ES2415244T3

ES2415244T3 - Conjugados de éster de aminoácido alfa-fármaco hidrolizables mediante carboxilesterasa

Info

Publication number: ES2415244T3
Application number: ES06727008T
Authority: ES
Inventors: Alan Hornsby Davidson; Alan Hastings Drummond; Lindsey Ann Needham
Original assignee: Chroma Therapeutics Ltd
Current assignee: Chroma Therapeutics Ltd
Priority date: 2005-05-05
Filing date: 2006-05-04
Publication date: 2013-07-24
Anticipated expiration: 2026-05-04
Also published as: ZA200708283B; ES2577433T3; NZ561710A; PT1877098E; CA2836827A1; CN101171039B; SI1877098T1; CN101171039A; SG2014007512A; CA2836827C; GB0509226D0; DK1877098T3

Abstract

Un conjugado covalente de un éster de alfa-aminoácido y un inhibidor de la actividad de la enzima histona acetilasa intracelular diana para usar en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia, donde el grupo éster del conjugado es hidrolizable por una o más enzimas carboxilesterasas intracelulares en el correspondiente ácido; el nitrógeno del grupo amino del aminoácido éster no está unido directamente a un resto carbonilo o se deja sin sustituir; y el alfa-aminoácido éster está conjugado con el inhibidor en una posición remota de la interfaz de unión entre el inhibidor y la enzima histona desacetilasa, donde la posición de la conjugación es remota cuando el conjugado tiene una potencia en un ensayo de actividad celular al menos tan alta como la del inhibidor no conjugado en el mismo ensayo, donde el ensayo de actividad celular es un ensayo de inhibición de la proliferación celular llevado a cabo en células de cáncer U937.

Description

Conjugados de éster de aminoácido alfa-fármaco hidrolizables mediante carboxilesterasa. La presente invención se refiere a incrementar o prolongar la actividad de un compuesto que inhibe la actividad de la 5 enzima intracelular diana histona desacetilasa mediante la conjugación covalente de un motivo de éster de alfa-aminoácido al modulador, más específicamente a inhibidores a los que se ha conjugado el motivo de éster de alfa-aminoácido, para usar en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante tratamiento. La invención también se refiere a un procedimiento para la identificación de dichos conjugados que tienen mejores propiedades respecto al inhibidor parental no conjugado. La invención además se refiere al uso de moduladores que 10 contienen motivos de éster de aminoácidos que permiten la acumulación selectiva de conjugados de aminoácidos dentro de las células del linaje monocito-macrófago. Antecedentes de la invención 15 Muchas enzimas intracelulares y receptores son dianas de fármacos farmacéuticamente útiles que modulan sus actividades mediante la unión a sus sitios activos. En la Tabla 1 siguiente se proporcionan Ejemplos. Para alcanzar las enzimas diana y los receptores, los compuestos moduladores deben, por supuesto, atravesar la membrana celular del fluido plasmático/extracelular. En general, los moduladores de carga neutra atraviesan la membrana celular con más facilidad que las especies cargadas. Después se establece un equilibrio dinámico de modo que el 20 modulador equilibra entre plasma e interior celular- Como resultado del equilibrio, los tiempos de residencia intracelular y las concentraciones de muchos modulares de enzimas intracelulares y receptores a menudo son muy bajos, especialmente en los casos en los que el modulador se elimina rápidamente del plasma. Las potencias de los modulares son, por tanto, bajas a pesar de sus elevadas afinidades de unión por la enzima o receptor diana. 25 Por tanto, sería deseable si un procedimiento estuviera disponible para incrementar la concentración celular de un modulador dado de una enzima o receptor intracelular. Esto daría como resultado un incremento de la potencia y prolongando la residencia del modulador dentro de la célula tendría como resultado mejores propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas. Se conseguirían una exposición más consistente y menor frecuencia de dosificación. Se podría obtener un beneficio adicional si se pudiera dirigir al fármaco a las células diana específicas 30 responsables de su acción terapéutica, reduciendo la exposición sistémica y, por tanto, los efectos secundarios. Breve descripción de la invención La presente invención describe este procedimiento y describe moduladores mejorados que incorporan los principios 35 estructurales en los que se basa el procedimiento. Aprovecha el hecho de que las moléculas lipófilas (baja polaridad o carga neutra) atraviesan la membrana celular y entran en las células con relativa facilidad y las moléculas hidrófilas (mayor polaridad, cargadas) no. Por tanto, si un motivo lipófilo está unido a un modulador dado, permitiendo que el modulador entre en la célula y si dicho motivo se convierte en la célula en uno de mayor polaridad, cabe esperar que el modulador con el motivo de mayor polaridad unido se acumule en la célula. Siempre 40 que dicho motivo esté unido al modulador de un modo que no altere su modo de unión a la enzima o receptor diana, cabe esperar que la acumulación del modulador con el motivo de mayor polaridad unido tenga como resultado una actividad prolongada y/o aumentada. La presente invención está relacionada con moduladores que son inhibidores de la histona desacetilasa, 45 La presente invención usa el hecho de que hay enzimas carboxilesterasa dentro de las células que pueden usarse para hidrolizar un éster de alfa-aminoácido unido a un modulador dado en el ácido parental. Por tanto, se puede administrar un modulador como conjugado covalente con un éster de alfa-aminoácido, forma en la cual entra fácilmente en la célula donde se hidroliza de forma eficiente mediante una o más carboxilesterasas intracelulares y el conjugado alfa-aminoácido-modulador se acumula dentro de la célula incrementando la potencia global y/o el 50 tiempo de residencia activa. También se ha descubierto que mediante la modificación del motivo del alfa-aminoácido o del modo mediante el cual se conjuga se puede dirigir los moduladores a los monocitos y los macrófagos. En le presente documento, a menos que se especifique “monocito” o “monocitos”, el término macrófago o macrófagos se utilizará para indicar macrófagos (incluidos los macrófagos asociados a tumores) y/o monocitos. 55 Descripción detallada de la invención Por tanto, en un amplio aspecto, la presente invención proporciona un conjugado covalente de un éster de alfa-aminoácido y un inhibidor de la actividad de la enzima histona acetilasa intracelular diana para usar en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia, donde el grupo éster del conjugado es 60 hidrolizable mediante una o más enzimas carboxilesterasa intracelulares en el correspondiente ácido; el nitrógeno del grupo amino del éster de aminoácido no está unido directamente a un resto carbonilo o se deja sin sustituir; y el éster de alfa-aminoácido está unido covalentemente al inhibidor en una posición remota de la interfaz de unión entre el inhibidor y la enzima histona desacetilasa y/o está conjugado con el inhibidor de un modo tal que el modo de unión del inhibidor conjugado y dicho ácido correspondiente a la enzima histona desacetilasa es el mismo que el del 65 inhibidor no conjugado; donde la posición de la conjugación es remota/el modo de unión es el mismo cuando el conjugado tiene una potencia en un ensato de actividad celular al menos tan alta como la de un inhibidor no conjugado en el mismo ensayo, donde el ensayo de actividad celular es un ensayo de inhibición de la proliferación celular llevado a cabo en células de cáncer U937. Como se ha indicado, la invención se refiere a la modificación de inhibidores de la histona desacetilasa. Aunque el 5 principio de la invención es de aplicación general, no restringida por la identidad química del inhibidor, es fuertemente preferible que el inhibidor sea uno que ejerza su efecto mediante unión reversible a la histona desacetilasa diana, frente a aquéllos cuyo efecto se debe a la unión covalente a la histona desacetilasa diana. Dado que por utilidad práctica el conjugado carboxilesterasa-hidrolizado se requiere que conserve la actividad de 10 unión intracelular del modulador parental con su enzima histona desacetilasa diana, la unión del motivo éster debe tener en cuenta dicho requisito, que se cumplirá si el motivo éster de alfa-aminoácido carboxilesterasa está unido al modulador de un modo tal que el modo de unión del correspondiente producto de hidrólisis de la carboxilesterasa (Es decir, el correspondiente ácido) a la diana es esencialmente el mismo que el modulador no conjugado. En general, esto se consigue mediante unión covalente del motivo de éster carboxilesterasa al modulador en una 15 posición remota de la interfaz de unión entre el modulador y la enzima histona desacetilasa diana. De este modo, el motivo se extiende al disolvente, en lugar de interferir potencialmente en el modo de unión. Además, el motivo aminoácido carboxilesterasa obviamente debe ser un sustrato para la carboxilesterasa si el primero debe ser hidrolizado por el último dentro de la célula. Las carboxilesterasas intracelulares son bastante 20 promiscuas en general, en cuanto a que su capacidad para hidrolizar no depende de los requisitos estructurales muy estrictos del sustrato éster de aminoácido. Por tanto, la mayoría de los modos de conjugación covalente del motivo aminoácido carboxilesterasa co un modulador permitirá la hidrólisis. La unión mediante una cadena enlazadora flexible será normalmente como se consigue esto. 25 Se apreciará que cualquier modificación química de un fármaco puede alterar sutilmente su geometría de unión y la estrategia química para la unión del motivo de éster carboxilesterasa puede introducir interacciones de unión adicionales con la diana o puede sustituir una o más de estas interacciones. Por tanto, el requisito del modo de unión del conjugado hidrolizado a la diana es el mismo que el modulador no conjugado se debe interpretar como que requiere a que no hay una perturbación significativa del modo de unión, en otras palabras que el modo de 30 unión es esencialmente el mismo que el del modulador no conjugado. Cuando se cumple el requisito, las principales características de la unión del modulador parental se conservan y los moduladores modificados y no modificados tienen un conjunto común global de características de unión. Los puntos de vista del “mismo modo de unión” y la “unión remota” son similares porque, como se ha indicado anteriormente, el modo habitual de alcanzar el requisito del “mismo modo de unión” es unir el motivo de la carboxilesterasa en un punto en la 35 molécula moduladora que sea remoto con respecto a la interfaz de unión entre el inhibidor y la enzima histona desacetilasa diana. No obstante, cabe destacar que estos requisitos no implican que el conjugado y/o su correspondiente ácido deba tener la misma potencia moduladora in Vitro o in vivo que el modulador parental. No obstante, como se usa en el presente documento, las características del mismo modo de unión” y la “unión remota” se consideran satisfechas cuando el éster tiene una potencia en un ensayo de actividad celular al menos 40 tan alta como la del modulador parental en el mismo ensayo, siendo el ensayo celular un ensayo de proliferación llevado a cabo en células de cáncer U937. En general, es preferible que el ácido carboxílico hidrolizado por la esterasa tenga una potencia en un ensayo inhibidor de la histona desacetilasa in vitro no inferior a un décimo de la potencia del modulador parental en dicho ensayo. 45 Aunque los procedimientos de química medicinal tradicional de mapear las relaciones estructura-actividad son perfectamente capaces de identificar una estrategia de unión para cumplir los anteriores requisitos de “mismo modo de unión” y la “unión remota”, las técnicas modernas como RMN y cristalografía de rayos X han avanzado hasta el punto en el que es muy habitual que se conozca el modo de unión de un inhibidor conocido de la histona desacetilasa o que se pueda conocer. Dicha información es, en la mayoría de los casos, de dominio público o se 50 puede modelar usando métodos de modelación basado en ordenador, tal como anclaje de ligando y modelación de homología, en base a los modos de unión conocidos de moduladores estructuralmente similares, o la estructura conocida del sitio activo de la histona desacetilasa. Con conocimientos del modo de unión del modulador obtenido mediante estas técnicas se puede identificar una localización adecuada para la unión del motivo de éster carboxilesterasa, normalmente (como se ha indicado anteriormente) en un punto sobre el modulador que es remoto 55 de la interfaz de unión entre el inhibidor y la enzima histona desacetilasa diana. Las enzimas carboxilesterasa intracelular capaz de hidrolizar el grupo éster del alfa-aminoácido conjugado con el correspondiente ácido incluyen los tres isótopos conocidos de la enzima carboxilesterasa humana (("hCE") hCE-1 (también conocido como CES-1), hCE-2 (también conocido como CES-2) y hCE-3 (Drug Disc. Today 2005, 10, 313-60 325). Aunque estos se consideran las principales enzimas, otras enzimas de carboxiléster como la bifenilhidrolasa (BPH) también pueden desempeñar un papel en la hidrólisis de los conjugados. El ensayo de rotura celular descrito más adelante es un procedimiento simple de confirmar que un conjugado dado de modulador y alfa-aminoácido éster o un alfa-aminoácido éster dado para evaluar como un posible éster de 65 carboxilesterasa se hidroliza según se requiera. Estas enzimas también se pueden expresar fácilmente usando técnicas recombinantes y las enzimas recombinantes pueden usarse para determinar o confirmar que se produce la hidrólisis. Es una característica de la invención que el conjugado deseado conserve el motivo de alfa-aminoácido unido covalentemente cuando se hidroliza mediante la o las carboxilesterasas dentro de la célula, ya que es el grupo 5 carboxilo polar de dicho motivo el que previene o reduce la eliminación del conjugado hidrolizado de la célula y, de este modo, contribuye a su acumulación dentro de la célula. De hecho, la potencia celular del modulador modificado se debe principalmente a la acumulación del ácido y si modulación de la actividad de la diana (aunque el éster no hidrolizado también ejerce su actividad sobre la diana siempre que permanezca sin hidrolizar. Dado que las células en general contienen varios tipos de enzimas peptidasa, es preferible que el conjugado, o más especialmente el 10 conjugado hidrolizado (el correspondiente ácido), no sea un sustrato de dichas peptidasas. En particular, es muy preferible que el grupo alfa-aminoácido éster no sea un elemento en C-terminal de un motivo dipeptídico en el conjugado. No obstante, aparte de la limitación del modo de unión covalente, el grupo alfa-aminoácido éster puede no estar unido covalentemente al modulador mediante su grupo amino o mediante su carbono en alfa. En algunos casos, el modulador tendrá un punto de unión conveniente para el motivo de carboxilesterasa éster y, en otros 15 casos, tendrá que idearse una estrategia sintética para su unión. Se ha descubierto que las células que solo expresan las carboxilesterasas hCE-2, y/o hCE-3 y las formas recombinantes de estas enzimas solo hidrolizarán los conjugados de éster de aminoácido con sus ácidos resultantes si el nitrógeno del alfa-aminoácido está insustituido o está directamente unido a un grupo carbonilo, mientras que las 20 células que contienen hCE-1, o la hCE-1 recombinante, pueden hidrolizar conjugados de aminoácidos con un amplia gama de grupos en el nitrógeno. Este requisito de selectividad de hCE-2 y hCE-3 se puede volver una ventaja cuando sea necesario que el modulador se dirija a enzimas o receptores solo en ciertos tipos de célula. Se ha encontrado que las cantidades relativas de estas tres enzimas carboxilesterasa varían entre los tipos de célula (véase la figura 1 y la base de datos en http:/symatlas.gnf.org/SymAtlas (obsérvese que en esta base de datos 25 hCE3/CES3 de indica con el símbolo FLJ21736)). Si el modulador va a actuar solo en los tipos celulares en os que se encuentra hCE-1, la unión de un motivo carboxilesterasa éster donde el grupo amino esté unido directamente a un grupo distinto al carbonilo tiene como resultado la acumulación del conjugado de modulador hidrolizado preferentemente en las células con concentraciones eficaces de hCE-1. Dicho de otro modo, la acumulación específica del ácido derivado del conjugado del modulador en células que expresan hCE-1 se consigue mediante la 30 unión del motivo de aminoácido éster al modulador de un modo tal que el átomo de nitrógeno del aminoácido éster no está unido directamente a un carbonilo o se deja sin sustituir. Se sabe que los macrófagos desempeñan un papel principal en trastornos inflamatorios, la liberación de citoquinas, en concreto TNFα e IL-1 (van Roon et al Arthritis and Rheumatism , 2003, 1229-1238). En la artritis reumatoide, son 35 contribuyentes principales a la inflamación articular y a la destrucción articular ((Conell in N.Eng J. Med. 2004, 350, 2591-2602). Los macrófagos también están implicados en el crecimiento y desarrollo tumoral (Naldini and Carraro in Curr Drug Targets Inflamm Allergy,2005, 3-8 ). Por tanto, los agentes dirigidos selectivamente a las células macrófagos podrían ser valiosos en el tratamiento del cáncer, la inflamación y la enfermedad autoinmunitaria. Cabría esperar que dirigir agentes a tipos de células específicas conduzca a la reducción de efectos secundarios. La 40 presente invención permite un procedimiento de dirigir moduladores a macrófagos, que se basa en la observación anterior en que el modo donde el motivo de carboxilesterasa éster se une al modulador determina si es hidrolizado por carboxilesterasas específicas y, por tanto, su el ácido resultante se acumula o no en diferentes tipos celulares. Específicamente, se ha encontrado que los macrófagos contienen la carboxilesterasa hCE-1 humana, mientras que otros tipos celulares no. En los conjugados de la invención, el nitrógeno del motivo éster está sustituido peor no 45 unido directamente a un resto de grupo carbonilo de modo que el éster solo será hidrolizado por hCE-1 y, por tanto, los conjugados esterasa-modulador hidrolizado solo se acumularán en los macrófagos. Por supuesto, hay muchos posibles grupos éster que puedan estar presentes en principio en el motivo de carboxilesterasa éster para la unión al modulador. Asimismo, hay muchos alfa-aminoácidos, tanto naturales como no 50 naturales difieren en la cadena lateral en el carbono alfa, que se pueden usar como ésteres en el motivo de carboxilesterasa éster Algunos alfa-aminoácido ésteres se hidrolizan rápidamente mediante una o más de los isotipos hCE-1, -2 y -3 o células que contienen estas enzimas, mientras que otros son hidrolizados más lentamente o solo se hidrolizan en cierta medida. En general, si la carboxilesterasa hidroliza el aminoácido éster libre en el ácido parenteral, sujeto a la dependencia del N-carbonilo de hCE-2 y hCE-3 tratada anteriormente, también hidrolizará el motivo éster 55 cuando se conjuga covalentemente al modulador. Por tanto, el ensayo de rotura celular y/o el ensayo de carboxilesterasa aislada descritos en el presente documento proporcionan un primer cribado rápido, simple u directo para los ésteres que tienen el perfil de hidrólisis requerido. Los motivos éster seleccionados de este modo se pueden volver a analizar en el mismo ensayo de carboxilesterasa cuando se conjugan con el modulador a través de la química de conjugación escogida, para confirmar que todavía es un sustrato de carboxilesterasa en este punto. Los tipos 60 adecuados de éster se tratarán a continuación, pero en este punto se puede mencionar que se ha encontrado que los ésteres de t-butilo de alfa-aminoácidos son sustratos relativamente malos de hCE-1, -2 and -3, mientras que los ésteres de ciclopentilo se hidrolizan con eficacia. Los alfa-aminoácidos adecuados también se tratarán con más detalle a continuación, pero en este punto se puede mencionar que la fenilalanina, la homofenilalanina, la fenilglicina y la elucina son generalmente adecuados y se prefieren los ésteres de alcoholes secundarios. 65 Como se ha indicado anteriormente, el éster de alfa-aminoácido puede conjugarse con el modulador a través del grupo amino del aminoácido éster o mediante el carbono alfa (por ejemplo a través de su cadena lateral) del aminoácido éster. Un radical enlazador puede estar presente entre el motivo de carboxilesterasa éster y el modulador. Por ejemplo, el alfa-aminoácido éster puede estar conjugado con el modulador como un radical de fórmula (IA), (IB) o (IC): 5 en la que R1 es un grupo éster que es hidrolizable por una o más enzimas carboxilesterasas intracelulares en un grupo de 10 ácido carboxílico; R2 es la cadena lateral de un alfa aminoácido natural o no natural; R4 es hidrógeno o alquilo C1-C6, cicloalquilo C3-C7, arilo o heteroarilo opcionalmente sustituidos; 15 B es a anillo heterocíclico monocíclico de 5 o 6 átomos del anillo donde R1 está unido un carbono del anillo adyacente al nitrógeno del anillo mostrado y el anillo B está condensado opcionalmente con un segundo anillo carbocíclico o heterocíclico de 5 o 6 átomos del anillo, en cuyo caso el enlace a L puede ser desde un átomo del anillo en dicho segundo anillo 20 Y es un enlace, -C(=S)-NR3-, -C(=NH)NR3- o -S(=O)2NR3- donde R3 es hidrógeno o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido; Y1 es un enlace, -(C=O)-, -S(O2)-, -C(=O)O-, -OC(=O)-, -(C=O)NR3-, -NR3(C=O)-, -S(O2)NR3-, -NR3S(O2)-, o -25 NR3(C=O)NR5-, donde R3 and R5 son de forma independiente hidrógeno o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido; L es un radical divalente de fórmula -(Alc1)m(Q)n(Alc2)p- donde m, n y p son de forma independiente 0 o 1, 30 Q es (i) un radical heterocíclico o carbocíclico mono o bicíclico divalente opcionalmente sustituido que tiene 5 - 13 miembros de anillo, o (ii), en el caso donde ambos m y p son 0, un radical divalente de fórmula -X2-Q1- o -Q1-X2- en la que X2 es -O-, -S- o NRA- en la que RA es hidrógeno o alquilo C1-C3 opcionalmente sustituido, y Q1 es un radical heterocíclico o carbocíclico mono o bicíclico divalente opcionalmente sustituido 35 que tiene 5-13 miembros de anillo, Alc1 y Alc2 representan de forma independiente opcionalmente sustituido radicales cicloalquilo C3-C7 divalentes o alquileno C1-C6 lineal o ramificado opcionalmente sustituido, alquenileno C2-C6 o alquinileno C2-C6 que pueden contener opcionalmente o terminar en un enlace éter (-O-), tioéter (-S-) o amino (-NRA-) 40 donde RA es hidrógeno o alquilo C1-C3 opcionalmente sustituido; X representa un enlace, -C(=O)-; -S(=O)2-; -NR3C(=O)-, -C(=O)NR3-,-NR3C(=O)NR5-, -NR3S(=O)2-, o -S(=O)2NR3- donde R3 y R5 son de forma independiente hidrógeno o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido; z es 0 o 1; 45 s es 0 ó 1; y Alc3 representa un radicales cicloalquilo C3-C7 divalente opcionalmente sustituido o alquileno C1-C6 lineal o ramificado opcionalmente sustituido, alquenileno C2-C6 o alquinileno C2-C6 que pueden contener opcionalmente o 50 terminar en un enlace éter (-O-), tioéter (-S-) o amino (-NRA-) donde RA es hidrógeno o alquilo C1-C3 opcionalmente sustituido; donde el átomo de nitrógeno del grupo amino del aminoácido éster no está unido directamente a un resto carbonilo o se deja sin sustituir. El término “éster” o “"grupo carboxilo esterificado” quiere decir un grupo R9O(C=O)- donde R9 es el grupo que caracteriza el éster, derivado del alcohol R9OH. 5 Como se usa en el presente documento, el término "(Ca-Cb)alquilo" donde a y b son números enteros hace referencia a un radical alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene de a a b átomos de carbono. Por tanto, cuando a es 1 y b es 6, por ejemplo, el término incluye metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, t-butilo, n-pentilo, y n-hexilo.. 10 Como se usa en el presente documento, el término, el término "(Ca-Cb)alquileno divalente" donde a y b son números enteros hace referencia a una cadena de hidrocarburo saturada que tiene de a a b átomos de carbono y dos valencias no satisfechas. Como se usa en el presente documento, el término, el término "(Ca-Cb)alquenilo" donde a y b son números enteros 15 hace referencia a un resto de alquenilo de cadena lineal o ramificada que tiene de a a b átomos de carbono que tienen al menos un doble enlace de estereoquímica E o Z, cuando sea aplicable. El término incluye, por ejemplo, vinilo, alilo, 1 y 2-butenilo y 2-metil-2-propenilo. Como se usa en el presente documento, el término, el término "(Ca-Cb)alquenileno divalente" quiere decir una 20 cadena de hidrocarburo que tiene de a a b átomos de carbono, al menos un doble enlace y dos valencias no satisfechas. Como se usa en el presente documento, el término, el término "(Ca-Cb)alquinilo" donde a y b son números enteros hace referencia a grupos de hidrocarburo de cadena lineal o ramificada que tienen de dos a seis átomos de carbono 25 y que tienen, además, un triple enlace. Este término incluiría, por ejemplo, etinilo, 1-propinilo, 1- y 2-butinilo, 2-metilo-2-propinilo, 2-pentinilo, 3-pentinilo, 4-pentinilo, 2-hexinilo, 3-hexinilo, 4-hexinilo y 5-hexinilo. Como se usa en el presente documento, el término "radical alquinileno (Ca-Cb)" donde a y b son números enteros hace referencia a una cadena de hidrocarburo divalente que tiene de 2 a 6 átomos de carbono y al menos un triple 30 enlace. Como se usa en el presente documento, el término, el término "carbocíclico” se refiere a un radical mono, bi o tricíclico que tiene hasta 16 átomos de anillo, todos los cuales son carbono, e incluye arilo y cicloalquilo. 35 Como se usa en el presente documento el término "cicloalquilo" hace referencia a un radical carbocíclico saturado monocíclico que tiene 3-8 átomos de carbono e incluye, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y ciclooctilo. Como se usa en el presente documento, el término “arilo” no cualificado hace referencia a un radical carbocíclico 40 aromático mono, bi o tricíclico e incluye radicales que tienen dos anillos carbocíclico aromático monocíclicos que están unidos directamente mediante un enlace covalente. Ilustrativos de estos radicales son fenilo, bifenilo y naftilo. Como se usa en el presente documento, el término “heteroarilo” no cualificado hace referencia a un radical aromático mono, bi o tricíclico que contiene uno o más heteroátomos seleccionados de S, N y O, e incluye radicales 45 que tienen dos de estos anillos monocíclicos o uno de este anillo monocíclico y un anillo de arilo monocíclico que están unidos directamente mediante un enlace covalente. Ilustrativos de estos radicales son tienilo, benztienilo, furilo, benzfurilo, pirrolilo, imidazolilo, bencimidazolilo, tiazolilo, benztiazolilo, isotiazolilo, bencisotiazolilo, pirazolilo, oxazolilo, benzoxazolilo, isoxazolilo, bencisoxazolilo, isotiazolilo, triazolilo, benztriazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, piridinilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, triazinilo, indolilo e indazolil. 50 Como se usa en el presente documento, el término “no cualificado heterociclillo” o “heterocíclico” incluye “heteroarilo” como se ha definido anteriormente y en su significado no aromático hace referencia a un radical no aromático mono, bi o tricíclico que contiene uno o más heteroátomos seleccionados de S, N y O, y a grupos que consisten en radical no aromático monocíclico que contiene uno o más heteroátomos que están unidos 55 covalentemente a otro radical o a un radical carbocíclico monocíclico. Ilustrativos de estos radicales son grupos pirrolilo, furanilo, tienilo, piperidinilo, imidazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, tiadiazolilo, pirazolilo, piridinilo, pirrolidinilo, pirimidinilo, morfolinilo, piperazinilo, indolilo, morfolinilo, benzfuranilo, piranilo, isoxazolilo, bencimidazolilo, metiloenedioxifenilo, etiloenedioxifenilo, maleimido y succinimido. 60 A menos que se especifique otra cosa en el contexto donde se produce, el término ”sustituido” como se aplica a cualquier resto en el presente documento sustituido con hasta cuatro sustituyentes compatibles, cada uno de los cuales puede ser de forma independiente, por ejemplo, (C1-C6)alquilo, (C1-C6)alcoxi, hidroxi, hidroxi(C1-C6)alquilo, mercapto, mercapto(C1-C6)alquilo, (C1-C6)alquiltio, fenilo, halo (incluyendo flúor, bromo y cloro), trifluorometilo, trifluorometoxi, nitro, nitrilo (-CN), oxo, -COOH, -COORA, -CORA, -SO2RA, 65 -CONH2, -SO2NH2, -CONHRA, -SO2NHRA, -CONRARB, -SO2NRARB, -NH2, -NHRA, -NRARB, -OCONH2, -OCONHRA , - OCONRARB, -NHCORA, -NHCOORA, -NRBCOORA, -NHSO2ORA, -NRBSO2OH, -NRBSO2ORA,-NHCONH2, -NRACONH2, -NHCONHRB,-NRACONHRB, -NHCONRARB, o -NRACONRARB en las que RA y RB son de forma independiente un (C1-C6)alquilo, (C3-C6) cicloalquilo , fenilo o heteroarilo monocíclico que tiene 5 o 6 átomos del anillo. Un “sustituyente opcional” puede ser uno de los grupos sustituyentes anteriores. 5 El término "cadena lateral de un alfa-aminoácido natural o no natural" hace referencia al grupo R1 en un aminoácido natural o no natural de fórmula NH2-CH(R1)-COOH. Ejemplos de cadenas laterales de alfa-aminoácidos naturales incluyen los alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, cistina, ácido glutámico, histidina, 5-hidroxilisina, 4-hidroxiprolina, isoleucina, leucina, lisina, 10 metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina, ácido α-aminoadípico, ácido α-amino-n-butírico, 3,4-dihidroxifenilalanina, homoserina, α-metilserina, ornitina, ácido pipecólico y tiroxina. Alfa-aminoácidos naturales que contienen sustituyentes funcionales, por ejemplo grupos amino, carboxilo, hidroxi, mercapto, guanidilo, imidazolilo, o indolilo, en sus cadena laterales características incluyen arginina, lisina, ácido 15 glutámico, ácido aspártico, triptófano, histidina, serina, treonina, tirosina y cisteína. Cuando R2 en los compuestos de la invención es una de las cadenas laterales, el sustituyente funcional puede estar opcionalmente protegido.

El término “protegido”, cuando se usa en relación con un sustituyente funcional en una cadena lateral de un alfa-aminoácido natural significa un derivado de dicho sustituyente que es sustancialmente no funcional. Por ejemplo, los 20 grupos carboxilo pueden estar esterificados (por ejemplo como un éster de alquilo C1-C6), los grupos aminos pueden convertirse en amidas (por ejemplo como una amida de NHCOC1-C6 alquilo ) o carbamatos (por ejemplo como un NHC(=O)OC1-C6 alquilo o NHC(=O)OCH2Ph carbamato), los grupos hidroxilo pueden convertirse en éteres (por ejemplo un éter de OC1-C6 alquilo o un éter de O(C1-C6 alquilo)fenilo o ésteres (por ejemplo un éster de OC(=O)C1-C6 alquilo) y los grupos tiol pueden convertirse en tioéteres (por ejemplo un terc-butil o bencil tioéter) o tioésteres 25 (por ejemplo un SC(=O)C1-C6 alquilo tioéster). Ejemplos de cadenas laterales de alfa-aminoácidos no naturales incluyen los indicados más adelante en la discusión de grupos R2 adecuados para usar en compuestos de la presente invención 30 El grupo éster R1

Además del requisito de que el grupo éster debe ser hidrolizable por una o más enzimas intracelulares, puede ser preferible, para algunas aplicaciones (por ejemplo, para la administración sistémica del conjugado) que sea resistente a la hidrólisis por enzimas de hidrólisis de carboxiléster en plasma, ya que esto asegura que el modulador 35 conjugado sobrevivirá tras la administración sistémica durante un tiempo suficiente como para penetrar en las células como el éster. Simplemente hay que probar cualquier conjugado dado para medir su semivida en plasma como el éster mediante incubación en plasma. No obstante, se ha descubierto que los ésteres derivados de alcoholes secundarios son más estables a las enzimas de hidrólisis de carboxiléster en plasma que los derivados de alcoholes primarios. Además, también se ha descubierto que aunque los ésteres derivados de alcoholes terciarios 40 son generalmente estables a las enzimas de hidrólisis de carboxiléster en plasma, a menudo son también relativamente estables a las carboxilesterasas intracelulares. Teniendo en cuenta estos hallazgos, actualmente se prefiere que R1 en las fórmulas (IA), (IB) and (IC) anteriores sea un grupo éster de la fórmula -(C=O)OR9 en la que R9 es (i) R7R8CH- en la que R7 es (C1-C3)alquilo-(Z1)a-(C1-C3)alquilo- o (C2-C3)alquenilo-(Z1)a-(C1-C3)alquilo opcionalmente sustituido, en la que a es 0 o 1 y Z1 es -O-, -S-, o -NH-, y R8 es hidrógeno o (C1-C3)alquilo, o R7 y R8 45 tomados junto con el carbono al que están unidos forman un anillo C3-C7 cicloalquilo opcionalmente sustituido o un anillo heterocíclico opcionalmente sustituido de 5- o 6 átomos de anclo; o (ii) fenilo o anillo heterocíclico monocíclico opcionalmente sustituido que tiene 5 o 6 átomos del anillo. Dentro de estas clases, R9 puede ser, por ejemplo, metilo, etilo, n- o iso-propilo, n- o sec-butilo, ciclohexilo, alilo, fenilo, bencilo, 2-, 3- o 4-piridilometilo, N-metilopiperidin-4-ilo, tetrahidrofuran-3-ilo o metoxietilo Actualmente se prefiere cuando R9 es ciclopentilo. 50

La cadena lateral R2 del aminoácido

Sujeto al requisito de que el grupo éster R1 sea hidrolizable por enzimas carboxilesterasas intracelulares, la selección del grupo R2 de la cadena lateral puede determinar la velocidad de la hidrólisis. Por ejemplo, cuando el 55 carbono en R2 adyacente al carbono del alfa aminoácido no contiene una ramificación , por ejemplo cuando R2es etilo, isobutilo o bencilo, el éster se hidroliza con más facilidad que cuando R2 está ramificado, por ejemplo isopropilo o t-butilo.

Ejemplos de cadenas laterales de aminoácidos incluyen 60

grupos C1-C6 alquilo, fenilo, 2,- 3-, o 4-hidroxifenilo, 2,- 3-, o 4-metoxifenilo, 2,-3-, o 4-piridilometilo, bencilo, feniletilo, 2-, 3-, o 4-hidroxibencilo, 2,- 3-, o 4-benciloxibencilo, 2,- 3-, o 4- C1-C6 alcoxibencilo, y benciloxi(C1-C6 alquilo); El grupo caracterizador de un α aminoácido natural donde cualquier grupo funcional puede estar protegido. grupos -[Alc]nR6 donde Alc es un grupo (C1-C6)alquilo o (C2-C6)alquenilo opcionalmente interrumpido por uno o más átomos de -O-, o -S- o grupos -N(R7)- [en los que R7 es un átomo de hidrógeno o un grupo (C1-C6)alquilo], n es 0 o 65 1, y R6 es un grupo cicloalquilo o cicloalquenilo opcionalmente sustituido; Un grupo bencilo sustituido en el anillo fenilo por un grupo de la fórmula OCH2COR8 en la que R8 es hidroxilo, amino, (C1-C6)alcoxi, feni(C1-C6)alcoxi, (C1-C6)alquilamino, di((C1-C6)alquilo)amino, fenil(C1-C6)alquiloamino, el residuo de un aminoácido o un derivado haluro de ácido, éster o amida del mismo, estando dicho residuo unido a través de un enlace amida, estando dicho residuo unido mediante un enlace amida, seleccionándose dicho aminoácido de glicina, α o β alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, tirosina, triptófano, serina, treonina, cisteína, metionina, 5 asparagina, glutamina, lisina, histidina, arginina, ácido glutámico y ácido aspártico; un grupo heterocíclico(C1-C6)alquilo, estando insustituido o mono o disustituido en el anillo heterocíclico con halo, nitro, carboxi, (C1-C6)alcoxi, ciano, (C1-C6)alcanoilo, trifluorometilo (C1-C6)alquilo, hidroxi, formilo, amino, (C1-C6)alquiloamino, di-(C1-C6)alquiloamino, mercapto, (C1-C6)alquilotio, hidroxi(C1-C6)alquilo, mercapto(C1-C6)alquilo o (C1-C6)alquilfenilmetilo; y 10 un grupo -CRaRbRc donde: cada uno de Ra, Rb and Rc con independencia uno de otro, son hidrógeno, (C1-C6)alquilo, (C2-C6)alquenilo, (C2-C6)alquinilo, fenil(C1-C6)alquilo, (C3-C8)cicloalquilo; o 15 Rc es hidrógeno y Ra y Rb son de forma independiente fenilo o heteroarilo, tal como piridilo; o Rc es hidrógeno, (C1-C6)alquilo, (C2-C6)alquenilo, (C2-C6)alquinilo, fenil(C1-C6)alquilo, (C3-C8)cicloalquilo; y Ra and Rb junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un cicloalquilo de 3 a 8 miembros o un anillo heterocíclico de 5 a 6 miembros; o 20 Ra, Rb y Rc junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un anillo tricíclico (por ejemplo adamantilo); o Ra y Rb son cada uno de forma independiente (C1-C6)alquilo, (C2-C6)alquenilo, (C2-C6)alquinilo, fenil(C1-25 C6)alquilo, o un grupo como se define para Rc más adelante aparte del hidrógeno, o Ra y Rb junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un anillo cicloalquilo o heterocíclico, y Rc es hidrógeno, -OH, -SH, halógeno, -CN, -Co2h, (C1-C4)perfluoroalquilo, -CH2OH, -CO2(C1-C6)alquilo, -O(C1-C6)alquilo, -O(C2-C6)alquenilo,-S(C1-C6)alquilo, -SO(C1-C6)alquilo, -SO2(C1-C6) alquilo, -S(C2-C6)alquenilo, -SO(C2-C6)alquenilo, -SO2(C2-C6)alquenilo o un grupo -Q-W donde Q representa un enlace o -O-, -S-, -SO- o -SO2- y W representa un 30 grupo fenilo, fenilalquilo, (C3-C8)cicloalquilo, (C3-C8)cicloalquilalquilo, (C4-C8)cicloalquenilo, (C4-C8)cicloalquenilalquilo, heteroarilo heteroarilalquilo, donde el grupo W puede estar opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados de forma independiente de hidroxilo, halógeno, -CN, -CO2H, -CO2(C1-C6)alquilo, -CONH2, -CONH(C1-C6)alquilo, -CONH(C1-C6alquilo)2, -CHO, -CH2OH, (C1-C4)perfluoroalquilo, -O(C1-C6)alquilo, -S(C1-C6)alquilo, -SO(C1-C6)alquilo, -SO2(C1-C6)alquilo , - NO2, -NH2, -NH(C1-C6)alquilo, -N((C1-35 C6)alquilo)2, -NHCO(C1-C6)alquilo, (C1-C6)alquilo, (C2-C6)alquenilo, (C2-C6)alquinilo, (C3-C8)cicloalquilo, (C4-C8)cicloalquenilo, fenilo o bencilo.

Ejemplos de grupos R2 concretos incluyen bencilo, fenilo, ciclohexilometilo, piridin-3-ilometilo, terc-butoximetilo, iso-butilo, sec-butilo, terc-butilo, 1-benciltio-1-metiletilo, 1-metiltio-1-metiletilo y 1-mercapto-1-metiletilo, feniletilo. Grupos 40 R2 preferidos actualmente incluyen bencilo, fenilo, terc-butoximetilo, feniletilo e iso-butilo- El grupo R4

R4 puede ser C1-C6 alquilo, C3-C7cycloalquilo, arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido, por ejemplo metilo, etilo, 45 n- o iso-propilo, ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, fenilo, o piridilo. El anillo o sistema anular B El anillo o sistema anular B puede ser uno escogido de, por ejemplo, los siguientes: 50 El radical -Y-L-X-[CH2]z- Cuando el alfa-aminoácido éster se conjuga con el inhibidor como un radical de fórmula (IA), este radical (o enlace) surge de la estrategia química concreta elegida para unir el motivo de aminoácido éster R1CH(R2)NH al modulador. Claramente, la estrategia química para este acoplamiento puede variar mucho y, por tanto, son posibles muchas 5 combinaciones de las variables Y, L, X y z. Cabe destacar que los beneficios del motivo aminoácido éster carboxilesterasa descrito anteriormente (fácil entrada en la célula, hidrólisis por la carboxilesterasa dentro de la célula y acumulación dentro de la célula del producto de hidrólisis del ácido carboxílico activo) se consiguen mejor cuando el enlace entre el motivo de aminoácido éster y el 10 modulador no es un sustrato para la actividad peptidasa dentro de la célula, que podría dar lugar a la escisión del aminoácido de la molécula. Por supuesto, la estabilidad a las peptidasas intracelulares se analiza fácilmente incubando el compuesto con los contenidos de la célula rota y analizando dicha escisión. Con las observaciones anteriores en mente, tomando las variables formando el radical -Y-L-X-[CH2]z- , a su vez 15 z puede ser 0 o 1, de modo que un radical metileno unido al modulador es opcional. Ejemplos preferidos específicos de Y incluyen un enlace. 20 En el radical L, ejemplos de radicales Alc1 y Alc2, cuando están, incluyen  CH2-, -CH2CH2- -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2-, -CH=CH-, -CH=CHCH2-, -CH2CH=CH-, CH2CH=CHCH2-,-C≡C-, -C≡CCH2-, CH2C≡C-, yCH2C≡CCH2. Ejemplos adicionales de Alc1 y Alc2 incluyen -CH2W-, -CH2CH2W- -CH2CH2WCH2-, -CH2CH2WCH(CH3)-, -CH2WCH2CH2-, -CH2WCH2CH2WCH2-, y -WCH2CH2- 25 donde W es -O-, -S-, -NH-, -N(CH3)-, o -CH2CH2N(CH2CH2OH)CH2-. Otros ejemplos de Alc1 y Alc2 incluyen radicales ciclopropilo, ciclopentilo u ciclohexilo divalentes. En L, cuando n es 0, el radical es una cadena de hidrocarburo (opcionalmente sustituida y quizá con un enlace éter, tioéter, o amino). Actualmente se prefiere que no haya sustituyentes opcionales en L. Cuando m y p son 0, L es un 30 radical heterocíclico o carbocíclico divalente mono o bicíclico con 5 - 13 átomos de anillo (opcionalmente sustituido). Cuando n es 1 y al menos uno de m y p es 1, L es un radical divalente que incluye una cadena o cadenas de hidrocarburo u un radical heterocíclico o carbocíclico mono o bicíclico con 5 - 13 átomos de anillo (opcionalmente sustituido). Cuando está presente, Q puede ser, por ejemplo, un radical fenilo, naftilo, ciclopropilo, ciclopentilo o ciclohexilo divalente o un radical heterocíclico mono o bicíclico que tiene de 5 a 13 miembros de anillo, tal como 35 piperidinilo, piperazinilo, indolilo, piridilo, tienilo, o pirrolilo, pero actualmente se prefiere but 1,4-fenileno. Específicamente, en algunas realizaciones de la invención, m y p pueden ser 0, siendo n 1. En otras realizaciones, n y p pueden ser 0, siendo m 1. En otras realizaciones, m, n y p pueden ser todos 0. En otras realizaciones más, m puede ser 0, n puede ser 1, siendo Q un radical heterocíclico monocíclico, y p puede ser 0 o 1. Alc1 y Alc2, cuando 40 están presentes se pueden seleccionar de -CH2-, -CH2CH2-, y -CH2CH2CH2- y Q puede ser 1,4-fenileno. Ejemplos específicos del racial -Y-L-X-[CH2]z- incluyen -(CH2)v-, -(CH2)vO- (CH2)wO- 45 y . En la que v es1, 2, 3 o 4 y w es 1, 2 o 3, tal como -CH2- y -CH2O 50 El radical -L-Y1- Cuando el alfa-aminoácido éster se conjuga con el inhibidor como un radical de fórmula (IB), este radical (o enlace) surge de la estrategia química concreta elegida para unir el motivo de aminoácido éster en la fórmula (IB) o (IC) al 55 modulador. (En el último caso, el radical -L-Y1- está unido indirectamente al carbono alfa a través de los átomos de anillo intermedios del anillo del sistema B). Claramente, la estrategia química para dicho acoplamiento puede variar ampliamente y, por tanto, muchas combinaciones de las variables L y Y1 son posibles. Por ejemplo, L puede ser como se ha tratado anteriormente en el contexto del radical -Y-L-X-[CH2]z-. Por ejemplo, 60 en algunas realizaciones m y n son 1 y p es 0; Q es -O-; y Alc1 es un alquileno C1-C6, alquenileno C2-C6 o alquinileno C2-C6 de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido, que pueden contener opcionalmente o terminar en un enlace éter (-O-), tioéter (-S-) o amino (-NRA-) donde RA es hidrógeno o alquilo C1-C4 opcionalmente sustituido. En otras realizaciones, m, n y p pueden ser cada uno 1 y, en estos casos, Q puede ser, por ejemplo, un radical 1.4-fenileno o un radical ciclopentilo, ciclohexilo, piperidinilo o piperacinilo. En todas las realizaciones, Y1 puede ser, por ejemplo, un enlace o -(C=O)-, -(C=O)NH-, y - (C=O)O- 5 Para los compuestos de la invención que se van a administrar sistémicamente se prefieren ésteres con una velocidad lenta de escisión por la carboxilesterasa, ya que son menos susceptibles al metabolismo presistémico. Su capacidad para alcanzar su tejido diana intacto aumenta y el éster se puede convertir dentro de las células del tejido diana en el producto ácido. No obstante, para la administración local, cuando el éster se aplica directamente al tejido diana o se dirige allí mediante, por ejemplo, inhalación, a menudo será deseable que el éster tenga una velocidad 10 rápida de escisión de la esterasa para minimizar la exposición sistémica y los consiguientes efectos secundarios no deseados. Cuando el motivo de esterasa se une al modulador mediante su grupo amino, como en la fórmula (IA) anterior, si el carbono adyacente al carbono alfa alfa-aminoácido éster está monosustitiuido, es decir R2 es CH2Rz (siendo Rz el monosustituyente), después los ésteres tienden a ser escindidos con más rapidez que si el carbono está di o trisustituido, como en el caso donde R2 es, por ejemplo, fenilo o ciclohexilo. De un modo similar, cuando el 15 motivo de esterasa se une al modulador mediante un átomo de carbono como en las fórmulas (IB) y (IC) anteriores, si un átomo de carbono al que están unidos los motivos cR4NHCH(R1)- o R1-(ranillo B)- esterasa está insustituido, es decir R4NHCH(R1)- o R1-(anillo B)- está unido a un radical (-CH2)- metileno, los ésteres tienden a ser escindidos con más rapidez que si el carbono está sustituido, o es parte de un sistema anular tal como un anillo de fenilo o ciclohexilo. 20 Moduladores de enzimas y receptores intracelulares Los principios de la presente invención se pueden aplicar a moduladores de un amplio abanico de dianas intracelulares que están implicados en una amplia gama de enfermedades. Como se ha tratado, los modos de unión 25 de moduladores conocidos a sus dianas generalmente se conocen poco después de que se conozcan los propios moduladores. Además, las técnicas modernas, como cristalografía de rayos X y RMN son capaces de revelar dichas topologías y geometrías de unión, como lo son los procedimientos de química médica tradicional de caracterización de las relaciones estructura-actividad. Con dichos conocimientos, se identifica directamente donde en la estructura de un modulador dado se puede unir un motivo de carboxilesterasa éster sin alterar la unión del modulador a la 30 enzima o receptor mediante el uso de datos estructurales. Por ejemplo, en la Tabla 1 se indican algunas dianas de enzimas o receptores intracelulares cuando se publican los datos estructurales del cristal. La presente invención se refiere a inhibidores de la histona desacetilasa. El resto de los moduladores se proporcionan por referencia.

Tabla 1 35

Diana: Referencia de la estructura cristalina Enfermedad diana

CD45: Nam y col., J Exp Med 201, 441 (2005) Enfermedad autoinmunitaria

Lck: Zhu y col., Structure 7, 651 (1999) Inflamación

ZAP-70: Jin y col., J Biol Chem 279, 42818 (2004) Enfermedad autoinmunitaria

PDE4: Huai y col., Biochemistry 42, 13220 (2003) Inflamación

PDE3: Scapin y col., Biochemistry 43, 6091 (2004) Asma

IMPDH: Intchak y col., Cell 85, 921 (1996) Psoriasis

p38 MAPK: Wang y col., Structure 6, 1117 (1998) Inflamación

COX2: Kiefer y col., J Biol Chem 278, 45763, (2003) Inflamación

Adenosina quinasa: Schumacher y col., J Mol Biol 298, 875 (2000) Inflamación

PLA2: Chandra y col., Biochemistry B 10914 (2002) Psoriasis

PLC: Essen y col., Biochemistry 36, 1704, (1997) Artritis reumatoide

PLD: Leiros y col., J Mol Biol 339, 805 (2004) Inflamación

iNOS: Rosenfeld y col., Biochemistry 41, 13915 (2002) Inflamación

LTA4 hidrolasa: Rudberg y col., J Biol Chem 279, 27376 (2004) Inflamación

ICE: Okamato y col., Chem Pharm Bull 47, 11 (1999) Artritis reumatoide

GSK3β: Bertrand y col., J Mol Biol 333, 393 (2003) Artritis reumatoide

PKC: Xu y col., JBC 279, 50401 (2004) Inflamación

PARP: Ruf y col., PNAS (USA) 93, 7481 (1996) Trastornos proliferativos

MetAP2: Sheppard et al Bioorg Med Chem Lett 14, 865 (2004) Artritis reumatoide

Receptor de corticoides: Bledsoe y col., Cell 110, 93 (2002) Inflamación

PI3K: Walker y col., Mol Cell Biol 6, 909 (2000) Trastornos proliferativos

Raf: Wan y col., Cell 116, 855 (2004) Trastornos proliferativos

AKT/PKB: Yang y col., Nat Struct Biol 9, 940 (2002) Trastornos proliferativos

HDAC: Finnin y col., Nature 401, 188 (1999) Trastornos proliferativos

Diana: Referencia de la estructura cristalina Enfermedad diana

c-Abl: Nagar y col., Cancer Res 62, 4236 (2002) Trastornos proliferativos

IGF-1R: Munshi y col., Acta Crystallogr Sect D 59, 1725 (2003) Trastornos proliferativos

Timidilato Sintetasa: Stout y col., Structure 6, 839 (1998) Trastornos proliferativos

Glicinamida Ribonucleótido Formiltransferasa: Klein y col., J Mol Biol 249, 153 (1995) Trastornos proliferativos

Nucleósido púrico fosforilasa: Koelner y col., J Mol Biol 280, 153 (1998) Trastornos proliferativos

Estrona sulfatasa: Hernandez-Guzman y col., J Biol Chem 278, 22989 (2003) Trastornos proliferativos

EGF-RTK: Stamos y col., J Biol Chem 277, 46265 (2002) Trastornos proliferativos

Src quinasa: Lamers y col., J Mol Biol 285, 713 (1999) Trastornos proliferativos

VEGFR2: McTigue y col., Structure 7, 319 (19999) Trastornos proliferativos

Superóxido Dismutasa: Hough y col., J Mol Biol 287, 579 (1999) Trastornos proliferativos

Ornitina Descarboxilasa: Almrud y col., J Mol Biol 295, 7 (2000) Trastornos proliferativos

Topoisomerasa II: Classen y col., PNAS (USA) 100, 10629 (2003) Trastornos proliferativos

Topoisomerasa I: Staker y col., PNAS (USA), 99, 15387 (2002) Trastornos proliferativos

Receptor de andrógenos: Matias y col., J Biol Chem 275, 26164 (2000) Trastornos proliferativos

JNK: Heo y col., EMBO J 23, 2185 (2004) Trastornos proliferativos

Farnesil Transferasa: Curtin y col., Bioorg Med Chem Lett 13, 1367 (2003) Trastornos proliferativos

CDK: Davis y col., Science 291, 134 (2001) Trastornos proliferativos

Dihidrofolato Reductasa: Gargaro y col., J Mol Biol 277, 119 (1998) Trastornos proliferativos

Flt3: Griffith y col., Mol Cell 13, 169 (2004) Trastornos proliferativos

Anhidrasa carbónica: Stams y col., Protein Sci 7, 556 (1998) Trastornos proliferativos

Timidina Fosforilasa: Norman y col., Structure 12, 75 (2004) Trastornos proliferativos

Dihidroporimidina Deshidrogenasa: Dobritzsch y col., JBC 277, 13155, (2002) Trastornos proliferativos

Manosidasa α: Van den Elsen y col., EMBO J 20, 3008 (2001) Trastornos proliferativos

Peptidil-prolil isomerasa (Pin1): Ranganathan y col., Cell 89, 875 (1997) Trastornos proliferativos

Receptor retinoide X: Egea y col., EMBO J 19, 2592 (2000) Trastornos proliferativos

β-Glucuronidasa: Jain y col., Nat Struct Biol 3, 375 (1996) Trastornos proliferativos

Glutatión Transferasa: Oakley y col., J Mol Biol 291, 913 (1999) Trastornos proliferativos

hsp90: Jez y col., Chem Biol 10, 361 (2003) Trastornos proliferativos

IMPDH: intchak y col., Cell 85, 921 (1996) Trastornos proliferativos

Fosfolipasa A2: Chandra y col., Biochemistry 41, 10914 (2002) Trastornos proliferativos

Fosfolipasa C: Essen y col., Biochemistry 36, 1704, (1997) Trastornos proliferativos

Fosfolipasa D: Leiros y col., J Mol Biol 339, 805 (2004) Trastornos proliferativos

MetAP2: Sheppard et al Bioorg Med Chem Lett 14, 865 (2004) Trastornos proliferativos

PTP-1 B: Andersen y col., J Biol Chem 275, 7101 (2000) Trastornos proliferativos

Aurora quinasa: Fancelli y col., in press Trastornos proliferativos

PDK-1: Komander y col., Biochem J 375, 255 (2003) Trastornos proliferativos

HMGCoA reductasa: Istvan and Deisenhofer Science 292, 1160 (2001) Aterosclerosis

Oxidoescualeno ciclasa: Lenhart y col., Chem Biol 9, 639 (2002) Hipercolesterolemia

Estimulador de la piruvato deshidrogenasa: Mattevi y col., Science 255, 1544 (1992) Enfermedad cardiovascular

Adenilato ciclasa: Zhang y col., Nature 386, 247 (1997) Enfermedad cardiovascular

Agonista de PPARγ: Ebdurp y col., J Med Chem 46, 1306 (2003) Diabetes

Alcohol deshidrogenasa: Bahnson y col., PNAS USA 94, 12797 (1997) Intoxicación alcohólica

Lipasa sensible a hormonas: Wei y col., Nat Struct Biol 6, 340 (1999) Diabetes resistente a la insulina

Adenosina quinasa: Mathews y col., Biochemistry 37, 15607 (1998) Epilepsia

Aldosa reductasa: Urzhmsee al.,Structure 5, 601 (1997) Diabetes

Receptor de la vitamina D3: Tocchini-Vatentini y col., PNAS USA 98, 5491 (2001) Osteoporosis

Proteína tirosina fosfatasa: Andersen y col., J Biol Chem 275, 7101 (2000) Diabetes

VIH Proteasa: Louis y col., Biochemistry 37, 2105 (1998) VIH

Diana: Referencia de la estructura cristalina Enfermedad diana

VHC Polimerasa: Bressanelli y col., PNAS USA 96, 13034 (1999) Hepatitis C

Neuraminidasa: Taylor y col., J Med Chem 41, 798 (1998) Influenza

Transcriptasa inversa: Das y col., J Mol Biol 264, 1085 (1996) VIH

Proteasa del CMV: Khayat y col., Biochemistry 42, 885 (2003) Infección por CMV

Timidina quinasa: Champness y col., Proteins 32, 350 (1998) Infecciones por herpes

Integrasa del VIH: Molteni y col., Acta Crystallogr Sect D 57, 536 (2001) VIH

Con fines ilustrativos, se hace referencia a inhibidores conocidos de 5 de las dianas intracelulares anteriores cuyo modo de unión a la diana se conoce. Estos ejemplos ilustran cómo dichos datos estructurales se pueden usar para determinar las posiciones adecuados para la unión del motivo de carboxilesterasa éster. Se conocen esquemas de los sitios activos junto con los inhibidores representativos. En general, las posiciones remotas de la interfaz de unión 5 entre el modulador y la diana y, por tanto, alejándose de la interfaz de unión de la enzima en el disolvente son lugares adecuados para la unión del motivo de carboxilesterasa éster y estos se indican en los diagramas. Se puede usar un enfoque similar para los demás ejemplos identificados en la Tabla 1. El procedimiento de la invención para incrementar la potencia celular y/o el tiempo de residencia intracelular de un inhibidor de la actividad de la histona desacetilasa diana puede implicar varias etapas: 5 Etapa 1: Identificar una posición o posiciones sobre un inhibidor dado de la actividad de la enzima histona desacetilasa intracelular o sobre una pluralidad de inhibidores dados de la actividad de la enzima histona desacetilasa intracelular que comparten el mismo modo de unión para la enzima histona desacetilasa diana, estando dicha posición o posiciones remotas con respecto a la interfaz de unión entre el o los inhibidores y la enzima histona 10 desacetilasa diana. Normalmente, dichas posiciones se identifican de la estructura de co-cristal de ratos X (o estructura derivada mediante RMN) de la enzima histona desacetilasa diana con un modulador conocido (o un análogo estructural estrecho del mismo) unido a la enzima mediante inspección de la estructura. Como alternativa, la estructura de 15 cristal de rayos X de la enzima histona desacetilasa diana con el modulador anclado en el sitio activo de la enzima se modela mediante procedimientos gráficos de ordenador y se inspecciona el modelo. La suposición es que la modificación estructural del modulador en posiciones remotas con respecto a la interfaz de unión es improbable que interfieran significativamente con la unión del modulador al sitio activo de la enzima. Las posiciones adecuadas aparecerán normalmente de la estructura de co-cristal o modelo de anclaje para su orientación hacia el disolvente. 20 Etapa 2: Modificar covalentemente el o los inhibidores mediante unión de un radical alfa aminoácido éster o una serie de diferentes radicales alfa aminoácido éster en una o más posiciones identificadas en la etapa 1. La unión de los radicales alfa aminoácido éster (es decir, los potenciales motivos carboxilesterasa) pueden ser 25 mediante una funcionalidad de acoplamiento covalente existente en el o los moduladores o mediante una funcionalidad adecuada introducida específicamente para ese fin. Los motivos carboxilesterasa pueden espaciarse desde el grueso molecular principal mediante un elemento espaciador o enlazador para colocar el motivo más profundo en el disolvente y, de este modo, reducir más cualquier efecto pequeño del motivo sobre el modo de unión del modulador y/o garantizar que el motivo es accesible a la carboxilesterasa reduciendo la interferencia estérica que 30 puede ser el resultado del grueso molécula principal del modulador. El funcionamiento de la etapa 2 tiene como resultado la preparación de uno o, más normalmente, una pequeña biblioteca de moduladores candidatos, cada uno modificado covalentemente con respecto a su inhibidor parental mediante la introducción de varios radicales de aminoácido éster, en uno o más puntos de unión identificados en la 35 etapa 1. Etapa 3: Analizar el o los moduladores conjugados con alfa-aminoácido preparados en la etapa 2 para determinar su actividad contra la enzima histona desacetilasa diana. 40 Como es normal en la química médica, las versiones del motivo carboxilesterasa del o los moduladores parentales preparados como resultado de las etapas 1 y 2, se analizan, preferentemente, en ensayos adecuados para determinar si la retención prevista de la actividad moduladora se ha conservado de verdad y en qué medida y con qué perfil de potencia. De acuerdo con la finalidad subyacente de la invención, que es producir la acumulación de la actividad moduladora en células, los ensayos adecuados normalmente incluirán ensayos en líneas celulares para evaluar el grado de actividad celular, el perfil de potencia de los moduladores modificados. Otros ensayos que se pueden usar en la etapa 3 incluyen ensayos de inhibición enzimática para determinar la actividad intrínseca del 5 modulador modificado y su producto de hidrólisis con carboxilesterasa; ensayos para determinar la velocidad de conversión de los moduladores modificados en el ácido carboxílico correspondiente mediante carboxilesterasas; y ensayos para determinar la velocidad y/o el nivel de acumulación del producto de hidrólisis de la carboxilesterasa (el ácido carboxílico) en las células. En dichos ensayos, las células monocíticas y no monocíticas, y/o un panel de carboxilesterasas aisladas se pueden usar para identificar los compuestos que muestran selectividad celular. 10 En caso necesario o deseable, la etapa 3 se puede repetir con un conjunto diferente de versiones de conjugado alfa aminoácido éster candidatos del modulador parental. Etapa 4: A partir de los datos adquiridos en la etapa 3, seleccionar una o más de las versiones de conjugado alfa 15 aminoácido éster candidatos del o los moduladores parentales que producen modulación de la actividad de la histona desacetilasa dentro de las células, se convierte en y se acumula como el correspondiente ácido carboxílico dentro de las células y que muestran un incremento o prolongación de la potencia celular. Las etapas 1-4 anteriores representan un algoritmo general para la implementación de los principios de la presente 20 invención. La aplicación del algoritmo se ilustra en el Ejemplo de referencia A siguiente aplicado a un inhibidor conocido de la enzima dihidrofolato reductasa intracelular Ejemplo de referencia A El ácido fólico (pteroilglutámico) es una vitamina que es un componente clave en la biosíntesis de los nucleótidos púricos y pirimidínicos. Tras la absorción del folato de la dieta, se reduce a dihidrofolato y, después, se reduce más a tetrahidrofolato mediante la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR). La inhibición de la DHFR conduce a la reducción de la biosíntesis de los nucleótidos que tiene como resultado la inhibición de la biosíntesis de ADN y la reducción de la división celular. Los inhibidores de la DHFR son ampliamente usados en el tratamiento del cáncer (Bertino J, J. 30 Cin. Oncol. 11, 5-14, 1993), enfermedades proliferativas como la artritis reumatoide (Cronstein N., Pharmacol. Rev. 57, 163-1723), psoriasis y rechazo de transplantes. Asimismo, los inhibidores de la DHFR han encontrado utilidad como agentes antiinfecciosos (Salter A., Rev. Infect. Dis. 4,196-236, 1982) y antiparasitarios (Plowe C. BMJ 328, 545-548, 2004). 35 Se han sugerido muchos compuestos inhibidores de la DHFR y varios de estos compuestos se usan como agentes anticancerosos, antiinflamatorios, antiinfecciosos y antiparasitarios. A continuación se muestran modelos generales para inhibidores de la DHFR conocidos: 40 El metotrexato ácido (S)-2-(4-(((2,4-diaminopteridin-6-il)metil)metilamino)-benzamido)pentanedioico es el inhibidor de la DHFR más usado y contiene una funcionalidad glutamato que permite que se transporte de forma activa hacia el interior de las células y se mantenga allí. Sin embargo, las células cancerosas se hacen resistentes al metotrexato modificando su mecanismo de transporte activo. Además, las células que no son de mamífero carecen del sistema 45 de transporte activo y el metotrexato tiene una utilidad limitada como agente antiinfeccioso. Por tanto, se han desarrollado inhibidores lipófilos de la DHFR como el trimetrexato, (2,4-diamino-5-metil-6-[(3,4,5-trimetoxianilino)metil]quinazolina) (2 G = CH) (patente del RU 1345502) y análisis tales como (2 G = N) (Gangjee et al J.Med.Chem. 1993, 36, 3437-3443) que pueden ser captados por difusión pasiva para sortear la resistencia de las células cancerosas y para usar como agentes antiinfecciosos. 50 Sin embargo, los agentes que difunden de forma pasiva al interior de las células también salen de la célula fácilmente y no son retenidas con facilidad en el interior de la célula. Por tanto, un inhibidor de la DHFR modificado de acuerdo con la presente invención, que es lipófilo pero cuya actividad se acumule dentro de la célula podría tener 5 ventajas significativas. Además, ambas clases de inhibidores de la DHFR tienen efectos secundarios que limitan las dosis que se pueden usar en la clínica. Un inhibidor de la DHFR cuya actividad de acumula selectivamente en macrófagos podría tener valor como macrófagos, mediante la producción de citoquinas, se sabe que desempeñan un papel principal en los trastornos inflamatorios y cada vez hay más pruebas de que tienen un papel negativo en el cáncer. 10 Etapa 1 del algoritmo general descrito en lo que antecede La estructura RMN de la DHFR con trimetrexato (2 G = CH) anclado en el sito activo se ha publicado (Polshakov, V.I. et al, Protein Sci. 1999, 8 ,467-481) y es evidente que la posición más adecuada para colocar un motivo 15 carboxilesterasa de acuerdo con la invención estaba en el anillo fenilo, como se indica más adelante. Se dedujo que también sería adecuada la unión en este punto en análogos estructurales cercanos conocidos del trimetrexato, tales como (2 G = N). La Figura 2 muestra (2 G = N) anclado a la DHFR que muestra que un punto adecuado de unión está en la posición 4 del anillo aromático, dado que esto lo aleja del sitio activo de la enzima. 20 Etapa 2 del algoritmo general descrito en lo que antecede Los compuestos en los que el motivo carboxilesterasa está unido a través de su nitrógeno en el alfa-aminoácido se prepararon como se muestra en los esquemas I y II. Dentro de esta serie, se fabricaron compuestos con y sin un carbonilo para identificar los posibles compuestos selectivos de macrófagos. 25 Esquema I Esquema II También se fabricaron compuestos en los que el motivo esterasa estaba unido al modulador a través de la cadena lateral del alfa-aminoácido, esquemas III y IV. Dentro de esta serie, se fabricaron compuestos con sustitución de alquilo en el nitrógeno para identificar los posibles compuestos selectivos de macrófagos (Esquema IV). 5 Esquema III Esquema IV Etapa 3 del algoritmo general descrito en lo que antecede Los compuestos que incluyen el análogo del trimetrexato (2 G = N) se analizaron en el ensayo de la enzima DHFR, el ensayo de proliferación celular, usando líneas celulares tanto monocíticas como no monocíticas y el ensayo de 5 rotura celular con el fin de evaluar la escindibilidad de los ésteres mediante líneas celulares tanto monocíticas como no monocíticas. Los detalles de todos estos ensayos se muestran a continuación: Etapa 4 del algoritmo general descrito en lo que antecede Como se muestra en la Tabla 2 se identificaron compuestos cuyos ácidos tienen actividad contra la enzima comparable con el análogo trimetrexato (2 G = N). También se puede ver que alterando el modo donde el motivo esterasa está unido puede conducir a un compuesto (6) que es 100 veces más potente en células U937 y 15 veces 5 más potente en HCT116 que el análogo no modificado (2 G=N). Además, las modificaciones del enlazador o el sustituyente en el nitrógeno del motivo esterasa permitieron la identificación de los compuestos 4 y 5 que mostraron escisión selectiva en líneas celulares monocíticas pero no monocíticas que eran significativamente más antiproliferativas en las líneas celulares monocíticas que en las líneas 10 celulares no monocíticas (véase la tabla 2). Tabla 2


: U937 (línea celular monocítica) HCT116 (línea celular no monocítica)

Compuesto: CI50 nM enzima1 (ácido) CI50 nM proliferación celular Proporción CI50 Célula/enzima Ácido producido2 ng/ml CI50 nM proliferación celular Proporción CI50 Célula/enzima Ácido producido2 ng/ml

(2 G=N): NA NA

: 2700 (11) 1,9 1,4

: 1033 (25) 0,3 6,6

: 4000 (10) 0,8 1,7

: 1700 (8) 0,013 0,04

Notas 1 Las cifras entre corchetes hacen referencia a las CI50 de la enzima para el ácido resultante de la escisión de los ésteres 2 La cantidad de ácido producido tras la incubación del éster durante 80 minutos en el ensayo de carboxilesterasa de rotura celular descrito anteriormente.

Usando estrategias similares se ha aplicado con éxito el concepto a una serie de dianas intracelulares como se indica en los ejemplos siguientes. A modo de ilustración de los principios de la presente invención se presentan los siguientes ejemplos. En la síntesis de compuestos descrita a continuación: 5 Los reactivos y disolventes comercialmente disponibles (de calidad para HPLC) se usaron sin purificación adicional. Se irradió con microondas usando un reactor de microondas enfocado CEM Discover. Los disolventes se retiraron usando un GeneVac Series I sin calentamiento o un Genevac Series II con VacRamp at30° C. 10 La purificación de los compuestos mediante columna en cromatografía ultrarrápida se realizó usando gel de sílice, tamaño de partícula 40-63 µm (230-400 malla) obtenidos de Silicycle. La purificación de los compuestos mediante HPThermoHypersil-Keystone Hyperprep HS C18LC preparativa se realizó en sistemas Gilson usando columnas de fase inversa (12 µm, 100 X 21,2 mm), gradiente 20-100 % B (A= agua/ 0,1 % de TFA, B= acetonitrilo/ 0,1 % de TFA) en 9,5 min, caudal = 30 ml/min, disolvente de inyección 2:1 DMSO:acetonitrilo (1,6 15 ml), detección UV a 215 nm. Los espectros de RMN de 1H se registraron usando un espectrómetro Bruker 400MHz AV en disolventes deuterados. Los desplazamientos químicos (δ) están en partes por millón. El análisis de cromatografía en capa fina (TLC) se realizó con placas Kieselgel 60 F254 (Merck) y se visualizó usando luz UV. La HPLCMS analítica ase realizó 20 en sistemas Agilent HP1100, Waters 600 o Waters 1525 LC usando columnas de fase inversa Hypersil BDS C18 (5 µm, 2,1 X 50 mm), gradiente 0 – 95 % de B (A= agua/ 0,1 % de TFA, B= acetonitrilo/ 0,1 % de TFA) durante 2,10 min, caudal = 1,0 ml/min. Espectros UV se registraron a 215 nm usando un detector Gilson G1315A Diode Array Detector, G1214A de longitud de onda única, detector de UV, detector de UV Waters 2487 de longitud de onda doble, detector de UV de longitud de onda doble Waters 2488 o detector de UV de matriz de diodos Waters 2996. 25 Los espectros de masas se obtuvieron en el intervalo m/z fe 150 a 850 a una velocidad de muestreo de 2 barridos por segundo o de 1 barrido por 1,2 segundos usando Micromass LCT con interfaz de pulverización Z o Micromass LCT con interfaz de pulverización Z o MUX. Los datos se integraron y comunicaron usando el software OpenLynx and OpenLynx Browser. Se han usado las abreviaturas siguientes: 30 MeOH = MeOH EtOH = EtOH EtOAc = EtOAc Boc = terc-butiloxicarbonilo 35 DCM = DCM DMF = dimetilformamida DMSO = dimetilsulfóxido TFA = ácido trifluoroacético THF = tetrahidrofurano 40 Na2CO3 = carbonato de sodio HCl = ácido clorhídrico DIPEA = diisopropiletilamina NaH = hidruro de sodio NaOH = hidróxido sódico 45 NaHCO3 = hidrogenocarbonato de sodio Pd/C = paladio sobre carbono TBME = terc-butil metil éter N2 = nitrógeno PyBop = Hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio 50 Na2SO4 = sulfato sódico Et3N = trietilamina NH3 = amoniaco TMSCI = trimetilclorosilano NH4Cl = cloruro amónico 55 LiAHI4 = hidruro de litio-aluminio PyBrOp = Hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidino fosfonio MgSO4 = MgSO4 nBuLi = n-butil-litio CO2 = dióxido de carbono 60 EDCl = N-(3-dimetilaminopropil)-N′-etilcarbodiimida clorhidrato Et2O = éter dietílico LiOH = hidróxido de litio HOBt = 1-hidroxibenzotriazol ELS = Dispersión de luz evaporativa 65 TLC= cromatografía en capa fina Ml= mililitro g =gramo(s) mg= miligramo(s) mol = moles mmol =milimol(s) 5 CL/EM = cromatografía líquida de alto rendimiento/espectrometría de masas RMN= resonancia magnética nuclear t.a.= temperatura ambiente. min =minuto(s) h= hora(s) 10 INTERMEDIOS

Los siguientes bloques estructurales se usaron para la síntesis de los moduladores modificados:

Éster de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-4-hidroxibutírico: Éster ciclopentílico de (S)-4-bromo-2-terc-butoxicarbonilaminobutírico

Éster ciclopentílico de (S)-2-amino-4-metil-pentanoico: Éster ciclopentílico de ácido (S)-amino-fenilacético

Éster ciclopentílico de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-pentanodioico: Éster terc-butílico de ácido (S)-2-benciloxicarbonilamino-4-bromo-butírico

Éster terc-butílico de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-pentanodioico

Síntesis de éster ciclopentílico de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-4-hidroxibutírico y éster 1-terc-butílico de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamiino-4-hidroxibutírico

Etapa 1- Síntesis de ácido (S)2-amino-4-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)butírico

5

A una suspensión de L-homoserina (1 g, 8,4 mmol) en acetonitrilo (10 ml) a 0ºC se añadió 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (1,32 ml, 8,8 mmol, 1,05 eq). Después se añadió en porciones cloruro de terc-butil-dimetilsililo (1,33 g, 8,8 mmol, 1,05 eq) en 5 minutos y la mezcla de reacción se dejó calentar hasta la t.a. y se agitó durante 16 horas. Se formó un precipitado blanco que se filtró y se lavó con acetonitrilo antes de secar al vacío. El 10 compuesto del título se aisló como un sólido blanco (1,8 g, 92 %). RMN de 1H (500 MHz, DMSO) δ: 7,5 (1H, as), 3,7 (1H, m), 3,35 (4H, am), 1,95 (1H, m), 1,70 (1H, m), 0,9 (9H, s), 0,1 (6H, s). Etapa 2- Síntesis de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-4-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)butírico 15 Una suspensión del producto de la etapa 1 (1,8 g, 7,7 mmol) en DCM (100 ml) a 0 ºC se trató con trietilamina (2,15 ml, 15,4 mmol, 2 eq) y dicarbonato de di-terc-butilo (1,77 g, 8,1 mmol, 1,05 eq). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas para completar la reacción. El DCM se eliminó a presión reducida y la 20 mezcla se trató con EtOAc / salmuera. La capa DE EtOAc se secó sobre MgSO4 y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se utilizó sin purificación adicional (2,53 g, 99 %). RMN 1H (500 MHz, CDCI3) δ: 7,5 (1H, ss), 5,85 (1H, d, J = 6,5 Hz), 4,3 (1H, m), 3,75 (2H, m), 1,95 (2H, m), 1,40 (9H, s), 0,85 (9H, s), 0,1 (6H, s). Etapa 3- Síntesis de éster ciclopentílico de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-4-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)butírico A una solución del producto de la etapa 2 (2,53 g, 7,6 mmol) en DCM (50 ml) a 0 ºC se añadió ciclopentanol (1,39 5 ml, 15,4 mmol, 2 eq), EDCl (1,61 g, 8,4 mmol, 1,1 eq) y DMAP (0,093 g, 0,76 mmol, 0,1 eq). La mezcla de reacción se agitó durante 16 h a t.a. antes de evaporar a presión reducida. El residuo bruto se disolvió en EtOAc (100 ml) y se lavó con HCl 1M, Na2CO3 1M y salmuera. La capa orgánica se secó después sobre MgSO4 y se evaporó a presión reducida. El producto se purificó mediante cromatografía en columna usando (EtOAc / heptano (1:4) para dar el compuesto de título (2,24 g, 73 %). CLEM pureza 100 % (m/z) 402,5 [M++H], RMN 1H (250 MHz, CDCl3) δ: 5,2 (1H, 10 d, J = 6,3 Hz), 5,15 (1H,m), 4,2 (1H, m), 3,6 (2H, m), 2,0 (1H, m), 1,95 - 1,55 (9H, am), 1,4 (9H,s), 0,85 (9H,s), 0,1 (6H,s). Etapa 4 – Síntesis de éster ciclopentílico de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-4-hidroxibutírico 15 El producto de la etapa 3 (1,57 g, 3,9 mmol) se disolvió en ácido acético:THF (3:1:1, 100 ml). La mezcla de reacción se agitó a 30 ºC durante 16 horas para completar la reacción. Se añadió EtOAc (200 ml) y se lavó con Na2CO3 1M, 20 HCl 1M y salmuera. Los extractos de EtOAc se secaron sobre MgSO4 y se evaporaron a presión reducida para dar el producto como un aceite transparente que cristalizó con el reposo (1,0 g, 95 %). CLEM pureza 100 % (m/z) 310,3 [M++Na], RMN 1H (250 MHz, CDCl3) δ: 5,4 (1H, d, J = 6,5 Hz), 5,2 (1H, m), 4,4 (1H, m), 3,65 (2H, m), 2,15 (1H, m), 1,9 - 1,55 (9H, am), 1,45 (9H, s) 25 Etapa 5 – Síntesis de éster ciclopentílico de ácido (S)-4-bromo-2-terc-butoxicarbonilamino-butírico A una pasta de N-bromo succinimida (1,86 g, 10,4 mmol) en DCM (16,2 ml) se añadió una solución de trifenilfosfaina 30 (2,56 g, 9,74 mmol) en DCM (7,2 ml). La solución se agitó durante 5 minutos más tras la adición. Se añadió piridina (338 µl, 4,18 mmol) seguido de una solución de producto de la etapa 4 (1,00 g, 3,48 mmol) en DCM (8,8 ml). La solución se agitó durante 18 horas, se concentró a presión reducida y el disolvente residual se sometió a azeotropismo con tolueno (3 x 16 ml). El residuo se trituró con éter dietílico (10 ml) y acetato de etilo. heptano (1:9, 2 x 10 ml). Las soluciones combinadas de éter y heptano se concentraron en sílice y se purificaron mediante 35 cromatografía en columna eluyendo con EtOAc / heptano (1:9 a 2:8) para dar el compuesto de título (1,02 g, 84 %). RMN 1H (300 MHz, CDCI3) δ: 5,30 - 5,05 (2H, m), 4,45 - 4,30(1H, m), 3,45 (2H, t, J = 7,3 Hz), 2,50 - 2,30 (1H, m), 2,25 - 2,10 (1H, m), 1,95- 1,60 (8H, a m), 1,47 (9H, s) Síntesis de éster ciclopentílico de ácido (S)-2-amino-4-metil-pentanoico Etapa 1 - Síntesis de éster ciclopentílico de ácido (S)-2-amino-4-metil-pentanoico tolueno-4-sulfónico 5 A una suspensión de (S)-leucina (15 g, 0,11 mol) en ciclohexano (400 ml) se añadió ciclopentanol (103,78 ml, 1,14 mmol), y ácido p-toluenosulfónico (23,93 g, 0,13 mmol). La suspensión se calentó a reflujo para efectuar el sulfato. 10 Tras someter a reflujo la solución durante 16 horas se enfrió para dar una suspensión blanca. A la mezcla se añadió heptano (500 ml) y la suspensión se filtró para dar el producto como un sólido blanco (35 g, 85 %). RMN de 1H (300 MHz, MeOD) δ: 1,01 (6H, t, J = 5,8 Hz), 1,54 - 2,03 (11 H, m), 2,39 (3H, s), 3,96 (1H, t, J = 6,5 Hz), 5,26 - 5,36 (1H, m), 7,25 (2H, d, J = 7,9 Hz), 7,72 (2H, d, J = 8,3 Hz). 15 Etapa 2- Síntesis de éster ciclopentílico de ácido (S)-2-amino-4-metil-pentanoico Una solución del producto de la etapa 1 (2,57 g, 0,013 mol) en DCM (5 ml) se lavó con una solución de NaHCO3 20 saturada acuosa (2 x 3 ml). Las capas acuosas combinadas se extrajeron con DCM (3 x 4 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4 y el disolvente se eliminó al vacío para dar el compuesto del título como un aceite incoloro (1,10 g, 80 %).. RMN 1H (300 MHz, CDCI3) δ: 0,90 (6H, t, J = 6,4 Hz), 1,23 - 1,94 (11 H, m), 3,38 (1H, dd, J = 8,4, 5,9 Hz), 5,11 - 5,22 (1H, m). Síntesis del éster ciclopentílico de ácido (S)-amino-fenilacético

El éster ciclopentílico de ácido (S)-amino-fenilacético se preparó a partir de ácido (S)-amino-fenilacético siguiendo el mismo procedimiento usado para la síntesis de éster ciclopentílico de ácido (S)-amino-4-metilpentanoico. 5

Síntesis de éster ciclopentílico de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-pentanodioico 10 Etapa 1- Síntesis de éster ciclopentílico de éster 5-bencílico de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-pentanodioico A una solución agitada de éster 5-bencílico de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilaminopentanodioico (5 g, 14,8 mmol) 15 en una mezcla de DCM (50 ml) y DMF (30 ml) a 0 ºC se añadió ciclopentanol (2,7 ml, 29,6 mmol), EDCI (4,25 g, 22,2 mmol) y DMAP (0,18 g, 1,48 mmol). La agitación continuó a t.a. durante la noche, tiempo tras el cual la CLEM mostró que la reacción se había completado. El DCM se eliminó a presión reducida. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (200 ml), se lavó con agua (100 ml), HCl acuoso 1M (50 ml), seguido de NaHCO3 acuoso saturado (50 ml). La capa de EtOAc se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró al vacío para dar un aceite viscoso que se solidifió 20 en reposo durante la noche. La titulación con Et2O (2 x 10 ml) dio el compuesto del título en forma de un sólido blanco (43,78 g, 80 %). Pureza mediante CLEM 94 %. Etapa 2- Síntesis de éster ciclopentílico de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-pentanodioico Una mezcla del producto de la etapa 1 (3 g, 3,20 mmol), y 10 % Pd/ C (0,5 g) en EtOH (150 ml) se agitó en H2 5 (globo) a t.a. durante 4 horas, tiempo tras el cual la CLEM mostró que la reacción se había completado. La mezcla de reacción se filtró a través de una lámina de celite, se lavó con EtOH (20 ml) y se concentró al vacío para dar un sólido blanco. Para eliminar el EtOH residual, el sólido se disolvió en una mezcla de tolueno/THF (5/1) (20 ml) y se concentró al vacío para dar el compuesto del título (0,8 g, 79 %). RMN de 1H (400 MHz, MeOD) δ: 1,35 (9H, s), 1,60 - 2,10 (10H, m), 4,05 (1H, m), 5,20 (1H, m) 10 Síntesis de éster terc-butílico de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-pentanodioico 15 El éster terc-butílico de (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-pentanodioico se preparó a partir de éster 5-bencílico de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilaminopentanodioico siguiendo el mismo procedimiento usado para la síntesis de éster ciclopentílico de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilaminopentanoico. Síntesis de éster terc-butílico de ácido (S)-2-benciloxicarbonilamino-4-bromo-butírico 20 Etapa 1 - Síntesis de éster terc-butílico de ácido (S)-2-benciloxicarbonilamino-succínico 25 El éster 1-terc-butílico de ácido (S)-2-amino-succínico (0,9 g, 4,75 mmol) e hidróxido sódico (0,28 g, 7,13 mmol, 1,5 eq) se disolvió en 25 % de agua en dioxano (50 ml). La solución se agitó a 5 ºC y lentamente se añadió dibencildicarbonato (2 g, 4,13 mmol, 1,5 eq) en dioxano (10 ml). La mezcla se agitó a 0 ºC durante 1 hora, después a 30 t.a. durante la noche. Después, se añadió agua (10 ml) y la mezcla se extrajo con EtOAc (2 x 20 ml). La fase orgánica se extrajo con una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico (2 x 10 ml). Las capas acuosas combinadas se acidificaron hasta un dpH 1 con HCl 1M y se extrajo con EtOAc (3 x 10 ml). Las fracciones orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4 y se concentran a presión reducida. El producto se purificó mediante cromatografía en columna (35 % EtOAc en heptano) para dar el compuesto del título como un aceite incoloro (0,76 g, 50 %). m/z 346 [M+23]+, RMN de 1H (300 MHz, CDCl3), δ 7,39 - 7,32 (5H, m), 5,72 (1H, d, J = 8,1 Hz), 5,13 (2H, 5 s), 4,58 - 4,50 (1H, m), 3,10 - 2,99 (1H, m), 2,94 - 2,83 91 H, m), 1,45 (9H, s). Etapa 2 – Síntesis de éster terc-butílico de ácido (S)-2-benciloxicarbonilamino-4-hidroxibutírico 10 A una solución del producto de la etapa 1 (0,6 g, 1,87 mmol) en THF anhidro (20 ml) a -20 ºC se añadió lentamente trietilamina (0,032 ml, 2,24 mmol, 1,2 eq) y cloroformiato de etilo (0,021 ml, 2,24 mmol, 1,2 eq). La mezcla se agitó a -20 ºC durante 2 horas. El sólido formado se filtró y se lavó con THF (2 x 10 ml). El filtrado se añadió gotat a gota a una solución de borohidruro sódico (0,2 g, 5,61 mmol, 3 eq) at 0° C y se agitó a t.a. durante 4 horas. El disolvente se 15 eiminó a presión reducida, el rsiduo se diluyó con agua (10 ml) y se acidificó hasta un Ph 5 con HCl 1 M y se extrajo con EtOAc. Las fraccione sorgánicas se combinaron y se lavaron con hidróxido sódico al 10 % acuoso agua y salmuera, se secaron sobre MgSO4 y se concentraron a presión reducida para dar el producto como un aceite transparente (0,3 g, 51 %). m/z 332 [M+23]+. 20 Etapa 3 – Síntesis de éster terc-butílico de ácido (S)-2-benciloxicarbonilamino-4-bromo-butírico A una solución del bromosuccinimida (0,52 g, 2,91 mmol, 3 eq) en DCM (10 ml) se añadió lentamente una solución 25 de trifenilfosfina (0,71 g, 2,72 mmol, 2,8 eq) en DCM (10 ml). La mezcla se agitó a t.a. durante 5 minutos. Gota a gota se añadieron piridina (0,094 ml, 1,16 mmol, 1,2 eq) y una solución del producto de la etapa 2 ((0,3 g, 0,97 mmol, 1 eq) en DCM (20 ml) y la mezcla se agitó a t.a. durante la noche. El disolvente se eliminó a presión reducida, el residuo se sometió a azeotropismo con tolueno (2 x 15 ml) y se trituró 30 con éter dietílico (2 x 25 ml) y 10 %de EtOAc en heptanos. Las soluciones de la trituración se combinaron y evaporaron hasta sequedad. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna (15 % EtOAc en heptanos) para dar el compuesto del título como un aceite transparente (0,16 g, 44 %). m/z 395 [M+23]+, RMN de 1H (300 MHz, CDCl3), δ 7,39 - 7,30 (5H, m), 5,40 (1H, d, J = 6,8 Hz), 5,12 (2H, s), 4,38 (1H, q, J = 7,7 Hz), 3,47 - 3,38 (2H, m), 5,49 - 2,33 (1H, m), 2,28 - 2,13 (1H, m), 1,48 (9H, s). 35 Ejemplo 1 Este ejemplo describe la modificación del inhibidor conocido de HDAC (histona desacetilasa) ácido suberoilanilida hidroxámico (compuesto 7) denominado en el presente documento “SAHA” mediante la unión de los motivos de 40 aminoácido éster en los puntos remotos de la interfaz de unión con la diana, donde no se produce alteración de su modo de unión. Compuesto 7: Ácido suberoilanilida hidroxámico (SAHA) 45

El SAHA se adquirió de BioCat GmbH, Heidelberg, Alemania.

Procedimiento de lavado estándar para química de resina La resina se lavó con la secuencia siguiente: DMF, MeOH, DMF, MeOH, DCM, MeOH, DCM, MeOH x 2, TBME x 2. Escisión de ensayo de resina 5 Una cantidad pequeña de la resina hidroxilamina-2-clorotritilo funcionalizada (aprox. ,3 ml de la mezcla de reacción, aprox. 10 mg de resina) se trató con 2 % de TFA/DCM (0,5 ml) durante 10 min a t.a. La resina se filtró y el filtrado se concentró soplando con una corriente de gas N2. Se obtuvo la CLEM del residuo. 10 Preparación de resina hidroxilamina-2-clorotritilo derigada de ácido subérico Etapa 1- Inmovilización en resina de 2-clorotritilo-O-NH2 15 A un matraz de fondo redondo cargado con una resina de 2-clorotritilo-O-NH2 (6 g, carga1,14 mmol/g, 6,84 mmol) y DCM (60 ml) se añadió DIPEA (5,30 g, 41,0 mmol, 6 eq). Lentamente se añadió 8-cloro-8-oxooctanoato de metilo (4,2 g, 20,5 mmol, 3 eq) a la mezcla de reacción con agitación orbital y la mezcla de reacción se agitó durante 48 horas. La resina se filtró y se lavó usando el procedimiento de lavado estándar. La resina se secó al vacío. La 20 pureza CLEM se determinó mediante detección ELS, 100 %, m/z 204 [M++H]+. Etapa 2 - Saponificación 25

A un matraz de fondo redondo cargado con la resina de la etapa 1 (4 g, carga 1,14 mmol/g, 4,56 mmol) se añadió THF (16 ml) y MeOH (16 ml). A la reacción se añadió una solución de NaOH (0,91 g, 22,8 mmol, 5 eq) en agua (16 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 48 horas. La resina se filtró y se lavó con agua x 2, MeOH x 2, seguido del procedimiento de lavado estándar La resina se secó al vacío. La pureza CLEM se determinó mediante detección 30 ELS, 100 %, m/z 190 [M++H]+.

Preparación de derivados de SAHA Los compuestos basados en SAHA se prepararon mediante los procedimientos que se indican más adelante. 35 Los compuestos (8), (9) y (10) se prepararon mediante la metodología descrita en el esquema siguiente: Las etapas 1 a 5 se ejemplifican para R= ciclopentilo Etapa 1- Síntesis del éster ciclopentílico de ácido (S)-(3-Nitro-bencilamino)-fenilacético 5 El bromuro de 3-nitrobencilo (46 mmol) se disolvió en DMF (180 ml) y se añadió carbonato potásico (92 mmol), seguido por el éster de (S)-fenilglicina (10,6 g, 46 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 17 10 horas antes de evaporar hasta sequedad. El residuo se redisolvió en EtOAc (150 ml) y se lavó con agua (3 x 80 ml), se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró hasta sequedad. Después de purificar mediante cromatografía en columna ultrarrápida (30 % EtOAc / hexano) se obtuvo el éster y se usó directamente en la etapa 2. Etapa 2- Síntesis del éster ciclopentílico de ácido (S)-[terc-Butoxicarbonil-(3-nitro-bencil)-amino]-fenilacético El producto de la etapa 1 (40,9 mmol) se disolvió en THF (250 ml) antes de la adición de carbonato potásico (61,4 5 mmol) y agua (150 ml). Se añadió di-terc-butil-dicarbonato (163 mmol) y la mezcla de reacción se calentó hasta 50 ºC duranyte 18 h. Se añadió DCM y la mezcla resultante se lavó consecutivamente con 0,1 M HCl (150 ml), NaHCO3 acuoso saturado y agua (150 ml). La capa de DCM se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró hasta sequedad- Después de purificar mediante cromatografía en columna ultrarrápida (5 % EtOAc / hexano) se aisló el sulfato del título y se usó directamente en la etapa 3. 10 Etapa 3- Síntesis del éster ciclopentílico de ácido (S)-[(3-amino-bencil)-terc-butoxicarbonil-amino]-fenilacético 15 EL producto de la etapa 2 (11,5 mmol) se disolvió en EtOAc (150 ml) antes de la adición de catalizador Pd/C (10 % húmedo) (0,8 g)y se hidrogenó con presión en globo a t.a. durante 18 horas. La mezcla de reacción se filtró a través de una lámina de celite y se evaporó hasta sequedad para dar un sólido. Etapa 4 – Acoplamiento de la resina 20 Una resina de hidroxilamina 2-clorotritilo derivada con ácido subérico (1,0 g, carga 0,83 mmol/g) se hinchó en DCM (15 ml) se añadió PyBOP (1,36 g, 2,61 mmol), seguido de DIPEA (1,5 ml, 8,7 mmol). El producto de la etapa 3 (2,61 25 mmol) se disolvió en DCM (15 ml) y se añadió a la mezcla de reacción. Las reacción se agitó durante 24 horas a t.a.. La resina se filtró y se lavó usando el procedimiento de lavado estándar. La resina se secó al vacío. Etapa 5- Síntesis del éster ciclopentílico de ácido (S)-[3-(7-Hidroxicarbamoil-heptanoilamino)bencilamino)-fenilacético compuesto (8) 30 El producto de la etapa 4 (carga 0,83 mmol) se agitó suavemente en 2 % de TFA/DCM (10 ml) durante 20 min. La resina se filtró. El filtrado se evaporó a presión reducida a t.a. La resina se volvió a tratar con lavó con 2% de TFA/DCM (10 ml) y se filtró tras 20 minutos. Los filtrados combinados se evaporaron hasta sequedad a presión 5 reducida a t.a. para dar un residuo oleoso. El residuo se dejó reposar en 20 % de TFA/DCM durante 40 minutos. Tras la evaporación hasta sequedad, también a presión reducida a t.a., el producto bruto se purificó mediante HPLC preparativa. Datos analíticos para el compuesto 8 10 CLEM pureza 100 % (m/z) 496 [M++H], RMN de 1H (400MHz, MeOD), δ: 1,30 - 1,70 (16H, m), 2,00 (2H, t), 2,30 (2H, t), 4,05 (2H, dd), 5,00 (1H, m), 5,15 (1H, m), 7,05 (1H, m), 7,30 (2H, m), 7,40 (5H, m), 7,75 (1H, m). Datos analíticos para el compuesto (10) 15 CLEM pureza 97 % (m/z) 484 [M++H], RMN de 1H (400 MHz, MeOD), δ: 1,30 (13H, m), 1,45 - 1,65 (4H, m), 1,93 - 2,05 (2H, m), 2,20 - 2,40 (2H, m), 3,99 (2H, q), 4,65 - 4,95 (1H, m) 7,05 (1H, d), 7,25 - 7,33 (2 H, m), 7,35 - 7,50 (5H, m), 7,75 (1H, s). 20 Etapa 6 - Saponificación El producto de la etapa 5 donde R = Et (1,4 g, carga 0,83 mmol) se suspendió en THF (8,6 ml) y MeOH (8,6 ml) y se 25 añadió una solución de hidróxido sódico 1,4M (5,98 mmol). La mezcla se agitó durante 24 horas y la resina se filtró y se lavó con agua x 2, MeOH x 2, seguido del procedimiento de lavado estándar La resina se secó al vacío. Etapa 7- Síntesis del ácido (S)-[3-(7-Hidroxicarbamoil-heptanoilamino)bencilamino)-fenilacético (9) 30 El producto de la etapa 6 (1,44 g, loading 0,83 mmol) se agitó después suavemente en 2 % de TFA/DCM (10 ml) durante 20 min. La resina se filtró y el filtrado se evaporó a presión reducida a t.a. La resina se volvió a tratar con 2 % de TFA/DCM (10 ml) y se filtró tras 20 minutos. Los filtrados combinados se evaporaron hasta sequedad a presión 35 reducida a t.a. para dar un residuo oleoso. El residuo se dejó reposar en 20 % de TFA/DCM durante 40 minutos. Tras la evaporación hasta sequedad, a presión reducida a t.a., el producto bruto se purificó mediante HPLC preparativa para dar el compuesto (9). CLEM pureza 100 % (m/z) 428 [M++H], RMN de 1H (400MHz, MeOD), δ: 1,20 - 1,35 (4H, m), 1,50 - 1,65 (4H, m), 2,00 (2H, m), 2,30 (2H, m), 4,00 (2H, dd), 4,90 (1H, m), 7,05 (1H, m), 7,25 - 7,50 (7H, m), 7,70 (1H, m). 40 El compuesto (24) se preparó siguiendo la misma metodología descrita para la síntesos del compuesto (8). Éster ciclopentílico de ácido ({(R)-[4-7-Hidroxicarbamoil-heptanoilamino)-fenil)-fenil-metil}-amino)acético; 5 Pureza CLEM 95 % m/z 496 [M++H]+, RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1,30 - 1,50 (6H, m), 1,50 - 1,70 (8H, m), 1,80 (2H, m), 2,10 (2H, t), 2,45 (2H, t), 4,1 (2H, dd), 5,25 (1H, m), 5,35 (1H, m), 7,45 (2H, d), 7,60 (5H, m), 7,80 (2H, d), 10,00 - 10,10 (2H, br s), 10,50 (1H, s). 10 Ejemplo de referencia 2 Este ejemplo describe la modificación del inhibidor conocido de la aurora quinasa A (("Aurora A") N-{4-(7-metoxi-6-metoxi-quinolina-4-iloxi)-fenil}-benzamida (compuesto (11)) meduante la unión de un motivo de aminoácido éster en un punto donde no se produce alteración de su modo de unión. 15 Compuesto (11): N-{4-(7-metoxi-6-metoxi-quinolin-4-iloxi)-fenil}-benzamida 20 El compuesto (11) se preparó como se describe en la patente de EE.UU. nº 6.143.764. Los compuestos basados en el compuesto (11) se prepararon mediante los procedimientos que se indican más adelante. Los compuestos (12) y (13) se prepararon mediante el método descrito en el esquema siguiente: 25 Etapa 1- Síntesis de N-(4-Hidroxi-fenil)-benzamida A una solución de 4-aminofenol (4,27 g, 39,1 mmol) en DMF (50 ml) a 0 ºC en atmósfera de argón se añadió trietilamina (7,44 ml, 53,4 mmol, 1,5 eq). La reacción se agitó durante 10 minutos antes de la adición lenta de cloruro 5 de benzoílo (5 g, 35,6 mmol, 1 eq) durante un periodo de 5 minutos, La mezcla de reacción se dejó calentar hasta la t.a. y se agiotó durante 18 horas. El DMF se eliminó a presión reducida y la mezcla se trató con EtOAc/agua. Tuvo como resultado la precipitación de un sólido blanco, que se filtró y se secó a presión reducida para dar el compuesto del título (8,0 g, 96 %). RMN de 1H (270 MHz, DMSO) δ: 10,0 (1H, s), 9,35 (1H, s), 7,9 (2H, d, J = 7,2 Hz), 7,5 (5H, m), 6,75 (2H, d, J = 7,4 Hz). 10 Etapa 2- Síntesis de N-[4-(7-Benciloxi-6-metoxi-quinolin-4-iloxi)-fenil]-benzamida 15 Un matraz de fondo redondo cargado con 4-cloro-6-metoxi-7-benciloxiquinolina [véas Org. Synth. Col. Vol. 3, 272 (1955) y el documento US006143764A (Kirin Beer Kabushiki Kaisha) para los procedimientos de síntesos] (1,09 g, 3,6 mmol) se añadió el producto de la etapa 1 (2,33 g, 10,9 mmol, 3 eq). La reacción se calentó hasta 140 ºC durante 3 horas. Después de enfriar hasta la temperatura ambiente, a la mezcla de reacción se añadió agua y la mezcla se extrajo con agua. La capa EtOAc combinada se lavó con 5 % de NaOH acuoso salumera y se secó sobre 20 MgSO4. El disolvente se eliminó a presión reducida y se purificó mediante cromatografía en columna eluyendo con EtOAc / heptano (2:1) para obtener el compuesto del título (0,56 g, 32 %). m/z 477 [M++H Etapa 3- Síntesis de N-[4-(7-hidroxi-6-metoxi-quinolin-4-iloxi)-fenil]-benzamida 25 Una mezcla del producto de la etapa 2 0,56 g, 1,17 mmol) y 10 % de Pd/C (0,08 g) en 10 % de ciclohexano / EtOH (80 ml) se calentó a reflujo durante 3 h. El catalizador Pd/C de filtró a través de una lámina de celite, lavando dos veces con MeOH. El filtrado se concentró a presión reducida para dar compuesto del título como un sólido amarillo 30 (0,34 g, 75 %). m/z 387 [M++H]. Etapa 4 – Síntesis de éster ciclopentílico de ácido (S)-4-[4-(4-Benzoilamino-fenoxi)-6-metoxi-quinolin-7-iloxi]-2-terc-butoxicarbonilamino-butírico 5 A una solución del producto de la etapa 3 (0,2 g, 0,52 mmol) en DCM anhidor (30 ml) a 0 ºC se añadió céster ciclopentílico de ácido (S)-2-tertc-Butoxicarbonilamino-4-hidroxi-butírico (0,223 g, 0,78 mmol, 1,5 eq) en 5 ml de DCM. Después se añadieron Ph3P (0,557 g, 2,1 mmol, 4,1 eq) and DIAD (0,412 ml, 2,1 mmol, 4,1 eq) y la mezcla de reacción se dejó calentar hasta la t.a y se agitó durante 16 horas. La mezcla de reacción bruta se evapoiró a presión reducida y se purificó mediante cromatografía en columna para dar el compuesto del título (0,135 g, 46 %). m/z 10 656,3 [M++H]. Etapa 5 – Síntesis de éster ciclopentílico de ácido (S)-1-amino-4-[4-(4-Benzoilamino-fenoxi)-6-metoxi-quinolin-7-iloxi]-butírico (12) 15 A una solución del producto de la etapa 4 (5,8 mg, 0,009 mmol) en DCM (1 ml) se añadió TFA (1 ml). La mezcla de reacción se dejó agitar durante 16 h antes de evaporar a presión reducida, se sometió a azeotropismo con tolueno para eliminar los restos de TFA Se aisló el compuesto (12) como un sólido blancuzco (4,7 mg). CLEM pureza 95 % (m/z) 556,2 [M++H], RMN 1H (270 MHz, DMSO), δ: 10,4 (1H, s), 8,8 (1H, d, J = 6,5 Hz), 8,55 (2H,bs), 8,01 (4H, m), 20 7,65 (4H, m), 7,35 (1H, d, J = 7,6 Hz), 6,75 (1H, d, J = 6,5 Hz), 5,25 (1H, m), 4,35 (3H, m), 4,0 (3H, s), 2,4 (2H, m), 1,85 - 1,4 (8H, bm). Etapa 6 – Síntesis de ácido (S)-4-[4-(4-Benzoilamino-fenoxi)-6-metoxi-quinolin-7-iloxi]-2-terc-butoxicarbonilamino-butírico A una solución del producto de la etapa 4 (17 mg, 0,02 mmol) en THF (1 ml) se añadió NaOH 2M (0,026 ml, 0,046 5 mmol, 2 eq). Tras 16 horas, la reacción estaba incompleta, por lo que se añadieron 2 equivalentes adicionales de NaOH. La agitación se completó tras 6 horas y el THF se eliminó a presión reducida. La capa acuosa Se diluyó con 3 ml de agua y se acidificó hasta pH 6 con HCl 1M. El compuesto del título se extrajo en EtOAc, se secó sobre MgSO4 y se aisló como un sólido blanco. Esto se usó directamente en la etapa 7 sin más purificación. 10 Etapa 7 – Síntesis de ácido (S)-4-[4-(4-Benzoilamino-fenoxi)-6-metoxi-quinolin-7-iloxi]-2-terc-butoxicarbonilamino-butírico (13) 15 A una solución del producto de la etapa 6 (6,5 mg, 0,011 mmol) en DCM (1 ml) se añadió TFA (1 ml). La reacción se dejó agitar durante 6 h y después se eavporó a presión reducida para dar el compuesto del título (13) como un sólido blancuzco (90 %). CLEM pureza 100 % (m/z) 488,2 [M++H], RMN 1H (300 MHz, MeOD) δ: 8,75 (1H, d, J = 7,8 Hz), 8,00 (4H, m), 7,65 (4H, m), 7,4 (1H, d, J = 7,6 Hz), 6,95 (1H, d, J = 8,0 Hz), 4,6 (2H, m), 4,3 (1H, m), 4,2 (3H, s), 2,6 (2H, m). 20 El compuesto (14) se preparó mediante el procedimiento descrito en l esquema siguiente. Las etapas 1, 2 y 3 son las mismas que se han descrito en lo que antecede para la síntesis del compuesto (12). 5 Etapa 4 – Síntesis de éster terc-butílico de ácido (S)-4-[4-(4-Benzoilamino-fenoxi)-6-metoxi-quinolin-7-iloxi]-2-benciloxicarbonilamino-butírico El producto de la etapa 3 (0,15 g, 0,39 mmol), éster terc-butílico de ácido (S)-2-Benciloxicarbonilamino-4-bromo-butírico (0,16 g, 0,43 mmol, 1,1 eq) y K2CO3 (0,11 g, 0,78 mmol, 2 eq) se disolvieron en DMF anhidro (10 ml) en atmósfera de nitrógeno. La reacción se agitó a 35 ºC durante la noche antes de eliminar el DMF a presión reducida El residuo se disolvió en DCM y se lavó con agua y después con salmuera. La capa orgánica se secó sobre MgSO4 5 y se evaporó a presión reducida La Cromatografía en columna (eluyendo con 1 % de MeOH/ DCM) dio el compuesto del título (0,16 g, 60 %). m/z 678 [M+H] +,1H NMR (300 MHz, CDCl3), δ: 8,49 (1H, d, J = 5,3 Hz), 7,98 (1H, s), 7,92 (2H, dd, J = 8,2, 1,4 Hz), 7,80 - 7,72 (2H, m), 7,63 - 7,48 (4H, m), 7,43 - 7,29 (4H, m), 7,24 - 7,17 (2H, m), 6,64 (1H, d, J = 8,9 Hz), 6,49 (1H, d, J = 5,3 Hz), 5,15 (2H, s), 4,66 - 4,57 (1H, m), 4,43 - 4,34 (1H, m), 3,85 (3H, s), 2,55 - 2,33 (2H, m), 1,41 (9H, m). 10 Etapa 5 – Síntesis de éster terc-butílico de ácido (S)-2-amino-4-[4-(4-Benzoilamino-fenoxi)-6-metoxi-quinolin-7-iloxi]-butírico (14) 15 El producto de la etapa 4 (0,045 g, 0,066 mmol), se disolvió en EtOAc anhidro (5 ml) y se añadió Pd(OH)2/C en atmósfera de nitrógeno. La reacción se desgasificó y se agitó en atmósfera de hidrógeno a t.a. durante la noche. El catalizador se filtró a través de una lámina de Celite y el disolvente se eliminó a presión reducida. El compuesto (14) se purificó mediante HPLC preparativa m/z 544 [M+H]+,1H NMR (300 MHz, CD30D), δ: 8,67 (1H, d, J = 6,8 Hz), 7,98 (4H,d, J = 8,7 Hz), 7,90 (1H,s), 7,68 - 7,51 (4H, m), 7,42 - 7,36 (2H, m), 6,97 (1H, d, J = 6,6 Hz), 4,52 (2H, t, J = 5,7 20 Hz), 4,28 (1H, t, J = 6,5 Hz), 4,13 (3H, s), 2,69 - 2,45 (2H,m), 1,53 (9H, s). El compuesto (25) se preparó mediante el procedimiento descrito en l esquema siguiente. Etapa 1 – Síntesis de éster ciclopentílico de ácido (S)-4-[4-(4-Benzoilamino-fenoxi)-6-metoxi-quinolin-7-iloxi]-2-ciclohexilamino-butírico (25) Al compuesto (12) (37 mg, 0,066 mmol) en MeOH anhidro (1 ml) se añadieron 100 µ de una solución 1M de 5 ciclohexanona en MeOH y 1 gota de ácido acético. La mezcla de reacción se agitó a t.a. durante 3 h. Después se añadió cianoborohidruro sódico (10,3 mg, 0,165 mmol) y la reacción se dejó agitando durante 4 horas a t.a. antes de concentrar al vacío. La purificación mediante HPLC preparativa dio el compuesto del título (25) como una sal di-TFA m/z 638 [M+H]+. RMN de 1H (300 MHz, CD3OD) δ: 8,72 (1H, d, J = 6,8 Hz), 8,02 - 7,98 (4H, m), 7,93 (1H, s), 7,67 (1H, s), 7,66 - 7,53 (3H, m), 7,42 (2H, m), 6,99 (1H, d, J = 6,8 Hz), 5,38 (1H, m), 4,49 (3H, m), 4,14 (3H, s), 3,27 (11 10 H, m), 2,66 (2H, m), 2,20 (2H, m), 12,05 - 1,46 (16H, m). Ejemplo de referencia 3

Este ejemplo describe la modificación del inhibidor conocido de la P38 quinasa 6-Amino-5-(2,4-difluoro-benzoil)-1-15 (2,6-difluoro-fenil)-1H-piridin-2-ona (compuesto 3258) mediante la unión de un motivo de aminoácido éster en un punto donde no se produce alteración de su modo de unión Compuesto (15): 6-Amino-5-(2,4-difluoro-benzoil)-1-(2,6-difluoro-fenil)-1H-piridin-2-ona 20 El compuesto (15) se preparó como se ha descrito en el documento WO03/076405. Los compuestos basados en el compuesto (15) se prepararon mediante los procedimientos que se indican a continuación. 25 Los compuestos (16) y (17) se prepararon mediante el procedimiento descrito en l esquema siguiente. Etapa 1- Síntesis de (S)-4-{4-[6-Amino-5-(2,4-difluorobenzoil)-2-oxo-2H-piridin-1-il]-3,5-difluorofenoxi}-2-terc-butoxicarbonilaminobutirato de ciclopentilo 5 A una mezcla agitada de 6-amino-5-(2,4-difluorobenzoil)-1-(2,6-difluoro-4-hidroxi-fenil)-1H-piridin-2-ona [preparada mediante los procedimientos descritos en el documento WO03/076405] (100 mg, 0,265 mmol) y K2CO3 en DMF (1,5 ml) se añadió éster ciclopentílico de ácido (L)-5-bromo-2-terc-butoxicarbonilaminopentanoico (96 mg, 0,265 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 60° C durante 2 h. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (15 ml) y se lavó con NaHCO3 acuoso saturado (3 ml) y agua (10 ml). La capa de EtOAc se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró 10 hasta sequedad, La purificación mediante cromatografía ultrarrápida (20 % EtOAc / heptano) dio el compuesto del título como un sólido blanco (50 mg, 29 %). Pureza CLEM 100 % m/z 648 [M++H], RMN de 1H (400 MHz, MeOD), δ:1,30 (9H, s), 1,40 - 1,65 (6H, m), 1,70 - 1,85 (2H, m), 1,95 - 2,30 (2H, m), 4,00 - 4,10 (2H, m), 4,15 - 4,20 (1H, m), 5,05 - 5,10 (1H, m), 5,65 (1H, d), 6,70 - 6,80 (2H, m), 6,95 - 7,05 (2H, m), 7,25 - 7,45 (2H, m). 15 Etapa 2- Síntesis de (S)-2-amino-4-{4-[6-Amino-5-(2,4-difluorobenzoil)-2-oxo-2H-piridin-1-il]-3,5-difluorofenoxi}butanoato trifluoroacetato (16) 20 Una mezcla del producto de la etapa 1 (10 mg) y 20 5 de TFA / DCM (0,5 ml) se dejó reposar a t.a. durante 3 horas. La mezcla de reacción se concentró hasta sequedad soplando en N2. El residuo se trituró con Et2O (0,3 ml x 2) para proporcionar el compuesto (16) del como un sólido blanco (9,3 mg, 91 %). CLEM pureza 100 % (m/z) 548 [M++H], RMN 1H (400 MHz, MeOD) δ: 1,55 - 1,80 (6H, m), 1,85 - 2,00 (2H, m), 2,30 - 2,50 (2H, m), 4,15 - 4,30 (3H, m), 5,25 - 5,35 (1H, m), 5,75 (1H, d), 6,85 - 6,95 (2H, m), 7,05 - 7,15 (2H, m), 7,40 - 7,55 (2H, m). 25 Etapa 3- Síntesis de ácido (S)-2-amino-4-{4-[6-Amino-5-(2,4-difluorobenzoil)-2-oxo-2H-piridin-1-il]-3,5-difluorofenoxi}butanoico (17) 30 A una solución del compuesto (16) (20 mg, 0,0317 mmol) en una mezcla de MeOH (0,3 ml) y THF (0,3 ml) se añadió NaOH acuoso 2M (0,3 ml). La mezcla de reacción se dejó reposar a t.a. durante 3 horas. Una vez finalizada, la mezcla de reacción se evaporó hasta sequedad soplando con flujo N2, se acidificó hasta pH 1-2 mediante la adición gota a gota de HCl acuoso 2M. El sólido blanco resultante formado se recogió mediante filtración. Rendimiento = 9 35 mg, 48 %., CLEM pureza 97 % (m/z) 480 [M++H], RMN 1H (400 MHz, MeOD) δ: 2,35 - 2,55 (2H, m, CH2), 4,15 - 4,20 (1H, m, CH), 4,25 - 4,35 (2H, m, CH2), 5,75 (1H, d, CH), 6,85 - 7,00 (2H, m, Ar), 7,05 - 7,20 (2H, m, Ar), 7,40 - 7,55 (2H, m, Ar). El compuesto (18) se preparó mediante el procedimiento descrito en el esquema siguiente. Etapa 1- Síntesis de éster terc-butílico de ácido (S)-2-amino-4-{4-[6-Amino-5-(2,4-difluorobenzoil)-2-oxo-2H-piridin-1-il]-3,5-difluorofenoxi}-2-bencilozicarbonilamino-butírico 5 A una solución de la 6-Amino-5-(2,4-difluorobenzoyl)-1-(2,6-difluoro-4-hydroxyphenyl)-1H-pyridin-2-ona (100 mg, 0,26 mmol) y éster t-butílico de ácido (S)-2-benciloxicarbonilamino-4-bromo-butírico (108 mg, 0,29 mmol) en acetona 10 (2 ml) se añadió yoduro sódico (79 mg, 0,53 mmol) y carbonato potásico (146 mg, 1,06 mmol). La reacción se calentó a reflujo durante 12 horas y se repartió entre agua (20 ml) y acetato de etilo (20 ml). La capa acuosa se reextrajo con acetato de etilo (2x10 ml) y las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (20 ml), se secaron (MgSO4) y se concentraron a presión reducida para dar un aceite amarillo. Este residuo se sometió a cromatografía en columna [gel de sílice 40 % de acetato de etilo-heptano] para dar el producto deseado (186 mg, 79 15 %) en forma de un sólido incoloro m/z 670 [M+H]. Etapa 2- Síntesis de éster terc-butílico de ácido (S)-2-amino-4-{4-[6-Amino-5-(2,4-difluorobenzoil)-2-oxo-2H-piridin-1-il]-3,5-difluorofenoxi}-butírico 20 Éster terc-butílico de ácido (S)-2-amino-4-{4-[6-Amino-5-(2,4-difluorobenzoil)-2-oxo-2H-piridin-1-il]-3,5-difluorofenoxi}-2-bencilozicarbonilamino-butírico 25 (140 mg, 0,2 mmol) se disolvió en acetato de etilo (15 ml) que contiene 10 % de hidróxido de paladio sobre carbono (20 mg) y se agitó en atmósfera de hidrógeno (1 atm) durante 1 hora. La mezcla de reacción s epurgó con N2, y se filtró a través de celite® lavando con acetato de etilo adicional. El filtrado se concentró a presión reducida para dar un sólido que se sometió a cromatografía en columna [gel de sílice: 5 %MeOH en diclorometano]. Esto dio el producto deseado (60 mg, 54 %) ) en forma de un sólido gris. Pureza CLE, 98 %, m/z 536 [M+H]+, RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) 7,65 - 30 7,44 (1H, m), 7,39 - 7,29 (2H, m), 6,96 - 6,82 (2H, m), 6,66 (2H, br d, J=8,1 Hz), 5,82 (1H, d, J=9,9 Hz), 4,20 - 4,07 (3H, m), 3,48 (1H, dd, J=4,8, 8,7 Hz), 2,22 - 2,15 (1H, m), 1,91 - 1,84 (1H, m), 1,62 (2H, br s), 1,43 (9H, s). Ejemplo de referencia 4 Este ejemplo describe la modificación del inhibidor conocido de la DHFR 5-Metil-6-((3,4,5-trimetoxifenilamino)metil)pirido[2,3-d]pirimidina-2,4-diamina (compuesto 2 G=N)) mediante la unión de un motivo de 5 aminoácido éster en un punto donde no se produce alteración de su modo de unión Compuesto (2 G=N): 5-Metil-6-((3,4,5-trimetoxifenilamino)metil)pirido[2,3-d]pirimidina-2,4-diamina 10 El compuesto (2 G=N) se preparó mediante una modificación del procedimiento descrito en J. Med. Chem. 1993, 36, 3437-3443. 2,4-Diamino-5-metilpirido[2,3-d]pirimidina-6-carbonitrilo (0,10 g, 0,5 mmol), 3,4,5-trimetoxianilina (0,10 g, 0,55 mmol) 15 y níquel Raney (0,7 g, húmedo) en ácido acético (20 ml) se agitaron a t.a. en atmósfera de hidrógeno. Tras 2 horas, la mezcla de reacción se filtró a través de celite y el disolvente se evaporó a presión reducida. El residuo bruto se purificó mediante HPLC de fase inversa, para dar el compuesto (2 G=N) como un sólido (22 mg, 16 %). CLEM pureza 94 % (m/z) 371,1 [M+H]+, RMN 1H (400 MHz, DMSO), δ: 8,5 (1H, s), 7,0 (2H, bs), 6,2 (2H, bs), 6,0 (2H, s), 5,7 (1H, m), 4,2 (2H, d), 3,7 (6H, s), 3,5 (3H, s), 2,7 (3H, s). 20 Los compuestos basados en el compuesto (2 G=N) se prepararon mediante los procedimientos que se indican a continuación. Los compuestos (6) y (19) se prepararon mediante el procedimiento descrito en l esquema siguiente. 25 Etapa 1 – Síntesis de (S)-ciclopentil 4-metil-2-(4-nitrobenzamido)pentanoato 5 El cloruro de 4-nitrobenzoílo (0,60 g, 3,9 mmol) en DCM (2 ml) se añadió gota a gota durante 10 minutos a una solución de (S)-ciclopentil 2-amino-4-metilpentanoato (0,70 g, 3,5 mmol) y diisopropiletilamina (0,94 ml, 5,3 mmol) en DCM (10 ml) a -5 ºC en atmósfera de nitrógeno. Al finalizar la adición, la mezcla de reacción se dejó calentar hasta la t.a. y se agitó durante otros 30 minutos. La mezcla de reacción se vertió en NaHCO3 saturado acuoso y la capa 10 acuosa se extrajo con DCM. Los extractos orgánicos se combinaron, lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4 y se evaporaron a presión reducida para dar el compuesto del título como un sólido oleoso en rendimiento cuantitativo. Pureza CLEM 92 %, m/z 347,1 [M+H]+. Etapa 2 – Síntesis de (S)-ciclopentil -2-(4-aminobenzamido)-4-metilpentanoato Trietilamina (1,09 g, 10,8 mmol) y ácido fórmico (0,50 g, 10,8 mmol) se disolvieron en EtOH (10 ml) y se añadieron a 5 una solución del producto de la etapa 1 (1,2 g, 3,4 mmol) en EtOH (10 ml). Se añadió 10 % de Pd/C (aproximadamente 10 mol %) y la mezcla se calentó a reflujo. Tras 1 hora, la mezcla de reacción caliente se filtró a través de celite y el residuo se lavó con MeOH. El filtrado y los lavados se combinaron y evaporaron y el residuo se repartió entre DCM y NaHCO3 acuoso saturado. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO4 y se evaporó a presión reducida para dar el compuesto del título como un sólido blanco (0,80 g, 73 %). CLEM pureza 97 10 % (m/z) 319,2 [M+H]+, RMN 1H (400 MHz, CDCl3), δ: 7,6 (2H, dd), 6,6 (2H, dd), 5,2 (1H, m), 6,4 (1H, d) 4,7 (1H, m), 4,0 (2H, s), 1,9 (2H, m), 1,7 (5H, m), 1,6 (4H, m), 0,9 (6H, dd). Etapa 3 – Síntesis de éster ciclopentílico de ácido (S)-2-{4-[(2,4-Diamino-5-metil-pirido[2,3-d]pirimidin-6-ilmetil)-amino]-benzoilamino}-4-metil-pentanoico 15 2,4-Diamino-5-metilpirido[2,3-d]pirimidine-6-carbonitrilo (0,47 g, 2,4 mmol), el producto de la etapa 2 300 mg, 0,94 mmol) y níquel Raney (1 g, húmedo) en ácido acético (40 ml) se agitaron a t.a. en atmósfera de hidrógeno. Tras 48 20 horas, la mezcla de reacción se filtró a través de celite y el disolvente se evaporó a presión reducida. El material se cargó en MeOH en una columna SCX y se eluyó con una solución de 1 % de amoniaco en MeOH El producto bruto se absorbió después en gel de sílice y se purificó mediante cromatografía en columna (10 % de MeOH/DCM) para dar el compuesto (6) (60 mg,13 %). CLEM pureza 95 % (m/z) 506,1 [M+H]+, RMN 1H (400 MHz, DMSO), δ: 8,5 (1H, s), 8,2 (1H, d), 7,7 (2H, d), 7,0 (2H, bs), 6,7 (2H, d), 6,5 (1H, m), 6,2 (2H, bs), 5,1 (1H, m), 4,4 (1H, m), 4,3 (2H, d), 25 2,7 (3H, s), 1,7 (11H, m), 0,9 (6H, dd). Etapa 3 – Síntesis de ácido (S)-2-{4-[(2,4-Diamino-5-metil-pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)metilamino]-benzamido)-4-metil-pentanoico (19) 30 El producto de la etapa 3 (39 µM) se suspendió en EtOH (1,0 ml). A lo anterior se añadió una solución de hidróxido de litio 1 M (156 µl) y la suspensión se dejó agitar durante 48 horas. El EtOH se eliminó después a presión reducida, el residuo se diluyó con agua y se llevó hasta un pH 4 con ácido acético diluido. La solución se lavó con DCM, se evaporó y se sometió a purificación SCX para dar el compuesto (19). CLEM pureza 92 % (m/z) 438 [M+H]+, RMN 1H (400 MHz, DMSO), δ: 8,5 (1H, s), 8,1 (1H, d), 7,7 (2H, d), 7,2 (2H, br s), 6,7 (2H, d), 6,5 (1H, t), 6,4 (2H, br s), 4,4 5 (1H, m), 4,3 (2H, d), 2,7 (3H, s), 1,8 - 1,6 (2H, m), 1,6 - 1,5 (1H, m), 0,9 (6H, dd). Los compuestos (5) y el correspondiente ácido se prepararon mediante el procedimiento descrito en l esquema siguiente. Etapa 1 – Síntesis de (S)-ciclopentil 4-metil-2-(4-nitrobencilmino)pentanoato A una solución de (S)-ciclopentil 2-amino-4-metilpentanoato (2,00 g, 10,0 mmol) y 4-3,04 g, 20,0 mmol) en DCM (40 ml) se añadió ácido acético glacial (2 gotas). La solución se dejó agitar a t.a. durante 1 hora, mientras se añadió triacetoxiborohidruro (6,40 g, 30,2 mmol) en una única porción. Después de agitar durante 3 horas, la solución se 5 vertió en HCl acuoso 1M, se dejó agitar durante 30 minutos, se neutralizó con NaOH acuoso 1 M y se extrajo con DCM. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua y salmuera, se secaron sobre MgSO4 y se evaporaron a presión reducida. El material bruto se purificó mediante cromatografía (5 % de EtOAc/heptano) para dar el compuesto de título en forma de un aceite (1,51 g). Esto se usó sin más purificación en la etapa siguiente. Pureza CLEM 71 %, m/z 335,1 [M-H]+. 10 Etapa 2- Síntesis del éster ciclopentílico de ácido (S)-2-(4-Amino-bencilamino)-4-metil-pentanoico 15 El producto de la etapa 1 (0,90 g, 2,7 mmol) se disolvió en EtOH (5 ml) y se añadió a una suspensión de níquel Raney ( 0,5) y monohidrato de hidrazina (0,38 ml, 8,1 mmol) en EtOH (5 ml). Después de calentar a reflujo durante 1 hora, la mezcla de reacción caliente se filtró a través de celite y el residuo se lavó con MeOH. El filtrado y los lavados se combinaron y evaporaron y el residuo se repartió entre DCM e hidrogenocarbonato sódico acuoso saturado. La capa orgánica se lavó con salmuera, secó sobre MgSO4 y se evaporó a presión reducida. El material 20 bruto se purificó mediante cromatografía (20 % de EtOAc/heptano) para dar el compuesto de título en forma de un aceite (0,50 g, 61 %). CLEM pureza 99 % (m/z) 305,2 [M+H]+, RMN 1H (400 MHz, CDCl3), δ: 7,1 (2H, d), 6,6 (2H, d), 5,2 (1H, m), 3,7 (1H, d), 3,5 (1H, d), 3,2 (1H, t), 1,9 (2H, m), 1,7 (5H, m), 1,6 (4H, m), 0,9 (6H, dd). Etapa 3 – Síntesis de éster ciclopentílico de ácido (S)-2-{4-[(2,4-Diamino-5-metil-pirido[2,3-d]pirimidin-6-ilmetil)-25 amino]-benzlamino}-4-metil-pentanoico (5) 2,4-Diamino-5-metilpirido[2,3-d]pirimidina-6-carbonitrilo (0,16 g, 0,83 mmol), el producto de la etapa 2 (100 mg, 0,33 30 mmol) y níquel Raney (1 g, húmedo) en ácido acético (10 ml) se agitaron a t.a. en atmósfera de hidrógeno. Tras 5 horas, la mezcla de reacción se filtró a través de celite y el disolvente se evaporó a presión reducida. El material se cargó en MeOH en una columna SCX y se eluyó con una solución de 1 % de amoniaco en MeOH El producto bruto se absorbió después en gel de sílice y se purificó mediante cromatografía en columna (10 % de MeOH/DCM) para dar el compuesto del título (5) (30 mg19 %). CLEM pureza 95 % (m/z) 492,1 [M+H]+, RMN 1H (400 MHz, DMSO), δ: 8,5 (1H, s), 7,2 (2H, bs), 7,0 (2H, d), 6,6 (2H, d), 6,2 (2H, bs), 5,8 (1H, m), 5,1 (1H, m), 4,2 (2H, s), 3,6 (1H, m), 3,4 (1H, m), 3,1 (1H, m), 2,7 (3H, s), 1,5 (11 H, m), 0,8 (6H, dd). Etapa 4 – Síntesis de ácido (S)-2-{4-[(2,4-Diamino-5-metil-pirido[2,3-d]pirimidin-6-ilmetil)-amino]-bencilamino}-4-5 metil-pentanoico (5) El producto de la etapa 3 (39 µM) se suspendió en EtOH (1,0 ml). A lo anterior se añadió una solución de hidróxido 10 de litio 1 M (156 µl) y la suspensión se dejó agitar durante 48 horas. El EtOH se eliminó después a presión reducida, el residuo se diluyó con agua y se llevó hasta un pH 4 con ácido acético diluido. La solución se lavó con DCM, se evaporó y se sometió a purificación SCX para dar el compuesto del título. CLEM: 95 % de pureza a Rt 0,52 y 1,91 min, m/z (ES+) 424 [M+H]+; RMN 1H (400 MHz, DMSO), δ: 8,5 (1H, s), 7,1 (2H, d), 7,0 (2H, br s), 6,6 (2H, d), 6,2 (2H, br s), 5,7 (1H, t), 4,3 (2H, d), 3,6 (1H, m), 3,3 (2H, oscurecido con agua), 2,7 (3H, s), 1,8 (1H, m), 1,3 (1H, m), 1,2 15 (1H, m). El compuesto (3) se preparó mediante el procedimiento descrito en el esquema siguiente. Etapa 1 – Síntesis de (S)-ciclopentil -2-(terc-butoxicarbonilamino)-4-(4-nitrofenoxi)butanoato 5 A una solución de 4-nitrofenol (2,18 g, 15,7 mmol) en tetrahidrofurano (100 ml) a 0° C en nitrógeno se añadió hidruro sódico (0,63 g, 15,7 mmol). Después de calentar hasta la t.a y de agitar durante 10 minutos se añadió una solución de (S)-ciclopentil-4-bromo-2-(terc-butoxicarbonilamino)butanoato (5,0 g, 14,3 mmol) en DMF (20 ml). La reacción se calentó hasta 60 ºC durante 10 horas, tras lo cual la reacción se enfrió hasta la t.a. y se vertió en éter/carbonato 10 sódico. La capa orgánica se recogió y se lavó con una solución de carbonato sódico acuoso HCl 1M y salmuera antes de secar sobre mgSO4 y se concentró a presión reducida para dar un aceite que solidificó con el reposo para dar el compuesto del título (4,0 g, 69 %). CLEM pureza 97 % (m/z) 407,1 [M+H]+, RMN 1H (400 MHz, CDCl3), δ: 8,2 (2H, d), 7,4 (1H, d), 7,1 (2H, d), 5,1 (1H, m), 4,1 (3H, m), 2,1 (2H, m), 1,8 (2H, m), 1,6 (6H, m), 1,4 (9H, s). Etapa 2 – Síntesis de (S)-ciclopentil -4-(4-aminofenoxi-2-(terc-butoxicarbonilamino)butanoato Trietilamina (0,77 ml, 5,2 mmol) y ácido fórmico (0,19 ml, 5,2 mmol) se disolvieron en EtOH (4 ml) y se añadieron a una solución del producto de la etapa 1 (0,7 g, 1,7 mmol) en EtOH (4 ml). Se añadió 10 % de Pd/C 5 (aproximadamente 10 mol %) y la mezcla se calentó a reflujo. Tras 2 hora, la mezcla de reacción caliente se filtró a través de celite y el residuo se lavó con MeOH. El filtrado y los lavados se combinaron y evaporaron y el residuo se repartió entre DCM e hidrogenocarbonato sódico acuoso saturado. La capa orgánica se lavó con salmuera, secó sobre MgSO4 y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (elución de gradente, 10-40 % EtOAc en hexano) para dar el compuesto del título (0,3 g, 46 %). CLEM pureza 93 % (m/z) 10 379,1 [M+H]+, RMN 1H (400 MHz, CDCl3), δ: 6,9 (2H, d), 6,8 (2H, d), 5,3 (2H, m), 4,4 (1H, m) 4,0 (2H, m), 2,3 (1H, m), 2,2 (1H, m), 1,9 (2H, m), 1,7 (4H, m), 1,6 (2H, m), 1,4 (9H, s). Etapa 3 – Síntesis de (S)-ciclopentil-2-(terc-butoxicarbonilamino)-4-(4-((2,4-diamino-5-metilpirido[2,3-d]pirimidin-6-il)metilamino)fenoxi)butanoato 15 2,4-Diamino-5-metilpirido[2,3-d]pirimidin-6-carbonitrilo (0,50 g, 2,5 mmol), el producto de la etapa 2 (0,38 g, 1,0 mmol) y níquel Raney (3 g, húmedo) en ácido acético (40 ml) se agitaron a t.a. en atmósfera de hidrógeno. Tras 16 20 horas, la mezcla de reacción se filtró a través de celite y el disolvente se evaporó a presión reducida. El material se cargó en MeOH en una columna SCX y se eluyó con una solución de 1 % de amoniaco en MeOH El producto bruto se absorbió después en gel de sílice y se purificó mediante cromatografía en columna (5 % de MeOH/DCM) para dar el compuesto del título (145 mg, 26 %). CLEM pureza 95 % (m/z) 566,2 [M+H]+, RMN 1H (400 MHz, DMSO), δ: 8,5 (1H, s), 7,3 (2H, m), 7,0 (2H, m), 6,7 (2H, d), 6,6 (2H, d), 6,2 (2H, bs), 5,5 (1H, bs), 5,1 (1H, m), 4,1 (3H, m), 3,9 (2H, 25 m), 2,6 (3H, s), 2,0 (1H, m), 1,8 (3H, m), 1,6 (6H, m), 1,4 (9H, s). Etapa 4 – Síntesis de éster ciclopentílico de ácido (S)-2-amino-4-{4-[(2,4-Diamino-5-metil-pirido[2,3-d]pirimidin-6-ilmetil)-amino]-fenoxi}butírico 30 A una solución del producto de la etapa 3 (145 mg, 0,26 mmol) en DCM (3 ml) se añadió ácido trifluoroacético (·3 ml) y la reacción se agitó durante 30 min a t.a. El disolvente se evaporó a presión reducida y el residuo bruto se purificó mediante carga en MeOH en una columna SCX y eluyendo con 1 % de solución de amoniaco en MeOH para dar el 35 compuesto (3) (39 mg, 33 %). CLEM pureza 94 % (m/z) 466,1 [M+H]+, RMN 1H (400 MHz, DMSO), δ: 8,5 (1H, s), 7,0 (2H, bs), 6,7 (2H, d), 6,6 (2H, d), 6,2 (2H, bs), 5,5 (1H, bs), 5,1 (1H, m), 4,1 (2H, s), 3,9 (2H, m), 3,4 (1H, m), 2,7 (3H, s), 2,0 (2H, m), 1,8 (3H, m), 1,6 (6H, m). El compuesto (4) se preparó mediante el procedimiento descrito en el esquema siguiente. La etapa 1 es la misma que se ha descrito para el compuesto (3). 5 Etapa 2 – Síntesis de (S)-ciclopentil 2-amino-4-(4-nitrofenoxi)butanoato 10 A una solución del producto de la etapa 1 (4,0 g, 9,8 mmol) en DCM (12 ml) se añadió ácido trifluoroacético (12 ml). Después de agitar a t.a. durante 1 hora, la reacción se diluyó con DCM, se enfrió y se neutralizó mediante la adición de amoniaco acuoso. La capa orgánica se recogió y se lavó con agua, hidrogenocarbonato sódico acuoso y salmuera. Después se secó sobre MgSO4 y se concentró a presión reducida para dar compuesto del título como un aceite amarillo (3,0 g, 100 %). CLEM pureza 97 % (m/z) 309,1 [M+H]+, RMN 1H (400 MHz, CDCl3), δ: 8,2 (2H, d), 7,0 (2H, d), 5,2 (1H, m), 4,2 (2H, m), 3,6 (1H, dd), 1,7 - 1,5 (10H, m). Etapa 3 – Síntesis de (S)-ciclopentil 2-(ciclohexilamino-4-(4-nitrofenoxi)butanoato 5 A un matraz que contiene el producto de la etapa 2 (1,0 g, 3,3 mmol) y ciclohexanona (34 ml, 3,3 mmol) en nitrógeno se añadió a MeOh anhidro (10 ml). Después de agitar durante 12 h a t.a., se añadió triacetoxiborohidruro sódico (2,07 g, 9,75 mmol). Después de 4 horas, la reacción se vertió lentamente sobre una mezcla de DCM/Eq. HCl (1M). Después de agitar durante 10 min, se recogió la capa orgánica y se lavó con hidrogenocarbonato sódico, después 10 se secó sobre MgSO4 y se concentró a presión reducida para dar el compuesto del título como un sólido oleoso amarillos (1,21 g, 95 %). Pureza CLEM 92 %, m/z 391,1 [M+H]+. Etapa 2 – Síntesis de (S)-ciclopentil 4-(4-aminofenoxi-2-(ciclohexilamino)butanoato 15 Trietilamina (1,29 ml, 9,3 mmol) y ácido fórmico (348 µl, 9,3 mmol) se disolvieron en EtOH (10 ml) y se añadieron a una solución del producto de la etapa 3 (1,2 g, 3,1 mmol) en EtOH (10 ml). Se añadió 10 % de Pd/C (aproximadamente 10 mol %) y la mezcla se calentó a reflujo. Tras 30 hora, la mezcla de reacción caliente se filtró a 20 través de celite y el residuo se lavó con MeOH. El filtrado y los lavados se combinaron y evaporaron y el residuo se repartió entre DCM y NaHCO3 acuoso saturado. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO4 y se concentró a presión reducida para dar el compuesto del título como un sólido blanco (1,01 g, 92 %). CLEM pureza 94 % (m/z) 361,1 [M+H]+, RMN 1H (400 MHz, CDCl3), δ: 6,7 (2H, d), 6,6 (2H, d), 5,2 (1H, m), 4,0 (1H, m), 3,9 (1H, m), 3,5 (1H, dd), 2,3 (1H, m), 2,1 (1H, m), 1,9 (4H, m), 1,7 (7H, m), 1,6 (3H, m), 1,3 - 0,9 (5H, m). 25 Etapa 5 – Síntesis de éster ciclopentílico de ácido (S)-2-ciclohexilamino-4-{4-[(2,4-Diamino-5-metil-pirido[2,3-d]pirimidin-6-ilmetil)-amino]-fenoxi}butírico 30 2,4-Diamino-5-metilpirido[2,3-d]pirimidina-6-carbonitrilo (0,50 g, 2,5 mmol), el producto de la etapa 4 (0,36 g, 1,0 mmol) y níquel Raney (3 g, húmedo) en ácido acético (40 ml) se agitaron a t.a. en atmósfera de hidrógeno. Tras 48 horas, la mezcla de reacción se filtró a través de celite y el disolvente se evaporó a presión reducida. El material se cargó en MeOH en una columna SCX y se eluyó con una solución de 1 % de amoniaco en MeOH El producto bruto 35 se absorbió después en gel de sílice y se purificó mediante cromatografía en columna (10 % de MeOH/DCM) para dar el compuesto del título (76 mg, 14 %). CLEM pureza 90 % (m/z) 548,2 [M+H]+, RMN 1H (400 MHz, DMSO), δ: 8,5 (1H, s), 7,0 (2H, bs), 6,7 (2H, d), 6,6 (2H, d), 6,2 (2H, bs), 5,5 (1H, m), 5,1 (1H, m), 4,1 (2H, s), 3,9 (2H, m), 3,4 (1H, m), 2,7 (3H, s), 2,3 (1H, m), 1,9 (1H, m), 1,8 (4H, m), 1,6 (11 H, m), 1,1 (5H, m). Ejemplo de referencia 5 Este ejemplo describe la modificación del inhibidor conocido de la PI3 quinasa N-[5-(4-Cloro-3-metanosulfonilfenil)-4-metil-tiazol-2-il]-acetamida mediante la unión de un motivo de aminoácido éster en un punto donde no se produce alteración de su modo de unión 5 Compuesto (20): N-[5-(4-Cloro-3-metanesulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2-il]-acetamida El compuesto (20) se preparó como se ha descrito en el documento WO03072552. 10 Los compuestos basados en el compuesto (20) se prepararon mediante los procedimientos que se indican a continuación. Los compuestos (21) y (22) se prepararon mediante el procedimiento descrito en l esquema siguiente. 15 Etapa 1 - Síntesis de cloruro de 2-cloro-5-(2-oxo-propil)bencenosulfonilo 5 Gota a gota se añadió 4-clorofenil acetona (4 g, 0,023 mol) a ácido clorosulfónico (30 ml, 0,45 mol) a -10 ° C en N2 con agitación suave. La mezcla de reacción se dejó calentar hasta la t.a. y la agitación continuó durante 18 horas. La mezcla de reacción se inactivó cuidadosamente añadiendo gota a gota a hielo triturado (500 ml). La solución acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 250 ml). Las capas EtoOAC combinadas se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron hasta sequedad al vacío para dar el compuesto del ttítulo bruto (6,3 g, 65 %), que se usó en la siguiente etapa de reacción sin purificación adicional. Pureza mediante CLEM, 92 %. RMN 1H (400 MHz, CDCI3) δ: 2,30 (3H, s), 3,85 (2H, s), 7,50 (1H, d), 7,65 (1H, d), 7,95 (1H, s). 5 Etapa 1 - Síntesis de cloruro de 1-(4-Cloro-3-metanosulfonil-fenil)-propan-2-ona Una mezcla de Na2SO3 (3,79 g, 0,030 mol) y NaHCO3 (2,53 g, 0,030 mol) en agua (90 ml) se agitó a 70° C. A esta 10 solución se añadió una solución del producto de la etapa 1 (4,65 g, 0,015 mol) en dioxano (190 ml). La agitación continuó a 70 ºC durante 1 hora. Tras enfriar hasta la t.a., la mezcla de reacción se concentró hasta sequedad al vacío, dando un marrón sólido. Se añadió DMF (190 ml), seguido de Mel (1,88 ml, 0,030 mol). La mezcla de reacción se agitó a 40° C durante 1 h. Una vez finalizada, la mezcla de reacción se vertió en agua (90 ml) y se extrajo con con EtOAc (500 ml). El EtoOAC se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró al vacío para dar el compuesto 15 del título bruto como un solido marrón (2,49 g, 67 %), que se usó en la siguiente etapa de reacción sin purificación adicional. CLEM pureza 81 % (m/z) 247 [M++H], RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ: 2,15 (3H, s), 3,20 (3H, s), 3,75 (2H, s), 7,35 (1H, d), 7,45 (1H, d), 7,85 (1H, s). Etapa 3 - Síntesis de 1-bromo-1-(4-Cloro-3-metanosulfonil-fenil)-propan-2-ona 20 A una solucón agitada del producto de la etapa 2 (1,88 g, 7,60 mmol) en 1,4-dioxano (120 ml) se añadió gota a gota a t.a. bromo (0,292 ml, 5,72 mmol), dando una solución de color naranja oscuro. La agitación continuó durante 18 25 horas. La mezcla de reacción se evaporó hasta sequedad al vacío evitando calentar por encima de 30 ºC durante la evaporación. El residuo se redisolvió en EtOAc (100 ml) y se lavó con NaHCO3 acuoso saturado (20 ml), seguido de agua (20 ml). La capa de EtOAc se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró hasta sequedad al vacío. La purificación mediante cromatografía ultrarrápida (50 % EtOAc / heptano) dio el compuesto del título como un aceite amarillo (2,0 g, 80 %). CLEM pureza 74 % (m/z) 325/327 [M++H], RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ: 2,35 (3H, s), 3,25 30 (3H, s), 5,35 (1H, s), 7,50 (1H, d), 7,65 (1H, dd), 8,05 (1H, s). Etapa 4 – Síntesis de 5-(4-Cloro-3-metanesulfonil-fenil)-4-metil-tiiazol-2-ilamina 35 Una mezcla del producto de la etapa 3 (2 g, 6,15 mmol) y tiourea (468 mg, 6,15 mmol) en EtOH (65 ml) se agitó a 70 ºC durante 1,5 h. Después, la reacción se enfrió hasta la t.a y se produjo precipitación. El sólido crema se recogió mediante filtración para dar el compuesto del título (1,2 g, 64 %). CLEM pureza 91 % (m/z) 303 [M++H], RMN 1H (400 MHz, MeOD) δ: 2,35 (3H, s), 3,35 (3H, s), 7,75 - 7,85 (2H, m), 8,15 (1H, s). 40 Etapa 5- Síntesis de éster ciclopentílico de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-4[5-(4-cloro-3-metanosulfonilfenil)-4-metil-tiazol-2-ilcarbamoil]-butírico 5 A una mezcla agitada de éster 1-ciclopentílico de ácido 2-terc-butoxicarbonilamino-pentanodioico (208 mg, 0,66 mmol), EDCI (190 mg, 0,99 mmol) y HOBt (107 mg, 0,79 mmol) en DMF (1,5 ml) se añadió gota a gota una solución del producto de la etapa 4 (200 mg, 0,66 mmol) en DMF (1,5 ml) a t.a. Se añadió trietilamina (0,138ml,0,99 mmol) y la agitación continuó durante 18 h. La mezcla de reacción se diluyó con agua (10 ml) y se extrajo con EtOAc (15 ml). La capa de EtOAc se lavó con agua (10 ml), se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró al vacío. La purificación 10 mediante TLC preparativa (70 % EtOAc / heptano, Rf 0,5) dio el compuesto del título (160 mg, 40 %). CLEM pureza 91 % (m/z) 600/602 [M++H], RMN 1H (400 MHz, DMSO), δ: 1,45 - 1,55 (9H, s), 1,65 -2,15 (10H, m), 2,45 (3H, s), 2,70 (2H, m), 3,45 (3H, s), 4,10 - 4,25 (1H, m), 5,25 (1H, m), 7,75 - 7,90 (2H, m), 8,25 (1H, s). Etapa 6- Síntesis de éster ciclopentílico de ácido (S)-2-amino-4[5-(4-cloro-3-metanosulfonilfenil)-4-metil-tiazol-2-15 ilcarbamoil]-butírico (21) Una solución del producto de la etapa 5 (140 mg, 0,233 mmol) en 20 % de TFA / DCM (2 ml) se dejó reposar a t.a. 20 durante 3 horas. Una vez finalizada, la mezcla de reacción se concentró al vacío para dar el compuesto (21) (143 mg, 100 %). CLEM pureza 97 % (m/z) 500/502 [M++H], RMN 1H (400 MHz, MeOD) δ: 1,35 - 1,85 (8H, m), 2,00 - 2,20 (2H, m), 2,25 (3H, s), 2,60 (2H, m), 3,20 (3H, s), 3,85 - 4,00 (1H, m), 5,10 (1H, m), 7,50 - 7,65 (2H, m), 7,95 (1H, s). 25 Etapa 7- Síntesis de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-4[5-(4-cloro-3-metanosulfonilfenil)-4-metil-tiazol-2-ilcarbamoil]-butírico 30 A una solución del producto de la etapa 5 (20 mg, 0,033 mmol) en una mezcla de THF (0,5 ml) y MeOH (0,5 ml) se añadió NaOH acuoso 2M (0,5 ml).La mezcla se dejó reposar a t.a. durante 3 horas. Tras la finalización, la mezcla de reacción se concentró hasta casi sequedad y gota a gota se añadió HCl 1M hasta que un pH 1-2. El precipitado resultante se recogió mediante filtración a presión ligera. El sólido se lavó con agua (0,5 ml) y se secó extensamente al vacío para dar el compuesto del título (12 mg, 68 %). CLEM pureza 94 % (m/z) 532/534 [M++H], RMN de 1H (400 35 MHz, CDCl3) δ: 1,55 - 1,70 (9H, s), 2,15 - 2,55 (2H, m), 2,60 (3H, s), 2,75 - 2,90 (2H, m), 3,55 (3H, s), 4,25 - 4,45 (1H, m), 7,85 - 8,00 (2H, m), 8,35 (1H, s). Etapa 8- Síntesis de ácido (S)-2-amino-4[5-(4-cloro-3-metanosulfonilfenil)-4-metil-tiazol-2-ilcarbamoil]-butírico (22) Una solución del producto de la etapa 7 (12 mg, 0,0225 mmol) en 20 % de TFA / DCM (0,3 ml) se dejó reposar a t.a. 5 durante 3 horas. Una vez finalizada, la mezcla de reacción se concentró al vacío para dar el compuesto del título (22) (12 mg, 100 %). CLEM pureza 94 % (m/z) 432/434 [M++H], RMN de 1H (400 MHz, MeOD) δ: 2,10 - 2,25 (2H, m), 2,30 (3H, s), 2,65 - 2,75 (2H, m), 3,25 (3H, s), 3,95 - 4,05 (1H, m), 7,60 - 7,80 (2H, m), 8,05 (1H, s). El compuesto (23) se preparó mediante el procedimiento descrito en el esquema siguiente. 10 Las etapas 1, 2, 3 y 4 son las mismas que se han descrito para la preparación de los compuestos (21) y (22). 15 Etapa 5- Síntesis de éster terc-butílico de de ácido (S)-2-amino-4[5-(4-cloro-3-metanosulfonilfenil)-4-metil-tiazol-2-ilcarbamoil]-butírico Este compuesto se preparó a partir del éster terc-butílico de ácido 2-terc-butoxicarbonilamino-pentanedioico y de 5-(4-cloro-3-metanesulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2-ilamina (producto de la etapa 4) siguiendo el procedimiento descrito para la síntesis del compuesto (21). 5 Etapa 6- Síntesis de éster terc-butílico de de ácido (S)-2-amino-4[5-(4-cloro-3-metanosulfonilfenil)-4-metil-tiazol-2-ilcarbamoil]-butírico (23) 10 A una solución del producto de la etapa 5 (50 mg, 0,085 mmol) en EtOAc (0,25 ml) se añadió una solución de HCl 2M / éter (0,25 ml) a t.a. La mezcla de reacción se agitó enérgicamente durante 4 horas. La reacción se vlvió a tratar con una mezcla de EtOAc (0,25 ml) y HCl 2M/ éter (0,25 ml). La agitación continuó durante 1 hora. El precipitado formado se recogió mediante filtración por gravedad, se repartió entre EtOAc (3 ml) y NaHCO3 acuoso saturado (0,5 15 ml). La capa de EtOAc se lavó con agua (1 ml), se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró al vacío para dar el compuesto (23) (6,5 mg, 16 %). CLEM pureza 95 % (m/z) 488/490 [M++H], RMN de 1H (400 MHz, MeOD) δ: 1,35 - 1,40 (9H, s), 1,80 - 2,05 (2H, m), 2,30 (3H, s), 2,45 - 2,55 (2H, m), 3,25 (3H, s), 3,30 - 3,35 (1H, m), 7,60 - 7,70 (2H, m), 8,05 (1H, s). 20 Ensayos biológicos Ensayo de actividad inhibidora de la histona desacetilasa La capacidad de los compuestos para inhibir las actividades de la histona desacetilasa se midió usando el ensayo de 25 actividad fluorescente HDAC disponible comercialmente de Biomol. En resumen, el sustrato Fluor de Lys™, una lisina con una acetilación en el epsilon-amino, se incuba con la fuente de la actividad histona deacetilasa (Extracto nuclear de células HeLa) en presencia o ausencia de inhibidor. La desacetilación del sustrato sensibiliza al sustrato al desarrollador de Fluor de Lys™ y se genera un fluoróforo. Por tanto, la incubación del sustrato con una fuente de actividad de HDAC tiene como resultado un incremento de la señal que disminuye en presencia de un inhibidor de 30 HDAC. Los datos se expresan como porcentaje del control, medidos en ausencia de inhibidor, restándose la señal de fondo de todas las muestras del siguiente modo: 35 % actividad = ((Si – B) / (Sº– B)) x 100 En la que Si es la señal en presencia de sustrato, enzima e inhibidor, es la señal en presencia de sustrato, enzima y el vehículo en el que se disuelve el inhibidor, y B es la señal de fondo medida en ausencia de la enzima. 40 Los valores de CI50 se determinaron mediante análisis de regresión no lineal después de ajustar los resultados de ocho puntos de datos a la ecuación para una respuesta de dosis sigmoidea con una pendiente variable (% actividad contra la concentración log del compuesto) usando el software Graphpad Prism.

La actividad histona desacetilasa de extracto nuclear bruto derivado de células HeLa se usó pora cribado. La preparación, adquirida de 4C (Seneffe, Belgium), se preparó de de células HeLa recogidas durante la fase de crecimiento exponencial. El extracto nuclear se preparó de acuerdo con Dignam JD 1983 Nucl. Acid. Res. 11, 1475-1489, se ultracongeló en nitrógeno líquido y se almacenó a -80° C. La composición final dem tampón fue HEPES 20 mM, KCI 100 mM , EDTA 0,2 MM, DTT 0,5 mM, PMSF 0,2 mN y 20 % (v/v) de glicerol.. 5 Ensayo de actividad inhibidora de la aurora quinasa A La capacidad de los compuestos para inhibir la actividad de la aurora quinasa A se midió usando un ensayo de microplacas. En resumen, Flashplates ® de 96 pocillos (PerkinElmer Life Sciences) re recubrieron previamente con 10 la proteína básica de la mielina (PBM). MBP (100ul of 100 mg/ ml in PBS) se incubó a 37° C durante 1 hora, seguiod de incubación durante la noche a 4° C. Después, se lavaron las palcas con PBS y se dejaron secar al aire. Para determinar la actividad de la aurora quinasa A, 40 ng de la enzima (ProQuinase: Aurora quinasa A recombinante, de longitud completa, condensada en N-terminal con GST y expresada por baculovirus en células de 15 insecto Sf21) se incubaron en tampón de ensayo (Tris 50 mM (pH7,5), NaCl 10 mM,mgCl2 2,5 mM, DTT 1 mM, 0,4 % de DMSO), ATP 10 µM (Km de la enzima) y 0,5 µCi de [γ-33P]-ATP y con varias concentraciones del inhibidor. Los pocillos que carecen de inhibidor se usaron como vehículo control y los pocillos que no contenían enzima se usaron para medir la señal "de fondo". Las placas se incubaron durante la noche a 30° C. Tras la incubación, los conrenidos de los pocillos se extrajeron y las placas se lavaron tres veces con PBS que contiene pirofosfato 20 tetrasódico 10 mM antes del recuento por centelleo usando Wallac MicroBeta TriLux Se generaron curvas de dosis-respuesta de 10 concentraciones (concentración final superior 10 µM, con diluciones por 3) usando pocillos por triplicado. 25 Los valores de CI50 se determinaron mediante análisis de regresión no lineal después de ajustar los resultados de los puntos de datos a la ecuación para una respuesta de dosis sigmoidea con una pendiente variable (% actividad contra la concentración log del compuesto) usando el software Graphpad Prism. Ensayo de actividad inhibidora de la dihidrofolato reductasa (DHFR) 30 La capacidad de los compuestos para inhibir la actividad de la DHFR se midió usando un ensayo basado en la capacidad de la DHFR para catalizar la reducción reversible y dependiente de NADPH del ácido dihidrofólico usando un kit de Signa (número de catálogo CS0340). Esto usa un tampón de ensayo de propiedad exclusiva y DHFE humana recombinante a 7,5 x10-4 Unidad por reacción, NADPH a 60 µM y ácido dihidrofólico a 50 µM. La reacción 35 se siguió mediante monitorización de la disminución de la absorbancia a 340 nm durante un periodo de 2 minutos, a temperatura ambiente y la actividad enzimática se calculó como la tasa de disminución de la absorbancia. La actividad enzimática, en presencia de inhibidor, se expresó como un porcentaje de actividad sin inhibidor y la CI50 del inhibidor se determinó a partir de una curva de respuesta a la dosis sigmoidal usando el software Xlfit (% de actividad contra la concentración log del compuesto). Cada muestra se procesó por triplicado y cada curva de 40 respuesta a la dosis se compuso de 10 diluciones del inhibidor. Ensayo de actividad inhibidora de la P38 MAP quinasa α

La capacidad de los compuestos para inhibir la actividad de la P38 MAP quinasa α (enzima humana d elongitud 45 completa que se expresa en E. coli como una proteína marcada con GST en el extremo) se midió usando un ensayo realizado por Upstate (Dundee UK). En un volumen de reacción final de 25 µl, la P38 MAP quinasa α (5-10 mU) se incubó con Tris 25 mM a pH 7,5, EGTA 0,02 mM, 0,33 mg/ ml de la proteína básica de la mielina, acetato de magnesio 10 mM, ATP 90 µM (Km 97 µM) y [γ33P]-ATP (actividad específica aproximada 500 cpm/p mol). La reacción se inició mediante la adición de la mezcla de mgATP. Tras incubar durante 40 minutos TA, la reacción se 50 detuvo mediante la adición de 5 µl de solución de ácido fosfórico al 3 %. Después se colocaron 10 µl de la reacción sobre un filtro P30 y se lavó tres veces durante 5 mnutos en ácido fosfórico 75 mM y una cez con metanol, antes de secar y contar mediante centelleo.

Las curvas de respuesta a la dosis se generaron a partir de una serie de dilución ½ log de una solución madre del 55 inhibidor en DMSO. Se realizaron nueve dilucines desde una concentración superior final de 10 µM y no se incluyó un “compuesto blanco”. Las muestras se procesaron por duplicado. Los datos de los recuentos por centelleo se recogieron y sometieron a análisis de ajuste libre mediante el software Graphpad Prism. A partir de la curva generada se determinó la concentración que daba un 50 % de inhibición. 60 Ensayo de inhibición de la PI 3-quinasa γ La medición de la actividad de la PI 3-quinasa γ depende de la afinidad específica y elevada de la unión del dominio de homología de pleckstrina (PH) de GRP1 a PIP3, el producto de la actividad de la PI 3-quinasa. Se forma un complejo entre el anticuerpo monoclonal anti-GST marcado con europio, un dominio PH de GRP1 marcado con 65 GST, PIP3 biotinilada y estreptavidina-aloficocianina (APC). Este complejo genera una señal de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) resuelta en el tiempo y estable, que disminuye por la compoetición de PIP3, generada en el ensayo de la PI 3-quinasa, con la PIP3 biotinilada.

El ensayo se realizó en Upstate (Dundee, UK) del siguiente modo: En un volumen de reacción final de 20 µl, la PI3-quinasa γ (enzima humana recombinante de longitud completa, marcada con Hi6 en el estremo y expresada por 5 baculovirus en células de insecto Sf21) se incubó en tampón de ensayo que contiene fosfatidilinositol.4,5-bisfosfato 10 µM, y mgATP 100 µM (Km de la enzima 117 µM). La reacción se inició mediante la adición de la mezcla de mgATP. Tras incubar durante 30 minutos TA, la reacción se detuvo mediante la adición de 5 µl de solución de detención que contiene EDTA y fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato biotinilado. Por último, se añadieron 5 µl del tampón de detención, que contenía el anticuerpo monoclonal anti-GST marcado con europio, un dominio PH de GRP1 10 marcado con GST y estreptavidina-APC. Después, la placa se leyó en modo fluorescencia resuelta en el tiempo y la señal homogénea de fluorescencia resuelta en el tiempo (HTRF) se determinó de acuerdo con la fórmula HTRF =10000 x (Em665nm/Em620nm). Lis puntos de datos duplicados se generaron a partir de una serie de dilución ½ log de una solución madre del 15 compuesto en DMSO. Se realizaron nueve diluciones desde una concentración superior final de 10 µM y no se incluyó un “compuesto blanco”. Los datos de la proporción HTRF se transformaron en el % de actividad de los controles y se analizaron con una aplicación de dosis-respuesta sigmoidea de cuatro parámetros (pendiente variable). Se determinó la concentración que daba una inhibición del 50 % (CI). 20 Ensayo de inhibición de la proliferación celular Se recogieron líneas celulares de cáncer (U937 y HCT 116) y se sembraron a 1000 - 2000 células/pocillo (volumen final 100 µl) en placas de cultivo tisular de 96 pocillos. Tras 24 horas de crecimiento se trató a las células con el compuesto. Las placas se volvieron a incubar durante 72 – 96 horas más antes de realizar en ensayo de viabilidad 25 celular WST-1 de acuerdo con las instrucciones de los proveedores (Roche Applied Science). Los datos se expresaron como el porcentaje de inhibición del control, medidos en ausencia de inhibidor del siguiente modo: 30 Cuando Si es la señal en presencia de inhibidor y So es la señal en presencia de DMSO. Se generaron curvas de dosis-respuesta de 8 concentraciones (concentración final superior 10 µM, con diluciones por 3) usando 6 duplicados. 35 Los valores de CI50 se determinaron mediante análisis de regresión no lineal después de ajustar los a la ecuación para una respuesta de dosis sigmoidea con una pendiente variable (% actividad contra la concentración log del compuesto) usando el software Graphpad Prism. 40 Estimulación con LPS de sangre entera humana La sangre entera se extrajo mediante punción venosa usando tubos de tipo vacutainer heparinizados (Becton Dickinson) y se diluyó en un volumen igual de medio de cultivo tisular RPMI1640. Se sembraron 100 µlen placas de cultivo tisular de 96 pocillos de fondo en V. Se añadió inhibidor en 100 µl de medio RPMI1640 y 2 horas después la 45 sangre se estimuló con LPS (cepa de E. coli 005:B5, Sigma) a una concentración final de 100 ng/ml y se incubó a 37 ºC en 5 % de CO2 durante 6 h. se midieron los niveles de TNF-α en los sobrenadantes sin células mediante ELISA de tipo sándwich (R&D Systems #QTA00B). Ensayo de rotura celular con carboxilesterasa 50 Preparación de extractos celulares Las células tumorales U937 o HCT (- 109) se lavaron en 4 volúmenes de Dulbeccos PBS (~ 1 litro) y se sedimentaron a 525 g durante 10 min a 4° C. Esto se repitió dos veces y lel sedimento celular final se 55 resuspendió en 35 ml de tampón homogeneizante frío (Trizma 10 mM, NaCl 130 mM, CaCl2 0,5 mM pH 7,0 a 25° C). Los homogeneizados se prepararon mediante cavitación con nitrógeno (700 psi durante 50 min a 4° C). El homogeneizado se mantuvo en hielo y se suplementó con un cóctel de inhibidores a las concentraciones finales de: 60 Leupeptina 1 µM Aprotinina 0,1 µM E64 8 µM Pepstatina 1,5 µM Bestatina 162 µM Quimostatina 33 µM Tras aclarar el homogeneizado celular mediante centrifugacón a 525 g durante 10 minutos, se usó el sobrenadante resultante como fuente de actividad esterasa y se almacenó a -80 ºC hasta que fue necesario. 5 Medición de la escisión del éster La hidrólisis de los ésteres en los correspondientes ácidos carboxílicos se puede medir usando el extracto celular preparado como se ha indicado anteriormente. A tal efecto, el extracto celular (-30 µg / volumen total del ensayo de 10 0,5 ml) se incubó a 37° C en un tampón Tris- HCl 25 mM, 125 mM NaCl, pH 7,5 a 25° C. A tiempo cero, se añadió el éster (sustrato) a una concentración final de 2,5 µM y las muestras se incubaron a 37° C durante el tiempo adecuado (normalmente a 0 u 80 min). Las reacciones se detuvieron mediante la adición de 3 x volúmenes de acetonitrilo. Para las muestras a tiempo cero se añadió el acetonitrilo antes que el compuesto éster. Tras la centrifugación a 12.000 g durante 5 minutos, las muestras se analizaron para el éster y su correspondiente ácido carboxílico a 15 temperatura ambiente mediante CLEM (Sciex API 3000, HP1100 bomba binaria, CTC PAL). La cromatografía se basó en una columna de AceCN (75*2,1mm) y una fase móvil de 5-95 % de acetonitrilo en agua/ 0,1 % de ácido fórmico. Cuantificación de la expresión de hCE-1, hCE-2 and hCE-3 en líneas celulares monocíticas y no monocíticas 20 Se usaron cebadores específicos del gen para amplificar por PCR hCE-1, -2 y -3 de ADNc humano. Los productos de PCR se clonaron en un vector plasmídico y se verificó la secuencia. Después se diluyeron en serie para usar como curvas estándar en reacciones de PCR de tiempo real. El ARN total se extrajo sde varias líneas celulares humanas y ADNc preparado. Para cuantificar los niveles absolutos de hCE en las líneas celulares se compararon los 25 niveles de expresión con las nromas del producto de PCR clonados en un ensayo SYBR Green PCR en tiempo real. La Figura 1 muestra que hCE-1 solo se expresa en una cantidad significativa de una línea de células monocíticas. Resultados biológicos 30 Los compuestos a los que se hace referencia en los Ejemplos 1-5 anteriores se investigaron en los ensayos de inhibición enzimática, proliferación celular y escisión del éster, descritos anteriormente, y los resultados se muestran en las Tablas 3 y 4. Potencia 35 Tabla 3

HDAC: Inhibición enzimática CI50 nM (HDAC – extracto nuclear de células HeLa) CI50 (nM) proliferación celular Proporción celular/enzima, CI50

Compuesto modulador no modificado (7) (SAHA)

(Compuesto modulador modificado (8) (éster ciclopentílico): 0,5

Ácido resultante de la escisión del éster del modulador modificado (compuesto 9): Inactivo NA

(Compuesto modulador modificado (10): (éster de t-butilo)

Los resultados anteriores muestran que: 40

i. Los compuestos modificados con aminoácido éster (compuestos 8 y 10) y el ácido (compuesto 9), que resultaría de la escisión del motivo éster, tienen CI50 en el ensayo enzimático comparable al valor para el inhibidor no modificado HDAC (SAHA- Compuesto 7), lo que indica que el motivo alfa-aminoácido éster estaba unido a SAHA en un punto donde no se altere la unión a la P38 MAP quinasa .

ii. Aunque los ésteres (compuestos 8 y 19) y el ácido (compuesto 9) tienen actividades comparables al 45 inhibidor no modificado (SAH—puesto 8) sobre el inhibidor no modificado (compuesto 7),m pero una disminución sustancial en la potencia celular en el caso de la esterasa estable a t-butil éster (compuesto 10), lo que indica que cuando más tarde se acumule, el ácido en las células genera mayor potencia celular.

iii. La mayor actividad en el ensayo de proliferación celular del compuesto 8 sobre el homólogo no modifcado ((compuesto 7) (o el derivado de éster no hidrolizable, conpuesto 19, indica que el éster se hidroliza en el ácido 50 parental hidrolizado . El indica que el éster ciclopentílico se hidroliza en el ácido parental en la célula, donde se acumula y ejerce un mayor efecto inhibidor.

Tabla 3 Continuación

Aurora quinasa: Inhibición enzimática CI50 nM (Aurora quinasa A)) CI50 (nM) proliferación celular Proporción celular/enzima, CI50

Compuesto modulador no modificado (11): 1,3

(Compuesto modulador modificado (12) (éster ciclopentílico): 3,5 0,0015

Ácido resultante de la escisión del éster del modulador modificado (compuesto 13): >5000 NA

(Compuesto modulador modificado (14): (éster de t-butilo): 0,025

Los resultados anteriores muestran que:

i. el inhibidor modificado con alfa-aminoácido, compuesto 13, que resultaría de la escisión del motivo éster en 5 el compuesto 12, tiene un valor de CI50 en el ensayo enzimático comparable al del inhibidor no modificado de la aurora quinasa (compuesto 11), lo que indica que es posible unir el motivo alfa-aminoácido éster en un punto donde no se altere la unión a la aurora quinasa A.

ii. Aunque el ácido (compuesto 13) tiene una actividad inhibidora enzimática comparable a la del inhibidor no modificado (compuesto 11) y el éster (compuesto 12) es un inhibidor más débil, existe un incremento 10 significativo de la potencia celular del compuesto 12 sobre la del inhibidor no modificado (compuesto 11). El éster-t-butílico (compuesto 14) menos fácilmente escindido tiene una actividad enzimática comprable a la del éster ciclopentílico escindible (compuesto 12), ero es unas 20 veces menos activo en el ensayo celular.

iii. La mayor actividad en el ensayo de proliferación celular del compuesto 12 sobre el homólogo no modificado (compuesto 11) y el éster t-butílico menos fácilmente escindido (compuesto 14) indica que el éster ciclopentílico 15 se hidroliza en el ácido parental en la célula, donde se acumula y ejerce un mayor efecto inhibidor.

Tabla 3 Continuación

P38 MAP quinasa: Inhibición enzimática CI50 nM (P38 MAP quinasa) Inhibiciσn de la producciσn de TNFα en sangre entera humana, CI50 nM Proporción WB/enzima, CI50

Compuesto modulador no modificado (15)

(Compuesto modulador modificado (16) (éster ciclopentílico): 0,8

Ácido resultante de la escisión del éster del modulador modificado (compuesto 17): No analizado NA

(Compuesto modulador modificado (18): (éster de t-butilo)

Los resultados anteriores muestran que: 20

i. el inhibidor modificado con alfa-aminoácido éster, compuesto 16, y el ácido, compuesto 17, que resultaría de la escisión del motivo éster en el compuesto 16, tienen un valor de CI50 en el ensayo enzimático comparable al valor para el inhibidor no modificado de la P38 MAP quinasa (compuesto 15), lo que indica que es posible unir el motivo alfa-aminoácido éster en un punto donde no se altere la unión a la P38 MAP quinasa . 25

ii. el ácido, compuesto 17, tiene una actividad comparable contra la enzima a la del inhibidor no modificado (compuesto 15) y al éster t-butílico (compuesto 18). No obstante, existe un incremento significativo de la capacidad del éster ciclopentílico (compuesto 16) para inhibir la producción del TNF dentro de las células monocíticas presentes en la sangre entera en comparación con el inhibidor no modificado (compuesto 15) y el éster t-butílico menos fácilmente escindido (compuesto 18). 30

iii. la mayor actividad en el ensayo de sangre entera para el compuesto 16 sobre el homólogo no modificado, compuesto 15, y el éster t-butílico menos fácilmente escindido compuesto 18 indica que el éster ciclopentílico se hidroliza en el ácido parental en la célula, donde se acumula y ejerce un mayor efecto inhibidor.

Tabla 3 Continuación

DHFR: Inhibición enzimática CI50 nM (DHFR) CI50 (nM) proliferación celular (células U937) Proporción celular/enzima, CI50

Compuesto modulador no modificado (2 G=N):

(Compuesto modulador modificado (6) (éster ciclopentílico): 0,013

Ácido resultante de la escisión del éster del modulador modificado (compuesto 19): No analizado No aplicable

Los resultados anteriores muestran que:

i. el inhibidor modificado con alfa-aminoácido, compuesto 19, que resultaría de la escisión del motivo éster en el compuesto 6, tiene un valor de CI50 en el ensayo enzimático comparable al del inhibidor no modificado de la 5 DHFR (compuesto 2 (G=N)), lo que indica que es posible unir el motico alfa-aminoácido éster en un punto donde no se altere la unión a la DHFR.

ii. aunque el ácido (compuesto 19) tiene una actividad inhibidora enzimática comparable a la del inhibidor no modificado (compuesto 2 (G=N)), el éster (compuesto 6) es significativamente más potente en la inhibición de la proliferació celular que el inhibidor no modifcado (compuesto 2 (G=N)). 10

iii. la mayor actividad en el ensayo de proliferación celular del compuesto 6 sobre el homólogo no modifcado ((compuesto 2 (G=N)) indica que el éster ciclopentílico se hidroliza en el ácido parental en la célula, donde se acumula y ejerce un mayor efecto inhibidor.

Tabla 3 Continuación 15

PI 3-quinasa: Inhibición enzimática CI50 nM (PI3-quinasa) Inhibición de la producción de TNFα en sangre entera humana, CI50 nM Proporción WB/enzima, CI50

Compuesto modulador no modificado (20)

(Compuesto modulador modificado (21) (éster ciclopentílico): 0,15

Ácido resultante de la escisión del éster del modulador modificado (22): No analizado No aplicable

Compuesto modulador modificado (23) (éster-t-butílico): 0,75

Los resultados anteriores muestran que:

i. el inhibidor modificado con alfa-aminoácido éster, compuesto 21, y el ácido, compuesto 22, que resultaría de la escisión del motivo éster en el compuesto 21, tiene un valor de CI50 en el ensayo enzimático dentro de 20 un factor de 10 del valor para el inhibidor no modificado de la PI3 quinasa (compuesto 20), lo lo que indica que es posible unir el motivo alfa-aminoácido éster en un punto donde no se altere la unión a la PI3 quinasa.

ii. aunque el ácido, compuesto 22, tiene una actividad comparable con la del inhibidor no modificado (compuesto 20) y el éster (compuesto 21), hay un incremento significativo de la potencia del éster para inhibir 25 la producción de TNF en células monocíticas presentes en sangre entera en comparación con el inhibidor no modificado (Compuesto 20) y el éster t-butílico menos fácilmente escindido (compuesto 23).

iii. la mayor actividad en el ensayo de sangre entera para el compuesto 21 sobre el homólogo no modificado, compuesto 20, y el éster t-butílico menos fácilmente escindido compuesto 23 indica que el éster ciclopentílico 30 se hidroliza en el ácido parental en la célula, donde se acumula y ejerce un mayor efecto inhibidor.

Selectividad

Tabla 4: Comparación de la proliferación celular y la escisión del éster para una línea celular monocítica y no monocítica

HDAC: U937 (línea celular monocítica) HCT116 (línea celular no monocítica)

Compuesto: CI50 (nM) proliferación celular Ácido producido1 ng/ml CI50 (nM) proliferación celular Ácido producido1 ng/ml

Compuesto modulador no modificado (7): No aplicable No aplicable

(Compuesto modulador modificado (24):

2 La cantidad de ácido producido tras la incubación del compuesto modificado (compuesto 24) durante 80 minutos en el ensayo de carboxilesterasa de rotura celular descrito anteriormente.

Los resultados anteriores muestran que:

i. el compuesto no modificado (compuesto (7) no muestra selectividad entre una línea celular monocítica y no monocítica, mientras que esto se puede conseguir uniendo un motivo éster adecuado, como en el compuesto 24. 10

ii. esta selectividad se correlaciona con la mejora de la escisión del éster en ácido por la línea celular monocítica.

iii. la mejor actividad celular solo se be en la línea celular en la que se produce ácido, lo que indica que esta 15 mejora en la potencia celular se debe a la acumulación del ácido.

Tabla 4 Continuación

Aurora quinasa A: U937 (línea celular monocítica) HCT116 (línea celular no monocítica)

Compuesto modulador no modificado (10): NA NA

(Compuesto modulador modificado (25):

2 La cantidad de ácido producido tras la incubación del compuesto (25) durante 80 minutos en el ensayo de carboxilesterasa de rotura celular descrito anteriormente.

Los resultados anteriores muestran que: 20

i. El compuesto no modificado (compuesto (10) no muestra selectividad entre una línea celular monocítica y no monocítica, mientras que esto se consigue uniendo un motivo éster adecuado, como en el compuesto 25.

ii. esta selectividad se correlaciona con la mejora de la escisión del éster en ácido por la línea celular 25 monocítica.

iii. La mejor actividad celular solo se be en la línea celular en la que se produce ácido, lo que indica que esta mejora en la potencia celular se debe a la acumulación del ácido.

Tabla 4 Continuación

DHFR: U937 (línea celular monocítica) HCT116 (línea celular no monocítica)

Compuesto modulador no modificado (2 G=N):: No aplicable NA

(Compuesto modulador modificado (5):

2 La cantidad de ácido producido tras la incubación del compuesto (5) durante 80 minutos en el ensayo de carboxilesterasa de rotura celular descrito anteriormente.

Los resultados anteriores muestran que:

i. el compuesto no modificado (compuesto 2 G = N) no muestra selectividad entre una línea celular monocítica y no monocítica, mientras que esto se consigue uniendo un motivo éster adecuado, como en el compuesto 5. 5

iii. La mejor actividad celular solo se be en la línea celular en la que se produce ácido, lo que indica que esta 10 mejora en la potencia celular se debe a la acumulación del ácido.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un conjugado covalente de un éster de alfa-aminoácido y un inhibidor de la actividad de la enzima histona acetilasa intracelular diana para usar en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia, donde 5

el grupo éster del conjugado es hidrolizable por una o más enzimas carboxilesterasas intracelulares en el correspondiente ácido;

el nitrógeno del grupo amino del aminoácido éster no está unido directamente a un resto carbonilo o se deja sin sustituir; y 10

el alfa-aminoácido éster está conjugado con el inhibidor en una posición remota de la interfaz de unión entre el inhibidor y la enzima histona desacetilasa, donde la posición de la conjugación es remota cuando el conjugado tiene una potencia en un ensayo de actividad celular al menos tan alta como la del inhibidor no conjugado en el mismo ensayo, donde el ensayo de actividad celular es un ensayo de inhibición de la proliferación celular llevado a cabo en células de cáncer U937. 15
2. Un conjugado covalente de un éster de alfa-aminoácido y un inhibidor de la actividad de la enzima histona acetilasa intracelular diana para usar en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia, donde

el grupo éster del conjugado es hidrolizable por una o más enzimas carboxilesterasas intracelulares en el correspondiente ácido;

el nitrógeno del grupo amino del aminoácido éster no está unido directamente a un resto carbonilo o se deja sin sustituir; y

el alfa-aminoácido éster está conjugado con el inhibidor de un modo tal que el modo de unión del inhibidor 25 conjugado y dicho correspondiente ácido a la enzima histona desacetilasa es el mismo que el del inhibidor no conjugado, donde el modo de unión es el mismo cuando el conjugado tiene una potencia en un ensayo de actividad celular al menos tan alta como la del inhibidor no conjugado en el mismo ensayo, donde el ensayo de actividad celular es un ensayo de inhibición de la proliferación celular llevado a cabo en células de cáncer U937.
3. Un conjugado covalente para usar de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el conjugado es para usar en el tratamiento de un trastorno proliferativo.
4. Un conjugado para usar de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el alfa-aminoácido éster conjugado covalentemente no es el elemento en C-terminal de un motivo dipeptídico del inhibidor conjugado. 35
5. Un conjugado para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el inhibidor es uno que se une no covalentemente a la enzima histona desacetilasa.
6. Un conjugado para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el alfa-aminoácido 40 éster está unido covalentemente al inhibidor a través de un radical enlazador.
7. Un conjugado para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el alfa-aminoácido éster está conjugado al inhibidor mediante el grupo amino del aminoácido éster.
8. Un conjugado para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el alfa-aminoácido éster está conjugado al inhibidor mediante el carbono alfa del aminoácido éster.
9. Un conjugado para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el éster es hidrolizable por las células que contienen una o más de las enzimas carboxilesterasa intracelulares hCE-1, hCE-2 y 50 hCE-3 en el correspondiente alfa-aminoácido.

10, Un conjugado para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el éster es hidrolizable por las células que contienen la enzimas carboxilesterasa intracelular hCE-1, en el correspondiente alfa-aminoácido y no por las células que contienen hCE-2 o hCE-3. 55
11. Un conjugado para usar de acuerdo con la reivindicación 10, donde el nitrógeno del grupo amino del aminoácido éster está sustituido pero no directamente unido a un grupo cabronilo.
12. Una composición farmacéutica para usar en un procedimiento de tratamiento del cuerpo animal o humano 60 mediante terapia, comprendiendo la composición un conjugado como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones a 1 a 11 y un vehículo farmacéuticamente aceptable de la misma.
13. Una composición farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 12, que está adaptada para administración tópica y en la que el conjugado (a) cuando el alfa-aminoácido éster está unido al inhibidor mediante 65 su grupo amino, el carbono adyacente al carbono alfa del alfa-aminoácido éster está monosustituido o (b) cuanto el

alfa-aminoácido éster está unido al inhibidor a través de un átomo de carbono del aminoácido, el átomo adyacente al átomo de carbono del aminoácido está sustituido.
14. Un procedimiento in vitro para incrementar o prolongar de forma selectiva la potencia intracelular y/o e tiempo de residencia de un inhibidor de la actividad de la enzima intracelular diana histona desacetilasa y&o los monocitos 5 relacionados con otros tipos de células , que comprende tratar una población mixta de células con un conjugad del inhibidor de acuerdo con la reivindicación 11.
15. Un procedimiento para identificar un conjugado covalente de un éster de alfa-aminoácido de un inhibidor dado de la actividad de la enzima histona acetilasa intracelular diana, teniendo dicho conjugado una potencia celular mayor o 10 prolongada en relación con el inhibidor dado, donde el procedimiento comprende:

(i) identificar una posición o posiciones sobre un inhibidor dado de la actividad de la enzima histona desacetilasa intracelular o sobre una pluralidad de inhibidores dados de la actividad de la enzima histona desacetilasa intracelular que comparten el mismo modo de unión para la enzima histona desacetilasa diana, estando dicha 15 posición o posiciones remotas con respecto a la interfaz d eunión entre el o los inhibidores y la enzima histona desacetilasa diana.

(ii) modificar covalentemente el o los inhibidores mediante unión de un radical alfa aminoácido éster o una serie de diferentes radicales alfa aminoácido éster en una o más posiciones identificadas en (i).

(iii) analizar el o los inhibidores conjugados con alfa-aminoácido preparados en la (ii) para determinar su 20 actividad contra la enzima histona desacetilasa diana; y

(iv) A partir de los datos adquiridos en (iii), seleccionar una o más de las versiones de conjugado alfa aminoácido éster candidatos del o los inhibidores dados que producen modulación de la actividad de la histona desacetilasa dentro de las células, se convierte en y se acumula como el correspondiente ácido carboxílico dentro de las células y que muestran un incremento o prolongación de la potencia celular. 25