CN101168778A - 一种检测中国荷斯坦牛乳蛋白率性状的方法及试剂盒 - Google Patents

一种检测中国荷斯坦牛乳蛋白率性状的方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测中国荷斯坦牛乳蛋白率性状的方法及试剂盒。检测中国荷斯坦牛乳蛋白率性状的方法是检测中国荷斯坦牛自GenBank AccessionNo.NM_176608中自5′端第873位(即GHR外显子8的第279位)脱氧核糖核苷酸是T还是A，确定所述中国荷斯坦牛的基因型，然后通过基因型确定乳蛋白率性状。本发明的试剂盒包括用于PCR扩增含有自GenBank Accession No.NM_176608中自5′端第873位(即GHR外显子8的第279位)核苷酸的基因组片段的引物、限制性核酸内切酶SSpI、除所述引物外的PCR试剂和限制性核酸内切酶缓冲液。本发明方法及试剂盒操作简便、快速、灵敏，使用本方法及试剂盒检测到的结果可靠、稳定、准确。因此，本发明方法及试剂盒在动物的育种领域将有广阔的应用前景。

Description

一种检测中国荷斯坦牛乳蛋白率性状的方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测中国荷斯坦牛乳蛋白率性状的方法及试剂盒。
背景技术
目前世界上主要国家的奶牛平均单产水平可以分为三个层次：美国、加拿大、日本、以色列和欧盟属于第一个层次，奶牛平均单产在6000千克以上，这些国家以集约化圈养方式为主；澳大利亚、新西兰、阿根廷属于第二个层次，奶牛平均单产在4000千克左右，这些国家草原面积大，奶牛以放牧饲养为主，具有生产成本低的优势；中国、巴西、墨西哥等国家属于第三个层次，奶牛平均单产不足2000千克。可见我国奶牛平均单产水平、品种结构及生产性能远远低于奶业发达国家。
影响奶牛业生产效率的主要因素有四个，即优质高产的奶牛群、优质的饲料、良好的饲养管理条件和有效的防病治病措施。上述四个因素需要有遗传育种技术、营养饲料技术、饲养管理技术和疫病防治技术的实施来实现。其中，遗传育种技术的贡献最大，达到40％。因此，要想提高我国奶牛种质水平就要从奶牛育种这一关键环节做起。
伴随着遗传学理论的发展，奶牛育种技术也从表型值选择发展到育种值选择。尤其是分子数量遗传学的产生及其理论和技术的发展为动物育种提供了新的策略，使动物育种学家从操纵数量性状表型逐步过渡到操纵数量性状基因型，从由表型的选择转为标记辅助选择(Marker-Assisted Selection，MAS)(Soller andBeckmamn，1983)，最终实现分子育种。标记辅助选择是在基因组分析的基础上，通过DNA标记技术对畜禽数量性状座位进行直接选择，或通过标记辅助渗入导入有利基因，通过标记辅助淘汰清除不利基因等，从而达到更有效地改良畜禽的目的。
生长激素(growth hormone，GH)是调节动物生长发育和三大物质代谢过程的一个重要的内分泌因子。但是，由于GH为生物大分子，不能直接透过细胞膜，必须经过与靶细胞膜表面的生长激素受体(GHR)结合，由GHR介导，通过不同的途径将信号传到细胞内，从而产生一系列的生理效应。因此，GHR基因结构的变异可能会影响其表达蛋白的结构和功能，从而影响到GH的结合能力和信号转导过程，即GHR基因碱基序列发生突变可能影响到GH正常功能的发挥，最终影响到产奶、产肉等许多性状。因此，将GHR作为数量性状来研究其与生长性状和产奶性状的关系对牛的育种有很大的实践意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测中国荷斯坦牛乳蛋白率性状的方法。
本发明所提供的检测中国荷斯坦牛乳蛋白率性状的方法，是检测中国荷斯坦牛自GenBank Accession No NM_176608中自5′端第873位脱氧核糖核苷酸是T还是A，确定所述中国荷斯坦牛的基因型，然后通过基因型确定乳蛋白率性状；
所述基因型按照如下方法确定：如果自GenBank Accession No.NM_176608中自5′端第873位脱氧核糖核苷酸是T，其纯合体的基因型为TT；如果自GenBankAccession No.NM_176608中自5′端第873位脱氧核糖核苷酸是A，其纯合体的基因型为AA；它们的杂合体基因型为AT。
在实际应用中，本发明方法确定的乳蛋白率性状可作为中国荷斯坦牛育种的辅助选择标记。
TT基因型个体的第一泌乳期乳蛋白率高于所述AT基因型个体和AA基因型个体。
检测中国荷斯坦牛自GenBank Accession No.NM_176608中自5′端第873位脱氧核糖核苷酸是T还是A的方法包括如下步骤：先PCR扩增含有自GenBankAccession No.NM_176608中自5′端第873位核苷酸的基因组片段，然后对扩增产物进行测序或者用限制性核酸内切酶SSpI酶切扩增产物。PCR扩增的一对引物中，一个引物的核苷酸序列是序列表中序列1，另一个引物的核苷酸序列是序列表中序列2。
限制性核酸内切酶SSpI酶切所述PCR扩增产物，若只得到175bp片段，其基因型为AA纯合体；若得到175bp、151bp及24bp三个酶切片段时，其基因型为AT杂合体；若得到151bp和24bp两个片段时，其基因型为TT纯合体。
本发明的另一个目的是提供一种试剂盒，包括用于PCR扩增含有自GenBankAccession No.NM_176608中自5′端第873位(即GHR外显子8的第279位)核苷酸的基因组片段的引物(一个引物的核苷酸序列是序列表中序列1，另一个引物的核苷酸序列是序列表中序列2)、限制性核酸内切酶SSpI、除所述引物外的PCR试剂和限制性核酸内切酶缓冲液。
本发明的检测中国荷斯坦牛乳蛋白率性状的方法及试剂盒可在个体早期进行乳蛋白率的检测，加快育种进程，高效改善牛群的产奶性能。本发明的方法与常规乳蛋白率性状检测相结合，可提高检测的准确性和效率。本发明方法及试剂盒操作简便、快速、灵敏，检测的结果可靠、稳定、准确。
附图说明
图1为部分个体的基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
图2为部分个体的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
泳道M：DNA分子量标准100 ladder Marker，泳道1到14：PCR产物。
图3为部分个体的酶切分型结果。
泳道M为DNA分子量标准pBR322/MspI，泳道1、4-6、10-15、17、18、21、22为TT基因型，泳道2、7-9、16、20、23、24为AT基因型，泳道3为AA基因型。
图4为序列分析结果图，箭头所示为点突变碱基。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。
试剂：
(1)50×TAE(1L)：Tris碱242g、冰乙酸57.1ml，0.5mol/L的EDTA(pH＝8.0)100ml，加水充分溶解，定溶到1L。
(2)0.7％琼脂糖凝胶：将0.7g琼脂糖加入含有100ml 1×TAE的三角瓶中，微波炉加热。
(3)2.0％琼脂糖凝胶：将2.0g琼脂糖加入含有100ml 1×TAE的三角瓶中，微波炉加热。
(4)4.0％琼脂糖凝胶：将4.0g琼脂糖加入含有100ml 1×TAE的三角瓶中，微波炉加热。
实施例1、检测中国荷斯坦牛乳蛋白率性状
一、实验材料的选取
本研究中的中国荷斯坦牛来自北京三元集团绿荷奶牛养殖中心的13个牛场，共选择15头公牛后代，每头公牛的女儿数平均为76头(12-150头不等)，共计1145头(表1)。
表1公牛及其女儿数
  公牛编号     女儿数 公牛编号e     女儿数
  1     18 9     106
  2     20 10     52
  3     12 11     121
  4     118 12     14
  5     117 13     148
  6     150 14     104
  7     67 15     58
  8     40 共计     1145
二、检测中国荷斯坦牛的基因型
1、血液基因组DNA的提取
对上述1145头中国荷斯坦牛分别进行采血取样。采用血液基因组DNA提取试剂盒DP318(北京天根生化科技有限公司)分别对上述1145头牛进行基因组DNA提取，主要步骤如下：
             剪取200μl血凝块于1.5ml离心管中，剪碎
                              ↓
加500μl细胞裂解液CL，颠倒混匀，10000rpm离心1min，弃上清，留下细胞核沉
              淀，如裂解不彻底可重复以上步骤一次
                              ↓
      向离心管收集到的细胞核沉淀中加200μl缓冲液GS，混匀
                              ↓
                       加入20μl蛋白酶K
                              ↓
加220μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃消化10min左右，其间颠倒混匀数次至溶
                           液变清亮
                              ↓
    加220μl无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀
                              ↓
  倾入到CB3吸附柱中(吸附柱放入废液收集管中)，12000rpm离心30s
                              ↓
    加500μl去蛋白液GD，12000rpm离心30s，弃废液
                        ↓
    加700μl漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃废液
                        ↓
   将CB3吸附柱放回废液收集管中，12000rpm离心2min
                        ↓
将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，加入100μl洗脱液TB(洗脱液在60℃-70℃水浴预热，效果更好)，室温放置2-5min，12000rpm离心30s，将溶液收集到离心
                       管中
                        ↓
为增加基因组DNA的回收效率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱中，室温放置
    2min，12000rpm离心2min，将离心管中的DNA溶液4℃保存以备利用
用0.7％琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组DNA(图1)。
2、利用试剂盒检测中国荷斯坦牛的基因型
该试剂盒包括：PCR扩增的一对引物，其中一个引物的核苷酸序列是序列表中序列1，另一个引物的核苷酸序列是序列表中序列2；其它PCR扩增试剂；限制性核酸内切酶SSpI及其酶切缓冲液。
1)错配PCR引物设计
根据牛GHR核酸序列(NM_176608)，利用PIRA-PCR网络在线引物设计程序(http://cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/prime2.html)，在GHR基因外显子8的第279位点的两侧设计引物，上下游引物序列分别为：5’-AATACTTGGGCTAGCAGTGACAATAT-3’(F)(序列表中序列1)；5’-ACTGGGTTGATGAAACACTTCACTC-3’(R)(序列表中序列2)。该引物由上海生工生物工程公司合成。
2)PCR扩增
以步骤1所提取的基因组DNA为模板，用上述引物，分别对1145头牛进行PCR扩增。
PCR反应体系20μl：模板DNA(100ng/μl)，1μl；正反向引物(25pmol/μl)，各0.5μl；dNTP(2.5mmol/L)，1.5μl；TaqDNA聚合酶(2.5U/μl)，0.5μl；10×PCR缓冲液(含Mg2+)，2μl；ddH2O补足至20μl。
PCR扩增程序：94℃欲变性5min；然后94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 30s，共30个循环；最后72℃延伸7min。
用2％的琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测。
对1145头中国荷斯坦牛GHR基因的PCR扩增均得到一条清晰的175bp的DNA片段(图2)。
3)RFLP酶切分型：
酶切反应：取7.5μl PCR扩增产物，加入SSpI内切酶(10U/μl)0.5μl，内切酶缓冲液TA(10×buffer)1μl、BSA(1mg/ml)1μl，混和均匀。在水浴锅中37℃酶切2小时。
将酶切产物用4％琼脂糖凝胶进行电泳检测(图3)。
结果表明：共三种带型，分别为175bp、151bp、24bp。其中，由于24bp的片段太短，因此在胶图上无法显示出来。将得到的只有175bp片段的基因型命名为AA型，得到151bp和24bp二个片段的基因型命名为TT型，得到175bp、151bp和24bp三个片段的基因型命名为AT型(图3)。
该1145头试验母牛中TT基因型440头，AT基因型583头，AA型122头。
4)序列分析
将该1145头中国荷斯坦牛的175bpPCR产物直接测序(上海生工生物工程技术服务有限公司)。用Chromas软件进行序列拼接(图4)。
测序结果表明：所有AA基因型个体(122头)的GHR基因自GenBank AccessionNo.NM_176608中自5′端第873位(即GHR外显子8的第279位)脱氧核糖核苷酸是A，所有TT基因型个体(440头)的GHR基因自GenBank Accession No.NM_176608中自5′端第873位(即GHR外显子8的第279位)脱氧核糖核苷酸是T，所有AT基因型个体(583头)的GHR基因自GenBank Accession No.NM_176608中自5′端第873位(即GHR外显子8的第279位)脱氧核糖核苷酸既含有A又含有T，为杂合子基因型(图4)。图4中，N＝A或T。
对所有实验母牛重复进行PIRA-PCR和RFLP分析，两次实验结果完全一致。
3、基因型与乳蛋白率性状的关联分析
应用SAS.V8.02软件中的MIXED过程，采用动物模型对GHR基因自GenBankAccession No.NM_176608中自5′端第873位(即GHR外显子8的第279位)核苷酸的多态性与奶牛第一泌乳期(第一产次母牛的泌乳期)1145条记录的乳蛋白率性状进行关联分析。
关联分析的公式为y＝μ+hys+G+b×m+a+e，
其中，y：个体乳蛋白率的观察值
μ：总体均值
hys：场年季效应
G：基因型效应
b：协变量产犊月龄的回归系数
m：产犊月龄效应
a：个体随机加性遗传效应
e：随机残差效应
软件分析之前，需要对模型中的场年季固定效应进行原始数据的预处理。场年季效应实际上由三项指标综合而成：场、产犊年份和产犊季节。其中，月份5、6、7、8和9五个产犊月份归为季1；月份1、2、3、4、10、11和12则归为季2。13个北京奶牛场分别用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13表示。那么场年季效应的编号为：场年季＝场X 100000+年X 10+季。
305天乳蛋白率的计算，是利用305天产奶量和305天乳蛋白量计算得到的：
方差分析结果表明：对于第一泌乳期数据，GHR基因对乳蛋白率的效应在P＜0.01水平上达到显著(P＝0.0014)。进一步通过Bonferronit检验进行各基因型之间对乳蛋白率性状的多重比较，最小二乘均值及标准误见表2。
分析结果表明：基因型AT与基因型TT对乳蛋白率的效应在P＜0.01水平上差异显著，基因型AA与基因型TT对乳蛋白率的效应在P＜0.05水平上差异显著(表2)。
表2不同基因型乳蛋白率性状的最小二乘均值及标准误
基因型 个体数     乳蛋白率(％)LSM±SE
    TT     440     3.23Aa±0.011
    AT     583     3.19Bb±0.0096
    AA     122     3.18b±0.018
注：小写字母标注的数值在同列中p＜0.05水平上差异显著
大写字母标注的数值在同列中p＜0.01水平上差异显著
序列表
<160>2
<210>1
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
aatacttggg ctagcagtga caatat    26
<210>2
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
actgggttga tgaaacactt cactc     25

Claims (8)

1.一种检测中国荷斯坦牛乳蛋白率性状的方法，是检测中国荷斯坦牛自GenBank Accession No NM_176608中自5′端第873位脱氧核糖核苷酸是T还是A，确定所述中国荷斯坦牛的基因型，然后通过基因型确定乳蛋白率性状；
所述基因型按照如下方法确定：如果自GenBank Accession No.NM_176608中自5′端第873位脱氧核糖核苷酸是T，其纯合体的基因型为TT；如果自GenBankAccession No.NM_176608中自5′端第873位脱氧核糖核苷酸是A，其纯合体的基因型为AA；它们的杂合体基因型为AT。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述TT基因型个体的第一泌乳期乳蛋白率高于所述AT基因型个体和AA基因型个体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述检测中国荷斯坦牛自GenBank Accession No.NM_176608中自5′端第873位脱氧核糖核苷酸是T还是A的方法包括如下步骤：先PCR扩增含有自GenBank Accession No.NM_176608中自5′端第873位核苷酸的基因组片段，然后对扩增产物进行测序或者用限制性核酸内切酶SSpI酶切扩增产物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的一对引物中，一个引物的核苷酸序列是序列表中序列1，另一个引物的核苷酸序列是序列表中序列2。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述限制性核酸内切酶SSpI酶切所述PCR扩增产物，若只得到175bp片段，其基因型为AA纯合体；若得到175bp、151bp及24bp三个酶切片段时，其基因型为AT杂合体；若得到151bp和24bp两个片段时，其基因型为TT纯合体。
6.一种试剂盒，包括用于PCR扩增含有自GenBank Accession No.NM_176608中自5′端第873位核苷酸的基因组片段的引物，和限制性核酸内切酶SSpI。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增的一对引物中，一个引物的核苷酸序列是序列表中序列1，另一个引物的核苷酸序列是序列表中序列2；
所述试剂盒还包括除所述引物外的PCR试剂和限制性核酸内切酶缓冲液。
8.权利要求1至5中任一所述的方法，或权利要求6或7所述的试剂盒在中国荷斯坦牛标记辅助选择中的应用。
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