)，1.70(1H，m)，0.9(9H，s)，0.1(6H，s)。
步骤2-合成(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁酸
Figure S2006800149819D00303
在0℃下用三乙胺(2.15ml，15.4mmol，2当量)和二碳酸(dicarbonate)二叔丁酯(1.77g，8.1mmol，1.05当量)处理步骤1产物(1.8g，7.7mmol)在DCM(100ml)中的悬液。室温下搅拌该反应混合物16小时，以完全反应。减压去除DCM，用EtOAc/盐水处理该混合物。EtOAc层用MgSO4干燥并进行减压蒸发。粗产物无需进一步纯化即可继续使用(2.53g，99％)。1H NMR(500 MHz，CDCl3)，δ：7.5(1H，bs)，5.85(1H，d，J＝6.5Hz)，4.3(1H，m)，3.75(2H，m)，1.95(2H，m)，1.40(9H，s)，0.85(9H，s)，0.1(6H，s)。
步骤3-合成(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁酸环戊酯
在0℃下将环戊醇(1.39ml，15.3ml，2当量)、EDCI(1.61g，8.4mmol，1.1当量)和DMAP(0.093g，0.76mmol，0.1当量)加入步骤2产物(2.53g，7.6mmol)在DCM(50ml)中的溶液中。室温搅拌该反应混合物16小时，然后减压蒸发。将粗残留物溶解于EtOAc(100ml)，并用1M HCl、1M Na2CO3和盐水洗涤。然后，用MgSO4干燥有机层并进行减压蒸发。通过采用EtOAc/庚烷(1∶4)的柱色谱纯化该产物，得到标题化合物(2.24g，73％)。LCMS纯度100％，m/z402.5[M++H]，1H NMR(250MHz，CDCl3)，δ：5.2(1H，d，J＝6.3Hz)，5.15(1H，m)，4.2(1H，m)，3.6(2H，m)，2.0(1H，m)，1.95-1.55(9H，bm)，1.4(9H，s)，0.85(9H，s)，0.1(6H，s)。
步骤4-合成(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-羟基-丁酸环戊酯
Figure S2006800149819D00312
将步骤3的产物(1.57g，3.9mmol)溶解于乙酸∶THF∶水(3∶1∶1，100ml)中。在30℃搅拌该反应混合物16小时以完全反应。加入EtOAc(200ml)，用1M Na2CO3、1M HCl和盐水洗涤。用MgSO4干燥EtOAc提取物并进行减压蒸发，得到澄清油状产物，静置后结晶(1.0g，95％)。LCMS纯度100％，m/z310.3[M++Na]，1H NMR(250MHz，CDCl3)，δ：5.4(1H，d，J＝6.5Hz)，5.2(1H，m)，4.4(1H，m)，3.65(2H，m)，2.15(1H，m)，1.9-1.55(9H，bm)，1.45(9H，s)。
步骤5-合成(S)4-溴-2-叔丁氧基羰基氨基-丁酸环戊酯
将三苯膦(2.56g，9.74mmol)在DCM(7.2ml)中的溶液加入N-溴琥珀酰亚胺(1.86g，10.4mmol)在DCM(16.2ml)中的浆液中。加入后搅拌该溶液5分钟。加入吡啶(338μl，4.18mmol)，然后加入步骤4产物(1.00g，3.48mmol)在DCM(8.8ml)中的溶液。搅拌该溶液18小时，减压浓缩，残留溶剂与甲苯共沸(3×16ml)。用二乙醚(10ml)和乙酸乙酯∶庚烷(1∶9，2×10ml)研磨残留物。将二乙醚和庚烷的混合溶液浓缩到二氧化硅上，并通过采用EtOAc/庚烷(1∶9-2∶8)洗脱的柱色谱纯化，得到标题化合物(1.02g，84％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)，δ：5.30-5.05(2H，m)，4.45-4.30(1H，m)，3.45(2H，t，J＝7.3Hz)，2.50-2.30(1H，m)，2.25-2.10(1H，m)，1.95-1.60(8H，brm)，1.47(9H，s)。
合成(S)-2-氨基-4-甲基-戊酸环戊酯
Figure S2006800149819D00322
步骤1-合成(S)-2-氨基-4-甲基-戊酸环戊酯甲苯-4-磺酸
将环戊醇(103.78ml，1.14mmol)和对甲苯磺酸(23.93g，0.13mol)加入(S)-亮氨酸(15g，0.11mol)在环己烷(400ml)中的悬液中。在回流下加热该悬液。使该溶液回流16小时后，冷却产生白色悬液。将庚烷(500ml)加入该混合物，过滤该悬液得到白色固态产物(35g，85％)。1H NMR(300MHz，MeOD)，δ：1.01(6H，t，J＝5.8Hz)，1.54-2.03(11H，m)，2.39(3H，s)，3.96(1H，t，J＝6.5Hz)，5.26-5.36(1H，m)，7.25(2H，d，J＝7.9Hz)，7.72(2H，d，J＝8.3Hz)。
步骤2-合成(S)-2-氨基-4-甲基-戊酸环戊酯
Figure S2006800149819D00331
用NaHCO3饱和水溶液(2×3ml)洗涤步骤1产物(2.57g，0.013mol)在DCM(5ml)中的溶液。再用DCM(3×4ml)萃取合并的水层。干燥合并的有机层(MgSO4)，真空去除溶剂，产生无色油状标题化合物(1.10g，80％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)，δ：0.90(6H，t，J＝6.4Hz)，1.23-1.94(11H，m)，3.38(1H，dd，J＝8.4，5.9Hz)，5.11-5.22(1H，m)。
合成(S)-氨基-苯基-乙酸环戊酯
Figure S2006800149819D00332
按照合成(S)-2-氨基-4-甲基-戊酸环戊酯所用步骤由(S)-氨基-苯基-乙酸制备(S)-氨基-苯基-乙酸环戊酯
合成(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-戊二酸1-环戊酯
Figure S2006800149819D00341
步骤1-合成(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-戊二酸5-苄酯1-环戊酯
Figure S2006800149819D00342
在0℃下将环戊醇(2.7ml，29.6mmol)、EDCI(4.25g，22.2mmol)和DMAP(0.18g，1.48mmol)加入搅拌的(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-戊二酸5-苄酯(5g，14.8mmol)在DCM(50ml)和DMF(30ml)混合物中的溶液中。室温下继续搅拌过夜，然后LCMS显示反应完成。减压去除DCM。用EtOAc(200ml)稀释反应混合物，用水(100ml)、1M盐酸(50ml)和NaHCO3饱和水溶液(50ml)洗涤。干燥EtOAc层(Na2SO4)，过滤并真空下浓缩，产生粘稠油状物，静置过夜后固化。用Et2O(2×10ml)研磨产生白色固态标题化合物(43.78g，80％)。LCMS纯度94％。
步骤2-合成(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-戊二酸1-环戊酯
Figure S2006800149819D00343
在H2(气球)下，室温搅拌步骤1产物(1.3g，3.20mmol)和10％Pd/C(0.5g)的EtOH(150ml)溶液的混合物4小时，然后LCMS显示反应完成。通过硅藻土垫过滤该反应混合物，用EtOH(20ml)洗涤，真空浓缩产生白色固体。为了去除残留的EtOH，将该固体溶解于甲苯/THF混合物(5/1)(20ml)中，真空浓缩产生标题化合物(0.8g，79％)。1HNMR(400MHz，MeOD)，δ：1.35(9H，s)，1.60-2.10(10H，m)，4.05(1H，m)，5.20(1H，m)。
合成(S)-2-叔可氧基羰基氨基戊二酸1-叔丁酯
Figure S2006800149819D00351
按照合成(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-戊二酸1-环戊酯所用的步骤由(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-戊二酸5-苄酯制备(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-戊二酸1-叔丁酯
合成(S)-2-苄氧基羰基氨基-4-溴-丁酸叔丁酯  
Figure S2006800149819D00352
步骤1-合成(S)-2-苄氧基羰基氨基-琥珀酸1-叔丁酯
将(S)-2-氨基-琥珀酸1-叔丁酯(0.9g，4.75mmol)和氢氧化钠(0.28g，7.13mmol，1.5当量)溶解于25％水在二
Figure 2006800149819_10
烷中的溶液(50ml)中。在5℃搅拌该溶液，缓慢加入二苄基二碳酸酯(2g，4.13mmol，1.5当量)在二
Figure 2006800149819_11
烷(10ml)中的溶液。0℃搅拌该混合物1小时，然后室温搅拌过夜。加入水(10ml)，用EtOAc(2×20ml)萃取该混合物。再用碳酸氢钠饱和溶液(2×10ml)萃取有机相。用1M HCl将混合的水层酸化至pH1，用EtOAc(3×10ml)萃取。用MgSO4干燥合并的有机部分并进行减压浓缩。用柱色谱(35％EtOAc在庚烷中的溶液)纯化产物，产生无色油状标题化合物(0.76g，50％)。m/z346[M+23]+，1H NMR(300MHz，CDCl3)，δ：7.39-7.32(5H，m)，5.72(1H，d，J＝8.1Hz)，5.13(2H，s)，4.58-4.50(1H，m)，3.10-2.99(1H，m)，2.94-2.83 91H，m)，1.45(9H，s)。
步骤2-合成(S)-2-苄氧基羰基氨基-4-羟基-丁酸叔丁酯
Figure S2006800149819D00361
在-20℃将三乙胺(0.032ml，2.24mmol，1.2当量)和氯甲酸乙酯(0.021ml，2.24mmol，1.2当量)缓慢加入步骤1产物(0.6g，1.87mmol)在无水THF(20ml)中的溶液中。-20℃搅拌该混合物2小时。滤除形成的固体，并用THF(2×10ml)洗涤。在0℃将滤出液逐滴加入硼氢化钠(0.2g，5.61mmol，3当量)溶液中，室温搅拌4小时。减压去除溶剂，用1M HCl酸化至pH5的水(10ml)稀释残留物，并用EtOAc萃取。合并有机部分，并用10％氢氧化钠水溶液、水和盐水洗涤，在MgSO4上干燥并减压浓缩，产生澄清油状标题化合物(0.3g，51％)。m/z332[M+23]+。
步骤3-合成(S)-2-苄氧基羰基氨基-4-溴-丁酸叔丁酯
Figure S2006800149819D00362
将三苯膦(0.71g，2.72mmol，2.8当量)在DCM(10ml)中的溶液缓慢加入N-溴琥珀酰亚胺(0.52g，2.91mmol，3当量)在DCM(10ml)中的溶液中。室温搅拌该混合物5分钟。逐滴加入吡啶(0.094ml，1.16mmol，1.2当量)和步骤2产物(0.3g，0.97mmol，1当量)在DCM (20ml)中的溶液，室温搅拌该混合物过夜。
减压去除溶剂，残留物与甲苯(2×15ml)共沸，并用二乙醚(2×25ml)和10％EtOAc在庚烷中的溶液研磨。合并研磨获得的溶液，蒸发至干燥。用柱色谱(15％EtOAc在庚烷中的溶液)纯化粗产物，产生无色油状标题化合物(0.16g，44％)。m/z395[M+23]+，1H NMR(300MHz，CDCl3)，δ：7.39-7.30(5H，m)，5.40(1H，d，J＝6.8Hz)，5.12(2H，s)，4.38(1H，q，J＝7.7Hz)，3.47-3.38(2H，m)，5.49-2.33(1H，m)，2.28-2.13(1H，m)，1.48(9H，s)。
实施例1
本实施例描述了通过在远离与靶点的结合界面的点上连接氨基酸酯基序对本文中称为“SAHA”的已知HDAC(组蛋白脱乙酰酶)抑制剂辛二酰苯胺氧肟酸(化合物7)进行修饰，该修饰没有破坏其结合模式。
化合物7：辛二酰苯胺羟肟酸(SAHA)
SAHA购自BioCat GmbH，Heidelberg，德国。
树脂化学的标准洗涤步骤
依下列顺序洗涤树脂：DMF、MeOH、DMF、MeOH、DCM、MeOH、DCM、MeOHx2、TBMEx2。
树脂检测切割
用2％TFA/DCM(0.5ml)在室温下处理少量官能化羟胺2-氯三苯甲基树脂(约0.3ml反应混合物，约10mg树脂)10分钟。过滤该树脂，通过吹入N2气流浓缩滤出液。获得残留物的LCMS。
制备辛二酸衍生的羟胺2-氯三苯甲基树脂
步骤1-固定至2-氯三苯-O-NH2树脂
Figure S2006800149819D00372
将DIPEA(5.30g，41.0mmol，6当量)加入装有2-氯三苯甲基-O-NH2树脂(6g，加入1.14mmol/g，6.84mmol)和DCM(60ml)的圆底烧瓶中。在回转式振荡的条件下，将8-氯-8-氧代辛酸甲酯(4.2g，20.5mmol，3当量)缓慢加入反应混合物中，振荡该反应混合物48小时。过滤该树脂，用标准洗涤步骤洗涤。真空下干燥该树脂。通过ELS检测确定LCMS纯度，100％，m/z 204[M+H]+。
步骤2-皂化
Figure S2006800149819D00373
将THF(16ml)和MeOH(16ml)加入装有步骤1树脂(4g，加入1.14mmol/g，4.56mmol)的圆底烧瓶中。向该反应中加入NaOH(0.91g，22.8mmol，5当量)的水溶液(16ml)。振荡该反应混合物48小时。过滤该树脂，按照标准洗涤步骤用水x2、MeOHx2洗涤。真空下干燥该树脂。通过ELS检测确定LCMS纯度，100％m/z190[M++H]+。
制备SAHA衍生物
按照下述方法制备SAHA系化合物。
通过下述方案所述的方法制备化合物(8)、(9)和(10)：
Figure S2006800149819D00381
举例说明R＝环戊基时的步骤1-5
步骤1-合成(S)-(3-硝基-苄基氨基)-苯基-乙酸环戊酯
Figure S2006800149819D00382
将3-硝基苄基溴(46mmol)溶解于DMF(180ml)中，加入碳酸钾(92mmol)，然后加入(S)-苯基甘氨酸酯(10.6g，46mmol)。室温下搅拌该反应17小时，然后蒸发至干燥。将残留物再溶解于EtOAc(150ml)中，用水洗涤(3×80ml)，干燥(Na25O4)，过滤并浓缩至干燥。用快速柱色谱(30％EtOAc/己烷)纯化后，获得它的酯，直接用于步骤2。
步骤2-合成(S)-[叔丁氧基羰基-(3-硝基-苄基)-氨基]-苯基-乙酸环戊酯
Figure S2006800149819D00391
将步骤1产物(40.9mmol)溶解于THF(250ml)，然后加入碳酸钾(61.4mmol)和水(150ml)。加入二碳酸二叔丁酯(163mmol)，将该反应混合物加热到50℃18小时。加入DCM，用0.1M HCl(150ml)、NaHCO3饱和水溶液和水(150ml)依次洗涤得到的混合物。干燥DCM层(Na2SO4)，过滤并浓缩至干燥。用快速柱色谱色谱(5％EtOAc/己烷)纯化后，分离标题化合物并直接用于步骤3。
步骤3-合成(S)-[(3-氨基-苄基)-叔丁氧基羰基-氨基]-苯基-乙酸环戊酯
Figure S2006800149819D00392
将步骤2产物(11.5mmol)溶解于EtOAc(150ml)中，然后加入Pd/C(含水10％)催化剂(0.8g)，在气球压力、室温下氢化18小时。通过硅藻土垫过滤反应混合物，蒸发至干燥得到固体。
步骤4-树脂偶联
用辛二酸(1.0g，加入0.83mmol/g)衍生的羟胺2-氯三苯甲基树脂在DMF(15ml)中溶胀，加入PyBOP(1.36g，2.61mmol)，然后加入DIPEA(1.5ml，8.7mmol)。将步骤3产物(2.61mmol)溶解于DCM(15ml)，并加入反应混合物中。室温下振荡该反应24小时。过滤该树脂，用标准洗涤步骤洗涤。真空下干燥该树脂。
步骤5-合成(S)-[3-(7-羟基氨基甲酰基-庚酰基氨基)-苄基氨基]-苯基-乙酸环戊酯化合物(8)
Figure S2006800149819D00401
在2％TFA/DCM(10ml)中温和振荡步骤4产物(加入0.83mmol)20分钟。过滤该树脂。室温下减压蒸发该滤出液。再用2％TFA/DCM(10ml)处理该树脂，20分钟后过滤。在室温下使合并的滤出液减压蒸发至干燥，得到油状残留物。将该残留物在20％TFA/DCM中静置40分钟。室温下减压蒸发至干燥后，用制备型HPLC纯化粗产物。
化合物8的分析数据
LCMS纯度100％，m/z496[M++H]+，1H NMR(400MHz，MeOD)，δ：1.30-1.70(16H，m)，2.00(2H，t)，2.30(2H，t)，4.05(2H，dd)，5.00(1H，m)，5.15(1H，m)，7.05(1H，m)，7.30(2H，m)，7.40(5H，m)，7.75(1H，m)。
化合物(10)的分析数据
LCMS纯度97％，m/z 484[M++H]+，1H NMR(400 MHz，MeOD)，δ：1.30(13H，m)，1.45-1.65(4H，m)，1.93-2.05(2H，m)，2.20-2.40(2H，m)，3.99(2H，q)，4.65-4.95(1H，m)7.05(1H，d)，7.25-7.33(2H，m)，7.35-7.50(5H，m)，7.75(1H，s)。
步骤6-皂化
Figure S2006800149819D00402
将R＝Et的步骤5产物(1.4g，加入0.83mmol)悬浮于THF(8.6ml)和MeOH(8.6ml)中，加入1.4M氢氧化钠溶液(5.98mmol)。振荡该混合物24小时，过滤该树脂，按照标准洗涤步骤用水洗涤2次，MeOH洗涤2次。真空下干燥该树脂。
步骤7-合成(S)-[3-(7-羟基氨基甲酰基-庚酰基氨基)-苄基氨基]-苯基-乙酸(9)
Figure S2006800149819D00411
然后，在2％TFA/DCM(10ml)中温和振荡步骤6产物(1.44g，加入0.83mmol)20分钟。过滤该树脂，室温下减压蒸发该滤出液。再用2％TFA/DCM(10ml)处理该树脂，20分钟后过滤。在室温下将合并的滤出液减压蒸发至干燥，得到油状残留物。使该残留物在20％TFA/DCM中静置40分钟。室温下减压蒸发至干燥后，用制备型HPLC纯化粗产物，得到化合物(9)。LCMS纯度100％，m/z428[M++H]+，1H NMR(400MHz，MeOD)，δ：1.20-1.35(4H，m)，1.50-1.65(4H，m)，2.00(2H，m)，2.30(2H，m)，4.00(2H，dd)，4.90(1H，m)，7.05(1H，m)，7.25-7.50(7H，m)，7.70(1H，m)。
按照合成化合物(8)所述的方法制备化合物(24)。
({(R)-[4-7-羟基氨基甲酰基-庚酰基氨基)-苯基]-苯基-甲基}-氨基)乙酸环戊酯(24)
Figure S2006800149819D00412
LCMS纯度95％，m/z496[M++H]+，1H NMR(400MHz，DMSO)，δ：1.30-1.50(6H，m)，1.50-1.70(8H，m)，1.80(2H，m)，2.10(2H，t)，2.45(2H，t)，4.1(2H，dd)，5.25(1H，m)，5.35(1H，m)，7.45(2H，d)，7.60(5H，m)，7.80(2H，d)，10.00-10.10(2H，br s)，10.50(1H，s)。
实施例2
本实施例描述了通过在不破坏其结合模式的点上连接氨基酸酯基序修饰已知的Aurora激酶A(“Aurora A”)抑制剂N-{4-(7-甲氧基-6-甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基}-苯甲酰胺(化合物(11))。
化合物(11)：N-{4-(7-甲氧基-6-甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基}-苯甲酰胺
Figure S2006800149819D00421
按美国专利6,143,764所述的方法制备化合物(11)
用下述方法制备基于化合物(11)的化合物。
按照以下方案所述方法制备化合物(12)和(13)：
Figure S2006800149819D00431
步骤1-合成N-(4-羟基-苯基)-苯甲酰胺
Figure S2006800149819D00441
在0℃、氩气气氛下，将三乙胺(7.44ml，53.4mmol，1.5当量)加入4-氨基苯酚(4.27g，39.1mmol)在DMF(50ml)中的溶液中。搅拌该反应10分钟，然后用5分钟缓慢加入苯甲酰氯(5g，35.6mmol，1当量)。使该反应混合物升温至室温，搅拌18小时。减压去除DMF，用EtOAc/水处理该混合物。得到白色固体沉淀，滤除此沉淀，减压干燥产生标题化合物(8.0g，96％)。1H NMR(270 MHz，DMSO)，δ：10.0(1H，s)，9.35(1H，s)，7.9(2H，d，J＝7.2Hz)，7.5(5H，m)，6.75(2H，d，J＝7.4Hz)。
步骤2-合成N-[4-(7-苄氧基-6-甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-苯甲酰胺
将步骤1产物(2.33g，10.9mmol，3当量)加入装有4-氯-6-甲氧基-7-苄氧基喹啉[合成方法参见Org.Synth.Col.第3卷，272(1955)和US006143764A(Kirin BeerKabushiki Kaisha)](1.09g，3.6mmol)的圆底烧瓶中。将该反应混合物加热到140℃3小时。冷却至室温后，将水加入该反应混合物中，用EtOAc萃取该混合物3次。用5％NaOH水溶液、盐水洗涤合并的EtOAc层，并用MgSO4干燥。减压去除溶剂，并通过以EtOAc/庚烷(2∶1)洗脱的柱色谱纯化，获得标题化合物(0.56g，32％)。m/z477[M++H]。
步骤3-合成N-[4-(7-羟基-6-甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-苯甲酰胺
Figure S2006800149819D00451
在回流下加热步骤2产物(0.56g，1.17mmol)和10％Pd/C(0.08g)在10％环己烯/EtOH(80ml)中的混合物3小时。通过硅藻土垫过滤Pd/C催化剂，用MeOH洗涤两次。减压浓缩滤出液，得到黄色固态标题化合物(0.34g，75％)。m/z387[M++H]。
步骤4-合成(S)-4-[4-(4-苯甲酰氨基-苯氧基)-6-甲氧基-喹啉-7-基氧基]-2-叔丁氧基羰基氨基-丁酸环戊酯
Figure S2006800149819D00452
在0℃将5ml DCM中的(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-羟基-丁酸环戊酯(0.223g，0.78mmol，1.5当量)加入步骤3产物(0.2g，0.52mmol)在无水DCM(30ml)中的溶液中。然后加入Ph3P(0.557g，2.1mmol，4.1当量)和DIAD(0.412ml，2.1mmol，4.1当量)，使该反应混合物升温至室温，搅拌16小时。减压蒸发粗反应混合物，用柱色谱纯化，产生标题化合物(0.135g，46％)。m/z 656.3[M++H]。
步骤5-合成((S)-2-氨基-4-[4-(4-苯甲酰氨基-苯氧基)-6-甲氧基-喹啉-7-基氧基]-丁酸环戊酯)(12)
Figure S2006800149819D00461
将TFA(1ml)加入步骤4产物(5.8mg，0.009mmol)在DCM(1ml)中的溶液中。将该反应混合物搅拌16小时，然后减压蒸发，与甲苯共沸以去除TFA。分离灰白色固态的化合物(12)(4.7mg)。LCMS纯度95％，m/z 556.2[M++H]，1H NMR(270MHz，DMSO)，δ：10.4(1H，s)，8.8(1H，d，J＝6.5Hz)，8.55(2H，bs)，8.01(4H，m)，7.65(4H，m)，7.35(1H，d，J＝7.6Hz)，6.75(1H，d，J＝6.5Hz)，5.25(1H，m)，4.35(3H，m)，4.0(3H，s)，2.4(2H，m)，1.85-1.4(8H，bm)。
步骤6-合成(S)-4-[4-(4-苯甲酰氨基-苯氧基)-6-甲氧基-喹啉-7-基氧基]-2-叔丁氧基羰基氨基-丁酸
Figure S2006800149819D00462
将2M NaOH(0.026ml，0.046mmol，2当量)加入步骤4产物(17mg，0.02mmol)在THF(1ml)中的溶液。16小时后，反应未完全，所以再加入2当量的NaOH。6小时后结束搅拌，减压去除THF。用3ml水稀释水层，并用1M HCl酸化至pH6。将标题化合物萃取至EtOAc中，用MgSO4干燥，分离得到白色固体。它无需进一步纯化即可直接用于步骤7。
步骤7-合成(S)-4-[4-(4-苯甲酰氨基-苯氧基)-6-甲氧基-喹啉-7-基氧基]-2-叔丁基羰基氨基-丁酸(13)
Figure S2006800149819D00471
将TFA(1ml)加入步骤6产物(6.5mg，0.011mmol)在DCM(1ml)中的溶液中。搅拌该反应混合物6小时，然后减压蒸发，产生灰白色固态标题化合物(13)(90％)。LCMS纯度100％，m/z488.2[M++H]，1H NMR(300MHz，MeOD)，δ：8.75(1H，d，J＝7.8Hz)，8.00(4H，m)，7.65(4H，m)，7.4(1H，d，J＝7.6Hz)，6.95(1H，d，J＝8.0Hz)，4.6(2H，m)，4.3(1H，m)，4.2(3H，s)，2.6(2H，m)。
按照以下方案所述方法制备化合物(14)：
Figure S2006800149819D00481
步骤1、2和3与合成化合物(12)中所述的步骤相同。
步骤4-合成(S)-4-[4-(4-苯甲酰氨基-苯氧基)-6-甲氧基-喹啉-7-基氧基]-2-苄氧基羰基氨基-丁酸叔丁酯
Figure S2006800149819D00491
在氮气气氛下将步骤3产物(0.15g，0.39mmol)、(S)-2-苄氧基羰基氨基-4-溴-丁酸叔丁酯(0.16g，0.43mmol，1.1当量)和K2CO3(011g，0.78mmol，2当量)溶解于无水DMF(10ml)中。在35℃搅拌该反应过夜，然后减压去除DMF。将残留物溶解于DCM中，用水洗涤，然后用盐水洗涤。用MgSO4干燥有机层，并进行减压蒸发。柱色谱(用1％MeOH/DCM洗脱)得到标题化合物(0.16g，60％)。m/z678[M+H]+，1HNMR(300MHz，CDCl3)，δ：8.49(1H，d，J＝5.3Hz)，7.98(1H，s)，7.92(2H，dd，J＝8.2，1.4Hz)，7.80-7.72(2H，m)，7.63-7.48(4H，m)，7.43-7.29(4H，m)，7.24-7.17(2H，m)，6.64(1H，d，J＝8.9Hz)，6.49(1H，d，J＝5.3Hz)，5.15(2H，s)，4.66-4.57(1H，m)，4.43-4.34(1H，m)，3.85(3H，s)，2.55-2.33(2H，m)，1.41(9H，m)。
步骤5-合成-(S)-2-氨基-4-[4-(4-苯甲酰氨基-苯氧基)-6-甲氧基-喹啉-7-基氧基]-丁酸叔丁酯(14)
Figure S2006800149819D00492
将步骤4产物(0.045g，0.066mmol)溶解于无水EtOAc(5ml)中，在氮气气氛下加入Pd(OH)2/C。对该反应混合物进行脱气，在室温、氢气气氛下搅拌过夜。通过硅藻土垫滤除催化剂，减压去除溶剂。用制备型HPLC纯化化合物(14)。m/z544[M+H]+，
1H NMR(300MHz，CD3OD)，δ：8.67(1H，d，J＝6.8Hz)，7.98(4H，d，J＝8.7Hz)，7.90(1H，s)，7.68-7.51(4H，m)，7.42-7.36(2H，m)，6.97(1H，d，J＝6.6Hz)，4.52(2H，t，J＝5.7Hz)，4.28(1H，t，J＝6.5Hz)，4.13(3H，s)，2.69-2.45(2H，m)，1.53(9H，s)。
按照以下方案所述方法制备化合物(25)：
Figure S2006800149819D00501
步骤1-合成(S)-4-[4-(4-苯甲酰氨基-苯氧基)-6-甲氧基-喹啉-7-基氧基]-2-环己基氨基-丁酸环戊酯(25)
Figure S2006800149819D00502
将100μL 1M环己酮的MeOH溶液和1滴乙酸加入化合物(12)(37mg，0.066mmol)在无水MeOH(1ml)中的溶液中。室温搅拌该反应混合物3小时。然后加入氰基硼氢钠(10.3mg，0.165mmol)，继续在室温下搅拌该反应4小时，然后真空下浓缩。用制备型HPLC纯化得到二-TFA盐形式的标题化合物(25)。m/z638[M+H]+。1H NMR(300MHz，CD3OD)δ：8.72(1H，d，J＝6.8Hz)，8.02-7.98(4H，m)，7.93(1H，s)，7.67(1H，s)，7.66-7.53(3H，m)，7.42(2H，m)，6.99(1H，d，J＝6.8Hz)，5.38(1H，m)，4.49(3H，m)，4.14(3H，s)，3.27(11H，m)，2.66(2H，m)，2.20(2H，m)，12.05-1.46(16H，m)。
实施例3
本实施例描述了通过在不破坏其结合模式的点上连接氨基酸酯基序修饰已知的P38激酶抑制剂6-氨基-5-(2，4-二氟-苯甲酰)-1-(2，6-二氟-苯基)-1H-吡啶-2-酮(化合物3258)。
化合物(15)：6-氨基-5-(2，4-二氟-苯甲酰)-1-(2，6-二氟-苯基)-1H-吡啶-2-酮
Figure S2006800149819D00511
按WO03/076405所述的方法制备化合物(15)。
按照下述方法制备基于化合物(15)的化合物。
按照下述方案所述方法制备化合物(16)和(17)：
Figure S2006800149819D00512
步骤1-合成(S)-4-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}-2-叔丁氧基羰基氨基丁酸环戊酯
Figure S2006800149819D00513
将(L)-5-溴-2-叔丁氧基羰基氨基戊酸环戊酯(96mg，0.265mmol)加入6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰)-1-(2，6-二氟-4-羟基-苯基)-1H-吡啶-2-酮[按照WO03/076405所述方法制备](100mg，0.265mmol)和K2CO3在DMF(1.5ml)中的搅拌混合物中。60℃搅拌该反应混合物2小时。用EtOAc(15ml)稀释该反应混合物，用NaHCO3饱和水溶液(3ml)和水(10ml)洗涤。干燥EtOAc层(Na2SO4)，过滤并浓缩至干燥。快速色谱纯化(20％EtOAc/庚烷)得到白色固态标题化合物(50mg，29％)。LCMS纯度100％，m/z648[M++H]，1H NMR(400MHz，MeOD)，δ：1.30(9H，s)，1.40-1.65(6H，m)，1.70-1.85(2H，m)，1.95-2.30(2H，m)，4.00-4.10(2H，m)，4.15-4.20(1H，m)，5.05-5.10(1H，m)，5.65(1H，d)，6.70-6.80(2H，m)，6.95-7.05(2H，m)，7.25-7.45(2H，m)。
步骤2-合成(S)-2-氨基-4-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}丁酸环戊酯三氟乙酸盐(16)
步骤1产物(10mg)和20％TFA/DCM(0.5ml)的混合物在室温下静置3小时。通过在N2下吹气将该反应混合物浓缩至干燥。用Et2O(0.3ml×2)研磨该残留物，得到白色固态化合物(16)(9.3mg，91％)。LCMS纯度100％，m/z 548[M++H]，1H NMR(400MHz，MeOD)，δ：1.55-1.80(6H，m)，1.85-2.00(2H，m)，2.30-2.50(2H，m)，4.15-4.30(3H，m)，5.25-5.35(1H，m)，5.75(1H，d)，6.85-6.95(2H，m)，7.05-7.15(2H，m)，7.40-7.55(2H，m)。
步骤3-合成(S)-2-氨基-4-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}丁酸(17)
Figure S2006800149819D00522
将2M NaOH水溶液(0.3ml)加入化合物(16)(20mg，0.0317mmol)在MeOH(0.3ml)和THF(0.3ml)的混合物中的溶液中。该反应混合物在室温下静置3小时。反应完成后，通过在N2流下吹气使该反应混合物蒸发至干燥，通过逐滴加入2M HCl水溶液酸化至pH1-2。通过过滤收集得到的白色固体。产率＝9mg，48％，LCMS纯度97％，m/z480[M++H]，1H NMR(400 MHz，MeOD)，δ：2.35-2.55(2H，m，CH2)，4.15-4.20(1H，m，CH)，4.25-4.35(2H，m，CH2)，5.75(1H，d，CH)，6.85-7.00(2H，m，Ar)，7.05-7.20(2H，m，Ar)，7.40-7.55(2H，m，Ar)。
用以下方案所述方法制备化合物(18)：
Figure S2006800149819D00531
步骤1-合成(S)-4-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟-苯甲酰)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟-苯氧基}-2-苄氧基羰基氨基-丁酸叔丁酯
将碘化钠(79mg，0.53mmol)和碳酸钾(146mg，1.06mmol)加入6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰)-1-(2，6-二氟-4-羟基苯基)-1H-吡啶-2-酮(100mg，0.26mmol)和(S)-2-苄氧基羰基氨基-4-溴-丁酸叔丁酯(108mg，0.29mmol)在丙酮(2mL)中的溶液中。在回流下加热该反应混合物12小时，冷却，在水(20mL)和乙酸乙酯(20mL)之间分配。再用乙酸乙酯(2×10mL)萃取水层，用盐水(20mL)洗涤合并的有机提取物，干燥(MgSO4)和减压浓缩得到黄色油状物。对此残留物进行柱色谱[硅胶，40％乙酸乙酯-庚烷]，得到无色固态的所需产物(186mg，79％)，m/z670[M+H]。
步骤2-合成(S)-2-氨基-4-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟-苯甲酰)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟-苯氧基}-丁酸叔丁酯
Figure S2006800149819D00533
将(S)-4-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟-苯甲酰)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟-苯氧基}-2-苄氧基羰基氨基-丁酸叔丁酯(140mg，0.2mmol)溶解于含有10％碳载氢氧化钯(20mg)的乙酸乙酯(15mL)中，在氢气气氛(1atm)下搅拌1小时。用N2吹扫该反应混合物，用Celite
Figure 2006800149819_12
过滤，再用乙酸乙酯洗涤。减压浓缩滤出液得到固体，对其进行柱色谱[硅胶：5％MeOH的二氯甲烷溶液]。产生灰色固态的所需产物(60mg，54％)：LCMS纯度98％，m/z 536[M+H]+，1H NMR(300MHz，CDCl3)7.65-7.44(1H，m)，7.39-7.29(2H，m)，6.96-6.82(2H，m)，6.66(2H，br d，J＝8.1Hz)，5.82(1H，d，J＝9.9Hz)，4.20-4.07(3H，m)，3.48(1H，dd，J＝4.8，8.7Hz)，2.22-2.15(1H，m)，1.91-1.84(1H，m)，1.62(2H，brs)，1.43(9H，s)。
实施例4
本实施例描述了通过在不破坏其结合模式的点上连接氨基酸酯基序修饰已知DHFR抑制剂5-甲基-6-((3，4，5-三甲氧基苯基氨基)甲基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺(化合物(2G＝N))。
化合物(2G＝N)：5-甲基-6-((3，4，5-三甲氧基苯基氨基)甲基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺
Figure S2006800149819D00541
按照J.Med.Chem.1993，36，3437-3443所述方法的改进形式制备化合物(2G＝N)。
在室温、氢气气氛下搅拌2，4-二氨基-5-甲基吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-腈(0.10g，0.5mmol)、3，4，5-三甲氧基苯胺(0.10g，0.55mmol)和拉尼镍(0.7g，含水)在乙酸(20ml)中的溶液。2小时后，通过硅藻土过滤该反应混合物，减压蒸发溶剂。用反相HPLC纯化粗残留物，得到固态化合物(2G＝N)(22mg，16％)。LCMS纯度94％，m/z371.1[M+H]+，1H NMR(400MHz，DMSO)，δ：8.5(1H，s)，7.0(2H，bs)，6.2(2H，bs)，6.0(2H，s)，5.7(1H，m)，4.2(2H，d)，3.7(6H，s)，3.5(3H，s)，2.7(3H，s)。
用下述方法制备基于化合物(2G＝N)的化合物。
按照下述方案所述方法制备化合物(6)和(19)：
Figure S2006800149819D00551
步骤1-合成(S)-4-甲基-2-(4-硝基苯甲酰胺基)戊酸环戊酯
Figure S2006800149819D00552
在-5℃、氮气气氛下用10分钟将4-硝基苯甲酰氯(0.60g，3.9mmol)在DCM(2ml)中的溶液逐滴加入(S)-2-氨基-4-甲基戊酸环戊酯(0.70g，3.5mmol)和二异丙基乙胺(0.94ml，5.3mmol)在DCM(10ml)中的溶液中。完成添加后，使该反应混合物升温至室温，再搅拌30分钟。将该反应混合物倾倒在NaHCO3饱和水溶液上，用DCM萃取水层。合并有机萃取物，用盐水洗涤，用MgSO4干燥，减压蒸发后以定量产率得到油状固态标题化合物。LCMS纯度92％，m/z347.1[M+H]+。
步骤2-合成(S)-2-(4-氨基苯甲酰胺基)-4-甲基戊酸环戊酯
Figure S2006800149819D00561
将三乙胺(1.09g，10.8mmol)和甲酸(0.50g，10.8mmol)溶解于EtOH(10ml)中，加入步骤1产物(1.2g，3.4mmol)的EtOH(10ml)溶液中。加入10％Pd/C(约10摩尔％)，将该混合物加热至回流。1小时后，通过硅藻土过滤热反应混合物，用MeOH洗涤残留物。合并滤出液和洗涤液并蒸发，使残留物在DCM和NaHCO3饱和水溶液之间分配。用盐水洗涤有机层，用MgSO4干燥并进行减压蒸发，以得到白色固态标题化合物(0.80g，73％)。LCMS纯度97％，m/z319.2[M+H]+，1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ：7.6(2H，dd)，6.6(2H，dd)，5.2(1H，m)，6.4(1H，d)4.7(1H，m)，4.0(2H，s)，1.9(2H，m)，1.7(5H，m)，1.6(4H，m)，0.9(6H，dd)。
步骤3-合成(S)-2-{4-[(2，4-二氨基-5-甲基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基)-氨基]-苯甲酰氨基}-4-甲基-戊酸环戊酯(6)
Figure S2006800149819D00562
在室温、氢气气氛下搅拌2，4-二氨基-5-甲基吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-腈(0.47g，2.4mmol)、步骤2产物(300mg，0.94mmol)和拉尼镍(1g，含水)在乙酸(40ml)中的溶液。48小时后，通过硅藻土过滤该反应混合物，减压蒸发溶剂。将该物质的MeOH溶液加载到SCX柱上，用1％氨的MeOH溶液洗脱。使粗产物吸附于二氧化硅，用柱色谱纯化(10％MeOH/DCM)，得到化合物(6)(60mg，13％)。LCMS纯度95％，m/z506.1[M+H]+，1H NMR(400MHz，DMSO)，δ：8.5(1H，s)，8.2(1H，d)，7.7(2H，d)，7.0(2H，bs)，6.7(2H，d)，6.5(1H，m)，6.2(2H，bs)，5.1(1H，m)，4.4(1H，m)，4.3(2H，d)，2.7(3H，s)，1.7(11H，m)，0.9(6H，dd)。
步骤4-合成(S)-2-(4-((2，4-二氨基-5-甲基吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)甲基氨基)苯甲酰胺基)-4-甲基戊酸(19)
Figure S2006800149819D00571
将步骤3产物(39μM)悬浮于EtOH(1.0ml)中。将1M氢氧化锂溶液(156μl)加入上述悬液中，搅拌该悬液48小时。然后减压去除EtOH，用水稀释残留物，用稀醋酸使pH降低到4。用DCM洗涤该溶液，蒸发，并进行SCX纯化，得到化合物(19)。LCMS纯度92％，m/z438[M+H]+；1H NMR(400MHz，DMSO)δ：8.5(1H，s)，8.1(1H，d)，7.7(2H，d)，7.2(2H，brs)，6.7(2H，d)，6.5(1H，t)，6.4(2H，brs)，4.4(1H，m)，4.3(2H，d)，2.7(3H，s)，1.8-1.6(2H，m)，1.6-1.5(1H，m)，0.9(6H，dd)。
按照下述方案所述方法制备化合物(5)和相应酸：
Figure S2006800149819D00581
步骤1-合成(S)-4-甲基-2-(4-硝基苄基氨基)戊酸环戊酯
Figure S2006800149819D00582
将冰醋酸(2滴)加入(S)-2-氨基-4-甲基戊酸环戊酯(2.00g，10.0 mmol)和4-硝基苯甲醛(3.04g，20.0mmol)在DCM(40ml)中的溶液中。室温搅拌该溶液1小时，然后以单份加入三乙酰氧基硼氢化钠(6.40g，30.2mmol)。搅拌3小时后，将该溶液倾倒在1M HCl水溶液上，搅拌30分钟，用1M NaOH水溶液中和，用DCM萃取。用水和盐水洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥并进行减压蒸发。用色谱(5％EtOAc/异己烷)纯化粗产物，以获得油状标题化合物(1.51g)。它无需进一步纯化即可用于下一步骤。
LCMS纯度71％，m/z 335.1[M-H]+。
步骤2-合成(S)-2-(4-氨基-苄基氨基)-4-甲基-戊酸环戊酯
Figure S2006800149819D00591
将步骤1产物(0.90g，2.7mmol)溶解于EtOH(5ml)，并加入拉尼镍(～0.5g)和一水合肼(0.38ml，8.1mmol)在EtOH(5ml)中的悬液。回流下加热1小时后，通过硅藻土过滤热的反应混合物，用MeOH洗涤残留物。合并滤出液和洗涤液并蒸发，使残留物在DCM和碳酸氢钠饱和水溶液之间分配。用盐水洗涤有机层，用MgSO4干燥和减压蒸发。通过色谱(20％EtOAc/异己烷)纯化粗产物，得到油状标题化合物(0.50g，61％)。LCMS纯度99％，m/z305.2[M+H]+，1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ：7.1(2H，d)，6.6(2H，d)，5.2(1H，m)，3.7(1H，d)，3.5(1H，d)，3.2(1H，t)，1.9(2H，m)，1.7(5H，m)，1.6(4H，m)，0.9(6H，dd)。
步骤3-合成(S)-2-{4-[(2，4-二氨基-5-甲基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基)-氨基]-苄基氨基}-4-甲基-戊酸环戊酯(5)
Figure S2006800149819D00592
在室温、氢气气氛下搅拌2，4-二氨基-5-甲基吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-腈(0.16g，0.83mmol)、步骤2产物(100mg，0.33mmol)和拉尼镍(1g，含水)在乙酸(10ml)中的溶液。5小时后，通过硅藻土过滤该反应混合物，减压蒸发溶剂。将该物质的MeOH溶液加载到SCX柱上，用1％氨的MeOH溶液洗脱。使粗产物吸附于二氧化硅，并用柱色谱纯化(10％MeOH/DCM)，产生标题化合物(5)(30mg，19％)。LCMS纯度95％，m/z 492.1[M+H]+，1H NMR(400MHz，DMSO)，δ：8.5(1H，s)，7.2(2H，bs)，7.0(2H，d)，6.6(2H，d)，6.2(2H，bs)，5.8(1H，m)，5.1(1H，m)，4.2(2H，s)，3.6(1H，m)，3.4(1H，m)，3.1(1H，m)，2.7(3H，s)，1.5(11H，m)，0.8(6H，dd)。
步骤4-合成(S)-2-{4-[(2，4-二氨基-5-甲基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基)-氨基]-苄基氨基}-4-甲基-戊酸
Figure S2006800149819D00601
将步骤3产物(39μM)悬浮于EtOH(1.0ml)中。将1 M氢氧化锂溶液(156μl)加入上述悬液中，搅拌该悬液48小时。然后，减压去除EtOH，用水稀释残留物，用稀乙酸将pH降低到4。用DCM洗涤该溶液，蒸发并进行SCX纯化，产生标题化合物LCMS：Rt为0.52和1.91分钟时纯度95％，m/z(ES+)424[M+H]+；1H NMR(400MHz，DMSO)δ：8.5(1H，s)，7.1(2H，d)，7.0(2H，brs)，6.6(2H，d)，6.2(2H，brs)，5.7(1H，t)，4.3(2H，d)，3.6(1H，m)，3.3(2H，水不透明性)，2.7(3H，s)，1.8(1H，m)，1.3 (1H，m)，1.2(1H，m)。
按照下述方案所述的方法制备化合物(3)：
步骤1-合成(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-4-(4-硝基苯氧基)丁酸环戊酯
Figure S2006800149819D00612
在0℃、氮气气氛下将氢化钠(0.63g，15.7mmol)加入4-硝基苯酚(2.18g，15.7mmol)在四氢呋喃(100ml)中的溶液中。升温至室温并搅拌10分钟后，加入(S)-环戊基-4-溴-2-(叔丁氧基羰基氨基)丁酸(5.0g，14.3mmol)在DMF(20ml)中的溶液。将该反应混合物加热到60℃10小时，然后将该反应混合物冷却至室温，并倾倒在乙醚/碳酸钠上。收集有机层，用2M碳酸钠水溶液、1M HCl和盐水洗涤，然后用MgSO4干燥并进行减压浓缩，以产生油状物，其静置后固化产生标题化合物(4.0g，69％)。LCMS纯度97％，m/z407.1[M+H]+，1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ：8.2(2H，d)，7.4(1H，d)，7.1(2H，d)，5.1(1H，m)，4.1(3H，m)，2.1(2H，m)，1.8(2H，m)，1.6(6H，m)，1.4(9H，s)。
步骤2-合成(S)-4-(4-氨基苯氧基)-2-(叔丁氧基羰基氨基)丁酸环戊酯
Figure S2006800149819D00621
将三乙胺(0.77ml，5.2mmol)和甲酸(0.19ml，5.2mmol)溶解于EtOH(4ml)中，并加入步骤1产物(0.7g，1.7mmol)在EtOH(4ml)中的溶液中。加入10％Pd/C(约10摩尔％)，将该混合物加热至回流。2小时后，通过硅藻土过滤热的反应混合物，用MeOH洗涤残留物。合并滤出液和洗涤液并蒸发，使残留物在DCM和碳酸氢钠饱和水溶液之间分配。用盐水洗涤有机层，用MgSO4干燥并进行减压浓缩。用柱色谱纯化残留物(梯度洗脱，10-40％EtOAc在己烷中的溶液)，产生标题化合物(0.3g，46％)。LCMS纯度93％，m/z379.1[M+H]+，1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ：6.9(2H，d)，6.8(2H，d)，5.3(2H，m)，4.4(1H，m)4.0(2H，m)，2.3(1H，m)，2.2(1H，m)，1.9(2H，m)，1.7(4H，m)，1.6(2H，m)，1.4(9H，s)。
步骤3-合成(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-4-(4-((2，4-二氨基-5-甲基吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)甲基氨基)苯氧基)丁酸环戊酯
Figure S2006800149819D00622
在室温、氢气气氛下搅拌2，4-二氨基-5-甲基吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-腈(0.50g，2.5mmol)、步骤2产物(0.38g，1.0mmol)和拉尼镍(3g，含水)在乙酸(40ml)中的溶液。16小时后，通过硅藻土过滤该反应混合物，减压蒸发溶剂。将该物质MeOH溶液加载到SCX柱上，用1％氨的MeOH溶液洗脱。使粗产物吸附于二氧化硅，并用柱色谱纯化(5％MeOH/DCM)，产生标题化合物(145mg，26％)。LCMS纯度95％，m/z566.2[M+H]+，1H NMR(400MHz，DMSO)，δ：8.5(1H，s)，7.3(2H，m)，7.0(2H，m)，6.7(2H，d)，6.6(2H，d)，6.2(2H，bs)，5.5(1H，bs)，5.1(1H，m)，4.1(3H，m)，3.9(2H，m)，2.6(3H，s)，2.0(1H，m)，1.8(3H，m)，1.6(6H，m)，1.4(9H，s)。
步骤4-合成(S)-2-氨基-4-{4-[(2，4-二氨基-5-甲基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基)-氨基]-苯氧基}-丁酸环戊酯(3)
Figure S2006800149819D00631
将三氟乙酸(3ml)加入步骤3产物(145mg，0.26mmol)在DCM(3ml)中的溶液中，室温搅拌该反应混合物30分钟。减压蒸发该溶剂，将粗残留物的MeOH溶液加载到SCX柱上，并用1％氨的MeOH溶液洗脱进行纯化，得到化合物(3)(39mg，33％)。LCMS纯度94％，m/z466.1[M+H]+，1H NMR(400MHz，DMSO)，δ：8.5(1H，s)，7.0(2H，bs)，6.7(2H，d)，6.6(2H，d)，6.2(2H，bs)，5.5(1H，bs)，5.1(1H，m)，4.1(2H，s)，3.9(2H，m)，3.4(1H，m)，2.7(3H，s)，2.0(2H，m)，1.8(3H，m)，1.6 (6H，m)。
通过以下方案所述方法制备化合物(4)：
Figure S2006800149819D00641
步骤1与化合物(3)中所述的步骤相同。
步骤2-合成(S)-2-氨基-4-(4-硝基苯氧基)丁酸环戊酯
Figure S2006800149819D00642
将三氟乙酸(12ml)加入步骤1产物(4.0g，9.8mmol)在DCM(12ml)中的溶液中。室温搅拌1小时后，该反应混合物用DCM稀释，用冰冷却，通过加入氨水中和。收集有机层，用水、碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤，然后用MgSO4干燥和减压浓缩，产生黄色油状标题化合物(3.0g，100％)。LCMS纯度97％，m/z309.1[M+H]+，1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ：8.2(2H，d)，7.0(2H，d)，5.2(1H，m)，4.2(2H，m)，3.6(1H，dd)，1.7-1.5(10H，m)。
步骤3-合成(S)-2-(环己基氨基)-4-(4-硝基苯氧基)丁酸环戊酯
Figure S2006800149819D00651
在氮气下将无水MeOH(10ml)加入含有步骤2产物(1.0g，3.3mmol)和环己酮(0.34ml，3.3mmol)的烧瓶中。室温搅拌12小时后，加入三乙酰氧基硼氢化钠(2.07g，9.75mmol)。4小时后，将该反应混合物缓慢倾倒在DCM/HCl水溶液(1M)的混合物上。搅拌10分钟后，收集有机层，用碳酸氢钠和盐水洗涤，然后用MgSO4干燥并进行减压浓缩，产生黄色油状固态标题化合物(1.21g，95％)。LCMS纯度92％，m/z391.1[M+H]+。
步骤4-合成(S)-4-(4-氨基苯氧基)-2-(环己基氨基)丁酸环戊酯
将三乙胺(1.29ml，9.3mmol)和甲酸(348μl，9.3mmol)溶解于EtOH(10ml)中，并加入步骤3产物(1.2g，3.1mmol)在EtOH(10ml)中的溶液中。加入10％Pd/C(约10摩尔％)，将该混合物加热至回流。30分钟后，通过硅藻土过滤热的反应混合物，用MeOH洗涤残留物。合并滤出液和洗涤液并蒸发，使残留物在DCM和NaHCO3饱和水溶液之间分层。用盐水洗涤有机层，用MgSO4干燥和减压浓缩，产生标题化合物(1.01g，92％)。LCMS纯度94％，m/z361.1[M+H]+，1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ：6.7(2H，d)，6.6(2H，d)，5.2(1H，m)，4.0(1H，m)，3.9(1H，m)，3.5(1H，dd)，2.3(1H，m)，2.1(1H，m)，1.9(4H，m)，1.7(7H，m)，1.6(3H，m)，1.3-0.9(5H，m)。
步骤5-合成(S)-2-环己基氨基-4-{4-[(2，4-二氨基-5-甲基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基)-氨基]-苯氧基}-丁酸环戊酯(4)
Figure S2006800149819D00661
在室温、氢气气氛下搅拌2，4-二氨基-5-甲基吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-腈(0.50g，2.5mmol)、步骤4产物(0.36g，1.0mmol)和拉尼镍(3g，含水)在乙酸(40ml)中的溶液。48小时后，通过硅藻土过滤该反应混合物，减压蒸发溶剂。将该物质的MeOH溶液加载到SCX柱上，用1％氨的MeOH溶液洗脱。使粗产物吸附于二氧化硅，并用柱色谱纯化(10％MeOH/DCM)，产生标题化合物(76mg，14％)。LCMS纯度90％，m/z548.2[M+H]+，1H NMR(400MHz，DMSO)，δ：8.5(1H，s)，7.0(2H，bs)，6.7(2H，d)，6.6(2H，d)，6.2(2H，bs)，5.5(1H，m)，5.1(1H，m)，4.1(2H，s)，3.9(2H，m)，3.4(1H，m)，2.7(3H，s)，2.3(1H，m)，1.9(1H，m)，1.8(4H，m)，1.6(11H，m)，1.1(5H，m)。
实施例5
本实施例描述了通过在不破坏其结合模式的点上连接氨基酸酯基序修饰已知的PI3激酶抑制剂N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2-基]-乙酰胺(化合物(20))。
化合物(20)：N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2-基]-乙酰胺
Figure S2006800149819D00662
按WO03072552所述的方法制备化合物(20)
用下述方法制备基于化合物(20)的化合物。
按照下述方案所述方法制备化合物(21)和(22)：
步骤1-合成2-氯-5-(2-氧代-丙基)-苯磺酰氯
Figure S2006800149819D00672
在-10℃、N2、温和搅拌下将4-氯苯基丙酮(4g，0.023mol)逐滴加入氯磺酸(30ml，0.45mol)中。使该反应混合物升温至室温，继续搅拌18小时。通过逐滴加入碎冰(500ml)中，小心地终止该反应混合物。用EtOAc(3×250ml)萃取该水溶液。合并EtOAc层，干燥(Na2SO4)，过滤，真空浓缩至干燥，得到粗标题化合物(6.3g，65％)，它无需进一步纯化即可用于下一步骤。LCMS纯度92％。1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ：2.30(3H，s)，3.85(2H，s)，7.50(1H，d)，7.65(1H，d)，7.95(1H，s)。
步骤2-合成1-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-丙-2-酮
Figure S2006800149819D00681
在70℃搅拌Na2SO3(3.79g，0.030mol)和NaHCO3(2.53g，0.030mol)的混合物的水(90ml)溶液。将步骤1产物(4.65g，0.015mol)在二
Figure 2006800149819_13
烷(190ml)中的溶液加入该溶液中。继续在70℃搅拌1小时。冷却至室温后，将该反应混合物真空浓缩至干燥，得到褐色固体。加入DMF(190ml)，然后加入MeI(1.88ml，0.030mol)。在40℃搅拌该反应混合物1小时。反应完成后，将该反应混合物倾倒在水(90ml)中，用EtOAc(500ml)萃取。用(Na2SO4)干燥EtOAc部分，过滤，真空浓缩，产生褐色固态标题化合物(2.49g，67％)，它无需进一步纯化即可用于下一步骤。LCMS纯度81％，m/z247[M++H]；1HNMR(400MHz，CDCl3)，δ：2.15(3H，s)，3.20(3H，s)，3.75(2H，s)，7.35(1H，d)，7.45(1H，d)，7.85(1H，s)。
步骤3-合成1-溴-1-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-丙-2-酮
Figure S2006800149819D00682
在室温下将溴(0.292ml，5.72mmol)逐滴加入搅拌的步骤2产物(1.88g，7.60mmol)在1，4-二
Figure 2006800149819_14
烷(120ml)中的溶液中，得到暗橙色溶液。继续搅拌18小时。将该反应混合物真空蒸发至干燥，避免在蒸发中加热到30℃以上。将残留物再溶解于EtOAc(100ml)，用NaHCO3饱和水溶液(20ml)洗涤，然后用水(20ml)洗涤。干燥EtOAc层(Na2SO4)，过滤，真空浓缩。快速色谱纯化(50％EtOAc/庚烷)得到黄色油状标题化合物(2.0g，80％)。LCMS纯度74％，m/z325/327[M++H]；1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ：2.35(3H，s)，3.25(3H，s)，5.35(1H，s)，7.50(1H，d)，7.65(1H，dd)，8.05(1H，s)。
步骤4-合成5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2-基胺
70℃搅拌步骤3产物(2g，6.15mmol)和硫脲(468mg，6.15mmol)的混合物在EtOH(65ml)中的溶液1.5小时。然后将该反应混合物冷却至室温，出现沉淀。过滤收集乳膏状固体，产生标题化合物(1.2g，64％)。LCMS纯度91％，m/z 303[M++H]，1HNMR(400MHz，MeOD)，δ：2.35(3H，s)，3.35(3H，s)，7.75-7.85(2H，m)，8.15(1H，s)。
步骤5-合成(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2-基氨基甲酰基]-丁酸环戊酯
Figure S2006800149819D00692
在室温下将步骤4产物(200mg，0.66mmol)在DMF(1.5ml)中的溶液逐滴加入2-叔丁氧基羰基氨基-戊二酸1-环戊酯(208mg，0.66mmol)、EDCI(190mg，0.99mmol)和HOBt(107mg，0.79mmol)的混合物在DMF(1.5ml)中的搅拌溶液中，加入三乙胺(0.138ml，0.99mmol)，继续搅拌18小时。用水(10ml)稀释该反应混合物，用EtOAc(15ml)萃取。用水(10ml)洗涤EtOAc层，干燥(Na28O4)，过滤，真空浓缩。用制备型TLC(70％EtOAc/庚烷，Rf0.5)纯化得到标题化合物(160mg，40％)。LCMS纯度91％，m/z 600/602[M++H]，1H NMR(400MHz，DMSO)，δ：1.45-1.55(9H，s)，1.65-2.15(10H，m)，2.45(3H，s)，2.70(2H，m)，3.45(3H，s)，4.10-4.25(1H，m)，5.25(1H，m)，7.75-7.90 (2H，m)，8.25(1H，s)。
步骤6-合成(S)-2-氨基-4-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2-基氨基甲酰基]-丁酸环戊酯(21)
Figure S2006800149819D00701
步骤5产物(140mg，0.233mmol)在20％TFA/DCM(2ml)中的溶液在室温下静置3小时。反应完成后，真空浓缩该反应混合物，得到化合物(21)(143mg，100％)。LCMS纯度97％，m/z500/502[M++H]，1H NMR(400MHz，MeOD)，δ：1.35-1.85(8H，m)，2.00-2.20(2H，m)，2.25(3H，s)，2.60(2H，m)，3.20(3H，s)，3.85-4.00(1H，m)，5.10(1H，m)，7.50-7.65(2H，m)，7.95(1H，s)。
步骤7-合成(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2-基氨基甲酰基]-丁酸
Figure S2006800149819D00702
将2M NaOH水溶液(0.5ml)加入步骤5产物(20mg，0.033mmol)在THF(0.5ml)和MeOH(0.5ml)的混合物中的溶液中。该混合物在室温下静置3小时。反应完成后，将反应混合物浓缩至接近干燥，逐滴加入1M HCl，直到pH1-2。在轻微的压力下通过过滤收集得到的沉淀。用水(0.5ml)洗涤该固体，真空中完全干燥，得到标题化合物(12mg，68％)。LCMS纯度94％，m/z 532/534[M++H]，1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ：1.55-1.70 (9H，s)，2.15-2.55(2H，m)，2.60(3H，s)，2.75-2.90(2H，m)，3.55(3H，s)，4.25-4.45(1H，m)，7.85-8.00(2H，m)，8.35(1H，s)。
步骤8-合成(S)-2-氨基-4-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2-基氨基甲酰基]-丁酸(22)
Figure S2006800149819D00711
步骤7产物(12mg，0.0225mmol)在20％TFA/DCM(0.3ml)中的溶液在室温下静置3小时。反应完成后，真空浓缩该反应混合物，产生标题化合物(22)(12mg，100％)。LCMS纯度94％，m/z432/434[M++H]，1H NMR(400MHz，MeOD)，δ：2.10-2.25(2H，m)，2.30(3H，s)，2.65-2.75(2H，m)，3.25(3H，s)，3.95-4.05(1H，m)，7.60-7.80(2H，m)，8.05(1H，s)。
按照下述方案所述方法制备化合物(23)：
Figure S2006800149819D00712
步骤1、2、3和4与制备化合物(21)和(22)中所述的步骤相同
步骤5-合成(S)-2-氨基-4-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2-基氨基甲酰基]-丁酸叔丁酯
Figure S2006800149819D00721
按照合成化合物(21)中所述的步骤由2-叔丁氧基羰基氨基-戊二酸1-叔丁酯和5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2-基胺(步骤4产物)制备此化合物。
步骤6-合成(S)-2-氨基-4-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2-基氨基甲酰基]-丁酸叔丁酯(23)
Figure S2006800149819D00722
在室温下将2M HCl/乙醚溶液(0.25ml)加入步骤5产物(50mg，0.085mmol)在EtOAc(0.25ml)中的溶液中。剧烈搅拌该反应混合物4小时。用EtOAc(0.25ml)和2MHCl/乙醚(0.25ml)的混合物再处理该反应。继续搅拌1小时。通过重力下过滤收集形成的沉淀，在EtOAc(3ml)和NaHCO3饱和水溶液(0.5ml)之间分配。用水(1ml)洗涤EtOAc层，干燥(Na2SO4)，过滤，真空浓缩，得到化合物(23)(6.5mg，16％)。LCMS纯度95％，m/z 488/490[M++H]，1H NMR(400MHz，MeOD)，δ：1.35-1.40(9H，s)，1.80-2.05(2H，m)，2.30(3H，s)，2.45-2.55(2H，m)，3.25(3H，s)，3.30-3.35(1H，m)，7.60-7.70(2H，m)，8.05(1H，s)。
生物实验
组蛋白脱乙酰酶抑制活性实验
用购自Biomol的HDAC荧光活性实验测定化合物抑制组蛋白脱乙酰酶活性的能力。简要说，在存在或不存在抑制剂的情况下，用组蛋白脱乙酰酶活性来源物(HeLa细胞核提取物)培育Fluor de LysTM底物，ε-氨基被乙酰化的赖氨酸。底物去乙酰化使该底物对Fluor de LysTM发色剂敏感，产生荧光团。因此，用HDAC活性来源物培育该底物，导致在HDAC抑制剂存在下减小的信号增加。
数据表示为在没有抑制剂时测定的对照的百分数，其中从所有样本中减去背景信号，如下所示：
％活性＝((Si-B)/(So-B))×100
其中Si是存在底物、酶和抑制剂时的信号，So是存在底物、酶和溶解抑制剂的载体时的信号，B是没有酶时测定的背景信号。
用Graphpad Prism软件将八个数据点的结果拟合至斜率可变的S形剂量反应曲线(％活性对化合物浓度的对数)的方程式后，通过非线性回归分析确定IC50值。
用获自HeLa细胞的粗核提取物的组蛋白脱乙酰酶活性进行筛选。购自4C(Seneffe，比利时)的制剂由指数生长期收获的HeLa细胞制备。按照Dignam JD 1983 Nucl.Acid.Res.11，1475-1489所述方法制备核提取物，用液氮速冻，并储存于-80℃。最终的缓冲液组合物为20mM Hepes，100mAM KCl，0.2mM EDTA，0.5mM DTT，0.2mMPMSF和20％(v/v)甘油。
Aurora激酶A抑制活性实验
用微孔板实验测定化合物抑制aurora激酶A活性的能力。简要说，用髓磷脂碱性蛋白(MBP)预包被96-孔Flashplates
Figure 2006800149819_15
(PerkinElmer Life Sciences)。37℃培育MBP(100ul of 100mg/ml in PBS)1小时，然后4℃培育过夜。然后用PBS洗涤平板，空气干燥。
为了测定aurora激酶A的活性，在含有10μMATP(酶的Km)、0.5 μCi[γ-33P]-ATP和不同浓度的抑制剂的测定缓冲液(50mM Tris(pH7.5)，10mM NaCl，2.5mM MgCl2，1mM DTT，0.4％DMSO)中培育40ng酶(ProQuinase：重组的全长人aurora激酶A，N-末端融合于GST，由杆状病毒在Sf21昆虫细胞中表达)。没有抑制剂的孔用作载体对照，不含酶的孔用于测定‘背景’信号。在30℃培育平板过夜。培育后，去除孔的内含物，用含有10mM焦磷酸四钠的PBS洗涤平板三次，然后用Wallac MicroBetaTriLux进行闪烁计数。
用10种浓度(终浓度最高为10μM，三倍稀释)、每种浓度三复孔产生剂量反应曲线。
用Xlfit软件将数据点结果拟合至斜率可变的S形剂量反应曲线(％活性对化合物浓度的对数)的方程式后，通过非线性回归分析确定IC50值。
二氢叶酸还原酶(DHFR)抑制活性实验
采用Sigma试剂盒(目录号CS0340)测定化合物抑制DHFR活性的能力的实验基于DHFR催化可逆的二氢叶酸NADPH-依赖性还原成四氢叶酸的能力。它采用了有专利权的测定缓冲液以及每个反应7.5×10-4单位的重组人DHFR、60μM的NADPH和50μM的二氢叶酸。该反应后，在室温下监测340nm处的吸光度降低2分钟，通过吸光度降低速率计算酶活性。抑制剂存在下的酶活性表示为无抑制剂活性的百分数，用Xlfit软件从S形剂量反应曲线测定抑制剂IC50(％活性对化合物浓度的对数)。各样品一式三份，各剂量反应曲线由10种稀释度的抑制剂组成。
P38 MAP激酶α抑制活性实验
在由Upstate(Dundee UK)进行的实验中测定化合物抑制p38 MAP激酶α(在大肠杆菌中表达成N-末端用GST标记的蛋白质的全长人酶)活性的能力。在25μl最终反应体积中，用25mM Tris pH7.5、0.02mM EGTA、0.33mg/ml髓磷脂碱性蛋白、10mM乙酸镁、ATP 90μM(Km 97μM)和[γ-33P]-ATP(特定活性约为500cpm/pmol)培育p38MAP激酶α(5-10mU)。通过加入MgATP混合物启动该反应。室温培育40分钟后，通过加入5μl3％磷酸溶液终止该反应。然后，将10μl反应液打点到P30滤垫上，用75mM磷酸洗涤3次，每次5分钟，并用甲醇洗涤一次，然后干燥，并进行闪烁计数。
从连续稀释抑制剂在DMSO中的储存溶液的1/2稀释度对数产生剂量反应曲线。从最高终浓度10μM开始进行9个稀释步骤，包括‘无化合物’空白。样品一式两份。收集闪烁计数数据，并用Graphpad Prism软件进行自由拟合分析。从产生的曲线确定产生50％抑制的浓度。
PI3-激酶γ抑制实验
PI3-激酶γ活性的测定依赖GRP1血小板-白细胞C激酶底物同源性(PH)结构域与PIP3的特异性和高亲和力结合，PIP3是PI3-激酶活性的产物。铕-标记的抗-GST单克隆抗体、GST-标记的GRP1PH结构域、生物素化PIP3和链霉亲和素-别藻蓝蛋白(APC)之间形成复合物。此复合物产生稳定的时间分辨的荧光共振能量转移(FRET)信号，这种信号会被PI3-激酶实验中产生的PIP3与生物素化PIP3的竞争减弱。
该实验在Upstate(Dundee，UK)进行，如下所述：在20μl最终反应体积中，在含有10μM磷脂酰肌醇-4，5-双磷酸和100μM MgATP(酶的Km 117μM)的测定缓冲液中培育PI3-激酶γ(N-末端用His6标记的重组全长人酶，由杆状病毒在Sf21昆虫细胞中表达)。通过加入MgATP混合物启动该反应。室温培育30分钟后，通过加入5μl含有EDTA和生物素化磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸的终止溶液终止该反应。最后，加入5μl检测缓冲液，其含有铕-标记的抗GST单克隆抗体、GST-标记的GRP1 PH结构域和链霉亲和素-APC。然后以时间分辨的荧光模式读板，按照等式HTRF＝10000×(Em665nm/Em620nm)确定同质的(homogenous)时间分辨的荧光(HTRF)信号。
从连续稀释化合物在DMSO中的储存溶液的1/2稀释度对数产生一式两份的数据点。从最高终浓度10μM开始进行9个稀释步骤，包括‘无化合物’空白。将HTRF比值数据转化成％对照活性，并用四参数S形剂量反应(斜率可变)进行分析。确定产生50％抑制的浓度(IC50)。
细胞增殖抑制实验
收获生长至对数期的癌细胞系(U937和HCT116)，以1000-2000个细胞/孔(终体积100μl)接种于96-孔组织培养板。生长24小时后，用化合物处理细胞。然后，再培育平板72-96小时，然后按照供应商(Roche Applied Science)说明书进行WST-1细胞活力测定。
数据表示为没有抑制剂时测定的对照的抑制百分数，如下所示：
％抑制＝100-((Si/So)×100)
其中Si是抑制剂存在时的信号，So是DMSO存在时的信号。
用8种浓度(终浓度最高为10μM，三倍稀释)、每种浓度六复孔产生剂量反应曲线。
用Graphpad Prism软件将结果拟合至斜率可变的S形剂量反应曲线(％活性对化合物浓度的对数)的方程式后，通过非线性回归分析确定IC50值。
用LPS-刺激人全血
通过静脉穿刺用添加肝素的真空容器(Becton Dickinson)采集全血，用等体积的RPMI1640组织培养基稀释。将100μl接种于V形底96孔组织培养板中。加入用100μl RPMI1640培养基配制的抑制剂，2小时后，用终浓度为100ng/ml的LPS(大肠杆菌菌株005:B5，Sigma)刺激血液，37℃、5％CO2培育6小时。用夹心ELISA(R&DSystems#QTA00B)测定无细胞上清液中的TNF-α水平。
破碎细胞羧酸酯酶实验
制备细胞提取物
用4体积的Dulbeccos PBS(～1升)洗涤U937或HCT116肿瘤细胞(～109)，525g4℃离心10分钟。重复此过程两次，将最终的细胞沉淀重悬于35ml冰冷的匀浆缓冲液(Trizma 10mM，NaCl 130mM，CaCl2 0.5mM，25℃时pH为7.0)。用氮气穴(cavitation)(700psi，4℃，50分钟)制备匀浆物。将匀浆物保持在冰上，并加入抑制剂混合物，其终浓度分别为：
亮抑肽酶          1μM
抑肽酶            0.1μM
E64               8μM
抑胃酶肽          1.5μM
贝他定            162μM
糜蛋白酶抑制素    33μM
通过525g离心10分钟使细胞匀浆物澄清后，得到的上清液用作酯酶活性来源物并贮存于-80℃待用。
测定酯切割
可用如上所述制备的细胞提取物测定酯水解成相应羧酸。为此目的，用Tris-HCl25mM 37℃培育细胞提取物(～30μg/0.5ml总测定体积)，再用125mM NaCl缓冲液pH7.5 25℃培育。在时间零点，加入终浓度为2.5μM的酯(底物)，37℃培育样品合适时间(通常为0或80分钟)。通过加入3体积乙腈终止反应。在时间零点的样品中，加入乙腈，然后加入酯化合物。12000g离心5分钟后，在室温下通过LCMS(Sciex API3000，HP1100二元泵，CTC PAL)分析样品中的酯和相应羧酸。在AceCN(75*2.1mm)柱上进行层析，移动相为5-95％乙腈在水/0.1％甲酸中的溶液。
hCE-1、hCE-2和hCE-3在单核和非单核细胞系中表达的定量
用基因特异性引物从人cDNA PCR扩增hCE-1、-2和-3。将PCR产物克隆入质粒载体并进行测序验证。然后将它们连续稀释，以用作实时PCR反应的标准曲线。从不同的人细胞系中提取总RNA并制备cDNA。为了对hCE在细胞系中的绝对水平进行定量，将基因表达水平与实时SYBR Green PCR实验中的克隆PCR产物标准物作比较。图1显示，只有单核细胞系表达显著量的hCE-1。
生物结果
用上述酶抑制、细胞增殖和酯切割实验研究上述实施例1-5所述的化合物，结果见表3和4。
效力
表3
Figure 2006800149819A00800071
上述结果显示：
(i)氨基酸酯修饰的化合物(化合物8和10)和通过切割酯基序产生的酸(化合物9)与未修饰的HDAC抑制剂(SAHA-化合物7)在酶实验中IC50值相当，表明α氨基酸酯基序结合于SAHA上不破坏结合模式的位点。
(ii)尽管酯(化合物8和10)和酸(化合物9)与未修饰的抑制剂(SAHA-化合物7)活性相当，但与未修饰的抑制剂(化合物7)相比，酯酶切割环戊酯(化合物8)的细胞效力显著提高，而酯酶稳定叔丁酯(化合物10)的细胞效力明显下降，表明后者未在细胞中积累酸以产生升高的细胞效力。
(iii)化合物8比未修饰的对应化合物7(或非水解酯衍生物，化合物10)在细胞增值实验中活性更强，表明在其累积的细胞中酯水解为母体酸，并发挥更强的抑制作用。
表3续
Figure 2006800149819A00800081
上述结果显示：
(i)通过切割化合物12酯基序产生的α氨基酸修饰的抑制剂化合物13与未修饰的aurora激酶抑制剂(化合物11)在酶实验中IC50相当，表明可将α氨基酸酯基序结合于不破坏aurora激酶A结合的位点。
(ii)尽管酸(化合物13)与未修饰的抑制剂(化合物11)的酶活性相当，且酯(化合物12)为一较弱抑制剂，但化合物12的细胞效力较未修饰的抑制剂(化合物11)显著升高。不易切割的叔丁酯(化合物14)与可切割环戊酯(化合物12)酶活性相当，但细胞实验中活性减弱20倍。
(iii)与未修饰对应物(化合物11)及不易切割化合物叔丁酯(化合物14)相比，在细胞增值实验中化合物12的活性均强于二者，表明在其累积的细胞中环戊酯水解为母体酸，并发挥更强的抑制作用。
表3续
上述结果显示：
(i)α氨基酸修饰的抑制剂化合物16和切割化合物16中酯基序产生的酸化合物17在酶实验中与未修饰的P38MAP激酶抑制剂(化合物15)IC50值相当，表明可将α氨基酸酯基序结合于不破坏P38MAP激酶结合的位点。
(ii)作为酸的化合物17与未修饰的抑制剂(化合物15)和叔丁酯(化合物18)酶抑制活性相当。但与未修饰的抑制剂(化合物15)和不易切割叔丁酯(化合物18)相比，环戊酯(化合物16)抑制全血中单核细胞内TNF产生的能力显著提高。
(iii)全血实验中化合物16比未修饰的对应化合物15和不易切割叔丁酯化合物18活性更强，表明在其累积的细胞中环戊酯水解为母体酸，并发挥更强的抑制作用。
表3续
Figure 2006800149819A00800101
上述结果显示：
(i)切割化合物6中酯基序产生的α氨基酸修饰的抑制剂，化合物19，与未修饰的DHFR抑制剂(化合物2(G＝N))在酶实验中IC50值相当，表明可将α氨基酸酯基序结合于不破坏DHFR结合的位点。
(ii)尽管(化合物19)与未修饰的抑制剂(化合物2(G＝N))的酶抑制活性相当，酯(化合物6)的细胞增殖抑制效力显著高于未修饰的抑制剂(化合物2(G＝N))。
(iii)在细胞增殖实验中化合物6比未修饰的对应物(化合物2(G＝N))活性更强，表明环戊酯在其累积的细胞中水解为母体酸，并发挥更强的抑制作用。
表3续
Figure 2006800149819A00800102
上述结果显示：
(i)α氨基酸酯修饰的抑制剂化合物21和切割化合物21中酯基序产生的酸化合物22在酶实验中比未修饰的PI 3-激酶抑制剂(化合物20)IC50值差约10倍以内，表明表明可将α氨基酸酯基序结合于不破坏PI3-激酶结合的位点。
(ii)尽管酸，化合物22，与未修饰的抑制剂(化合物20)和酯(化合物21)活性相当，但与未修饰的抑制剂(化合物20)和不易切割叔丁酯(化合物23)相比，酯抑制抑制全血中单核细胞内TNF产生的能力显著提高。
(iii)全血实验中化合物21比未修饰的对应化合物20和不易切割叔丁酯化合物23活性更强，表明在其累积的细胞中环戊酯水解为母体酸，并发挥更强的抑制作用。
选择性
表4：在单核细胞系和非单核细胞系中细胞增殖和酯切割的比较。
1前述破碎细胞羧酸酯酶测定与修饰化合物(化合物24)孵育80分钟产生酸的量。
上述结果显示：
(i)未修饰化合物(化合物7)在单核和非单核细胞系间未显示的选择性可通过连接适当的酯基序来实现，如化合物24。
(ii)该选择性与提高的单核细胞系切割酯为酸相关。
(iii)细胞活性提高仅在产生酸的细胞系中可见，表明细胞效力的提高是因为酸的累积。
表4续
Figure 2006800149819A00800121
1前述破碎细胞羧酸酯酶测定与修饰化合物(化合物25)孵育80分钟产生酸的量。
上述结果显示：
(i)未修饰化合物(化合物10)在单核和非单核细胞系间未显示的选择性可通过连接适当的酯基序来实现，如化合物25。
(ii)该选择性与提高的单核细胞系切割酯为酸相关。
(iii)细胞活性提高仅在产生酸的细胞系中可见，表明细胞效力的提高是因为酸的累积。
表4续
Figure 2006800149819A00800122
1前述破碎细胞羧酸酯酶测定与修饰化合物(化合物5)孵育80分钟产生酸的量。
上述结果显示：
(i)未修饰化合物(化合物2G＝N)在单核和非单核细胞系间未显示的选择性可通过连接适当的酯基序来实现，如化合物5。
(ii)该选择性与提高的单核细胞系切割酯为酸相关。
(iii)细胞活性提高仅在产生酸的细胞系中可见，表明细胞效力的提高是因为酸的累积。

Claims (22)

1.一种α氨基酸酯和靶胞内酶的活性抑制剂的共价偶联物，其中：
所述偶联物的酯基可被一种或多种胞内羧酸酯酶水解成相应酸，所述胞内羧酸酯酶选自hCE-1、hCE-2和hCE-3；和
所述α氨基酸酯在远离抑制剂和靶酶之间的结合界面的位置上偶联于所述抑制剂，
其中作为α氨基酸酯偶联物的水解产物的氨基酸偶联物保持母体抑制剂与所述靶酶的胞内结合活性。
2.一种α氨基酸酯和靶胞内酶的活性抑制剂的共价偶联物，其中：
所述偶联物的酯基可被一种或多种胞内羧酸酯酶水解成相应酸，所述胞内羧酸酯酶选自hCE-1、hCE-2和hCE-3；和
所述α氨基酸酯与所述抑制剂偶联时，所述抑制剂和所述相应酸的偶联物与靶酶的结合模式与未偶联抑制剂相同，
其中作为α氨基酸酯偶联物的水解产物的氨基酸偶联物保持母体抑制剂与所述靶酶的胞内结合活性。
3.如权利要求1或2所述的共价偶联物，其特征在于，所述共价偶联的α氨基酸酯不是所述偶联抑制剂的二肽基序的C-末端元件。
4.如权利要求1-3中任一项所述的共价偶联物，其特征在于，所述抑制剂是非共价结合于所述靶胞内酶的抑制剂。
5.如权利要求1-4中任一项所述的共价偶联物，其特征在于，所述α氨基酸酯通过接头基团共价偶联于所述抑制剂。
6.如权利要求1-5中任一项所述的共价偶联物，其特征在于，所述α氨基酸酯通过所述氨基酸酯的氨基偶联于所述抑制剂。
7.如权利要求1-6中任一项所述的共价偶联物，其特征在于，所述α氨基酸酯通过所述氨基酸酯的α碳偶联于所述抑制剂。
8.如权利要求1-6中任意一项所述的共价偶联物，其特征在于，所述酯可被含有胞内羧酸酯酶hCE-1的细胞水解成相应的α氨基酸，并且不能被含有hCE-2或hCE-3的细胞水解。
9.如权利要求8所述的共价偶联物，其特征在于，所述氨基酸酯的氨基氮被取代，但不直接连接于羰基部分。
10.一种药物组合物，包括权利要求1-9中任一项所述的偶联物以及药学上可接受的载体。
11.如权利要求10所述的药物组合物，其特征在于，该组合物适合局部给药，所述偶联物中，(a)当所述α氨基酸酯通过其氨基连接于所述抑制剂时，与所述α氨基酸酯的α碳相邻的碳被单取代，或者(b)当所述α氨基酸酯通过氨基酸的碳原子连接于所述抑制剂时，与氨基酸的这个碳原子相邻的碳原子未取代。
12.一种制备用于增加或延长靶胞内酶的活性抑制剂的胞内效力和/或停留时间的共价偶联物的方法，所述方法包括将α氨基酸酯在远离所述抑制剂和靶酶的结合界面的位置上共价连接于所述抑制剂，对所述抑制剂进行结构修饰，所述偶联物的酯基可被一种或多种胞内羧酸酯酶水解成相应酸，所述胞内羧酸酯酶选自hCE-1、hCE-2和hCE-3，
其中作为α氨基酸酯偶联物的水解产物的氨基酸偶联物保持母体抑制剂与所述靶酶的胞内结合活性。
13.一种制备用于增加或延长靶胞内酶的活性抑制剂的胞内效力和/或停留时间的共价偶联物的方法，所述方法包括通过将α氨基酸酯共价连接于所述抑制剂对所述抑制剂进行结构修饰，以使所述抑制剂和所述相应酸的偶联物与靶酶的结合模式与未偶联抑制剂相同，所述偶联物的酯基可被一种或多种胞内羧酸酯酶水解成相应酸，所述胞内羧酸酯酶选自hCE-1、hCE-2和hCE-3，
其中作为α氨基酸酯偶联物的水解产物的氨基酸偶联物保持母体抑制剂与所述靶酶的胞内结合活性。
14.如权利要求12或13所述的方法，其特征在于，所述共价偶联的α氨基酸酯不是所述偶联抑制剂的二肽基序的C-末端元件。
15.如权利要求12-14中任一项所述的方法，其特征在于，所述抑制剂是非共价结合于所述靶胞内酶的抑制剂。
16.如权利要求12-15中任一项所述的方法，其特征在于，所述α氨基酸酯通过接头基团共价偶联于所述抑制剂。
17.如权利要求12-16中任一项所述的方法，其特征在于，所述α氨基酸酯通过所述氨基酸酯的氨基偶联于所述抑制剂。
18.如权利要求12-17中任一项所述的方法，其特征在于，所述α氨基酸酯通过所述氨基酸酯的α碳偶联于所述抑制剂。
19.如权利要求12-17中任一项所述的方法，其特征在于，所述酯可被含有胞内羧酸酯酶hCE-1的细胞水解成相应的α氨基酸，并且不能被含有hCE-2或hCE-3的细胞水解。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述氨基酸酯的氨基氮被取代，但不直接连接于羰基部分。
21.一种相对于其它细胞类型选择性增加或延长靶胞内酶的活性抑制剂在巨噬细胞和/或单核细胞中的胞内效力的体外方法，所述方法包括用权利要求9所述的共价偶联物处理混合细胞群体。
22.一种鉴定给定的靶胞内酶活性抑制剂的α氨基酸酯的共价偶联物的方法，相对于给定抑制剂，所述偶联物具有增加或延长的细胞效力，所述方法包括：
(i)鉴定与靶酶的结合模式相同的给定或多个给定的靶胞内酶活性抑制剂上的位置，所述位置远离抑制剂和靶酶之间的结合界面；
(ii)通过在(i)中鉴定的一个或多个位置上连接一种α氨基酸酯基团或多种不同的α氨基酸酯基团共价修饰所述抑制剂；
(iii)检测(ii)中制备的所述α氨基酸-偶联的抑制剂，以测定其对靶酶的活性；和
(iv)由(iii)中得到的数据，选择能够在细胞内调节酶活性、在细胞内转化为相应羧酸并在细胞内累积以及显示增加或延长的细胞效力的一种或多种测试的给定抑制剂与α氨基酸酯的偶联物。
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