JP2008538930A - 食物サプリメントに対する個体変動評価のモデルとしての全血におけるexvivo遺伝子発現 - Google Patents
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Abstract
Description
化が食物成分の潜在的有効性と相関することを特徴とする方法が提供される。
有効性の測定方法であって、哺乳類の全血を食物成分に4時間以下の間曝露する工程、哺乳類の曝露された全血及び曝露されなかった全血を放射線で刺激する工程、刺激後に、曝露された全血及び曝露されなかった全血の血球中のp21又はPUMA遺伝子産物をコードするmRNAの量を測定する工程、曝露された全血及び曝露されなかった全血の血球で得られる測定結果を比較する工程、及び比較結果に基づいて食物成分の潜在的抗癌有効性を同定する工程を含み、mRNAの量の変化が食物成分の有効性と相関することを特徴とする方法を提供する。
で遠心分離後、50μlの血液試料を各ウエルに適用し、直ちに4℃で2分間、120×gで遠心分離し、その後、300μlのPBSで1回、各ウエルを洗浄し、4℃で5分間、2000×gで遠心分離した。次に、例えば0.5%のN−ラウロイルサルコシン、4×SSC、10mMトリスHCl pH7.4、1mMのEDTA、0.1%のIGEPAL CA−630及び1.791 M グアニジンチオシアネートを含有し、1%の2−メルカプトエタノール(BioRad, Hercules, CA, USA)、0.5mg/mlのプロテイナーゼK(Pierce, Rockford, IL, USA)、0.1mg/mlのサケ精子DNA(5 Prime
Eppendorf/Brinkmann, Westbury, NY, USA)、0.1mg/mlの大腸菌tRNA(Sigma)、表2に示した特異的なリバースプライマーの各々10mMを含むカクテル、及び標準RNA34オリゴヌクレオチドを補ったストック溶解緩衝液60μlをフィルタープレートに導入し、その後、37℃で10分間インキュベートした。次にフィルタープレートをオリゴ(dT)固定化マイクロプレート(GenePlate, RNAture)上に載せ、4℃で5分間、2000×gで遠心分離した。4℃で一晩貯蔵後、マイクロプレートを100μlの単純溶解緩衝液で3回、その後、150μlの洗浄緩衝液(0.5MのNaCl、10mMのトリス、pH7.4、1mMのEDTA)で4℃で3回、洗浄した。1×RT−緩衝液、各々1.25mMの各dNTP、4単位のrRNasin及び80単位MMLV逆転写酵素(Promega)(プライマーなし)を含有する緩衝液30μlを添加し、37℃で2時間インキュベートすることにより、各ウェル中でcDNAを直接合成した。特異的プライマーにより開始されたcDNAは溶液中に存在し、そしてオリゴ(dT)により開始されたcDNAはマイクロプレート中に固定されたままであった。TaqMan PCRのために、結果的に生じた4μlのcDNA溶液を384ウエルPCRプレートに直接移して、これに、5μlのTaqMan汎用マスターミックス(ABI)及び1μlのオリゴヌクレオチドカクテル(各々15μMのフォワード及びリバースプライマー、及び3〜6μMのTaqManプローブ)を導入し、そしてPCRをPRISM 7900HT(ABI)中で、95℃で10分を1サイクル、その後、95℃で30秒、55℃で30秒及び60℃で1分を45サイクル実行した。SYBRグリーンPCRも用い得る。このために、cDNAを水中で3〜4倍に希釈し、4μlのcDNA溶液を384ウエルPCRプレートに直接移して、これに、5μlのマスターミックス(BioRad, Hercules, CA)及び1μlのオリゴヌクレオチドカクテル(各々15μMのフォワード及びリバースプライマー)を適用し、そしてPCRをPRISM 7900HT(ABI)中で、95℃で10分を1サイクル、その後、95℃で30秒及び60℃で1分を45サイクル実行した。各遺伝子を別個のウエル中で増幅した。分析用ソフトウエア(SDS, ABI)により、Ctを確定した。
Aga」;Kyowa、全長)、プロポリス(「Pro」;1:10希釈)、メシマコブ(「Mesh」)、ノニ抽出物(「Noni」)及びサメ肝油(「Alk」;アルコキシグリセロール)(非同定用量)。これらの食物成分のすべてが、免疫系若しくは癌又は両方に及ぼす作用を報告した。上記の実施例1で考察した食物成分のほかに、ビタミンEは免疫食作用に及ぼす強力な作用を有することが既知であり、そして感染に対する感受性を低減するに際して、特にストレス下で、動物に対して有益であることが示されている。γリノール酸の欠如は、免疫系欠陥を生じる。それは免疫支持プロスタグランジンの産生における中間体である。クエルセチンは、ラットにおいてナチュラルキラー細胞活性を引き上げ、そして肥満細胞、好塩基球及び好中球の脱顆粒を阻止することが示されている。熟成ニンニク抽出物は、免疫系強化物質として数十年間用いられてきた。アガリクス茸、例えばアガリクス・ブラゼイ(Agaricus blazei)の抽出物は、抗腫瘍作用を有することが示されている。蜂の巣から得られる抗生物質であるプロポリスはコーヒー酸フェネチルエステルを含有し、これは、動物モデルにおいて癌形成を防止することが示されている。プロポリスは、アポトーシスのプロセスを増大することにより、癌細胞増殖を阻害する。メシマコブ(Phellinus linteus)は、抗腫瘍ベータ・グルカンを含有する重要な薬用茸である。その水性抽出物は、腫瘍の増殖を抑制することが示されている。ノニ抽出物は、ヤエヤマアオキ(Morinda citrifolia)の果実から得られ、そして肺腫瘍を有するマウスの生存持続期間を有意に延ばすことが示されているノニ−pptと呼ばれる多糖物質に富んだを含有する。サメ肝油中に見出されるもののようなアルコキシグリセロールは、抗癌治療及び免疫増強剤として用いられてきた。用いられ得るさらなる食物成分はフコイダンであり、これは海草から得られ、そして腫瘍細胞侵襲を阻害し、免疫系構成成分のレベルを引き上げることが示されている。この実施例では、リン酸緩衝生理食塩水を対照として用いた。
最適化される個々の食物を設計するために用いられ得る。
胞で発現されるため、この遺伝子の発現の増大はこれらの細胞のアポトーシスを増大し、したがってクエルセチンは、この個体に関して抗癌特性を有する食物中に含入するのに良好な候補である。白及び黒三角は、個体2からの値と同じ値を示す。図5におけるY軸値は、サイクル閾値(Ct)を示す。各記号は、50mLヘパリン化全血の三重アリコートからの平均±S.D.である。図6及び図7は、2つの個体(図6)における、並びにビタミンAのみの投与による5つのさらなる個体(図7)におけるTNFSF15の定量の結果を示す。図6から分かるように、ビタミンAはTNFSF−15のベースライン発現を低減し、そして1例(個体1)におけるHAGに及ぼす作用を排除した。図7に示した追跡調査データでは、ビタミンAは、個体1における、そして全体的には7個体のうちの2個体(両方の図の個体1)において、HAG誘導性TNFSF15発現に及ぼす阻害作用を示した。これらの個体1のような個体では、ビタミンAは、免疫系が自己免疫疾患のように不適切に活性化される症状を治療するか又は防止するに際して有用であり得る。
Claims (15)
- 癌又は自己免疫疾患に対する個々の哺乳類における食物成分の潜在的有効性の評価方法であって、
哺乳類の全血を食物成分に曝露する工程、
前記曝露後に、癌又は自己免疫疾患と関連するmRNAの量を測定する工程、及び
測定結果に基づいて哺乳類における前記食物成分の潜在的有効性を同定する工程
を含み、前記mRNAの量の変化が前記食物成分の潜在的有効性と相関することを特徴とする方法。 - 曝露されなかった全血中に存在する前記mRNAの量が測定され、曝露されなかった全血中で測定された該mRNAの量を曝露された全血中で測定された前記mRNAの量と比較することにより前記mRNAの量の変化を確定する、請求項1記載の方法。
- 前記曝露後、前記全血を刺激剤に曝露する工程、及び
曝露されなかった全血から得られる測定結果を、前記食物成分及び前記刺激剤への曝露後に得られる測定結果と比較することを含む前記食物成分の潜在的有効性を評価する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。 - 前記刺激剤がフィトヘムアグルチニン、放射線及び熱凝集性IgGから成る群から選択される、請求項3記載の方法。
- 前記mRNAの量が測定される前に前記曝露されなかった全血が対照媒体に曝露される、請求項2記載の方法。
- 前記対照媒体がリン酸緩衝生理食塩水又はジメチルスルホキシドである、請求項5記載の方法。
- 前記全血を曝露することがヘパリンの付加を含む、請求項1記載の方法。
- 前記全血が5時間以下の間刺激される、請求項3記載の方法。
- 前記全血が30分〜4時間刺激される、請求項8記載の方法。
- 前記mRNAが、インターロイキン−2、インターロイキン−4、腫瘍壊死因子α、IgG Fc受容体、p21、Fasリガンド、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー3及び腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー15をコードするmRNAから成る群から選択される、請求項1記載の方法。
- 前記食物成分が、ビタミンA、ビタミンC、ビタミンD、ビタミンE、エピガロカテキン没食子酸塩、g−リノール酸、ゲニステイン、クルクミン、クエルセチン、熟成ニンニク、アガリクス、プロポリス、メシマコブ、ノニ抽出物、アルコキシグリセロール及びフコイダンから成る群から選択される、請求項1記載の方法。
- ビタミンA、ビタミンC、ビタミンD、ビタミンE、エピガロカテキン没食子酸塩、g−リノール酸、ゲニステイン、クルクミン、クエルセチン、熟成ニンニク、アガリクス、プロポリス、メシマコブ、ノニ抽出物、アルコキシグリセロール及びフコイダンから成る群から選択される食物成分の哺乳類における潜在的抗癌有効性の測定方法であって、
哺乳類の全血を前記食物成分に4時間以下の間曝露する工程、
前記曝露された全血及び曝露されなかった全血の血球中のIgG Fc受容体をコー
ドするmRNAの量を測定する工程、
前記曝露された全血及び前記曝露されなかった全血の血球で得られる測定結果を比較する工程、及び
比較結果に基づいて前記食物成分の潜在的抗癌有効性を同定する工程
を含み、前記mRNAの量の変化が前記食物成分の有効性と相関することを特徴とする方法。 - ビタミンA、ビタミンC、ビタミンD、ビタミンE、エピガロカテキン没食子酸塩、g−リノール酸、ゲニステイン、クルクミン、クエルセチン、熟成ニンニク、アガリクス、プロポリス、メシマコブ、ノニ抽出物、アルコキシグリセロール及びフコイダンから成る群から選択される食物成分の哺乳類における潜在的抗癌有効性の測定方法であって、
哺乳類の全血を前記食物成分に4時間以下の間曝露する工程、
哺乳類の前記曝露された全血及び前記曝露されなかった全血を放射線で刺激する工程、
前記刺激後に、前記曝露された全血及び曝露されなかった全血の血球中のp21又はPUMA遺伝子産物をコードするmRNAの量を測定する工程、
前記曝露された全血及び前記曝露されなかった全血の血球で得られる測定結果を比較する工程、及び
前記比較結果に基づいて前記食物成分の潜在的抗癌有効性を同定する工程
を含み、前記mRNAの量の変化が前記食物成分の有効性と相関することを特徴とする方法。 - ビタミンA、ビタミンC、ビタミンD、ビタミンE、エピガロカテキン没食子酸塩、g−リノール酸、ゲニステイン、クルクミン、クエルセチン、熟成ニンニク、アガリクス、プロポリス、メシマコブ、ノニ抽出物、アルコキシグリセロール及びフコイダンから成る群から選択される食物成分の哺乳類における潜在的抗癌有効性又は潜在的抗自己免疫疾患有効性の測定方法であって、
哺乳類の全血を前記食物成分に4時間以下の間曝露する工程、
哺乳類の前記曝露された全血及び曝露されなかった全血をフィトヘムアグルチニンで刺激する工程、
前記刺激後に、前記曝露された全血及び前記曝露されなかった全血の血球中のインターロイキン−2、インターロイキン−4、腫瘍壊死因子α及びFasリガンドから成る群から選択されるタンパク質をコードするmRNAの量を測定する工程、
前記曝露された全血及び前記曝露されなかった全血の血球で得られる測定結果を比較する工程、及び
前記比較結果に基づいて前記食物成分の潜在的抗癌有効性又は潜在的抗自己免疫疾患有効性を同定する工程
を含み、前記mRNAの量の変化が前記食物成分の有効性と相関することを特徴とする方法。 - ビタミンA、ビタミンC、ビタミンD、ビタミンE、エピガロカテキン没食子酸塩、g−リノール酸、ゲニステイン、クルクミン、クエルセチン、熟成ニンニク、アガリクス、プロポリス、メシマコブ、ノニ抽出物、アルコキシグリセロール及びフコイダンから成る群から選択される食物成分の哺乳類における潜在的抗癌有効性又は潜在的抗自己免疫疾患有効性の測定方法であって、
哺乳類の全血を食物成分に4時間以下の間曝露する工程、
哺乳類の前記曝露された全血及び曝露されなかった全血を熱凝集性IgGで刺激する工程、
前記刺激後に、前記曝露された全血及び前記曝露されなかった全血の血球中の腫瘍壊死因子スーパーファミリー3及び腫瘍壊死因子スーパーファミリー15から成る群から選
択される遺伝子産物をコードするmRNAの量を測定する工程、
前記曝露された全血及び前記曝露されなかった全血の血球で得られる測定結果を比較する工程、及び
前記比較結果に基づいて前記食物成分の潜在的抗癌有効性又は潜在的抗自己免疫疾患有効性を同定する工程
を含み、前記mRNAの量の変化が前記食物成分の有効性と相関することを特徴とする方法。
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