CN101170899A - 含有新型淀粉的小麦及其生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供一种通过抑制上述酶的表达而蓄积新型特性的淀粉的小麦。本发明提供一种下述蛋白质全部不表达的小麦:(1)序列号1的淀粉合成酶II型-A1基因编码的淀粉合成酶II型-A1蛋白质;(2)序列号3的淀粉合成酶II型-B1基因编码的淀粉合成酶II型-B1蛋白质;(3)序列号5的淀粉合成酶II型-D1基因编码的淀粉合成酶II型-D1蛋白质;(4)序列号7的颗粒性淀粉合成酶-A1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-A1蛋白质;(5)序列号9的颗粒性淀粉合成酶-B1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-B1蛋白质;及(6)序列号11的颗粒性淀粉合成酶-D1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-D1蛋白质。
Description
技术领域
本发明涉及一种在小麦的胚乳中不表达颗粒性淀粉合成酶及淀粉合成酶II型蛋白质的小麦。
背景技术
淀粉是葡萄糖通过α-1,4键连接形成的直链状的直链淀粉和具有通过α-1,6键形成的分支结构的支链淀粉这2种成分的混合物。上述成分在各种酶的作用下被合成,在谷物中蓄积在种子的胚乳部分。已知直链淀粉通过颗粒性淀粉合成酶基因编码的颗粒结合型淀粉合成酶被合成。另一方面,支链淀粉通过多个酶的作用被合成。上述酶为(可溶性)淀粉合成酶I型、(可溶性)淀粉合成酶II型、(可溶性)淀粉合成酶III型、分支酶、脱支酶等。
另外,淀粉以高度结晶化颗粒的形式储藏在植物中。通过向其中加入水进行加热,使得淀粉颗粒逐渐膨胀,在某一温度(糊化峰温度)下,结晶结构同时崩溃,成为糊状(糊化)。之后,通过冷却,糊化淀粉的粘性逐渐增大,发生凝胶化(老化)。上述特性以及直链淀粉和支链淀粉的含量比因植物种类的不同而有较大差异已经是公知的。
淀粉是植物中的储藏物质,同时对于动物也是重要的能源之一。摄取淀粉时,不仅可以加工含有淀粉的谷粒,将其制成食品加以利用,而且,可以利用上述特性,将其用作增稠剂、保水剂、凝胶形成剂等添加剂。另一方面,在工业上也从很早开始就将其用作糊或膜的原料。另外,对实施化学或物理修饰的加工淀粉等也存在大量的需求。淀粉占据储藏器官(种子或块茎)重量的大部分,淀粉特性变化时,对利用上述器官得到的上述制品的食感、或加工性等产生较大影响,因此,对开发具有多种特性的淀粉的需要很高。
上述淀粉的特性因植物种类的不同而差异较大。但是,同一植物品种内的淀粉的多样性,通常由于直链淀粉含量不同而导致物性变化。例如,在小麦中,如果是通常类型的淀粉,直链淀粉含量大约为30%左右,已知有含量20%左右的低直链淀粉系统。低直链淀粉类小麦淀粉与通常类型相比优选用作面条等面用粉,商业上也广泛栽培。另外,已知水稻或玉米中蓄积直链淀粉含量极低的粘性淀粉的类型,中村等人(专利文献1)首次培育了糯小麦(glutinous wheat),与通常类型相比具有独特的加工性和食感。直链淀粉含量作为表示淀粉特性的特征之一,经常被讨论,但在同一植物品种内,直链淀粉含量之外的多样性低。因此,来自小麦的淀粉或含有该淀粉的小麦粉为多样性低的物质,由于商品品种单一,所以市场已经成熟。因此只要能够开发出蓄积具有新型特性的淀粉的小麦,就能够开发出具有与现有不同的特征的改良制品或新型用途,因此人们迫切期待开发出上述小麦。
已有报道指出,作为具有新型特性的小麦的制作例,山守等人开发出淀粉合成酶II型缺失的小麦系统,所述淀粉合成酶II型是合成支链淀粉支链的酶之一(参见非专利文献1)。也有报道指出上述小麦中以高含量蓄积直链淀粉,但关于其他特性的研究几乎没有进行,也未实现实用化。
在小麦中,直链淀粉通过颗粒性淀粉合成酶基因编码的颗粒性淀粉合成酶蛋白质合成。作为异源六倍体的小麦染色体中存在同源染色体A、B、D3个基因组。通常情况下,存在3种颗粒性淀粉合成酶基因,由上述基因表达颗粒性淀粉合成酶(颗粒性淀粉合成酶-A1、颗粒性淀粉合成酶-B1、颗粒性淀粉合成酶-D1)。但是,也存在因基因组DNA上产生的变异而使得蛋白质未被表达的类型,其表达的组合包含野生型共有8种。与此相应在直链淀粉含量方面存在显著差异也是已知的,缺失1至2种的小麦系统为低直链淀粉系统,3种全部缺失的类型为糯小麦。作为简便地识别上述缺失类型的方法,已经确立了直接解析在胚乳中表达的蛋白质的方法和以基因组DNA序列为基础进行调查的方法(例如参见专利文献1及非专利文献2)。
另一方面,作为参与支链淀粉的支链合成的酶之一,已知有淀粉合成酶II型蛋白质,由存在于7A、7B、7D染色体上的3种淀粉合成酶II型基因编码(淀粉合成酶II型-A1、淀粉合成酶II型-B1、淀粉合成酶II型-D1)。对于淀粉合成酶II型蛋白质,本发明人等也已经开发出了识别缺失类型的方法。使用此方法,淀粉合成酶II型蛋白质的表达类型也可以分为8类,但没有充分研究各个类型中淀粉特性的多样性。
专利文献1:特开平6-125669号公报
非专利文献1:Yamamori et.al.,Theor.Appl.Genet(2000)101:21-29
非专利文献2:Nakamura et.Al.,(2002)Genome 45:1150-1156
发明内容
鉴于此,本发明的目的在于通过控制上述酶的表达,提供蓄积新型特性的淀粉的小麦。
为了得到具有新型特性的小麦,进行了潜心的研究,结果发现,通过使特定的基因变异,并且控制特定的蛋白质的表达,能够得到生淀粉分解率非常高的小麦及糊化淀粉粘度非常低的小麦。即,本发明提供一种下述蛋白质全部不表达的小麦:(1)序列号1的淀粉合成酶II型-A1基因编码的淀粉合成酶II型-A1蛋白质;(2)序列号3的淀粉合成酶II型-B1基因编码的淀粉合成酶II型-B1蛋白质;(3)序列号5的淀粉合成酶II型-D1基因编码的淀粉合成酶II型-D1蛋白质;(4)序列号7的颗粒性淀粉合成酶-A1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-A1蛋白质;(5)序列号9的颗粒性淀粉合成酶-B1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-B1蛋白质;及(6)序列号11的颗粒性淀粉合成酶-D1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-D1蛋白质。
本发明提供一种小麦,所述小麦不具有上述蛋白质(1)~(6)具有的酶活性的全部。
本发明提供一种小麦,所述小麦中蓄积的淀粉的30重量%以上不形成粒径10μm以上的淀粉颗粒。
本发明提供一种小麦,其中,在支链淀粉的支链中,聚合度70以下的支链中,聚合度为3~5的支链的数量的比例为1.5%以上。
本发明提供一种小麦,生淀粉通过淀粉酶的分解率为80%以上。
另外,本发明提供一种小麦,其中上述蛋白质(1)至(3)中的1个以上不表达,并且上述蛋白质(4)至(6)中的1个以上不表达(但不包括只有蛋白质(2)、(4)及(5)同时不表达的小麦。)。
本发明提供一种小麦,所述小麦不具有上述蛋白质(1)至(3)所具有的酶活性中的1种以上酶活性,并且不具有上述蛋白质(4)至(6)所具有的酶活性中的1种以上酶活性(但,不包括仅不具有蛋白质(2)、(4)及(5)所具有的酶活性的小麦)。
本发明提供一种小麦,其中上述蛋白质(1)至(3)中的任意2种不表达,并且上述蛋白质(4)至(6)中的1种以上不表达。
本发明提供一种小麦,所述小麦不具有上述蛋白质(1)至(3)所具有的酶活性中的任意2种酶活性,并且不具有上述蛋白质(4)至(6)所具有的酶活性中的1种以上酶活性。
本发明提供一种小麦,其中上述蛋白质(1)至(3)中的2种以上不表达,并且上述蛋白质(4)至(6)中的2种以上不表达。
本发明提供一种小麦,所述小麦不具有上述蛋白质(1)至(3)所具有的酶活性中的2种以上酶活性,并且不具有上述蛋白质(4)至(6)所具有的酶活性中的2种以上酶活性。
本发明提供一种小麦,其中上述蛋白质(1)至(3)中的任意2种不表达,并且上述蛋白质(4)至(6)全部不表达。
本发明提供一种小麦,所述小麦不具有上述蛋白质(1)至(3)所具有的酶活性中的任意2种酶活性,并且不具有上述蛋白质(4)至(6)所具有的酶活性中的酶活性的全部。
本发明提供一种小麦,所述小麦中上述蛋白质(1)至(3)中的2种以上不表达,并且相比颗粒性淀粉合成酶蛋白质表达的组合与上述小麦相同、蛋白质(1)至(3)全部表达的小麦,淀粉糊化后的粘度较小。
本发明提供一种小麦,所述小麦中上述蛋白质(1)至(3)中的2种以上不表达,并且相比颗粒性淀粉合成酶蛋白质表达的组合与所述小麦相同、蛋白质(1)至(3)全部表达的小麦,淀粉糊化后的耐老化性提高。
另外,本发明提供一种特定小麦的筛选方法,其特征在于包括以下步骤,
检测下述基因变异体(7)至(9)中的1种以上的步骤:(7)在序列号1的淀粉合成酶II型-A1基因中,至少在位置124~412的碱基缺失及/或取代的淀粉合成酶II型-A1基因变异体;(8)在序列号3的淀粉合成酶II型-B1基因中,至少在位置6145~6146之间插入1个以上碱基的淀粉合成酶II型-B1基因变异体;及(9)在序列号5的淀粉合成酶II型-D1基因中,至少在位置2590~2652的碱基缺失的淀粉合成酶II型-D1基因变异体;及
检测以下蛋白质(4)至(6)中的1种以上的步骤:(4)序列号7的颗粒性淀粉合成酶-A1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-A1蛋白质;(5)序列号9的颗粒性淀粉合成酶-B1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-B1蛋白质;及(6)序列号11的颗粒性淀粉合成酶-D1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-D1蛋白质。
本发明提供一种小麦,其在除去胚的成熟种子中含有0.1重量%以上葡萄糖。
本发明提供一种小麦,其在除去胚的成熟种子中含有0.1重量%以上麦芽糖。
本发明提供一种小麦,其在除去胚的成熟种子中含有1重量%以上蔗糖。
此处,所谓成熟种子是指“穗头黄化,麦粒达到蜡状的硬度”(转作全书第1卷麦(农文协编)88页)时期的种子,并且没有发芽征兆。
本发明提供一种小麦,在支链淀粉的葡萄糖支链中,聚合度60以下的支链中,聚合度2~5的支链的数量的比例为3%以上。
本发明提供一种食品,所述食品含有上述小麦或来自上述小麦的淀粉。
本发明提供一种工业制品,所述工业制品含有上述小麦或来自上述小麦的淀粉。
本发明提供一种制品,所述制品利用上述小麦或来自上述小麦的淀粉加工而成。
具体实施方式
本发明的小麦不表达下述的全部蛋白质:(1)序列号1的淀粉合成酶II型-A1基因编码的淀粉合成酶II型-A1蛋白质;(2)序列号3的淀粉合成酶II型-B1基因编码的淀粉合成酶II型-B1蛋白质;(3)序列号5的淀粉合成酶II型-D1基因编码的淀粉合成酶II型-D1蛋白质;(4)序列号7的颗粒性淀粉合成酶-A1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-A1蛋白质;(5)序列号9的颗粒性淀粉合成酶-B1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-B1蛋白质;及(6)序列号11的颗粒性淀粉合成酶-D1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-D1蛋白质。
作为序列号1的淀粉合成酶II型-A1基因编码的淀粉合成酶II型-A1蛋白质(1)的例子,可以举出序列号2记载的序列表示的淀粉合成酶II型-A1蛋白质或与序列号2记载的序列的同源性为90%以上的淀粉合成酶II型-A1蛋白质。此处,使用Genetyx(Genetyx社)进行同源性计算。
作为序列号3的淀粉合成酶II型-B1基因编码的淀粉合成酶II型-B1蛋白质(2)的例子,可以举出序列号4记载的序列表示的淀粉合成酶II型-B1蛋白质或与序列号4记载的序列的同源性为90%以上的淀粉合成酶II型-B1蛋白质。
作为序列号5的淀粉合成酶II型-D1基因编码的淀粉合成酶II型-D1蛋白质(3)的例子,可以举出序列号6记载的序列表示的淀粉合成酶II型-D1蛋白质或与序列号6记载的序列的同源性为90%以上的淀粉合成酶II型-D1蛋白质。
作为由序列号7的颗粒性淀粉合成酶-A1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-A1蛋白质(4)的例子,可以举出序列号8记载的序列表示的颗粒性淀粉合成酶-A1蛋白质或与序列号8记载的序列的同源性为90%以上的颗粒性淀粉合成酶-A1蛋白质。
作为由序列号9的颗粒性淀粉合成酶-B1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-B1蛋白质(5)的例子,可以举出序列号10记载的序列表示的颗粒性淀粉合成酶-B1蛋白质或与序列号10记载的序列的同源性为90%以上的颗粒性淀粉合成酶-B1蛋白质。
作为由序列号11的颗粒性淀粉合成酶-D1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-D1蛋白质(6)的例子,可以举出序列号12记载的序列表示的颗粒性淀粉合成酶-D1蛋白质或与序列号12记载的序列的同源性为90%以上的颗粒性淀粉合成酶-D1蛋白质。
通过检测编码上述蛋白质(1)~(6)的基因的有无及变异,能够确认上述蛋白质(1)~(6)未表达。作为确认上述蛋白质(1)~(6)未表达的方法,只要是能够检测基因序列的变异的方法即可,可以为本领域技术人员所知的任何方法,例如可以举出PCR法等。
对PCR法没有特别限制,可以使用公知的各种改良方法,如果举例的话,可以举出除一对引物、模板(被检)DNA之外还混合Tris-HCl、KCl、MgCl2、各dNTP、TaqDNA聚合酶等试剂类而形成的PCR反应液。PCR的1次循环由热变性、引物的退火、DNA聚合酶作用下的DNA合成反应3个步骤构成。各步骤由于需要各不相同的反应温度和反应时间,所以要根据需要增幅的DNA区域的碱基序列和其长度,设定适当的范围。用于上述操作的热循环仪(thermal cycler)在市场上有售。如果对TaqDNA聚合酶、MgCl2浓度或反应循环数等优选的PCR条件进行研究、或使用嵌套式PCR(nested PCR),则能够进一步提高检测灵敏度。
PCR反应物可以使用免疫反应进行鉴定,也可以采用任意方法进行鉴定,使其进行电泳,必要时使用阳性对照或阴性对照,电泳像中能够确认清楚的条带时,就可以确认在被检物中存在检测物质(颗粒性淀粉合成酶基因及淀粉合成酶II型基因变异的小麦)。
作为PCR中使用的引物,只要能够检测出编码上述蛋白质(1)~(6)的基因的变异即可,可以使用任意引物。
作为淀粉合成酶II型基因变异体,本发明人等发现了(7)在序列号1的淀粉合成酶II型-A1基因中,至少位置124~412的碱基缺失及/或取代的淀粉合成酶II型-A1基因变异体(序列号27);(8)在序列号3的淀粉合成酶II型-B1基因中,至少在位置6145~6146之间插入1个以上碱基的淀粉合成酶II型-B1基因变异体(序列号28);及(9)在序列号5的淀粉合成酶II型-D1基因中,至少位置2590~2652的碱基缺失的淀粉合成酶II型-D1基因变异体(序列号29)。
因此,作为能够检测序列号1的淀粉合成酶II型-A1基因变异的引物,例如可以举出:
(i)其3′末端在序列号1的淀粉合成酶II型-A1基因区域的位置124的上游进行杂交的引物、和其5′末端在序列号1的淀粉合成酶II型-A1基因区域的位置412的下游进行杂交的引物的组合;
(ii)其3′末端在序列号1的淀粉合成酶II型-A1基因区域的位置412的下游跨越缺失部分124~412进行杂交的引物、和其5′末端在序列号1的淀粉合成酶II型-A1基因区域的位置412的下游进行杂交的引物的组合;及
(iii)其3′末端在序列号1的淀粉合成酶II型-A1基因区域的位置124的上游进行杂交的引物、和其5′末端在序列号1的淀粉合成酶II型-A1基因区域的位置124的上游跨越缺失部分124~412进行杂交的引物的组合。
并且,上述(i)、(ii)、(iii)引物优选设计成能够特异性地检出淀粉合成酶II型-A1基因区域。具体而言,是设计成与来自其他基因组的淀粉合成酶II型基因区域(淀粉合成酶II型-B1、淀粉合成酶II型-D1)完全不匹配的区域的引物。
具体而言,可以举出含有序列号13或14中任一个所记载的序列的引物、和含有序列号15至17中任一个所记载的序列的引物的组合。
另外,作为能够检测出序列号3的淀粉合成酶II型-B1基因的变异的引物,例如可以举出:
(i)其3′末端在序列号3的淀粉合成酶II型-B1基因区域的位置6145的上游进行杂交的引物、和其5′末端在序列号3的淀粉合成酶II型-B1基因区域的位置6146的下游进行杂交的引物的组合;
(ii)其3′末端与在序列号3的淀粉合成酶II型-B1基因区域的位置6145~6146之间插入的碱基进行杂交的引物、和其5′末端在序列号3的淀粉合成酶II型-B1基因区域的位置6146的下游进行杂交的引物的组合;
(iii)其3′末端在序列号3的淀粉合成酶II型-B1基因区域的位置6145的上游进行杂交的引物、和其5′末端与在序列号3的淀粉合成酶II型-B1基因区域的位置6145~6146之间插入的碱基进行杂交的引物的组合;及
(iv)其3′末端与在序列号3的淀粉合成酶II型-B1基因区域的位置6145~6146之间插入的碱基进行杂交的引物、和其5′末端在序列号3的淀粉合成酶II型-B1基因区域的位置6145~6146之间插入的碱基进行杂交的引物的组合。
并且,上述(i)、(ii)、(iii)、(iv)引物优选设计成能够特异性地检出淀粉合成酶II型-B1基因区域。具体而言,是设计成与来自其他基因组的淀粉合成酶II型基因区域(淀粉合成酶II型-A1、淀粉合成酶II型-D1)完全不匹配的区域的引物。
具体而言,可以举出含有序列号18或20中任一个所记载的序列的引物、和含有序列号21至23中任一个所记载的序列的引物的组合。
另外,作为能够检测序列号5的淀粉合成酶II型-D1基因变异的引物,例如可以举出:
(i)其3′末端在序列号5的淀粉合成酶II型-D1基因区域的位置2590的上游进行杂交的引物、和其5′末端在序列号5的淀粉合成酶II型-D1基因区域的位置2652的下游进行杂交的引物的组合;
(ii)其3′末端在序列号5的淀粉合成酶II型-D1基因区域的位置2652下游跨越缺失部分2590~2652进行杂交的引物、和其5′末端在序列号5的淀粉合成酶II型-D1基因区域的位置2652的下游进行杂交的引物的组合;
(iii)其3′末端在序列号5的淀粉合成酶II型-D1基因区域的位置2590的上游进行杂交的引物、和其5′末端在序列号5的淀粉合成酶II型-D1基因区域的位置2590的上游跨越缺失部分2590~2652进行杂交的引物的组合;
并且,上述(i)、(ii)、(iii)引物优选设计成能够特异性地检测淀粉合成酶II型-D1基因区域。具体而言,是设计成与来自其他基因组的淀粉合成酶II型基因区域(淀粉合成酶II型-A1、淀粉合成酶II型-B1)完全不匹配的区域的引物。
具体而言,可以举出含有序列号24或25中任一个所记载的序列的引物、和含有序列号26中的任一个所记载的序列的引物的组合。
另外,作为检测出编码上述蛋白质(4)~(6)的基因的变异的方法,可以使用Nakamura et.Al.,(2002)Genome 45:1150-1156记载的方法。
并且,作为检测编码上述蛋白质(1)~(6)的基因的变异的方法,除PCR法之外,还可以举出LAMP法、NASBA法、LCR法、SDA法、RCR法、TMA法、通过RT-PCR进行的mRNA的定性或定量法等。只要为能够检测该基因序列的变异的方法即可,可以使用任意方法,作为一例,可以举出LAMP法,以Notomi等人的报告(Notomi et.al.,Nucleic Acids Research(2000).28,No.12,e63)中给出的方法为参考,设计引物。此时,希望检测出的序列是(1)的序列时,可以将包括序列号13的位置124至412的区域作为检测区域,设计引物。另外,希望检测的序列是(2)的序列时,可以将序列号14的位置6145至6146的序列的一部分作为检测区域,设计引物。另外,希望检测的序列是(3)的序列时,可以将包括序列号15的2590至2652的区域作为检测区域,设计引物。除了设计的引物之外,还加入反应必需的模板DNA溶液、dNTP、BstDNA聚合酶、及其他反应所必需的试剂,在65℃下进行反应,采用适当的方法检测产物,由此能够进行淀粉合成酶II型基因变异小麦的检测、或淀粉合成酶II型基因类型小麦的判定。即使采用其他的方法,也可同样地按照操作手册来制备检测系统,进行相同的检测、判定。
另外,作为确认上述蛋白质(1)~(3)未表达的方法,可以举出山守等的报告(Yamamori et.al.,Theor.Appl.Genet(2000)101:21-29)中记载的方法。
作为确认上述蛋白质(4)~(6)不表达的方法,也可以使用特开平6-125669号中记载的方法。
上述本发明的小麦中,蓄积的淀粉的30重量%以上不形成粒径为10μm以上的淀粉颗粒。使用电子显微镜或光学显微镜,观察小麦种子胚乳的剖面,计算一定面积内10μm以上粒子占一定面积的比例,由此,可以计算出形成粒径为10μm以上的淀粉颗粒比例。或者,通过在淀粉精制过程中,分离不形成淀粉颗粒的级分和淀粉颗粒级分,测定其干燥重量,进行计算。通过降低形成粒径为10μm以上的淀粉颗粒的比例,可以使其容易被淀粉酶、支链淀粉酶等淀粉分解酶消化,成为易消化性淀粉。使用上述淀粉时,能够提供易于被消化、容易被体内吸收的食品。另外,由于淀粉形成淀粉颗粒之类高级结构(结晶化),所以即使在沸水中加热,也不完全糊化,但为本发明类型的淀粉时,由于不形成高级结构,因此,能够在较短时间、较低温度下实现糊化,是适合在更低温度下、短时间内进行处理的材料。如果能够在低温、短时间内进行加热处理,则具有能够显著地降低加热对其他材料的影响、或者实现节能等优点。并且,由于不形成粒子,所以优选作为膜等的原材料使用。
并且,上述本发明的小麦,在支链淀粉支链中,聚合度70以下的链中聚合度3~5的葡萄糖支链的数量的比例为1.5%以上。优选为3%以上。另外,上述本发明的小麦,聚合度60以下的链中,聚合度2~5的葡萄糖支链的数量的比例为3%以上。优选为5%以上。通过具有上述链长分布,能够使淀粉的结构发生较大变化。实际上,本发明通过制成上述类型的淀粉,能够不形成淀粉颗粒,并且使结构上的特性较大地改变。实际上,不能形成淀粉颗粒的糖成分作为由平滑连续层构成的基底物质蓄积,在淀粉精制过程中,形成凝胶样层等,对物性给与多方面影响。在通常淀粉精制过程中几乎未见凝胶样物质蓄积,可以将其用作例如膜之类工业制品的原料。
另外,由于上述凝胶样物质保水力非常高,所以也能够期待用作保水剂等。
或者,也可以用作表面的涂布剂。
需要说明的是,支链淀粉是由α-1,4键连接成直链的葡萄糖链通过用α-1,6键形成分支后键合而构成的巨大分子,支链淀粉分子之间,其分子量、分支的数量、长度均呈现多样性。所以,本发明所示的支链淀粉的葡萄糖支链的链长分布,表示蓄积在种子中的所有支链淀粉的平均分布。
并且,上述本发明的小麦的生淀粉在淀粉酶作用下的分解率为80%以上。优选为90%以上。热作用下不糊化的生淀粉状态下的分解性提高,使上述淀粉即使不进行加热处理也能高效且容易地被消化吸收。或者也可以用作生物分解性塑料的原料。
另外,本发明的其他小麦不具有下述蛋白质所具有的酶活性的全部,即(1)序列号1的淀粉合成酶II型-A1基因编码的淀粉合成酶II型-A1蛋白质;(2)序列号3的淀粉合成酶II型-B1基因编码的淀粉合成酶II型-B1蛋白质;(3)序列号5的淀粉合成酶II型-D1基因编码的淀粉合成酶II型-D1蛋白质;(4)序列号7的颗粒性淀粉合成酶-A1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-A1蛋白质;(5)序列号9的颗粒性淀粉合成酶-B1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-B1蛋白质;及(6)序列号11的颗粒性淀粉合成酶-D1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-D1蛋白质。
如上所述,上述(1)~(3)的蛋白质通常参与支链淀粉的支链(通过α-1,6键形成分支的葡萄糖聚合物)的合成、特别是参与聚合度为中等程度的链(聚合度为15~25左右的链)的合成。因此,一般认为该蛋白质的酶活性为:识别基质ADP-葡萄糖和支链淀粉,并与其结合,使葡萄糖从ADP-葡萄糖键合到支链淀粉的支链的末端。另一方面,认为上述(4)~(6)的蛋白质基本上参与直链淀粉的合成。因此,一般认为酶活性为:识别基质ADP-葡萄糖和直链淀粉,并与其结合,使葡萄糖从ADP-葡萄糖附加到延长中的直链淀粉的末端。
为了确认上述(1)~(6)蛋白质的酶活性,可以使用常用的任何方法。举出一例,从种子中精制上述酶,加入为基质的[U-14C]ADP-葡萄糖或糖原或者支链淀粉,再加入用于调整反应条件的成分,进行反应。一定时间的反应完成时,通过加热至100度使酶失活,使用阴离子交换柱除去未反应的[U-14C]ADP-葡萄糖后,使用液态闪烁计数管计测糖原或支链淀粉中含有的[U-14C]ADP-葡萄糖的量。作为其他方法,也可以使用下述方法,即,将从种子中粗精制得到的蛋白质级分或淀粉级分(蛋白质含量5-10μg)在从常用的SDS-PAGE中除去SDS和β-巯基乙醇的条件下进行丙烯酰胺凝胶电泳。将分离结束的凝胶浸渍在由50mM甘氨酸、100mM硫酸铵、5nMβ-巯基乙醇、5mMMgCl2、0.5mg/ml牛血清白蛋白、0.01mg/ml糖原或直链淀粉、4mMADP-葡萄糖构成的溶液中,放置4小时至12小时。之后,加入由0.2%碘、0.02%碘化钾构成的溶液,进行染色,判定酶活性。
另外,也可以使用如上所述确认蛋白质自身表达的方法、或识别使酶失活的基因组DNA上的变异的方法。在(1)至(3)的蛋白质中,所谓使酶失活的基因组DNA上的变异,可以举出在为酶基质的ADP-葡萄糖或支链淀粉的识别、键合部位上的变异、或在将葡萄糖转移至支链淀粉非还原末端的活性中心部位的变异、或存在于N末端的信号序列部位的变异等。在(4)~(6)的蛋白质中,所谓使酶失活的基因组DNA的变异,可以举出为酶基质的ADP-葡萄糖或直链淀粉的识别、键合部位的变异、或在将葡萄糖转移至直链淀粉非还原末端的活性中心部位的变异等。特别是,在通过放射线照射或给与变异原性化学物质进行变异诱导处理时,可能产生伴有仅1个残基氨基酸取代的变异。上述情况下通过SDS-PAGE确认时,通常难于识别,因此适用确认DNA上的变异的方法。确认DNA序列上的变异的方法如上所述。
另外,本发明的其他小麦不表达上述蛋白质(1)至(3)中的1个以上,并且不表达上述蛋白质(4)至(5)中的1个以上(但是不包括只有蛋白质(2)、(4)及(5)同时不表达的小麦。)。上述小麦,与现有小麦中蓄积的淀粉相比较,蓄积了被赋予新型特性的淀粉。作为新型特性,例如可以举出糊化液的粘度、糊化峰温度、耐老化性、冻结融解耐性、消化酶的分解性等的改变。特别是,在本发明中,发现通过缺失1个以上淀粉合成酶II型蛋白质,与不缺失类型相比糊化度升高,糊化液的粘度降低,老化度降低。另外发现,通过同时使1个以上颗粒性淀粉合成酶缺失,能够显著地改变上述效果。上述小麦中蓄积的淀粉,在糊化后冷却的时间点,可蓄积与现有相比糊化度高的淀粉或粘度低的淀粉、或耐老化性提高的淀粉。特别是,上述蛋白质(1)至(3)中的1个不表达,且上述蛋白质(4)至(6)中的2个不表达的小麦,与(1)至(3)全部表达、(4)至(6)中的2个不表达的小麦的淀粉相比,糊化后的耐老化性、冻结融解耐性显著改善。或者,上述(1)至(3)蛋白质中的2个不表达、且上述蛋白质(4)至(6)全部不表达的小麦,糊化液的粘度非常低。为了确认上述小麦,可以使用检测编码上述蛋白质(1)至(6)的基因的有无及变异,进行确认的方法,也可以使用确认蛋白质自身表达的方法。或者也可以使用将由序列号1至11记载的基因序列表达的RNA进行精制、定性或定量的方法。
优选上述蛋白质(1)至(3)中的任意2个不表达,并且上述蛋白质(4)至(6)中的1个以上不表达的小麦。上述小麦,特别是糊化后的粘度与现有小麦相比显著降低。此特征,在(1)至(3)蛋白质中的2个不表达、且上述蛋白质(4)至(6)全部不表达的小麦中特别显著。
另外,优选上述蛋白质(1)至(3)中的2个以上不表达,并且上述蛋白质(4)至(6)中的2个以上不表达的小麦。上述小麦,特别是糊化后的耐老化性与现有小麦相比有所提高。此特征,在上述蛋白质(1)至(3)中的任意2个不表达、且上述蛋白质(4)至(6)全部不表达的小麦中特别显著。
本发明的其他小麦不具有上述蛋白质(1)至(3)所具有的酶活性中的1种以上酶活性,并且不具有上述蛋白质(4)至(6)所具有的酶活性中的1种以上酶活性(但,不包含只不显示蛋白质(2)、(4)及(5)所具有的酶活性的小麦。)。
较优选不具有上述蛋白质(1)至(3)所具有的酶活性中的2种以上酶活性,并且不具有上述蛋白质(4)至(6)所具有的酶活性中的2种以上酶活性的小麦。
进一步优选不具有上述蛋白质(1)至(3)所具有的酶活性中的任意2种酶活性,并且不具有上述蛋白质(4)至(6)所具有的酶活性中的1个以上酶活性的小麦。
更优选不具有上述蛋白质(1)至(3)所具有的酶活性中的任意2种酶活性,并且不具有上述蛋白质(4)至(6)所具有的酶活性的全部的小麦。
另外,通过使小麦的上述蛋白质(1)至(3)中的2个以上不表达,与颗粒性淀粉合成酶蛋白质的表达组合与上述小麦相同、蛋白质(1)至(3)全部表达的小麦相比较,使淀粉糊化后的粘度降低。
另外,通过使小麦的上述蛋白质(1)至(3)中的2个以上不表达,与颗粒性淀粉合成酶蛋白质的表达组合与上述小麦相同、蛋白质(1)至(3)全部表达的小麦相比较,使淀粉糊化后的耐老化性提高。
由此可知,可以通过使用下述步骤来筛选特定的小麦,即检测上述基因变异体(7)至(9)中的1个以上的步骤、及检测上述蛋白质(4)至(6)中的1个以上的步骤。此处,作为特定小麦,可以举出生淀粉的分解率为80%以上的小麦,即完全不具有上述(1)至(6)蛋白质的小麦。或者,可以举出糊化液的粘度非常低的小麦,即上述(1)至(3)蛋白质中的(1)及(2)未表达、且(4)至(6)蛋白质均未表达的小麦。
本发明的小麦或来自本发明小麦的淀粉可以用于食品中。作为上述食品,可以举出使用普通小麦粉(包含全粒粉)或淀粉的食品等。例如可以举出用作焙烤食品(Bakery foods)、面条类、糕点类、油炸食品、烧烤食品、豆沙点心、汉堡等的材料。由该小麦得到的面粉或淀粉可以直接使用,也可以与其他粉类混合使用。另外,也可以用作酒精饮料等的发酵原料、用于氨基酸或多糖等的微生物生产的原料。
作为利用本发明的小麦制作的焙烤食品,例如可以举出主食面包、法式面包、面包卷、带馅面包等面包类,酵母油炸甜圈饼等油炸面包类、馒头类、披萨饼等意大利馅饼类、松糕等蛋糕类,小甜饼、饼干等烘焙食品类等。制作上述焙烤食品时使用的来自本发明小麦的面粉,可以使用经过通常的制粉步骤除去麦麸等成分的面粉,也可以使用未分开的全粒粉。作为用于制作上述焙烤食品的焙烤食品用面粉,可以直接使用从本发明小麦得到的上述面粉,优选与其他面粉混合使用。所谓其他面粉,可以举出强力粉、中力粉、薄力粉等小麦粉,或者不分类的来自小麦的面粉、黑麦粉、米粉、淀粉等。本发明的焙烤食品可以如下制作,即,在由本发明的小麦得到的面粉或与其他面粉的混合面粉中配合酵母、碳酸氢钠等化学膨胀剂、酵母食品、食盐、糖类、油脂类、鸡蛋、乳制品、水等通常焙烤食品制作中使用的各种副原料,将所得物混炼做成生面团,通过发酵等使其膨化,或直接焙烤或油炸制作焙烤食品。制作本发明的焙烤食品时,可以使用通常采用的生产方法、制作装置、冻结方法、冻结装置中的任意一种。另外,必要时可以加入维生素、矿物营养素等添加剂。
如上所述制作的含有来自本发明小麦的面粉的焙烤食品,甘甜、风味独特、香气十足、有咬劲儿。上述特征在只使用来自本发明小麦的面粉时也能获得,可以与其他面粉混合使用获得该特征,优选含有0.1~60质量份、更优选含有0.5~50质量份来自本发明小麦的面粉。
另外,本发明的小麦或来自本发明小麦的淀粉可以用于工业制品。作为上述工业制品,可以举出粘度稳定剂、保水剂、胶体稳定剂、糊、粘合剂等。
另外,本发明的小麦或来自本发明小麦的淀粉可以加工利用。例如可以举出通过酸或碱、或者酶处理生成糊精,将此糊精用于粘合剂、纤维、膜等的方法。另外,该糊精中的水溶性级分可以作为难消化性糊精用作整肠作用等优异的功能性食品。或者使其与各种无机、有机酸反应,形成淀粉酯加以利用。特别是与磷酸反应得到的磷酸淀粉作为增稠剂是有用的。
另外,蛋白质(1)~(6)都不表达的小麦,与普通小麦相比,糖含量增加。具体而言,除去胚的成熟种子中含有0.1重量%以上的葡萄糖。优选除去胚的成熟种子中含有0.3重量%以上的葡萄糖。更优选除去胚的成熟种子中含有0.5重量%以上的葡萄糖。另外,除去胚的成熟种子中含有0.1重量%以上的麦芽糖。优选除去胚的成熟种子中含有0.3重量%以上的麦芽糖。更优选除去胚的成熟种子中含有0.5重量%以上的麦芽糖。另外,除去胚的成熟种子中含有1重量%以上的蔗糖。优选除去胚的成熟种子中含有3重量%以上的蔗糖。更优选除去胚的成熟种子中含有5重量%以上的蔗糖。
作为种子中葡萄糖、麦芽糖及蔗糖含量的测定方法,只要为用于从种子中提取低分子糖进行分析的方法即可,可以使用任意方法。作为从种子中回收低分子糖的方法,可以将种子粉碎后,用水提取、用80%乙醇提取、用DMSO提取等,但操作中为了明确地区分淀粉或多糖与在淀粉酶等酶的作用下分解生成的糖,优选在淀粉酶不发挥作用的条件下进行提取、测定。另外,本发明为小麦胚乳部分以高含量蓄积糖的小麦,所以其测定中优选使用从种子颗粒中除去胚的部分作为样品。作为提取的样品所含的低分子糖的鉴定、定量的方法,可以使用下述方法中的任意一种,即,使用毛细管电泳的方法、或者使用HPLC的方法、利用酶、化学反应进行的测定方法等。
本发明的小麦中还包括下述小麦,即,通过使上述小麦与其他品种杂交得到的F1子代进一步进行自身受精或者与一方的亲代系统进行回交,导入其它有用的形质而得到的小麦。例如,可以使通常所知的耐病性高的品种和上述小麦杂交,所得的F1子代与亲代系统中耐病性高的品种进行回交。对于所得子代的个体,根据上述方法,筛选出颗粒性淀粉合成酶和淀粉合成酶II型的各蛋白质以所期望的组合表达的个体。对于筛选出的个体,通过进一步反复回交和筛选,能够赋予耐病性高的品种所期望的淀粉特性。或者,以进行回交的亲代系统作为上述小麦,使用适当的方法进行筛选,由此也能够赋予上述小麦耐病性。作为其它有用形质,可以举出面筋特性、耐倒伏性、秋播性、春播性、多收性、耐低温性、耐穗发芽性、制粉适应性等,但并不限定于此。
实施例
1、样品
本发明开发的小麦系统的颗粒性淀粉合成酶及淀粉合成酶II型蛋白质的类型,与作为比较对照的标准系统(类型(i))或者亲代系统(类型(ii)及类型(iii))一同示于表1。本发明中作为亲代系统使用的小麦系统是将东北农业研究中心培育的小麦品种乙女糯(颗粒性淀粉合成酶缺失型、淀粉合成酶II型蛋白质为野生型)和外来品种杂交,用其F5子代的种子筛选颗粒性淀粉合成酶缺失的系统(类型(ii))。另一方的亲代系统,使用该所培育的淀粉合成酶II型蛋白质缺失系统。此系统顺次杂交作为通常所知系统的关东79号(淀粉合成酶II型-B1缺失型)和作为外国品种的Turkey116(淀粉合成酶II型-D1缺失型)、Chosen57(淀粉合成酶II型-A1缺失型)3品种,筛选淀粉合成酶II型完全缺失的系统(类型(iii))。
小麦的栽培、杂交按照规定方法进行。杂交为亲代系统的2品种,得到F1子代。使其自身受精得到F2或者得到之后的子代,通过二维电泳确认颗粒性淀粉合成酶的有无,并通过PCR法分辨淀粉合成酶II型基因的基因型(野生型或变异型),由此从其中筛选出所期望的小麦系统。作为比较对照使用的小麦系统,使用作为一般栽培流通的品种的农林61号(类型(i))。
[表1]
表1通过杂交获得的各种子系统的基因类型
颗粒性淀粉合成酶-A1 | 颗粒性淀粉合成酶-B1 | 颗粒性淀粉合成酶-D1 | 淀粉合成酶II型-A1 | 淀粉合成酶II型-B1 | 淀粉合成酶II型-D1 | 备注 | |
(i) | ○ | ○ | ○ | ○ | ○ | ○ | 野生型 |
(ii) | × | × | × | ○ | ○ | ○ | (iv)~(x)的亲代系统 |
(iii) | ○ | ○ | ○ | × | × | × | (iv)~(x)的亲代系统 |
(iv) | × | × | ○ | ○ | ○ | ○ | |
(v) | × | ○ | × | ○ | × | ○ | |
(vi) | × | × | × | × | × | ○ | |
(vii) | × | × | × | × | × | × | |
(viii) | × | ○ | × | ○ | × | × | |
(ix) | × | × | ○ | ○ | × | × | |
(x) | × | × | × | ○ | × | × |
颗粒性淀粉合成酶的野生型、缺失型通过淀粉键合蛋白质的二维电泳进行确认。方法如下所示。
从成熟种子中除去胚,粉碎后通过60μm的筛子得到粉末,备用。以每20mg粉1mL的比例加入冷却的SDS缓冲液(0.1M Tris-HCl(pH6.8)、2.3%SDS、5%β-巯基乙醇、10%甘油),均化2分钟。过滤此悬浊液后,将滤液以15000rpm离心5分钟,除去上清液,再加入SDS缓冲液使其悬浊,进行离心。将此操作重复3次后,加入蒸馏水,将相同的操作重复2次,除去上清液,将回收的淀粉层自然干燥,制成精制淀粉。
为通常类型的淀粉时,在上述淀粉的精制中,加入SDS缓冲液,过滤后,在离心阶段大部分淀粉沉淀,由此形成淀粉颗粒层,与上层的水层明显分开。本发明的类型(vii)小麦在此阶段认为是淀粉颗粒层的部分仅极少量沉淀,在其上层大量地蓄积了由白浊不定形的凝胶样物质构成的层,并且在其上层形成水层。除去水层后,混合为糖成分的此凝胶样层和最下层的淀粉颗粒层,之后的操作与上述精制方法相同。
每10mg此精制淀粉,加入300μl的Lysis缓冲液(8M Ura、2%Nonidet P-40、2%ampholine(pH3.5-10)、5%β-巯基乙醇、5%聚乙烯吡咯烷酮),在100度的热水中加热处理2分钟。用冰冷却10分钟后,将淀粉凝胶化液在4度下以15000转离心10分钟,将200μl其上清液用于二维电泳。一维电泳进行3.5%丙烯酰胺凝胶构成的IEF,二维电泳进行15%双丙烯酰胺凝胶构成的SDS-PAGE。
颗粒性淀粉合成酶检测结果如图1所示。在图1A所示位置分别检测出颗粒性淀粉合成酶-A1、B1、D1,类型(vii)小麦系统中全部条带都未检出(图1B)。因此,类型(vii)的小麦完全缺失颗粒性淀粉合成酶。
淀粉合成酶II型的确认,使用已经由本发明人等开发(特愿2004-153904)的方法。方法如下所示。使种子发芽,使用Qiagen社制DNeasy plant mini试剂盒,对来自幼叶的基因组DNA进行处理。取100mg发芽种子的幼叶,在液氮中磨碎成粉末状。将磨碎的样品移至1.5ml试管中,之后加入试剂盒中附带的缓冲液AP1和RNase溶液,在65度下加热10分钟。然后加入缓冲液AP2,在冰上放置5分钟后,通过离心操作除去析出的沉淀物。在上清液中加入缓冲液AP3混合,之后全部用于mini spin column,进行离心操作,使DNA吸附在膜上。用缓冲液AW洗涤2次后,加入缓冲液AE,放置5分钟,通过离心回收DNA溶液。
采用PCR法确认编码3个淀粉合成酶II型的基因序列上产生的序列变异。所用引物序列如下所示。
淀粉合成酶II型-A1 SSIIAF1:GCGTTTACCCCACAGAGC
(序列号13)
SSIIAR1:ACGCGCCATACAGCAAGTCATA
(序列号17)
淀粉合成酶II型-B1:SSIIBF1:ATTTCTTCGGTACACCATTGGCTA
(序列号20)
SSIIBR1:TGCCGCAGCATGCC(序列号23)
淀粉合成酶II型-D1 SSIIBF1:
GGGAGCTGAAATTTTATTGCTTATTG(序列号24)
SSIIBR1:TCGCGGTGAAGAGAACATGG(序列号26)
PCR反应液如下进行调制。反应中使用LA Taq(TACARA Bio公司)。引物使用FASMAC社制引物。
10×LA Taq缓冲液 | 2μl |
dNTP | 0.2mM |
Mg(Cl)2 | 2.25mM |
引物1 | 0.25μM |
引物2 | 0.25μM |
基因组DNA | 1ng/μl |
LA Taq | 0.025U/μl |
总计 | 20μl |
PCR扩增装置使用GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems公司),反应条件如下设定。
第1步 | 98℃ | 5min |
第2步 | 98℃ | 30sec |
(40次循环) | 65℃ | 30sec |
74℃ | 1min | |
第3步 | 74℃ | 5min |
第4步 | 4℃ |
将PCR扩增反应液供给到3%琼脂糖凝胶电泳后,进行溴化乙锭染色,通过确认由各引物产生的最适大小的DNA扩增条带,判定样品中有无野生型及变异型基因。类型(i)的对照品种及类型(vii)小麦的基因型判定的结果如图2所示。类型(vii)中,3个淀粉合成酶II型基因全部为变异型。由此可知,类型(vii)的小麦完全缺失颗粒性淀粉合成酶及淀粉合成酶II型。
(通过SDS-PAGE确认淀粉合成酶II型和颗粒性淀粉合成酶缺失)
通过SDS-PAGE确认各样品中的淀粉合成酶II型蛋白质和颗粒性淀粉合成酶蛋白质的表达。每1mg由类型(i)、类型(ii)、类型(iii)及类型(vii)精制的淀粉中加入14μl SDS缓冲液,煮沸5分钟后,冰浴冷却2分钟。4℃下以15,000rpm离心5分钟后,回收上清液,作为SDS-PAGE用样品。SDS-PAGE中,使用丙烯酰胺溶液终浓度为12.5%的丙烯酰胺凝胶,丙烯酰胺溶液是丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺以30∶0.135的比率混合得到的混合物,除此之外根据规定方法进行电泳。泳动后蛋白质的检测使用银染色试剂盒(第一化学药品)。
根据上述结果,也可以确认类型(vii)中不具有淀粉合成酶II型及颗粒性淀粉合成酶蛋白质(图13)。
2、蓄积的淀粉中未形成粒径10μm以上的淀粉颗粒的淀粉的比例
计算蓄积的淀粉中未形成粒径10μm以上的淀粉颗粒的淀粉的比例时,在上述淀粉的精制中,用SDS缓冲液洗涤和用水洗涤后,用刮刀分离凝胶样层和最下层的淀粉颗粒层。将各级分移至预先称重的1.5ml试管中,测定湿重。通过自然干燥使样品干燥后,测定干燥重量。为通常类型的淀粉时,淀粉颗粒层约100%,几乎不形成凝胶样层。与此相反,来自本发明的类型(vii)小麦的淀粉颗粒层的干燥重量为22mg,相对于此,凝胶样层的干燥重量为13mg。因此,回收的淀粉级分的总重量中所含的凝胶样层的重量为约37%。
3、电子显微镜观察
用类型(vii)小麦系统生产的种子的电子显微镜照片如图3所示。将成熟小麦种子粗粉碎,用电子显微镜(Keyence社)观察其断裂面。与类型(i)的野生型淀粉比较,类型(vii)的淀粉颗粒为扁圆形,数量也少,大部分由平滑的基底物质构成。
4、链长分布解析
4.1
构成类型(i)、类型(ii)、类型(iii)及类型(vii)淀粉中所含支链淀粉的葡萄糖支链的链长分布解析结果如图4~6所示。方法如下所示。秤量精制淀粉,每1mg淀粉加入60μL的250mM NaOH,煮沸20分钟,使其完全糊化。冷却后,加入乙酸1.9μL、50mM乙酸钠缓冲液(pH4.0)240μL、2%叠氮化钠3.75μL后,加入1μL异淀粉酶(Nacalai社),在37℃下边搅拌边反应16小时。反应结束后,煮沸20分钟,酶失活后,在20℃下以14000rpm离心2分钟,取得上清液,加入树脂(Bio-Rad社制),进行脱离子。离心使树脂沉淀后,将上清液移至新的试管中,采用Park-Johnson法的改良法(生物化学实验法19“淀粉·相关糖质实验法”中村道德·贝沼圭二编学会出版中心,P123)对通过酶处理生成的寡糖的浓度进行定量。适当地稀释试样溶液,向50μl稀释溶液中,加入25μl的0.1%铁氰化钾和25μl氰化钾溶液(将0.48g Na2CO3、0.92g NaHCO3、0.065g KCN溶解于水中,配成100ml的溶液),加栓密封,在沸水中加热15分钟。之后,冰上冷却10分钟,加入125μl的0.3%铁明矾溶液(将1.5gFe·NH4(SO4)2·H2O溶解于500ml的50mM硫酸中所得的溶液),在室温下放置20分钟后,测定715nm处的吸光度。对浓度在0至10mM之间改变的葡萄糖溶液进行相同的处理,根据测定值制作标准曲线,使用该标准曲线,对试样溶液中的还原末端基团进行定量。分别量取各样品大约5nmol,进行真空离心干燥,作为链长分布解析用试样。链长分布解析中使用Beckman社制PA糖链解析试剂盒。向干燥的样品中加入2μl麦芽糖质量控制/迁移率标记物(maltose quantitativecontrol/mobility marker),再进行真空离心干燥。向干燥的样品中加入1M氰基硼氢化钠溶液2μL,再加入APTS标记试剂。在37℃下于暗处反应4小时,加入46μL蒸馏水,停止反应。进而,从此样品中取出5μL,用蒸馏水稀释至40倍,制成测定用样品。葡萄糖聚合度不同的寡糖的分离定量,使用Beckman社毛细管电泳装置PACEsystem5000。分离用毛细管使用eCAP N-CHO毛细管,在高压下经5秒钟注入样品后,使用eCAP糖分析凝胶缓冲液,在30kV下进行电泳30分钟。根据所得的峰图谱,计算葡萄糖聚合度3以上70以下的寡糖的各峰面积,以峰面积的总和为100%,求出各峰所占面积的比例。以由类型(i)的小麦系统得到的图案为标准,将从各样品对应的峰的比例中减去相当于类型(i)的峰的比例得到的值,制成图表。类型(vii)与为标准系统的类型(i)相比,聚合度3至10的葡萄糖侧链的比例显著增加,相反聚合度11至24的葡萄糖侧链的比例降低(图4)。
显然不同于为亲代系统的类型(ii)(图5)或者类型(iii)(图6)的图。认为特别是直链淀粉含量为1%以下且聚合度为3至5的葡萄糖侧链的比例降低使得不能得到淀粉颗粒结构的糖成分构成平滑的基底物质。
4.2
从种子中除去胚,用乳棒和乳钵粉碎后,移至1.5ml试管中。每1mg粉碎的种子重量加入50μl的100%DMSO。加栓密封,煮沸30分钟,使其完全糊化,经离心除去不溶性成分。向20μl所得样品溶液中加入0.5M乙酸钠缓冲液(pH4.0)2μl、7单位异淀粉酶(Nacalai社),用水混合至100μl(反应1)。
同时,此反应液中使用经预先煮沸而失活的异淀粉酶,对该样品进行处理,作为用于测定样品中预先含有的游离状态寡糖的样品(反应2)。在37℃下反应16小时以上,之后煮沸5分钟,使异淀粉酶失活,对于反应1,通过反应生成的葡萄糖支链的浓度,可以根据Park-Johnson法的改良法(上述)进行计算,将相当于10hmol寡糖的溶液量进行真空离心干燥。对于反应2,将与反应1中所求出的溶液量相等量的溶液进行干燥。之后,加入1M氰基硼氢化钠(THF中)溶液2μl,再加入2μl的APTS标记试剂,在暗处于60℃下反应90分钟。加入46μl水,停止反应,再用水稀释至40倍,制成测定用样品。按照与上述相同的方法进行使用PACE system 5000的解析。从由反应1得到的各葡萄糖支链的峰面积值中减去由反应2得到的对应峰的面积值,由此计算出通过异淀粉酶处理生成的葡萄糖支链的值。计算出聚合度1以上、60以下的支链的面积值,以总和为100%,求出各峰所占的面积的比例。
与类型(i)相比,类型(vii)中聚合度2至5的支链的比例明显增加(图7及8)。实施例的图4是对聚合度3以上的支链的解析,本实施例中,不使用与聚合度2的峰重叠的麦芽糖质量控制/迁移率标记物进行解析,聚合度2的支链的峰面积也变得清楚。结果为类型(vii)中聚合度2的峰也比类型(i)显著增高。
另外,类型(ii)的支链淀粉具有与类型(i)几乎相同的结构(图5),支链淀粉的链长结构几乎没有变化。与此相反,与类型(ii)粘性相同的类型(vi)、(x)(图12)与类型(ii)相比聚合度约为2至10的支链的比例增加,聚合度为11至25的链减少。表明在支链淀粉结构中存在变化,结果DSC中的糊化峰温度降低,糊化后溶液粘度下降。
5、直链淀粉含量的测定方法
测定各小麦系统的淀粉中直链淀粉含量。测定方法如下所示。每1mg精制淀粉,加入25μl乙醇,再加入1M氢氧化钠溶液225μl,在沸水中加热10分钟,使淀粉糊化。用水将此糊化液稀释10倍,分取50μl用于测定。向其中加入1M乙酸10μl、碘液20μl、水920μl,充分混合,在27度下放置20分钟后,测定620nm处的吸光度。另外,将来自马铃薯的直链淀粉作为制作标准曲线用试样,来自糯玉米(Waxycorn)的淀粉(不含直链淀粉的淀粉)作为空白,将上述淀粉进行相同的处理。从各试样的吸光度中减去由糯玉米求出的吸光度的值,套用到标准曲线的数据中,由此测定各试样的直链淀粉含量。
6、生淀粉在α-淀粉酶作用下的分解
对生淀粉经α-淀粉酶处理而消化产生的分解性进行如下研究。实施的方法,按照以“淀粉·相关糖质实验法、P189~P192”为参考经改良的方法进行。秤量来自类型(i)、(ii)、(iii)、(vii)小麦系统的生淀粉,用水调制成为1%悬浊液。将平均20μL此悬浊液分为3瓶(I、II、III),I和II中加入0.8M乙酸缓冲液(pH6.0)230μL。III中加入10μL的2M NaOH后,在50℃下加热5分钟,制成完全糊化的淀粉样品。用20μL的1M乙酸中和后,加入0.8M乙酸缓冲液(pH6.0)200μL。之后,向I、III中加入α-淀粉酶(Megazyme社制)10U。向II中等量加入将相同的α-淀粉酶煮沸20分钟失活的溶液。全部样品在40℃下边搅拌边进行反应。12小时后,将反应液用水稀释5倍,保存在4℃下使反应停止。经α-淀粉酶处理生成的寡糖采用上述Park-Johnson法的改良法进行定量。根据下式计算生淀粉的分解率。
(I-II)/(III-II)*100
7、糊化度
对加热糊化后,冷却至室温时的溶液白浊程度及糊化度进行调查。方法采用以“淀粉·相关糖质实验法、P189~P192”为参考改良的方法如下进行。秤量类型(i)、(iii)、(iv)、(v)的精制淀粉,用水调制成为1%的悬浊液。将平均20μL此悬浊液分成3瓶(I、II、III)、I和II煮沸20分钟,冷却至室温。通过目测确认此时各样品的白浊程度。然后,在4℃下保存2小时后,加入0.8M乙酸缓冲液(pH6.0)230μL。III中加入10μL的2M NaOH后,煮沸5分钟,冷却至室温后,用1M乙酸20μL中和,之后加入200μL的0.8M乙酸缓冲液(pH6.0)。然后,向I、III中各加入β-淀粉酶(SIGMA社制)及支链淀粉酶(Pullulanase)(林原生物化学研究所制)5μL。向II中等量加入将同种酶煮沸20分钟使其失活的溶液。全部样品在40℃下边搅拌边进行反应。30分后,将反应液用水稀释5倍,在4℃下进行保存,使反应停止。经酶处理生成的寡糖根据上述Park-Johnson法的改良法进行定量。计算各样品的寡糖浓度后、根据下式计算糊化度。
(1-II)/(III-II)*100
8、粘度
来自各小麦系统的淀粉糊化后,测定冷却至60度时的溶液的粘度。测定方法如下所示。秤量精制淀粉,用蒸馏水配制成4%淀粉悬浊液。在沸水中煮沸20分钟,保存在60℃下。将100μL此糊液移至垂直竖立的内径1mm的玻璃管中,测定液面前端落下5cm的距离所需要的时间。另一方面,将糯玉米(丰年社制)调制成由2%起间隔0.5%直至7.5%的各种浓度的淀粉溶液,将上述淀粉溶液相同地进行糊化、保温,与上述相同地测定落下速度,制作标准曲线。另一方面,使糯玉米以相同的浓度,通过快速粘度分析仪(Rapid Visco Analyser)测定糊化后60℃下的粘度,使用其制作标准曲线。通过在使用糯玉米制作的标准曲线中套用来自各种小麦的淀粉溶液在60℃下的落下速度,计算相对粘度。
9、糊化后的冻结融解耐性
如下进行冻结融解耐性的研究。在各试样的精制淀粉中加入水,制成5%的淀粉悬浊液。煮沸20分钟,将淀粉悬浊液糊化后,冷却至室温,首先观察此时糊化液的状态。冷却至室温,白浊化,得到凝胶化样品,根据其程度评价为“高”、“中”、“低”。另外,未见白浊和凝胶化的样品评价为“未白浊”。将上述糊液或者凝胶化的样品在-80℃下冷冻1小时后,在25度下融解30分钟,将此操作重复10次后,观察样品状态。在第10次的融解结束时凝胶化的样品评价为“×”,凝胶化程度低的样品评价为“△”,几乎未见凝胶化的样品评价为“○”。
各类型小麦的淀粉的上述特性评价结果汇总于下表2中。
[表2]
对于类型(vii)进行阐述,如上所述由于糖成分不能取得淀粉颗粒结构,所以一般认为易于受到α-淀粉酶之类分解酶的影响,生淀粉的分解性显著增加。以上述糖成分为主要成分的类型(vii)小麦系统在作为食品使用时的加工性、或者消化性方面,可以提供与现有完全不同的应用方法。具体而言,可以举出易消化性面包、面条、或者点心类等。另外,优选用作饲料用作物。另外,与形成淀粉颗粒的系统相比,加工时的糊化能量非常少即可。即,可以在低温下烹调,将加热给与其它食物成分的影响抑制在最小限度。总之由于糊化后的冻结融解耐性也十分优异,所以特别适用于冷藏、冷冻保存用食品。进而,类型(vii)淀粉在淀粉精制时吸水性与其他淀粉相比非常高。吸水量高时,作为凝胶化剂使用时,用少量即可吸收大量水分。或者用于果冻状食品时也可以用少量进行调制。另外,还可以用于难消化性淀粉的制作。
已知直链淀粉的含量因合成其的颗粒性淀粉合成酶基因的组合不同而不同。另一方面,如上所述使淀粉合成酶II型全部缺失时,与野生型相比直链淀粉含量显著增加(类型(iii))。由此可知,颗粒性淀粉合成酶的组合相同时,同时使淀粉合成酶II型缺失1至2个时,表观直链淀粉含量增加,但实际上表观直链淀粉含量为几乎相同程度的值(比较类型(iv)和类型(ix)、类型(v)和类型(viii)),或虽然少数但有降低倾向(未给出数据)。
耐老化性(“白浊程度”高的类型耐性差)的研究中,即使颗粒性淀粉合成酶的类型相同,同时使淀粉合成酶II型缺失时,耐性也将提高(比较类型(iv)和类型(ix)、类型(v)和类型(vii))、糊化后的糊液的相对粘度降低(比较类型(ii)和类型(vi)、(vii))。
由此可知,通过不仅使颗粒性淀粉合成酶缺失,而且同时使1个以上的淀粉合成酶II型缺失,能够制作直链淀粉含量与现有各种低直链淀粉含量小麦程度相同且耐老化性提高的小麦,或者糊化后的糊液粘度降低的小麦。另外,在使淀粉合成酶II型缺失2个以上时具有更大的效果。低直链淀粉小麦作为面条用粉广为使用,糊化、老化特性的改良可以给上述用途带来改善效果。另外,也可以用于饺子、馒头等的皮等。
另外,本发明的类型(vi)小麦是颗粒性淀粉合成酶全部缺失、淀粉合成酶II型只表达1个的类型,与类型(ii)小麦相比,粘度显著降低。已知类型(ii)小麦糊化后冷却时的糊液的粘度低,类型(vi)具有粘度低于上述粘度水平的新型特性。
以上数据表明,可以筛选出蓄积下述类型的淀粉的小麦系统,即目前根据有无颗粒性淀粉合成酶的表达进行的小麦系统的筛选无法筛选出的类型。
本发明提供一种含有新型淀粉的六倍体小麦,应用本发明可以制作具有相同效果的四倍体小麦。很早以前人们就已经知道由六倍体小麦和四倍体小麦的杂交后代可以得到四倍体小麦。因此颗粒性淀粉合成酶和淀粉合成酶II型以所期望的组合表达的本发明小麦和四倍体小麦杂交,通过组合上述筛选方法,可以从其后代中,筛选出以所期望组合具有颗粒性淀粉合成酶和淀粉合成酶II型的四倍体小麦。四倍体小麦可以举出硬质小麦等。
10、麦芽糖及葡萄糖含量的测定
测定使用的种子样品,与糖含量测定用样品不同,事先轻度粉碎,135℃下干燥2小时,由干燥前后的重量变化事先计算出水分含量。
将类型(i)及类型(vii)小麦的除去了胚的成熟种子在液氮中磨碎,每10mg重量的磨碎的粉加入1ml的DMSO充分混合,一边经常搅拌一边静置于室温下。1.5小时后以13,000rpm离心5分钟,将上清液移至新试管中。煮沸10分钟后,准确量取一定量,进行真空干燥(DMSO提取样品)。
另外,将类型(i)及类型(vii)小麦的除去了胚的干燥种子在液氮中磨碎后,每10mg重量的粉加入1ml的80%乙醇,密闭煮沸20分钟。冷却后,以10,000rpm离心5分钟,准确量取一定量,进行真空干燥(乙醇提取样品)。
与链长分布解析中所述方法相同地在上述样品中加入1M氰基硼氢化钠溶液2μl、APTS标记试剂2μl,在37℃下于暗处反应4小时后,加入46μl蒸馏水,使反应停止。进而用蒸馏水稀释至40倍,作为测定用样品。在分析装置及条件与链长分布解析中所述方法相同的条件下测定。以预先使用标准物质制成的标准曲线为基础,根据葡萄糖及麦芽糖的峰面积计算浓度,计算每单位种子干燥重量的各糖浓度,进行样品间的比较。
11、蔗糖含量的测定
将类型(i)及类型(vii)小麦的除去了胚的成熟种子在液氮中磨碎后,每10mg重量的粉加入1ml的80%乙醇,加盖密闭,煮沸20分钟。冷却后,以10,000rpm离心5分钟,准确量取一定量上清液,进行真空干燥。加入与干燥前的体积相同的量的灭菌水,溶解样品后,通过0.45μm的过滤器过滤,进而将用截留分子量10,000的超滤膜过滤得到的样品作为蔗糖测定溶液。样品中的蔗糖含量的分析使用HewlettPackard社制HP毛细管电泳装置,使用市售的缓冲液(用于HPCE的碱性阴离子缓冲液(Agilent社))及毛细管(CE标准毛细管(50μm、104cm)(Agilent社))进行分离。参照预先使用市售蔗糖制作的标准曲线,计算样品中的蔗糖含量,进行样品间的比较。
(糖含量测定的结果)
与作为与商业上广为使用的小麦类型相同的类型(i)相比,类型(vii)中葡萄糖的含量至少为5倍以上、麦芽糖的含量至少为10倍以上、蔗糖的含量至少为2倍以上。另外,类型(vii)的种子含有上述糖至吃起来感觉甘甜的水平,是现有类型中没有的新型特征。通过增加糖含量,将本发明小麦加工成食品时不仅不需要添加新的糖成分,而且也可以用作供给糖自身的原材料。
12、糊化特性(DSC)
将从各小麦中精制的淀粉分别称量约3mg,加入3倍量的水,加水半日以上。将此样品封入密封盒中,采用示差扫描热量测定计,以5℃/min的速度从30℃升温至105℃,测定糊化开始温度(T0)、糊化峰温度(Tp)、糊化终止温度(Tc)、及焓。
结果,为类型(vii)的亲代系统的类型(ii)与为野生型的类型(i)相比,T0升高,为另一方亲代系统的类型(iii)的T0降低。与其相对,类型(vii)显示比为亲代系统的类型(iii)更低的糊化峰温度。尽管如此,焓值与类型(iii)相比仍变大,是非常特征性的特性。另外,众所周知3个颗粒性淀粉合成酶全部缺失的粘型淀粉(类型(ii)),与3个颗粒性淀粉合成酶都存在的类型(i)相比,糊化峰温度升高。与其相对,类型(vi)虽然是无直链淀粉的类型,但与类型(i)相比糊化峰温度仍然降低。通过不仅使颗粒性淀粉合成酶缺失,而且同时使2个淀粉合成酶II型缺失,能够使糊化峰温度或焓降低。
DSC测定时的糊化峰温度降低时,在较低温度下就可以糊化,不仅对加工性产生较大影响,而且可以进行与不适于加热的材料等的加工。并且在较低温度下进行糊化时,更易被淀粉酶等分解,由此,使游离的糖感觉更加甘甜,也给与食物味道较大影响。
[表3]
样品 | 糊化开始温度(T0) | 糊化峰温度(Tp) | 糊化终止温度(Tc) | 焓(ΔH) |
(i) | 54 | 60.1 | 65.7 | -6.672 |
(ii) | 57.3 | 62.7 | 70.7 | -9.047 |
(iii) | 46.1 | 49.7 | 54.9 | -3.238 |
(vi) | 52.6 | 58.3 | 70.1 | -8.192 |
(vii) | 43.7 | 47.3 | 52.3 | -6.47 |
13、可溶性聚葡萄糖(water soluble polyglucan,WSP)含量的测定将除去胚的成熟种子破碎,使用通过65μm尼龙网的级分。将回收的级分在甲醇中煮沸15分钟后,离心回收沉淀部分。再用90%甲醇洗涤此沉淀,离心回收后,干燥测定重量。秤量约50mg的样品,每1mg加入20μl水,边在室温下搅拌20分钟,边提取可溶性聚葡萄糖。600×g离心20分钟,分别回收可溶性级分和不溶性级分。其中不溶性级分再次用水提取,回收可溶性级分和不溶性级分。将第1次和第2次的可溶性级分混合,用于之后的操作。
为了除去蛋白质,向混合的可溶性级分中加入三氯乙酸(TCA)使终浓度为5%,在冰上静置3.5小时。经2,400×g离心10分钟除去沉淀的蛋白质层,向上清液中加入3倍量的甲醇,使WSP沉淀,离心回收后,干燥,测定重量。
在上述水不溶性级分中加入1050μl水,悬浊后,加入150μl甲苯,搅拌1小时,进行除蛋白质处理。700×g离心10分钟,回收沉淀。再将除蛋白质处理重复2次,最后回收的沉淀用水洗涤3次,用甲醇洗涤1次后,真空干燥,测定重量。各样品均通过将水不溶性级分的重量和WSP重量的总和作为总糖量的重量,计算WSP重量相对于此的比率(图14)。相对于类型(i)、(ii)、(iii),类型(vii)中WSP的含量明显地增加。
14、焙烤食品
制造焙烤食品时,使用本发明小麦中的类型(vii)。每100g收获的成熟种子,加入1.5ml水充分混合,混料30分钟后,使用Brabender社制Testmill Quadrumat Jr.制粉,得到小麦粉。此时的有效利用率为46重量%。以下,按照表4及表5给出的比例和下述制作步骤制作主食面包。混合表4中除起酥油(shortening)以外的原料,用混合机低速混合1分钟、高速混合2分钟(27℃)。停止混合加入起酥油后,再低速混合1分钟、高速混合3分钟,使揉捏后的生面团在27℃、湿度75%下发酵90分钟。翻揉面团后,再于相同条件下发酵30分钟,分割成100g,制成圆形,放置20分钟。用模整形后,在38℃、湿度85%的发酵室中进行40分钟焙烘而制成(205℃、20分钟)。
上述条件下制作的主食面包的味道及食感由10名评价人员(panelists)进行评价。根据表6给出的项目和评价标准,按5阶段进行评价,计算各项目的平均值。合计此平均值,作为各试验区的综合评价(表7)。根据上述结果可以确认,使用由本发明小麦得到的面粉,能够制作出甘甜、香气、味道等风味很强的焙烤食品。另外,制作焙烤食品时,优选使用0.1~60质量份,更优选使用0.5~50质量份。
[表4]
表4
面粉(表5所示面粉) | 600质量份 |
酵母 | 12质量份 |
砂糖 | 30质量份 |
食盐 | 12质量份 |
脱脂奶粉 | 12质量份 |
激酵母活性剂(Yeast Food) | 0.2质量份 |
起酥油 | 30质量份 |
水 | 420质量份 |
[表5]
表5
*数值单位为质量份。
*来自本发明小麦的面粉,使用通过Brabender公司制Testmill粉碎得到的粉。
*强力粉使用Eagle(日本制粉(株))、薄力粉使用Heart(日本制粉(株))。
[表6]
表6主食面包的官能评价标准表
香气 | 5.有芳香的浓郁的香气。4.有较浓的香气。3.能够闻到香气。2.无香气。1.有难闻气味。 |
食感 | 5.口感非常好。4.口感好。3.口感一般。2.口感稍差。1.口感差,残留在嘴中。 |
味道 | 5.味道强、有风味。4.味道稍强。3.味道淡。2.无味道。1.无味道、有酸味。 |
甘甜 | 5.感觉非常甜。4.感觉较强的甜味。3.感觉稍稍有点甜。2.感觉很微弱的甜味。1.完全没甜味。 |
[表7]
附图说明
[图1A]类型(i)的通过二维电泳得到的电泳结果的模式图。
[图1B]类型(vii)的二维电泳结果。
[图2]进行类型(i)的对照品种及类型(vii)小麦的基因型判定的结果。
[图3]用类型(vii)的小麦系统生产的种子的电子显微镜照片。
[图4]构成来自类型(vii)系统的淀粉中的支链淀粉的葡萄糖侧链链长分布解析结果((vii)-(i))。
[图5]构成来自类型(ii)系统的淀粉中的支链淀粉的葡萄糖侧链链长分布解析结果((ii)-(i))。
[图6]构成来自类型(iii)系统的淀粉中的支链淀粉的葡萄糖侧链链长分布解析结果((iii)-(i))。
[图7]构成来自类型(i)系统的淀粉中的支链淀粉的葡萄糖侧链链长分布解析结果。
[图8]构成来自类型(vii)系统的淀粉中的支链淀粉的葡萄糖侧链的链长分布解析结果。
[图9]为表示成熟种子中葡萄糖含量的图。
[图10]为表示成熟种子中麦芽糖含量的图。
[图11]为表示成熟种子中蔗糖含量的图。
[图12]构成来自类型(x)系统的淀粉中的支链淀粉的葡萄糖侧链链长分布解析结果。
[图13]为通过SDS-PAGE进行的电泳结果。
[图14]为表示成熟种子中可溶性聚葡萄糖含量的图。
序列表
<110>日本制粉株式会社
<120>含有新型淀粉的小麦及其生产方法
<130>Y1N-0284
<160>29
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>6898
<212>DNA
<213>小麦
<400>1
gggggccgtt cgtacgtacc cgcccctcgt gtaaagccgc cgccgtcgtc gccgtccccc 60
gctcgcggcc atttccccgg cctgaccccg tgcgtttacc ccacagagca cactccagtc 120
cagtccagcc cactgccgcc gcgctactcc ccactcccgc tgccaccacc tccgcctgcg 180
ccgcgctctg ggcggaggac caacccgcgc atcgtaccat cgcccgcccc gatcccggcc 240
gccgccatgt cgtcggcggt cgcgtccgcc gcgtccttcc tcgcgctcgc ctccgcctcc 300
cccgggagat cacgcaggcg ggcgagggtg agcgcgccgc caccccacgc cggggccggc 360
aggctgcact ggccgccgtg gccgccgcag cgcacggctc gcgacggagg tgtggccgcg 420
cgcgccgccg ggaagaagga cgcgagggtc gacgacgacg ccgcgtccgc gaggcagccc 480
cgcgcacgcc gcggtggcgc cgccaccaag gtagttggtt cgttatgact tgctgtatgg 540
cgcgtgcgcc tcgagatcag ctcacgaatt gtttctacaa aacgcacgcg ctcgtgtgca 600
ggtcgcggag cggagggatc ccgtcaagac gctcgatcgc gacgccgcgg aaggtggcgc 660
gccggcaccg ccggcaccga ggcaggacgc cgcccgtcca ccgagtatga acggcacgcc 720
ggtgaacggt gagaacaaat ctaccggcgg cggcggcgcg accaaagaca gcgggctgcc 780
cgcacccgca cgcgcgcccc atccgtcgac ccagaacaga gtaccagtga acggtgaaaa 840
caaagctaac gtcgcctcgc cgccgacgag catagccgag gtcgtggctc cggattccgc 900
agctaccatt tccatcagtg acaaggcgcc ggagtccgtt gtcccagccg agaagccgcc 960
gccgtcgtcc ggctcaaatt tcgtggtctc ggcttctgct cccaggctgg acattgacag 1020
cgatgttgaa cctgaactga agaagggtgc ggtcatcgtc gaagaagctc caaacccaaa 1080
ggctctttcg ccgcctgcag cccccgctgt acaagaagac ctttgggact tcaagaaata 1140
cattggcttc gaggagcccg tggaggccaa ggatgatggc tgggctgttg cagatgatgc 1200
gggctccttt gaacatcacc agaaccatga ttccggacct ttggcagggg agaacgtcat 1260
gaacgtggtc gtcgtggctg ctgaatgttc tccctggtgc aaaacaggca tggacattac 1320
ctcttcagtc tctcttcccg ttgttcataa aactttgctc gaatcactca taagaacaaa 1380
cattgtgttg cataggtggt cttggagatg ttgcgggtgc tctgcccaag gctttggcaa 1440
agagaggaca tcgtgttatg gtactgcagg ctttcactta actctgttga gtccatatgt 1500
tcgaataata tcagtgattg gcataatgtt attaagtgca agacatgaaa gtgttcttct 1560
gttagagtat ttcatagcca accctggagg ttaggttgtt ggggcctact gggtgcggga 1620
gggggtttgc aaaaagtggt ggttagcagt cggatttcac aaataaggag gctgataacc 1680
acgccatcag tgaagggaat gagtgtcggg tacccgatcg accgttttgc ccgacgtcag 1740
gtttacctgc cctgtagatc cgaataagta gttcctatcc tcagttaagt accaaatatc 1800
gccagcaccc gtgtgtgtat ttatagtact ggatgatcaa tttatcaaca tttccggtta 1860
atggttgcta tcatattcac tgtaattgtt agtaaacagt ggatgtttgt aatgtagatg 1920
atggctaaat gtatgttgtc aagctttcat tttaaagaaa attttattgg gagctagttt 1980
tcgggtttgg ttagagccac caaaacccca gaatttttgg gagttggctt gtgacagagg 2040
gttttgggga gttaactttc gggattcagt tagagacgct cttactagtt ccagtaaaga 2100
gtaaactatt ttctgcagtc atcccaattg ttctgtagaa attaaaagta gaaaatagtt 2160
gtggtatcat ataaaccata tattattcaa aatctagaat catggacttg gctagacttt 2220
gatgatctga aattttaaat ttgatgataa ttgagaaatg atcctttcta tcttaggttg 2280
tggtaccaag gtatggggac tatgaggaag cctacgatgt cggagtccga aaatactaca 2340
aggctgctgg acaggtaagc gaaaatgcaa tcaaagggga gctgaaattt caatgcttac 2400
tatcataata aatcaatttt aagtaaaaaa atttgtcctg caggatatgg aagtgaatta 2460
tttccatgct tatatcgatg gagttgattt tgtgttcatt gacgctccta tcttccgaca 2520
ccgtcaggaa gacatttatg ggggcagcag acaggttaat tttctatatg ttggtgtttg 2580
attgcactga taaactgaga ataagccaag gcctactgac tggcatatga ttacacattt 2640
tattttttca ggaaattatg aagcgcatga ttttgttctg caaggccgct gtcgaggtat 2700
cctctccaac tcaattgaca acctattacc actatacaat tatgtgtatg catgtatttc 2760
aacagatacg taatctccct tgtgaagtgt atatatacta ataacatttc aatacctcac 2820
atgcacattt ggtcaagcgt tatgatttaa cttctgataa tctattgcac tgatgaacaa 2880
taatattgat gatccttgtt acttcatcgt tatgtttatg ttctcttcac cggcgcattg 2940
attttggaaa tagcatttcc acctgccaca aacaataata tatactccta ctttcatcca 3000
atgtagatat tttcgcactt ggcatatcat cccattaaat attattggtc catcattttt 3060
attcctctat aatttgcagg ttccttggca cgttccatgc ggcggtgtcc cttatgggga 3120
tggaaatctg gtgtttattg caaatgattg gcacacggca ctcctgcctg tctatctgaa 3180
agcatattac agggaccatg gtttgatgca gtacactcgg tccattatgg tgatacataa 3240
catcgcgcac caggttcctt ttctcctaat cttgtttttt ctctagtctc tactattcac 3300
tccacattgt ttgaggaaac taaaggggtt gcaaaattat gatggcttat gaaagttatg 3360
gaggtaaatg catcagtggt gcttgaactt gtcacgcatg ttcactttgg tgcttacagt 3420
tgtagactac ggaaaactgg tgcaaaaact tggctattgt gtgcaatacg gtgtattttc 3480
cgtatgtagg gtcaaatgtt gcctatgtgg cattgtattc ccgtctatag atgttagacc 3540
gtgcctacat cgccattggg cccacacact ccctattaca tgtgggaccc acttgtcagc 3600
ctatgacata aataaaatgg aaatttataa taaaaatgat ggcctggggt cttgaaaatg 3660
ggacctcgca ggtatgccgc tagccagcac gccctaatca ttaatcccct atgcacttca 3720
gtatgtgtgt gtctgtgtgt ggagtcgggg gggggggggg tatgtattct tatatccttt 3780
gctctaaggc tatcattggc gtgctagcac cgccgggtct ccatcaacac cgacatcatc 3840
cacgacccca tccagctctt cctcaacaag cccacctcca gcctcaactc gggcagcacc 3900
ttcatggtgg cctaggtgct ctgcaccatc gctcgaagtg gcaacgtcgt tgtcatgacc 3960
atccaccaac ccaacacgca aaatcctcaa catcatttga cagtgagcat gcccctcttg 4020
tcatttcccc ctcataccca aacctgtctc gataaccctt ggagctgcac aagttgtgac 4080
catcgcctgc gtcgctgcac aacgcctgac ctagccggac cattatagaa gcctgccttg 4140
ggagcccata cctccctgca catcctcctc tttccccata gaccgtgccg ccatcgcaaa 4200
tcgacttctc ctctcctcct tctcctgctc tggccgtttt ccccgccgcg aagctgcaat 4260
ccatggcgag ttggccatgg ccctattccc caattgctcg cactaggagg tcctccttga 4320
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atccgacccg aatcatcata gaaccaacgc cagagaggtc atcccgacga cgtcgcactg 4560
ttcctctatt tcccccaagc tgtgtcgcgt cataatataa gacgggcttg tttgtatctc 4620
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gaacccccgc gtgcacataa tttatttgct atttatttct cctatctact aataagtggg 4740
acccacacat catactaagc cctttttgtc tcttgcctgc tgataagtgg gacccacacg 4800
caatacttag ccagagagag aacatgagct tgttggtgcc gcgttggcaa gccacgccag 4860
cagtcttaac ggctacaaac agaggatatg gtgtcacatc aacgtgcaga gcgtttacga 4920
atggaaagtg tactatatgc acacaagagc cagagccagg tttttgcacc agttttttgt 4980
attctacaac tgcgagcacc aaagtgtaca tgccgaacca aagtgaacac ggcgagtcca 5040
ttcttttctg gtacgatggg tggctcaaag acaccccaat agaagctatc acctcggaca 5100
ttgccaattg ggtgccgaac tacattaaag tggcaaggtc agttgattgc gctatgtgtt 5160
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gctcgctccg cgcaatagga tttggatcac gggcagacgc gctagatgag gtcttccaca 5460
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tagcctgaac tttctggact tagttttttc ctctataatg atcacatgct ttggtcagtt 5880
attcctttct tgggtactcc gttgggctaa ttctttctct tgattgatgt tgtatatgca 5940
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<210>2
<211>799
<212>PRT
<213>小麦
<400>2
Met Ser Ser Ala Val Ala Ser Ala Ala Ser Phe Leu Ala Leu Ala Ser
1 5 10 15
Ala Ser Pro Gly Arg Ser Arg Arg Arg Ala Arg Val Ser Ala Pro Pro
20 25 30
Pro His Ala Gly Ala Gly Arg Leu His Trp Pro Pro Trp Pro Pro Gln
35 40 45
Arg Thr Ala Arg Asp Gly Gly Val Ala Ala Arg Ala Ala Gly Lys Lys
50 55 60
Asp Ala Arg Val Asp Asp Asp Ala Ala Ser Ala Arg Gln Pro Arg Ala
65 70 75 80
Arg Arg Gly Gly Ala Ala Thr Lys Val Ala Glu Arg Arg Asp Pro Val
85 90 95
Lys Thr Leu Asp Arg Asp Ala Ala Glu Gly Gly Ala Pro Ala Pro Pro
100 105 110
Ala Pro Arg Gln Asp Ala Ala Arg Pro Pro Ser Met Asn Gly Thr Pro
115 120 125
Val Asn Gly Glu Asn Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ala Thr Lys Asp
130 135 140
Ser Gly Leu Pro Ala Pro Ala Arg Ala Pro His Pro Ser Thr Gln Asn
145 150 155 160
Arg Val Pro Val Asn Gly Glu Asn Lys Ala Asn Val Ala Ser Pro Pro
165 170 175
Thr Ser Ile Ala Glu Val Val Ala Pro Asp Ser Ala Ala Thr Ile Ser
180 185 190
Ile Ser Asp Lys Ala Pro Glu Ser Val Val Pro Ala Glu Lys Pro Pro
195 200 205
Pro Ser Ser Gly Ser Asn Phe Val Val Ser Ala Ser Ala Pro Arg Leu
210 215 220
Asp Ile Asp Ser Asp Val Glu Pro Glu Leu Lys Lys Gly Ala Val Ile
225 230 235 240
Val Glu Glu Ala Pro Asn Pro Lys Ala Leu Ser Pro Pro Ala Ala Pro
245 250 255
Ala Val Gln Glu Asp Leu Trp Asp Phe Lys Lys Tyr Ile Gly Phe Glu
260 265 270
Glu Pro Val Glu Ala Lys Asp Asp Gly Trp Ala Val Ala Asp Asp Ala
275 280 285
Gly Ser Phe Glu His His Gln Asn His Asp Ser Gly Pro Leu Ala Gly
290 295 300
Glu Asn Val Met Asn Val Val Val Val Ala Ala Glu Cys Ser Pro Trp
305 310 315 320
Cys Lys Thr Gly Gly Leu Gly Asp Val Ala Gly Ala Leu Pro Lys Ala
325 330 335
Leu Ala Lys Arg Gly His Arg Val Met Val Val Val Pro Arg Tyr Gly
340 345 350
Asp Tyr Glu Glu Ala Tyr Asp Val Gly Val Arg Lys Tyr Tyr Lys Ala
355 360 365
Ala Gly Gln Asp Met Glu Val Asn Tyr Phe His Ala Tyr Ile Asp Gly
370 375 380
Val Asp Phe Val Phe Ile Asp Ala Pro Ile Phe Arg His Arg Gln Glu
385 390 395 400
Asp Ile Tyr Gly Gly Ser Arg Gln Glu Ile Met Lys Arg Met Ile Leu
405 410 415
Phe Cys Lys Ala Ala Val Glu Val Pro Trp His Val Pro Cys Gly Gly
420 425 430
Val Pro Tyr Gly Asp Gly Asn Leu Val Phe Ile Ala Asn Asp Trp His
435 440 445
Thr Ala Leu Leu Pro Val Tyr Leu Lys Ala Tyr Tyr Arg Asp His Gly
450 455 460
Leu Met Gln Tyr Thr Arg Ser Ile Met Val Ile His Asn Ile Ala His
465 470 475 480
Gln Gly Arg Gly Pro Val Asp Glu Phe Pro Phe Thr Glu Leu Pro Glu
485 490 495
His Tyr Leu Glu His Phe Arg Leu Tyr Asp Pro Val Gly Gly Glu His
500 505 510
Ala Asn Tyr Phe Ala Ala Gly Leu Lys Met Ala Asp Gln Val Val Val
515 520 525
Val Ser Pro Gly Tyr Leu Trp Glu Leu Lys Thr Val Glu Gly Gly Trp
530 535 540
Gly Leu His Asp Ile Ile Arg Gln Asn Asp Trp Lys Thr Arg Gly Ile
545 550 555 560
Val Asn Gly Ile Asp Asn Met Glu Trp Asn Pro Glu Val Asp Val His
565 570 575
Leu Gln Ser Asp Gly Tyr Thr Asn Phe Ser Leu Ser Thr Leu Asp Ser
580 585 590
Gly Lys Arg Gln Cys Lys Glu Ala Leu Gln Arg Glu Leu Gly Leu Gln
595 600 605
Val Arg Ala Asp Val Pro Leu Leu Gly Phe Ile Gly Arg Leu Asp Gly
610 615 620
Gln Lys Gly Val Glu Ile Ile Ala Asp Ala Met Pro Trp Ile Val Ser
625 630 635 640
Gln Asp Val Gln Leu Val Met Leu Gly Thr Gly Arg His Asp Leu Glu
645 650 655
Ser Met Leu Arg His Phe Glu Arg Glu His His Asp Lys Val Arg Gly
660 665 670
Trp Val Gly Phe Ser Val Arg Leu Ala His Arg Ile Thr Ala Gly Ala
675 680 685
Asp Ala Leu Leu Met Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Asn Gln
690 695 700
Leu Tyr Ala Met Ala Tyr Gly Thr Val Pro Val Val His Ala Val Gly
705 710 715 720
Gly Leu Arg Asp Thr Val Pro Pro Phe Asp Pro Phe Asn His Ser Gly
725 730 735
Leu Gly Trp Thr Phe Asp Arg Ala Glu Ala His Lys Leu Ile Glu Ala
740 745 750
Leu Gly His Cys Leu Arg Thr Tyr Arg Asp Tyr Lys Glu Ser Trp Arg
755 760 765
Gly Leu Gln Glu Arg Gly Met Ser Gln Asp Phe Ser Trp Glu His Ala
770 775 780
Ala Lys Leu Tyr Glu Asp Val Leu Leu Lys Ala Lys Tyr Gln Trp
785 790 795
<210>3
<211>6811
<212>DNA
<213>小麦
<400>3
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actgggtgtg ggagggggtt tgaaaaaagt gttggttagc agtcggattt cacaaagaac 1680
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accaaatatc ggcagcgccc gtgtgtgtat ttatagtact ggatgatcaa tttatcaaca 1860
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aatgtttctt cctgcagcca tgcctgccgt tacaacgggt gccgtgtccg tgcaggccaa 420
cggtcaccgg gtcatggtca tctccccgcg ctacgaccag tacaaggacg cctgggacac 480
cagcgtcatc tccgaggtat atatccgcca catgaattat cacaattcac atgctcctgc 540
acatttctgc aagactttac tgactggctg gatctcgcag atcaaggtcg ttgacaggta 600
cgagagggtg aggtacttcc actgctacaa gcgcggggtg gaccgcgtgt tcgtcgacca 660
cccgtgcttc ctggagaagg tgaccgatcg ctcgccgtcg atcgatcaag ctagctcctc 720
gtcgtctcaa cccgcatggt gtttgataat ttcagtgagt ctttgcgtct gctggttaca 780
atttccaggt ccggggcaag accaaggaga agatctatgg acccgacgcc ggcaccgact 840
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tcctcgacct caacaacaac ccacactttt ctggacccta cggtaagatc aagaacaact 960
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gtatcttggt gctgccatgc tatgccgtgc cgtgccgcgc cgcgcagggg aagacgtggt 1080
gtttgtgtgc aacgactggc acacgggcct tctggcctgc tacctcaaga gcaactacca 1140
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tgcatatcaa ttttgcggtt cattctggca gcctgaattt tacattgcaa ctccatttca 1260
tggctaggtg gcattctgca tccacaacat ctcgtaccag ggccgcttct ccttcgacga 1320
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caaggtgctg actgtgagcc cctactatgc tgaggagcta atctctggcg aagccagggg 1500
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aggcgctgca ggccgaggtg gggctgccgg tggaccggaa ggtgcccctg gtggcgttca 1800
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<211>604
<212>PRT
<213>小麦
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Val Met Val Ile Ser Pro Arg Tyr Asp Gln Tyr Lys Asp Ala Trp Asp
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Thr Ser Val Ile Ser Glu Ile Lys Val Val Asp Arg Tyr Glu Arg Val
130 135 140
Arg Tyr Phe His Cys Tyr Lys Arg Gly Val Asp Arg Val Phe Val Asp
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165 170 175
Tyr Gly Pro Asp Ala Gly Thr Asp Tyr Glu Asp Asn Gln Gln Arg Phe
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Ser Leu Leu Cys Gln Ala Ala Leu Glu Val Pro Arg Ile Leu Asp Leu
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Asn Asn Asn Pro His Phe Ser Gly Pro Tyr Gly Glu Asp Val Val Phe
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Val Cys Asn Asp Trp His Thr Gly Leu Leu Ala Cys Tyr Leu Lys Ser
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Asn Tyr Gln Ser Asn Gly Ile Tyr Arg Thr Ala Lys Val Ala Phe Cys
245 250 255
Ile His Asn Ile Ser Tyr Gln Gly Arg Phe Ser Phe Asp Asp Phe Ala
260 265 270
Gln Leu Asn Leu Pro Asp Arg Phe Lys Ser Ser Phe Asp Phe Ile Asp
275 280 285
Gly Tyr Asp Lys Pro Val Glu Gly Arg Lys Ile Asn Trp Met Lys Ala
290 295 300
Gly Ile Leu Gln Ala Asp Lys Val Leu Thr Val Ser Pro Tyr Tyr Ala
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Glu Glu Leu Ile Ser Gly Glu Ala Arg Gly Cys Glu Leu Asp Asn Ile
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Met Arg Leu Thr Gly Ile Thr Gly Ile Val Asn Gly Met Asp Val Ser
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<212>DNA
<213>小麦
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Phe Val Cys Asn Asp Trp His Thr Gly Leu Leu Ala Cys Tyr Leu Lys
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Cys Ile His Asn Ile Ser Tyr Gln Gly Arg Phe Ser Phe Asp Asp Phe
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Ala Glu Val Gly Leu Pro Val Asp Arg Lys Val Pro Leu Val Ala Phe
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Ile Gly Arg Leu Glu Glu Gln Lys Gly Pro Asp Val Met Ile Ala Ala
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Ile Pro Glu Ile Leu Lys Glu Glu Asp Val Gln Ile Val Leu Leu Gly
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Phe Pro Ser Lys Val Arg Ala Val Val Arg Phe Asn Ala Pro Leu Ala
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<212>PRT
<213>小麦
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Met Ala Ala Leu Val Thr Ser Gln Leu Ala Thr Ser Gly Thr Val Leu
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260 265 270
Gln Leu Asn Leu Pro Asp Arg Phe Lys Ser Ser Phe Asp Phe Ile Asp
275 280 285
Gly Tyr Asp Lys Pro Val Glu Gly Arg Lys Ile Asn Trp Met Lys Ala
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Thr Thr Ala Leu Glu Gly Lys Ala Leu Asn Lys Glu Ala Leu Gln Ala
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Glu Val Gly Leu Pro Val Asp Arg Lys Val Pro Leu Val Ala Phe Ile
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Gly Arg Leu Glu Glu Gln Lys Gly Pro Asp Val Met Ile Ala Ala Ile
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Pro Glu Ile Leu Lys Glu Glu Asp Val Gln Ile Val Leu Leu Gly Thr
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Gly Lys Lys Lys Phe Glu Arg Leu Leu Lys Ser Ile Glu Glu Lys Phe
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Pro Ser Lys Val Arg Ala Val Val Arg Phe Asn Ala Pro Leu Ala His
450 455 460
Gln Met Met Ala Gly Ala Asp Val Leu Ala Val Thr Ser Arg Phe Glu
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Pro Cys Gly Leu Ile Gln Leu Gln Gly Met Arg Tyr Gly Thr Pro Cys
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ggcccccttg cttagcaaat ttttcatatg gctcgcactg cgcaagagga tttagatcac 5100
gggcagacgc gctagacgag gtcttccgca caatgaacat tgcgttcttt gctctgctct 5160
tcccggagac acttgtgatc ttattacgag ttgtgccatt tcaaacatct gtctctccat 5220
ggtcgctcca gccatagatg ccttgttctc tgaatggtgg gtttcagcta ggaacagggt 5280
gccaccttcg acaagaagtt gcatagtttg gtcgtcttga ctgcttggtc gatttggaag 5340
gaacgcaaca taagagtctt tgaaggcaaa gctaatttct ttgatcaagt tattagccag 5400
atcaaatgtg atgtattcta ctggtacaag gccggggcta tttgctttga gtcacttttt 5460
agctaaggcc gcttgggcta agcgcttggg gtcgtttttg ctcaactgta gcctgaactt 5520
tctggacttt gtaatttttt ttatcctcta taatgatcac atacagctct cctgcatggt 5580
tcgaaaagga aaaatgtgaa catgtgtggc aagtttaagc acaacccgtg catttacctc 5640
aaagttatac aacactgaca tgctgaatta catttttttt gaggatctga catgccgaat 5700
tacatgcttt ggacagttat tcatttcttc ggtacaccat tggctaatta tttctcttga 5760
cagttgctga attagtacat gctttggtcg cagttattcc tttgttcggt actctgttgg 5820
gctaattatt tctcttgatt gatgttgcat gcagggccgt ggcccagtag atgagttccc 5880
gttcaccgag ttgcctgagc actacctgga acacttcaga ctgtacgacc ccgtgggtgg 5940
tgaacacgcc aactacttcg ccgccggcct gaagatggcg gaccaggttg tcgtcgtgag 6000
cccggggtac ctgtgggagc tgaagacggt ggagggcggc tgggggcttc acgacatcat 6060
acggcagaac gactggaaga cccgcggcat cgtgaacggc atcgacaaca tggagtggaa 6120
ccccgaggtg gacgtccacc tcaagcagtg gcgtagccaa tccaatacgc cagggtggtc 6180
cattgataga aacatttaca taagattatt tattttttaa agaaatactt ttttactgca 6240
ctgtacataa gctatggaga aattccaggg tggtccatgg accaccctgg ccacccccta 6300
gctacgccac tgacctcaag tcggacggct acaccaactt ctccctgggg acgctggact 6360
ccggcaagcg gcagtgcaag gaggccctgc agcgggagct gggcctgcag gtccgcggcg 6420
acgtgccgct gctcggcttc atcgggcgcc tggacgggca gaagggcgtg gagatcatcg 6480
cggacgcgat gccctggatc gtgagccagg acgtgcagct ggtcatgctg ggcaccgggc 6540
gccacgacct ggagggcatg ctgcggcact tcgagcggga gcaccacgac aaggtgcgcg 6600
ggtgggtggg gttctccgtg cggctggcgc accggatcac ggccggcgcc gacgcgctcc 6660
tcatgccctc ccggttcgag ccgtgcggac tgaaccagct ctacgccatg gcctacggca 6720
ccgtccccgt cgtgcatgcc gtcggcggcc tgagggacac cgtgccgccg ttcgacccct 6780
tcaaccactc cgggctcggg tggacgttcg accgcgcaga ggcgcagaag ctgatcgagg 6840
cgctcgggca ctgcctccgc acctaccggg actacaagga gagctggagg gggctccagg 6900
agcgcggcat gtcgcaggac ttcagctggg agcatgccgc caagctctac gaggacgtcc 6960
tcgtcaaggc caagtaccag tggtga 6986
<210>29
<211>6946
<212>DNA
<213>小麦
<400>29
gggggccgtt cgtacgtacc cgcccctcgt gtaaagccgc cgccgtcgtc gccgtccccc 60
gctcgcggcc atttcttcgg cctgaccccg ttcgtttacc cccacacaga gcacactcca 120
gtccagtcca gcccactgcc accgcgctac tctccactcc cactgccacc acctccgcct 180
gcgccgcgct ctgggcggac caacccgcga accgtaccat ctcccgcccc gatccatgtc 240
gtcggcggtc gcgtccgccg catccttcct cgcgctcgcg tcagcctccc ccgggagatc 300
acgcaggcgg gcgagggtga gcgcgcagcc accccacgcc ggggccggca ggttgcactg 360
gccgccgtgg ccgccgcagc gcacggctcg cgacggagct gtggcggcgc tcgccgccgg 420
gaagaaggac gcggggatcg acgacgccgc cgcgtccgtg aggcagcccc gcgcactccg 480
cggtggcgcc gccaccaagg tagttagtta tgaccaagtt atgacgcgtg cgcgcgcctc 540
gagatcatcg tcgtctcgct cacgaattgt ttatttatac aaaacgcacg cccgcgtgtg 600
caggtcgcgg agcgaaggga tcccgtcaag acgctcgacc gcgacgccgc ggaaggcggc 660
gggccgtccc cgccggcagc gaggcaggac gccgcccgtc cgccgagtat gaacggcatg 720
ccggtgaacg gcgagaacaa atctaccggc ggcggcggcg cgactaaaga cagcgggctg 780
cccacgcccg cacgcgcgcc ccatccgtcg acccagaaca gagcaccggt gaacggtgaa 840
aacaaagcta acgtcgcctc gccgccgacg agcatagccg aggccgcggc ttcggattcc 900
gcagctacca tttccatcag cgacaaggcg ccggagtccg ttgtcccagc tgagaagacg 960
ccgccgtcgt ccggctcaaa tttcgagtcc tcggcctctg ctcccgggtc tgacactgtc 1020
agcgacgtgg aacaagaact gaagaagggt gcggtcgttg tcgaagaagc tccaaagcca 1080
aaggctcttt cgccgcctgc agcccccgct gtacaagaag acctttggga tttcaagaaa 1140
tacattggtt tcgaggagcc cgtggaggcc aaggatgatg gccgggctgt cgcagatgat 1200
gcgggctcct ttgaacacca ccagaatcac gactccggac ctttggcagg ggagaatgtc 1260
atgaacgtgg tcgtcgtggc tgctgagtgt tctccctggt gcaaaacagg catggacatt 1320
acctcttcag tctctcttcc tgttgttcat aaaactttgc tcgaattact cataagaaca 1380
aacattgtgt tgcataggtg gtctgggaga tgttgcgggt gctctgccca aggctttggc 1440
aaagagagga catcgtgtta tggtactaca agctttcatt taactctgtt gggtccatat 1500
gttcgaataa tatcagtgag tagtataatg ttattaagtg caagacatga aagtgttctt 1560
ttgtcatact ccctccgtaa attaatataa gagcgtttag attactactt tagtgatcta 1620
aacgctctta tagtagttta cagacggagt agagtatttc atagccaacc ctggaggtta 1680
ggttgctgag gcctactggg tgggggaggg ggtttgaaac aagtggtggt tagcagccag 1740
atttcacaaa gaaggaggct gataaccaca ccatcagtga aggaatgaat gtcgggtacc 1800
cgatcgaccg ttttgcccaa cgtcgggttt acccgcccta tagatccgaa taagtagttc 1860
ctatcttcaa ttaggtacca aatatcgcca gcgcccgtgt gtgtatttat actactggat 1920
gatcaattta tcaacatttc cggttaatgg tttctatcat attcactgta attgttagta 1980
aacagtagat gtttgtaatg tagatgatgg ataaatgtat gttgtcgagc tttcatttca 2040
atgcaatttt gattgggagc tagtttcgcg gttcggttag agccatcaaa accccagaat 2100
ttttgggagt tggcttgtga gagagggttt tggggagtta actttcggga ttcagttaga 2160
gacgctctta ctagttccag taaagagtaa actattttct gcaggcatcc caattattct 2220
gtagaaatta gaagtggaaa atagttatgg tatcatataa accatatatt attcaaaatc 2280
tagaatcatg gacttggcta gactttgata atctgaaatt ttaaatttga tgataattga 2340
gaaatgatcc tttctatctt aggttgtggt accaaggtat ggggactatg aagaagccta 2400
cgatgtcgga gtccgaaaat actacaaggc tgctggacag gtaagcaaaa atgcaatcga 2460
aggggagctg aaattttatt gcttattgtc ataataaatc aatttttaag tgtttttttt 2520
gtcctgcagg atatggaagt gaattatttc catgcttata tcgatggagt tgattttgtg 2580
ttcattgact atgttggtgt ttgattgcac tgataaactg agaacaagcc aaggcctact 2640
gactggcata tgattacaca ttttattttt tcaggaaatt atgaagcgca tgattttgtt 2700
ctgcaaggcc gctgttgagg tatctctcca actcaattga caacctatta ccactataca 2760
attatgtgta tgcatgtatt tcaacagata cataatctct tgtgaagtgc atatatacta 2820
ataacatttc aataccttac atgcacattt ggtcaagcgt tatgatttaa cttctgataa 2880
tctattgcac tgatgaacaa ttatcttgat gatccttgtt acttcatcgt tatgtttcca 2940
tgttctcttc accgcgaatt gatttggaaa tagcatttcc acctgccaca aacaataata 3000
tacactccta ctttcatcca atttagatat tttcgtactt ggcatatcat cccattaaat 3060
attattggtc catcattttt attcctctat aatttgcagg ttccatggca cgttccatgc 3120
ggcggtgtcc cttatgggga tggaaatctg gtgtttattg caaatgattg gcacacggca 3180
ctcctgcctg tctatctgaa agcatattac agggaccatg gtttgatgca gtacactcgg 3240
tccattatgg tgatacataa catcgctcac caggttcctt ttctcctaat cttgattttt 3300
ctctagtctc tactatttac tccacattgt ttgaggaaac taaacgggtt gcaaaattat 3360
gatggcttat gaaagttata gtcttataga ggtaaatgca ccagtggtgc ttgaacttgt 3420
cacgcgtgtt cactttggtg cttacagttg tagactatga aaaacgggtg caaaaacttg 3480
ctgttgtgtg ccatacggtg cattttccgt atgtaggagt caaacgttgc ctatgtgggc 3540
attgtattcc cgtctatagc tgttagaccg tgcctacgtc gccattgggc ccacacactc 3600
tctatttaca tgtgggcccc acttgtcaac ctatgacata aataaatgga aatttataat 3660
aaaaatgatg gcctggggtc ttgaaaatgg gacctcgcag gtatgctggt agccagcacg 3720
ccctaaacat taatccccta tgcacttcat gtcttgtgta tgtgtgtgtc tgtgtgggga 3780
ggggggggta tgtatgctta tatcctttgc tccaaggcta ccatcctcaa caagcccacc 3840
tccgcttcaa cacggccagc gccttcatga tggcccaggt gctccgcacc atcgctcaaa 3900
gcggcaacgt cgttgtcatg accatccacc aacccaacac acaaaatcct caacatccgc 3960
aaatagtgag catgcccctc ttgtcctttc ccctcgtacc caaacatgtc ttgataaccc 4020
ttggagctgc acaagttgtg accatcgcct gcgtcgcctc atagagcccg acctagccgg 4080
accgttatag aagcctactt gggagcccat acctccctgc acatcctcct ctttccccat 4140
agatcgtgcc gccatcgcaa accaacttct cctctccttc tcccactctg gccgtttccc 4200
ccgccgcgaa gctgcaatac atgccgagtt ggccatggcc ctattcccca attgctcgca 4260
ctaggaggtc ctcctctaag cctagcacct tttcccctca ccaattgcaa gttggggagc 4320
ccctcgcgag ctccctacgt cggctgcagt tgcctgccgc ctcaactctg atccagacct 4380
cgttcccgtg gcctcggcga catctcctcg acctcccatt ccacacgtgg cctggcgagg 4440
atcaccgcat gttcatccat gtgaaccgaa tcatcataga actaacaccg gagaggtcat 4500
cccgacggcg tcgcactgtt cctctattcc ccccaagccg tgtcgcgtca taatataaga 4560
cggacttatt tgtatccctt gggtcatcgg ttcaatggct atttctttct cctgtctact 4620
gataagtggg acccacacgc cacactaagc cctttctttc tcctacccgt tgataagtgg 4680
gacccacaca cagtacttag ccagagagag aacatgagct tgttggtgcc acgtcggcaa 4740
gccatgtcag cagtcttaac ggctacaaac aacggatatg gtgtcacgtg agcgtttacg 4800
aatggaaagt gcatcatact gcatgcgaga gccagagcca ggtttttgca ccagttttct 4860
gtattttaca actgcgagca tcaaagtgta catatgccga accaaagtga acatggtgag 4920
tccattcttt tctggtgcgg tgggtggctc aaagacaccc caatagaagc tattgcctcc 4980
gacattgcca attcggtgcc gaaccatatt gaagtggtga ggtcagttgc ttgtgctatg 5040
actactaggt attggatgag ggacataaag gatctcataa atattgcaat gttcattcaa 5100
attcttaaca tttgcgaagc gcttcatgat ttccatctcc cctagatcag agacacttgg 5160
tcgtgtacac tgaatttctc aggtcgcttc tcgtctaaat ccgcatatgt agctcacttc 5220
aatgacttgc ctttggtcca gctaacgcca tttgcgtagc aaatttttca tatggctcgc 5280
tctgcgcaag aggatttgga tcacgggcag acgcgctaga caaggtcttc cgcacaatga 5340
acattgagtt ttttgatccg ctcttcccga agacacttgt gatcttatta cgagttgtgc 5400
catttcaaac atctgtctct ccatggtcgc cccagccata gatgccttgt tctctgaatg 5460
gtgggtttca gctaggaaca gggtgccacc ttcggacaag aagttgcgta gtttggtcgt 5520
cttaactgct tggttgattt ggaaggaaca caacaacagt ctttgaaggc aaagctaatt 5580
ccttcgatca agttattaga cggatcaagt gtgatgaatc ctactggtac aatgccgttg 5640
ctagttgctt ggagtcacta tttggctagg tcgcttgcca tcccgctctg tgctaagcgc 5700
ttggggtcgc ttttgctcaa tttgtatttt gttgttatgt gtttttagta atgtaacctg 5760
aactttctgg actaagtaga aaaaaattct cctccataat gatcacatac agttctcctg 5820
catggttcga aaaaaaaatg agaacatccg tggcaagttt aagcaccacc ggtgcatttt 5880
tacctcaaag ttatatacaa cactgacatg ccgaattaca tgctttggtc agttattcca 5940
ttcttcggta ctccgttggg ctaattcttt ctcttcatgt tgcatgcagg gccgtggccc 6000
tgtagatgaa ttcccgttca ccgagttgcc tgagcactac ctggaacact tcagactgta 6060
cgaccccgtg ggtggtgaac acgccaacta cttcgccgcc ggcctgaaga tggcggacca 6120
ggttgtcgtg gtgagccccg ggtacctgtg ggagctgaag acggtggagg gcggctgggg 6180
gcttcacgac atcatacggc agaacgactg gaagacccgc ggcatcgtca acggcatcga 6240
caacatggag tggaaccccg aggtggacgc ccacctcaag tcggacggct acaccaactt 6300
ctccctgagg acgctggact ccggcaagcg gcagtgcaag gaggccctgc agcgcgagct 6360
gggcctgcag gtccgcgccg acgtgccgct gctcggcttc atcggccgcc tggacgggca 6420
gaagggcgtg gagatcatcg cggacgccat gccctggatc gtgagccagg acgtgcagct 6480
ggtgatgctg ggcaccgggc gccacgacct ggagagcatg ctgcagcact tcgagcggga 6540
gcaccacgac aaggtgcgcg ggtgggtggg gttctccgtg cgcctggcgc accggatcac 6600
ggcgggggcg gacgcgctcc tcatgccctc ccggttcgag ccgtgcgggc tgaaccagct 6660
ctacgccatg gcctacggca ccgtccccgt cgtgcacgcc gtcggcggcc tcagggacac 6720
cgtgccgccg ttcgacccct tcaaccactc cgggctcggg tggacgttcg accgcgccga 6780
ggcgcacaag ctgatcgagg cgctcgggca ctgcctccgc acctaccgag acttcaagga 6840
gagctggagg gccctccagg agcgcggcat gtcgcaggac ttcagctggg agcacgccgc 6900
caagctctac gaggacgtcc tcgtcaaggc caagtaccag tggtga 6946
Claims (24)
1.一种小麦,其不表达下述全部蛋白质:
(1)序列号1的淀粉合成酶II型-A1基因编码的淀粉合成酶II型-A1蛋白质;
(2)序列号3的淀粉合成酶II型-B1基因编码的淀粉合成酶II型-B1蛋白质;
(3)序列号5的淀粉合成酶II型-D1基因编码的淀粉合成酶II型-D1蛋白质;
(4)序列号7的颗粒性淀粉合成酶-A1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-A1蛋白质;
(5)序列号9的颗粒性淀粉合成酶-B1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-B1蛋白质;及
(6)序列号11的颗粒性淀粉合成酶-D1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-D1蛋白质。
2.一种小麦,其中不具有下述蛋白质所具有的酶活性的全部:
(1)序列号1的淀粉合成酶II型-A1基因编码的淀粉合成酶II型-A1蛋白质;
(2)序列号3的淀粉合成酶II型-B1基因编码的淀粉合成酶II型-B1蛋白质;
(3)序列号5的淀粉合成酶II型-D1基因编码的淀粉合成酶II型-D1蛋白质;
(4)序列号7的颗粒性淀粉合成酶-A1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-A1蛋白质;
(5)序列号9的颗粒性淀粉合成酶-B1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-B1蛋白质;及
(6)序列号11的颗粒性淀粉合成酶-D1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-D1蛋白质。
3.一种小麦,其中蓄积的淀粉的30重量%以上不形成粒径10μm以上的淀粉颗粒。
4.一种小麦,在支链淀粉的葡萄糖支链中,聚合度70以下的支链中,聚合度为3~5的支链的数量的比例为1.5%以上。
5.一种小麦,生淀粉在淀粉酶作用下的分解率为80%以上。
6.一种小麦,其中,下述蛋白质(1)至(3)中的1种以上不表达,并且下述蛋白质(4)至(6)中的1种以上不表达,但不包括只有蛋白质(2)、(4)及(5)同时不表达的小麦,
(1)序列号1的淀粉合成酶II型-A1基因编码的淀粉合成酶II型-A1蛋白质;
(2)序列号3的淀粉合成酶II型-B1基因编码的淀粉合成酶II型-B1蛋白质;
(3)序列号5的淀粉合成酶II型-D1基因编码的淀粉合成酶II型-D1蛋白质;
(4)序列号7的颗粒性淀粉合成酶-A1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-A1蛋白质;
(5)序列号9的颗粒性淀粉合成酶-B1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-B1蛋白质;及
(6)序列号11的颗粒性淀粉合成酶-D1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-D1蛋白质。
7.一种小麦,所述小麦不具有下述蛋白质(1)至(3)所具有的酶活性中的1种以上酶活性,并且不具有下述蛋白质(4)至(6)所具有的酶活性中的1种以上酶活性,但不包括只不具有蛋白质(2)、(4)及(5)所具有的酶活性的小麦,
(1)序列号1的淀粉合成酶II型-A1基因编码的淀粉合成酶II型-A1蛋白质;
(2)序列号3的淀粉合成酶II型-B1基因编码的淀粉合成酶II型-B1蛋白质;
(3)序列号5的淀粉合成酶II型-D1基因编码的淀粉合成酶II型-D1蛋白质;
(4)序列号7的颗粒性淀粉合成酶-A1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-A1蛋白质;
(5)序列号9的颗粒性淀粉合成酶-B1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-B1蛋白质;及
(6)序列号11的颗粒性淀粉合成酶-D1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-D1蛋白质。
8.一种小麦,其中下述蛋白质(1)至(3)中的任意2种不表达,并且下述蛋白质(4)至(6)中的1种以上不表达,
(1)序列号1的淀粉合成酶II型-A1基因编码的淀粉合成酶II型-A1蛋白质;
(2)序列号3的淀粉合成酶II型-B1基因编码的淀粉合成酶II型-B1蛋白质;
(3)序列号5的淀粉合成酶II型-D1基因编码的淀粉合成酶II型-D1蛋白质;
(4)序列号7的颗粒性淀粉合成酶-A1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-A1蛋白质;
(5)序列号9的颗粒性淀粉合成酶-B1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-B1蛋白质;及
(6)序列号11的颗粒性淀粉合成酶-D1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-D1蛋白质。
9.一种小麦,不具有下述蛋白质(1)至(3)所具有的酶活性中的任意2种酶活性,并且不具有下述蛋白质(4)至(6)所具有的酶活性中的1种以上酶活性,
(1)序列号1的淀粉合成酶II型-A1基因编码的淀粉合成酶II型-A1蛋白质;
(2)序列号3的淀粉合成酶II型-B1基因编码的淀粉合成酶II型-B1蛋白质;
(3)序列号5的淀粉合成酶II型-D1基因编码的淀粉合成酶II型-D1蛋白质;
(4)序列号7的颗粒性淀粉合成酶-A1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-A1蛋白质;
(5)序列号9的颗粒性淀粉合成酶-B1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-B1蛋白质;及
(6)序列号11的颗粒性淀粉合成酶-D1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-D1蛋白质。
10.一种小麦,其中下述蛋白质(1)至(3)中的任意2种不表达,并且下述蛋白质(4)至(6)都不表达,
(1)序列号1的淀粉合成酶II型-A1基因编码的淀粉合成酶II型-A1蛋白质;
(2)序列号3的淀粉合成酶II型-B1基因编码的淀粉合成酶II型-B1蛋白质;
(3)序列号5的淀粉合成酶II型-D1基因编码的淀粉合成酶II型-D1蛋白质;
(4)序列号7的颗粒性淀粉合成酶-A1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-A1蛋白质;
(5)序列号9的颗粒性淀粉合成酶-B1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-B1蛋白质;及
(6)序列号11的颗粒性淀粉合成酶-D1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-D1蛋白质。
11.一种小麦,不具有下述蛋白质(1)至(3)所具有的酶活性中的任意2种酶活性,并且不具有下述蛋白质(4)至(6)所具有的酶活性的全部,
(1)序列号1的淀粉合成酶II型-A1基因编码的淀粉合成酶II型-A1蛋白质;
(2)序列号3的淀粉合成酶II型-B1基因编码的淀粉合成酶II型-B1蛋白质;
(3)序列号5的淀粉合成酶II型-D1基因编码的淀粉合成酶II型-D1蛋白质;
(4)序列号7的颗粒性淀粉合成酶-A1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-A1蛋白质;
(5)序列号9的颗粒性淀粉合成酶-B1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-B1蛋白质;及
(6)序列号11的颗粒性淀粉合成酶-D1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-D1蛋白质。
12.一种小麦,其中下述蛋白质(1)至(3)中的2种以上不表达,并且下述蛋白质(4)至(6)中的2种以上不表达,
(1)序列号1的淀粉合成酶II型-A1基因编码的淀粉合成酶II型-A1蛋白质;
(2)序列号3的淀粉合成酶II型-B1基因编码的淀粉合成酶II型-B1蛋白质;
(3)序列号5的淀粉合成酶II型-D1基因编码的淀粉合成酶II型-D1蛋白质;
(4)序列号7的颗粒性淀粉合成酶-A1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-A1蛋白质;
(5)序列号9的颗粒性淀粉合成酶-B1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-B1蛋白质;及
(6)序列号11的颗粒性淀粉合成酶-D1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-D1蛋白质。
13.一种小麦,不具有下述蛋白质(1)至(3)所具有的酶活性中的2种以上酶活性,并且不具有下述蛋白质(4)至(6)所具有的酶活性中的2种以上酶活性,
(1)序列号1的淀粉合成酶II型-A1基因编码的淀粉合成酶II型-A1蛋白质;
(2)序列号3的淀粉合成酶II型-B1基因编码的淀粉合成酶II型-B1蛋白质;
(3)序列号5的淀粉合成酶II型-D1基因编码的淀粉合成酶II型-D1蛋白质;
(4)序列号7的颗粒性淀粉合成酶-A1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-A1蛋白质;
(5)序列号9的颗粒性淀粉合成酶-B1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-B1蛋白质;及
(6)序列号11的颗粒性淀粉合成酶-D1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-D1蛋白质。
14.一种小麦,是下述蛋白质(1)至(3)中的2种以上不表达的小麦,相比颗粒性淀粉合成酶蛋白质的表达组合与所述小麦相同、蛋白质(1)至(3)全部表达的小麦,其淀粉糊化后的粘度较小,
(1)序列号1的淀粉合成酶II型-A1基因编码的淀粉合成酶II型-A1蛋白质;
(2)序列号3的淀粉合成酶II型-B1基因编码的淀粉合成酶II型-B1蛋白质;
(3)序列号5的淀粉合成酶II型-D1基因编码的淀粉合成酶II型-D1蛋白质。
15.一种小麦,是下述蛋白质(1)至(3)中的2种以上不表达的小麦,相比颗粒性淀粉合成酶蛋白质的表达组合与所述小麦相同、蛋白质(1)至(3)全部表达的小麦,其淀粉糊化后的耐老化性提高,
(1)序列号1的淀粉合成酶II型-A1基因编码的淀粉合成酶II型-A1蛋白质;
(2)序列号3的淀粉合成酶II型-B1基因编码的淀粉合成酶II型-B1蛋白质;
(3)序列号5的淀粉合成酶II型-D1基因编码的淀粉合成酶II型-D1蛋白质。
16.一种小麦,其除去胚的成熟种子中含有0.1重量%以上葡萄糖。
17.一种小麦,其除去胚的成熟种子中含有0.1重量%以上麦芽糖。
18.一种小麦,其除去胚的成熟种子中含有1重量%以上蔗糖。
19.一种小麦,在支链淀粉的葡萄糖支链中,聚合度60以下的支链中,聚合度2~5的支链的数量的比例为3%以上。
20.一种食品,所述食品含有权利要求1~19中任一项所述的小麦或来自所述小麦的淀粉。
21.如权利要求20所述的食品,所述食品为焙烤食品。
22.一种工业制品,所述工业制品含有权利要求1~19中任一项所述的小麦或来自所述小麦的淀粉。
23.一种制品,所述制品利用权利要求1~19中任一项所述的小麦或来自所述小麦的淀粉进行加工。
24.一种特定小麦的筛选方法,其特征在于包括以下步骤,
检测下述基因变异体(7)至(9)中的1种以上的步骤:
(7)在序列号1的淀粉合成酶II型-A1基因中,至少位置124~412的碱基缺失及/或取代的淀粉合成酶II型-A1基因变异体;
(8)在序列号3的淀粉合成酶II型-B1基因中,至少在位置6145~6146之间插入1个以上碱基的淀粉合成酶II型-B1基因变异体;及
(9)在序列号5的淀粉合成酶II型-D1基因中,至少位置2590~2652的碱基缺失的淀粉合成酶II型-D1基因变异体;以及
检测以下蛋白质(4)至(6)中的1种以上的步骤:
(4)序列号7的颗粒性淀粉合成酶-A1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-A1蛋白质;
(5)序列号9的颗粒性淀粉合成酶-B1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-B1蛋白质;及
(6)序列号11的颗粒性淀粉合成酶-D1基因编码的颗粒性淀粉合成酶-D1蛋白质。
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