CN101166537B - 全血中基因的体外表达作为评定对饮食补充物个体差异的模型 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于为个体定制给药饮食组分例如补充物的方法。在该方法中，哺乳动物的全血被暴露于饮食组分。在暴露于所述饮食组分之后在某些情况中是在进一步刺激被暴露的血细胞之后，对白细胞中与疾病状态相关的标记物mRNA水平进行检测。通过将暴露后的mRNA水平与在未被暴露的血细胞中所得到的数值进行比较，可以确定所述饮食组分在哺乳动物中将发挥何种作用。通过针对许多可能的饮食组分的哺乳动物血液筛选，可以开发出一组优化的饮食组分，其对具体的哺乳动物进行定制以治疗或者防止疾病状态。

Description

全血中基因的体外表达作为评定对饮食补充物个体差异的模型
技术领域
本发明涉及一种定制给药饮食组分例如补充物的方法。在该方法中，哺乳动物的全血被暴露于饮食组分。在暴露于饮食组分之后，在某些情况中是在进一步刺激被暴露的血细胞之后，检测与疾病状态相关的标记物mRNA在白细胞中的水平。通过将暴露之后的mRNA水平与未暴露的血细胞中所得到的数值进行比较，可以确定在哺乳动物中所述饮食组分将具有什么样的作用。通过对许多可能的饮食组分的哺乳动物血液筛选，可以开发出为具体的哺乳动物定制的最佳饮食组分组，以治疗或者预防疾病状态。
背景技术
已知饮食组分(补充物)，例如维生素、多酚、姜黄等会在培养的细胞和动物中诱导各种生物学活性，这些活性中的一些已经被后续的临床研究所证实。这些活性中的一些也被认为对患者具有作用，其结果是各种疾病状态。例如，那些提高免疫系统组分活性的饮食组分可以被认为具有抵抗某些癌症的作用，而降低某些免疫系统组分活性的饮食组分可以在自体免疫疾病的情况下有疗效。然而，难以采用临床研究结果来为特定的个人设计个性化的饮食组分组合。如果在研究人群中同时存在应答者和无应答者，并且无应答者人群基本上大于应答者人群的话，则双盲临床试验将不再能够鉴定那些能够预期具有功效的饮食组分。而且，基因分型或者单核苷酸多态性分析仅仅可以在目的基因和热点已经被表征后用于饮食最佳化。所谓定制、个性化或者个体化的药物或者营养物的价值在科学团体和全体公众中都得到认识(参见Jain，KK，″Personalized medicine，″Curr Opin Mol Ther 2002；4：548-58)。然而，可以应用的技术仍然是有限的。
各种报道已经显示饮食补充物的血液水平。期望将在已知标准血液水平上的各种饮食补充物的已知或者猜测作用与被考虑进行饮食治疗的哺乳动物的试剂个体结果进行比较。这将能够对来自其全血的哺乳动物白细胞中每种补充物的功效进行评定，其以设计哺乳动物的饮食或者饮食补充物组为目的。这些在白细胞中的作用将可以用于炎症、癌症免疫、自体免疫性疾病等。然而，还没有完成这些的有效方法，特别是在体外环境下没有。
发明内容
本发明公开了为哺乳动物个体定制饮食组分例如补充物的方法，其基于在将哺乳动物的全血暴露于候选饮食组分之后检测白细胞中标记物mRNA的水平。
在本发明的一个实施方式中，提供了一种评定饮食组分在哺乳动物中抵抗癌症或者自体免疫紊乱的潜在效率的方法，该方法包括：将哺乳动物的全血暴露于饮食组分；在暴露之后，检测与癌症或者自体免疫紊乱相关的mRNA的量；以及基于检测结果鉴定所述饮食组分在所述哺乳动物中的潜在效率，其中mRNA量的变化与所述饮食组分的潜在效率相关。
在更进一步的方面中，检测未被暴露的全血中所出现的mRNA的量，并通过将从未被暴露的全血中所检测到的mRNA的量与从被暴露的全血中所检测到的mRNA的量进行比较来确定mRNA量的改变。
在更进一步的方面中，所述方法还包括：在暴露之后，将所述全血暴露于刺激剂；以及评定饮食组分的潜在效率包括将从未被暴露的全血中获得的检测结果与在暴露于饮食组分和刺激剂之后所获得的检测结果进行比较。
在更进一步的方面中，所述刺激剂选自由植物凝集素、辐射(radiation)和热聚(heat-aggregated)IgG所组成的组中。
在更进一步的方面中，在检测mRNA的量之前，将未被暴露的全血暴露于对照载体(vehicle)。
在更进一步的方面中，所述对照载体是磷酸盐缓冲液或者二甲基亚砜。
在更进一步的方面中，暴露全血包括加入肝素。
在更进一步的方面中，所述全血被刺激5个小时或者更少。
在更进一步的方面中，所述全血被刺激30分钟至4个小时。
在更进一步的方面中，所述mRNA选自由编码下列的mRNA所组成的组中：白介素-2、白介素-4、肿瘤坏死因子α、IgG Fc受体、p21、Fas配体、肿瘤坏死因子超家族成员3，以及肿瘤坏死因子超家族成员15。
在更进一步的方面中，所述饮食组分选自由下列所组成的组中：维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、表没食子儿茶素没食子酸酯、γ-亚油酸(g-linoleicacid)、金雀异黄素、姜黄色素、栎精、老蒜(aged garlic)、伞蕈(Agaricus)、蜂胶、桑黄(meshimakobu)、诺丽提取物(noni extract)、烷氧基甘油和墨角藻聚糖。
在本发明更进一步的实施方式中，提供了一种检测选自由维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、表没食子儿茶素没食子酸酯、γ-亚油酸、金雀异黄素、姜黄色素、栎精、老蒜、伞蕈、蜂胶、桑黄、诺丽提取物、烷氧基甘油和墨角藻聚糖所组成组中的饮食组分在哺乳动物中潜在抗癌效率的方法，其包括：将哺乳动物的全血暴露于所述饮食组分持续4小时或者更少；检测被暴露的全血和未被暴露的全血的血细胞中编码IgG Fc受体的mRNA的量；将从被暴露的全血和未被暴露的全血的血细胞中所获得的检测结果进行比较；以及基于比较结果鉴定所述饮食组分的潜在抗癌效率，其中mRNA量的变化与所述饮食组分的效率相关。
在本发明更进一步的实施方式中，提供了一种检测选自由维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、表没食子儿茶素没食子酸酯、γ-亚油酸、金雀异黄素、姜黄色素、栎精、老蒜、伞蕈、蜂胶、桑黄、诺丽提取物、烷氧基甘油和墨角藻聚糖所组成组中的饮食组分在哺乳动物中潜在抗癌效率的方法，该方法包括：将哺乳动物的全血暴露于所述饮食组分持续4小时或者更少；使用辐射对哺乳动物被暴露的全血和未被暴露的全血进行刺激；在所述刺激之后，检测被暴露的全血和未被暴露的全血的血细胞中编码p21或PUMA基因产物的mRNA的量；将从被暴露的全血和未被暴露的全血的血细胞中所获得的检测结果进行比较；以及基于比较结果鉴定所述饮食组分的潜在抗癌效率，其中mRNA量的变化与所述饮食组分的效率相关。
在本发明更进一步的实施方式中，提供了一种检测选自由维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、表没食子儿茶素没食子酸酯、γ-亚油酸、金雀异黄素、姜黄色素、栎精、老蒜、伞蕈、蜂胶、桑黄、诺丽提取物、烷氧基甘油和墨角藻聚糖所组成组中的饮食组分在哺乳动物中潜在抗癌或抗自体免疫紊乱效率的方法，其包括：将哺乳动物的全血暴露于所述饮食组分持续4小时或者更少；使用植物凝集素对哺乳动物被暴露的全血和未被暴露的全血进行刺激；在所述刺激之后，检测被暴露的全血和未被暴露的全血的血细胞中编码选自由白介素-2、白介素-4、肿瘤坏死因子α和Fas配体所组成组中的蛋白质的mRNA的量；将从被暴露的全血和未被暴露的全血的血细胞中所获得的检测结果进行比较；以及基于比较结果鉴定所述饮食组分的潜在抗癌或抗自体免疫紊乱效率，其中mRNA量的变化与所述饮食组分的效率相关。
附图说明
图1表示在使用植物凝集素对全血进行刺激后，白细胞中IL-2、IL-4和TNF-αmRNA水平的检测结果；
图2表示在将全血暴露于各种饮食组分后，白细胞中CD32A mRNA水平的检测结果；
图3表示在将全血暴露于各种饮食组分和辐射刺激后，白细胞中p21mRNA水平的检测结果；
图4表示在将全血暴露于各种饮食组分和植物凝集素刺激后，白细胞中Fas配体mRNA水平的检测结果；
图5～7表示在将全血暴露于各种饮食组分和热聚IgG刺激后，肿瘤坏死因子超家族成员3和15mRNA水平的检测结果。
具体实施方式
在本发明的实施方式中，评定个体对各种饮食组分例如饮食补充物的响应差异。“饮食组分”是指形成哺乳动物饮食部分的任何化合物或者物质，而“饮食补充物”表示那些有益的饮食组分例如维生素和天然提取物，其被用于补充哺乳动物的饮食。在体外将肝素化的人全血与每种饮食组分进行孵育，并通过对被暴露于饮食补充物的白细胞中以及没有被暴露的白细胞中与病症(例如癌症、自体免疫疾病等)相关的基因表达进行定量，评定暴露于饮食组分所诱导的基因表达的变化。在某些情况下，在对mRNA水平进行定量之前，使用刺激剂例如植物凝集素、辐射或热聚IgG(″HAG″)对全血进行刺激。另外，对于某些饮食补充物，在对未被暴露的全血的mRNA水平进行定量之前，将所述血暴露于通常在其中溶解所述饮食补充物的载体。
发现某些饮食组分会提高或者抑制基因表达；但是鉴定了个体与个体间的实质差异，这种差异是统计学上显著的。对于给定的个体，通过将该个体的全血暴露于特定的饮食组分所诱导的mRNA的变化，将与饮食组分在预防或者治疗与所述mRNA相关的病症中的潜在效率相关。正相关和负相关都是有可能的；正相关将表示所述饮食组分将有效的抵抗所述病症，而负相关将表示所述饮食组分在个体中将没有效果并且不应该被使用。mRNA水平的提高或者降低都可以作为所述饮食组分抵抗病症的潜在效率的信号，这依赖于病症的特征以及被定量的mRNA。例如，与免疫系统活性相关的mRNA(例如白介素-2(T细胞激活的标记物))水平的提高，可以与抗癌的潜在效率正相关，而相同mRNA水平的降低可以与抵抗自体免疫疾病的效率正相关。从筛选个体血针对许多饮食组分获得的数据可以用于设计一种饮食，为治疗或者预防与所定量的mRNA相关的疾病，例如癌症，优选该饮食。
这种方法在工业上可以用于发现未加工的天然产品中所包含的普遍活性组分。在健康保健领域，所述方法将在涉及个性化饮食治疗中提供新的可能性。
根据本发明的实施例，将对本发明进行更详细的解释；然而，这些实施例不应该被解释为限制本发明。
实施例1
为了尽可能接近地评定白细胞在生理病症中的功能，本发明方法的实施例采用全血，而没有分离具体的白细胞群。作为抗凝血剂，柠檬酸葡萄糖溶液和乙二胺四乙酸钙螯合剂，一种对于许多生物活性关键的组分(参见Eggesbo等人，″LPS induced release of IL-1 beta，IL-6，IL-8 and TNF-alpha in EDTA orheparin anticoagulated whole blood from persons with high or low levels of serumHDL，″Cytokine 1996；8：152-60)，肝素被用作该实施例的抗凝血剂。因为mRNA转录是蛋白质合成和后续生物活性的上游事件，所以在本发明的实施例中采用mRNA水平作为与所述mRNA所编码的蛋白质相关的生物活性的指示。本发明的实施例采用一种定量mRNA的方法，其能够鉴定基因表达中小到20％～40％的变化(参见Mitsuhashi M.，″Absolute quantitation of mRNA inhuman blood leukocytes as a model for phenotypic gene expression-baseddiagnostics，″Clin Chem，2006)。
在该实施例中，以下面的方式对植物凝集素所诱导的白介素-2(IL-2)、白介素(IL-4)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的基因表达进行定量。将50μL肝素化的全血与各种饮食补充物孵育30分钟的时间。采用下面的补充物：维生素A、维生素C和维生素D、表没食子儿茶素没食子酸酯(来自绿茶)、金雀异黄素(来自大豆)和姜黄色素(来自姜黄(spice turmeric))。已知维生素A会刺激免疫系统。维生素C表现出提高T细胞的活性。维生素D表现出对某些癌症具有保护性效果。表没食子儿茶素没食子酸酯是效力强大的抗氧化剂，表现出能够降低癌细胞中所发现的多药抗性，并优选诱导瘤细胞的凋亡。在许多研究中已经发现金雀异黄素具有抗癌活性；其功能的可能机制包括增量调节凋亡，抑制血管生成、抑制DNA拓扑异构酶II和抑制蛋白质酪氨酸激酶。姜黄色素在瘤细胞中具有促进凋亡的作用，并且干扰通常在这些细胞中高度过表达的转录因子NF-κB的活性。
在与所述饮食补充物进行孵育之后，加入100μg/mL的植物凝集素(PHA)，并在37℃下将孵育额外持续2个小时。每种饮食补充物的含量(参见表I，注解)都比所报道的血液水平稍高。如下所描述的，接着纯化mRNA，合成cDNA，并如以下所述，通过TaqMan实时聚合酶链式反应(PCR)对IL-2、IL-4和TNF-α的水平进行定量(参见Holland等人，″Detection of specificpolymerase chain reaction product by utilizing the 5′to 3′exonuclease activity ofThermus aquaticus DNA polymerase，″Proc Natl Acad Sci USA 1991；88：7276-80)。
从被暴露于饮食组分的全血以及保持未被暴露的全血中制备mRNA和cDNA。简言之，将自制的96孔过滤板(filterplate)置于收集板之上，并应用150μL 5mM Tris(pH 7.4)。接着在4℃下，以120×g离心1分钟，将50μL血样应用到每个孔，并立即在4℃下120×g离心2分钟，接着对每个孔使用300μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行清洗一次，并在4℃下2000×g离心5分钟。接着，将60μL裂解缓冲液贮液(stock lysis buffer)应用到过滤板，然后在37℃下孵育10分钟，其中所述裂解缓冲液贮液含有例如0.5％月桂酰肌氨酸、4×SSC、10mM Tris HCl，7.4、1mM EDTA、0.1％IGEPAL CA-630和1.791M硫氰酸胍，并被补充1％2-巯基乙醇(Bio Rad，Hercules，CA，USA)、0.5mg/mL蛋白酶K(Pierce，Rockford，IL，USA)、0.1mg/mL鲑鱼精子DNA(5 Prime Eppendorf/Brinkmann，Westbury，NY，USA)、0.1mg/mL大肠杆菌(E.coli)tRNA(Sigma)、10mmol/L在表2中所示的每种特异性反向引物混合物(cocktail)以及标准的RNA34寡聚核苷酸。接着将过滤板置于固定寡聚(dT)的微孔板(GenePlate，RNAture)上，并在4℃下2000×g离心5分钟。在4℃下存储过夜后，使用100μL单纯(plain)裂解缓冲液对微孔板进行清洗3次，接着在4℃下使用150μL清洗缓冲液(0.5M NaCl，10mM Tris(pH 7.4)，1mM EDTA)清洗3次。通过加入30μL含有1×RT-缓冲液、1.25mM每种dNTP、4单位rRNasin以及80单位MMLV反转录酶(Promega)(不含引物)的缓冲液并在37℃下孵育2小时，在每个孔中直接合成cDNA。特异性引物引导的cDNA存在于溶液中，寡聚(dT)-引导的cDNA保持固定在微孔板上。对于TaqMan PCR，将所得到的4μL cDNA直接转到384孔PCR板中，向其中应用5μL TaqMan通用主体混合物(master mix)(ABI)以及1μL寡聚核苷酸混合物(正向和反向引物每种都为15μM以及3～6μM TaqMan探针)，在PRISM 7900HT(ABI)中进行PCR，其通过一个循环的95℃下10分钟，接着45个循环的95℃下30秒、55℃下30秒以及60℃下1分钟。也可以采用SYBR Green PCR；对于该PCR，将cDNA在水中稀释3～4倍，并将4μl cDNA溶液直接转移到384孔PCR板中，向其中应用5μl主体混合物(BioRad，Hercules，CA)和1μl寡聚核苷酸混合物(正向和反向引物每种都为15μM)，在PRISM 7900HT(ABI)中进行PCR，其通过一个循环的95℃下10分钟，接着45个循环的95℃下30秒以及60℃下1分钟。在单独的孔中扩增每一种基因。通过分析软件(SDS，ABI)确定Ct。
选择IL-2、IL-4和TNF-α分别作为T-细胞激活、IgE级联反应(可能的过敏反应)激活和细胞毒性的标记物。为了进行精确的统计分析(研究者的t-检验)，使用3等份的全血作为起始材料。数据被表达为循环阈值(Ct)，其是产生一定量的PCR产物所需要的PCR循环数(图1)，将使用PHA刺激的样品的Ct减去未刺激的样品的Ct所得到的ΔCt，将使用饮食补充物处理的样品的ΔCt减去未处理的对照样品的ΔCt所得到的ΔΔCt(表I)。因为Ct是对数标度(log scale)的，因此1个ΔCt或者ΔΔCt意味着两倍量或一半量，负的ΔCt意味着表达的提高。
图1表示全血中PHA诱导的基因表达。将50μL肝素化的全血与各种浓度(A)或者100μg/mL(B)的PHA在37℃下孵育2小时(A)或各种时间长度，接着根据上面所描述的，对IL-2(■)、IL-4(▲)和TNFα(◆)的水平进行定量。每个数据都是来自三等份全血的平均Ct±标准偏差，。
正如图1所示，PHA以剂量依赖的模式诱导IL-2、IL-4和TNF-α mRNA的表达，其EC50大约是10～20μg/mL(图1A)。mRNA的诱导是快速的，并在30～60分钟之后达到稳定水平(plateau)(图1B)。为了避免对PHA自身的次级作用，PHA剂量和孵育时间被固定在最大水平(100μg/mL和120分钟)。如表I所示，饮食补充物对每种mRNA的作用都表现出实质性的个体差异。因为使用100μg/mLPHA的基因表达是过饱和的(图1A)，因此低于-0.65ΔΔCt的变化显著，具有统计学显著性。令人感兴趣的是，在所有7个实例中，绿茶表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)都增强PHA所诱导的IL-4表达，但它的作用对IL-2和TNF-α的作用表现出个体差异(表I)。对于IL-2和IL-3，7个人表现出降低，1个人表现出提高，3个人没有变化(表I)。姜黄的姜黄色素(Cur.)在2个实例中显著地降低IL-2、IL-4和TNF-α的表达，但在其他5个人中没有变化(表I)。维生素A、维生素C和维生素D除了1-3例外，全部都增强IL-4的表达(表I)。大豆金雀异黄素(在表I中标记为“Gen”)主要是没有活性的，但某些个体表现出显著的应答(表I)。
表I饮食补充物在体外对有丝分裂素诱导的基因表达的作用
Figure 2006800141361A00800011
*VA：维生素A(终浓度＝100nM)，VC：维生素C(10μg/mL)，VD：维生素D(100nM)，EGCG：表没食子儿茶素没食子酸酯(绿茶)(10μM)，Gen：金雀异黄素(大豆)(2μM)，Cur.：姜黄色素(姜黄(turmeric))(200nM)。
**黑体：显著增强；下划线斜体：显著抑制
表2基因引物序列
Figure 2006800141361A00800021
实施例2
在本发明的方法的该实施例中，在个体的白细胞中评定CD32AmRNA的表达。这种mRNA编码IgG Fc受体，并涉及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。提高CD32A mRNA水平的饮食组分将被预计能够推动个体的ADCC活性，并因此提供直接的抗癌活性。可选择地，这些饮食组分能够增强最近开发的昂贵的基于单克隆抗体的治疗(例如曲妥单抗(trastuzumab)(Herceptin)或者利妥昔单抗(rituximab)(Rituxan))的效率，其通过同时提高循环的白细胞中的IgG Fc受体mRNA水平。这里所描述的方法可以用于检测CD32A mRNA水平，除了未采用刺激剂如植物凝集素以外。它们的引物序列被表示在上面的表2中。
所采用的饮食补充物是：维生素A(″VA″；100nmol/L，终浓度)、维生素C(″VC″，10mg/mL)、维生素D(″VD″，100nmol/L)、维生素E(″VE″；1IU/mL)、表没食子儿茶素没食子酸酯(从绿茶获得的卡瑟森(cathecin)多酚)(″EGC″或″卡瑟森(cathecin)″；10mmol/L)、γ-亚油酸(植物油中的多不饱和脂肪酸)(″rLA″；1mg/mL)、金雀异黄素(大豆)(″Gen″；2mmol/L)、姜黄色素(″Cur″；姜黄(spice turmeric))(200nmol/L)、栎精(″Que″；植物色素类黄酮)(100nmol/L)、老蒜(Kyolic(″Kyo″)，全长)、落叶松蕈(″Aga″；Kyowa，全长)、蜂胶(″Pro″；1∶10稀释)、桑黄(″Mesh″)、诺丽提取物(noniextract)(″Noni″)以及鲨鱼肝油(″Alk″；烷氧基甘油)(剂量未确认)。所有这些饮食组分都被报道对免疫系统或者癌症有作用，或者对两者都有作用。除了在上面实施例1中所讨论的饮食组分外，已知维生素E对免疫吞噬作用有强大的作用，并对动物特别是在压力下在降低对感染的易感性方面已经表现出有益。缺乏γ-亚油酸会导致免疫系统的缺陷；其是产生支持免疫的前列腺素的中间产物。栎精已经表现出推动大鼠中自然杀伤细胞的活性，并抑制肥大细胞、嗜碱粒细胞和嗜中性白细胞的脱粒。老蒜提取物已经被用作免疫系统推进剂几十年。蕈蘑菇(Agaricus mushrooms)例如姬松茸(Agaricus blazei)的提取物已经表现出具有抗肿瘤作用。蜂胶，一种从蜂房(bee hive)获得的抗生素，其含有咖啡酸苯乙酯，其在动物模型中已经表现出防止癌形成。蜂胶通过提高凋亡过程抑制癌细胞的生长。桑黄(Phellinus linteus)是重要的药用蘑菇，其含有抗肿瘤的β-葡聚糖；其水提取物已经表现出抑制肿瘤的增殖。诺丽提取物是从印度桑树(Morinda citrifolia)的果实获得的，其含有被称作noni-ppt的富含多糖的物质，其已经表现出显著延长患有肺部肿瘤的老鼠的存活持续时间。例如在鲨鱼肝油中所发现的烷氧基甘油已经被采用为抗癌治疗剂和免疫增强剂。可以被采用的其他饮食组分是墨角藻聚糖，其是从海藻获得的，并且已经表现出抑制肿瘤细胞入侵和提高免疫系统组分水平。在该实施例中，采用磷酸缓冲液作为对照。
孵育是在37℃下进行3个小时。接着对CD32AmRNA进行定量，图2表示了这些结果。空心圆表示p＜0.05。每个符号都是平均值±S.D.，其中S.D.来自三等份50mL的肝素化全血。大豆金雀异黄素的血浆浓度被报道在单次食用大豆之后8小时为4mmol/L。因此，在全血中与2mmol/L大豆金雀异黄素进行3小时孵育是合理可以达到的。
在该个体中的结果表示饮食组分维生素D和E、表没食子儿茶素没食子酸酯、γ-亚油酸、金雀异黄素、蜂胶和诺丽提取物将适合在该个体中用于被优化为抗癌活性的饮食中。
实施例3
在该实施例中，四个个体的肝素化全血与各种饮食补充物在37℃下预孵育1～2个小时(与实施例2中相同的血浓度)，接着使用1Gy幅射进行刺激。然后将血在37℃下孵育2个小时。接着使用实施例1中所描述的方法对p21mRNA的水平进行评定。表2中提供了这些引物的序列。选择p21 mRNA作为凋亡标记物，其能够指示每种饮食组分对DNA损伤响应的作用。作为p21的替代，可以对PUMA(p53增量调节的凋亡调控因子)mRNA进行定量。
结果表示在图3中。在该图中，空心圆表示没有进行幅射刺激而得到的数值，而实心圆表示使用幅射所得到的数值。每个符号都是平均值±S.D.，其中S.D.来自三等份50mL的肝素化全血。
正如在图中所表示的，个体对饮食组分的响应大不相同。这些结果可以用于设计个体的饮食，其被优化用于通过促进瘤细胞中的凋亡治疗或者预防癌症。
实施例4
在该实施例中，两个个体的肝素化全血与各种饮食补充物在37℃下预孵育1～2个小时(与实施例2中相同的血浓度)，接着使用植物凝集素进行刺激。接着，将血在37℃下孵育2个小时。接着使用实施例1中所描述的方法对Fas配体(FasL)mRNA的水平进行评定。表2中提供了这些引物的序列。选择Fas配体mRNA作为凋亡标记物，其能够指示每种饮食组分对促进凋亡的作用。
结果表示在图4中。在该图中，实心符号表示与对照没有显著区别的数值，交叉阴影的符号表示代表与对照数值比显著提高的数值(p＜0.05)，空心符号表示与对照数值比显著降低的数值(p＜0.05)。每个符号都是平均值±S.D.，其中S.D.来自三等份50mL的肝素化全血。
如图4所示，对所述饮食组分的个体响应相当不同。这些结果可以用于设计个体的饮食，其被优化用于通过促进瘤细胞中的凋亡治疗或者预防癌症。
实施例5
在该实施例中，两个个体的肝素化全血与各种饮食组分在37℃下预孵育30分钟(与实施例2中相同的血浓度)，接着使用1.2μL热聚IgG进行刺激。热聚IgG(HAG)是通过在PBS中在63℃下对20mg/mL人IgG(Sigma，St.Louis)加热15分钟制备的(参见Ostreiko等人，Immunol Lett.15，311(1987)，这里作为参考加以引入)。接着，将血在37℃下孵育2个小时。接着除了使用SYBR Green PCR定量mRNA外，使用实施例1中所描述的方法对TNFSF3和TNFSF15 mRNA的水平进行评定。TNFSF3也被认为是淋巴毒素-α(LT-α)、肿瘤坏死因子-β(TNF-β)和淋巴毒素-β(LT-β)。分泌的LT-α装配成可溶的同源三聚体，LT-α3。所分泌的LT-α也会与膜连接(memberane-associated)的LT-β形成复合体以产生两类异源三聚体，LT-α1/β和LT-α2/β1。TNFSF3是由激活的初生(naive)CD4细胞、非极化分泌IL-2的效应细胞和Th1效应细胞所表达的，并且TNFSF3受体是由许多肿瘤细胞所表达的。TNFSF15也被称作TL1A，其是属于TNF超家族的II型跨膜蛋白。TNFSF15主要在内皮细胞中表达，其表达由TNF-α和IL-1α所诱导。TNFSF15以高亲和力与死亡受体3(DR3)结合，其目前被称作TNF受体超家族成员25(TNFRSF25)。根据细胞环境，DR3通过TNFSF15的连接能够激发两条信号通路之一：转录因子NF-κB的激活，或者天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)和凋亡的激活。
上面的表2中提供了这些引物的序列。这些mRNA被选择为凋亡标记物，其能够指示每种饮食组分对免疫系统活性和凋亡响应的作用。
这些结果被表示在图5、图6和图7中。在图5中，空心圆表示使用PBS作为对照从实例1获得的TNFSF3值，而实心圆表示在使用HAG刺激时所获得的TNFSF3值。而且，灰色阴影的圆表示HAG诱导TNFSF3在被暴露于栎精的血中表达。因为TNFSF3受体在某些癌细胞上表达，因此该基因表达的提高可以提高这些细胞的凋亡，因此栎精可以是在对个体具有抗癌性能的饮食中所包含的良好候选。空心的三角和实心的三角表示来自实例2的相同数值。图5中的Y-轴数值表示循环阈值(Ct)。每个符号都是平均值±S.D.，其中S.D.来自三等份50mL的肝素化全血。图6和图7表示在两个实例中对TNFSF15的定量结果(图6)，以及在另外5个实例中仅给药维生素A的结果(图7)。正如可以从图6中看出的，维生素A在一个实例中(实例1)降低了TNFSF-15表达的基线，并消除了对HAG的作用。在图7中所表示的重复(follow-up)数据中，维生素A在实例1中以及在总共7个实例的两个中(两幅图中都有实例1)，对HAG-所诱导的TNFSF15的表达表现出抑制作用。在诸如实例1的实例中，维生素A可以用于治疗或者预防免疫系统被不适当地激活的病症例如自体免疫疾病。
在上面所描述的实施例中，采用已经确定血液水平的饮食补充物。然而，在该方法的其他实施方式中，各种天然产物的粗提取物都可以被筛选以鉴定活性组分。通过选择适当的mRNA目标，可以完成各种功能。选择对通过进行定量以鉴定饮食组分对特定病症的潜在效率的适当mRNA，是本领域技术人员的能力范围之内的。这些结果证明体外的生理基因表达分析是用于鉴定饮食补充物在个体中效率的适当方法。负响应即使在高浓度的饮食补充物的情况下也能够揭示这些人不太可能预计白细胞功能被所测试的饮食补充物在采血时达到期望的放大或者抑制。尽管该研究采用了具体的饮食补充物，但是该方法能够相同地应用于其他饮食组分例如具体的食物。

Claims (13)

1.一种检测饮食组分在个体哺乳动物中抵抗癌症或者自体免疫紊乱的潜在效率的方法，该方法包括：
在体外将哺乳动物的全血暴露于所述饮食组分；
在所述暴露之后，检测所述全血中mRNA的量，其中，所述mRNA与所述癌症或者自体免疫紊乱相关，所述mRNA选自由编码下列的mRNA所组成的组中：白介素-2、白介素-4、肿瘤坏死因子α、IgGFc受体、Fas配体、肿瘤坏死因子超家族成员3以及肿瘤坏死因子超家族成员15；以及
基于检测结果鉴定所述饮食组分在所述哺乳动物中的潜在效率，其中，mRNA量的变化与所述饮食组分的潜在效率相关，
检测未被暴露的全血中存在的所述mRNA的量，并通过将从未被暴露的全血中所检测到的所述mRNA的量与从被暴露的全血中所检测到的所述mRNA的量进行比较，以确定所述mRNA量的改变。
2.根据权利要求1所述的方法，该方法还包括：
在所述暴露之后，将所述全血暴露于刺激剂；以及
检测所述饮食组分的潜在效率，包括将从未被暴露的全血中获得的检测结果与在暴露于所述饮食组分和所述刺激剂之后所获得的检测结果进行比较。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述刺激剂选自由植物凝集素、幅射和热聚IgG所组成的组中。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，在检测所述mRNA的量之前，将未被暴露的全血暴露于对照载体。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述对照载体是磷酸盐缓冲液或者二甲基亚砜。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，暴露全血包括加入肝素。
7.根据权利要求2所述的方法，其中，所述全血被刺激5个小时或者更少。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述全血被刺激30分钟至4个小时。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述饮食组分选自由下列所组成的组中：维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、表没食子儿茶素没食子酸酯、γ-亚油酸、金雀异黄素、姜黄色素、栎精、老蒜、伞蕈、蜂胶、桑黄、诺丽提取物、烷氧基甘油和墨角藻聚糖。
10.一种检测选自由维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、表没食子儿茶素没食子酸酯、γ-亚油酸、金雀异黄素、姜黄色素、栎精、老蒜、伞蕈、蜂胶、桑黄、诺丽提取物、烷氧基甘油和墨角藻聚糖所组成组中的饮食组分在哺乳动物中潜在抗癌效率的方法，该方法包括：
将所述哺乳动物的全血暴露于所述饮食组分持续4小时或者更少；
检测所述被暴露的全血和未被暴露的全血的血细胞中编码IgG Fc受体的mRNA的量；
将从所述被暴露的全血和未被暴露的全血的血细胞中所获得的检测结果进行比较；以及
基于比较结果鉴定所述饮食组分的潜在抗癌效率，其中，所述mRNA量的变化与所述饮食组分的效率相关。
11.一种检测选自由维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、表没食子儿茶素没食子酸酯、γ-亚油酸、金雀异黄素、姜黄色素、栎精、老蒜、伞蕈、蜂胶、桑黄、诺丽提取物、烷氧基甘油和墨角藻聚糖所组成组中的饮食组分在哺乳动物中潜在抗癌效率的方法，该方法包括：
将所述哺乳动物的全血暴露于所述饮食组分持续4小时或者更少；
使用幅射对所述哺乳动物被暴露的全血和未被暴露的全血进行刺激；
在所述刺激之后，检测所述被暴露的全血和未被暴露的全血的血细胞中编码PUMA基因产物的mRNA的量；
将从所述被暴露的全血和未被暴露的全血的血细胞中所获得的检测结果进行比较；以及
基于比较结果鉴定所述饮食组分的潜在抗癌效率，其中，所述mRNA量的变化与所述饮食组分的效率相关。
12.一种检测选自由维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、表没食子儿茶素没食子酸酯、γ-亚油酸、金雀异黄素、姜黄色素、栎精、老蒜、伞蕈、蜂胶、桑黄、诺丽提取物、烷氧基甘油和墨角藻聚糖所组成组中的饮食组分在哺乳动物中潜在抗癌或抗自体免疫紊乱效率的方法，该方法包括：
将所述哺乳动物的全血暴露于所述饮食组分持续4小时或者更少；
使用植物凝集素对所述哺乳动物被暴露的全血和未被暴露的全血进行刺激；
在所述刺激之后，检测所述被暴露的全血和未被暴露的全血的血细胞中编码选自由白介素-2、白介素-4、肿瘤坏死因子α和Fas配体所组成组中的蛋白质的mRNA的量；
将从所述被暴露的全血和未被暴露的全血的血细胞中所获得的检测结果进行比较；以及
基于比较结果鉴定所述饮食组分的潜在抗癌或抗自体免疫紊乱效率，其中，所述mRNA量的变化与所述饮食组分的效率相关。
13.一种检测选自由维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、表没食子儿茶素没食子酸酯、γ-亚油酸、金雀异黄素、姜黄色素、栎精、老蒜、伞蕈、蜂胶、桑黄、诺丽提取物、烷氧基甘油和墨角藻聚糖所组成组中的饮食组分在哺乳动物中潜在抗癌或抗自体免疫紊乱效率的方法，该方法包括：
将所述哺乳动物的全血暴露于所述饮食组分持续4小时或者更少；
使用热聚IgG对所述哺乳动物被暴露的全血和未被暴露的全血进行刺激；
在所述刺激之后，检测所述被暴露的全血和未被暴露的全血的血细胞中编码选自由肿瘤坏死因子超家族3和肿瘤坏死因子超家族15所组成组中的基因产物的mRNA的量；
将从所述被暴露的全血和未被暴露的全血的血细胞中所获得的检测结果进行比较；以及
基于比较结果鉴定所述饮食组分的潜在抗癌或抗自体免疫紊乱效率，其中，所述mRNA量的变化与所述饮食组分的效率相关。
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