JP2013528371A - インターフェロン応答マーカーのエクスビボ誘導によるインターフェロンに対する宿主応答性を特徴づける方法 - Google Patents

Abstract

本発明の実施形態は、概して、インターフェロン応答遺伝子の発現を定量し、インターフェロン投与に対する個体の潜在的応答性を特徴づけるエクスビボの方法に関する。特定の実施形態は、インターフェロン投与の前および後にインターフェロン応答遺伝子の発現を評価することにより、インターフェロン療法の現在進行の薬効をモニタリングするための方法に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は米国仮出願である、２０１０年５月７日出願の６１／３３２，６７７号及び２０１０年９月２９日出願の６１／３８７，６６８号の優先権を主張し、これらの各々は参照により全体が本明細書に組み込まれる。

本発明の実施形態は、概して、特定の治療剤に対する個体の応答性を特徴づけるための方法に関する。より詳細には、本明細書に開示する実施形態は、癌及び／又は肝炎の療法を包含する特定の疾患範囲におけるインターフェロン（ＩＦＮ）療法に、個体が応答することになるか、または応答できないか、の予測に関する。特定の実施形態は、個体における現在進行のＩＦＮ療法の有効性をモニタリングする方法に関する。

インターフェロンはウィルス感染に対抗するための、及び／又は、癌のような適応症の治療において、実験研究環境並びに臨床的に使用されている抗ウィルス薬である。Ｂ型及びＣ型の肝炎、並びに特定の白血病、骨髄腫、及び黒色腫を包含する種々の癌の治療に関して臨床的に認可されている。

肝炎は、肝臓における炎症細胞の存在を特徴とするウィルス性の肝疾患である。この疾患には多くの原因が存在する（例えば、感染性の血液又は体液への曝露、未防御の性的接触、輸血、汚染注射針の使用、出産時の母親から子供への垂直感染）ものの、感染の開始からかなり時間が経過するまでウィルス抗原が出現しない場合があるため、診断は困難である。肝炎もまた、多くの形態で、存在し、最も顕著なものはＢ型肝炎（Ｂ型肝炎ウィルス「ＨＢＶ」に起因）及びＣ型肝炎（Ｃ型肝炎ウィルス「ＨＣＶ」に起因）である。肝炎のこれらの形態の両方とも、急性（消散まで６ヶ月未満）又は慢性（６ヶ月超の感染）となる場合がある。

ＨＢＶ及びＨＣＶは、両方とも種々の遺伝子サブタイプにおいて存在し、これらは、疾患症状の重症度、合併症の可能性、及びインターフェロン療法を含む種々の使用可能な治療に対する宿主の潜在的応答性に影響する。

ＩＦＮは、培養癌細胞に対しては抗増殖、アポトーシス促進及び抗血管形成作用を有するが、特定の分子標的および外因性ＩＦＮにより引き起こされる機序は未だ研究中である。更にまた、癌に伏在する種々の病因が、関連する型の癌のうちかなりの数の癌に対する単一の治療剤又は投薬法の薬効を制限する場合がある。

その現在の臨床使用にもかかわらず、ある個体がＩＦＮ投与に正の応答を示すことになる可能性を評価する必要性が残っている。また、ＩＦＮの投与個体における、現在進行のＩＦＮ投与の薬効をモニタリングする必要もある。

幾つかの実施形態においては、インターフェロンの投与に対する個体の潜在的応答性を特徴づけるためのエクスビボでの方法であって、この方法は、個体由来の全血の第１の試料を、溶媒中のインターフェロンに、インターフェロンが１つ以上のインターフェロン応答マーカーの発現を改変するために十分な時間、曝露すること、個体由来の全血の第２の試料を、インターフェロン非含有の溶媒に曝露すること（同じ時間）、第１及び第２の全血試料の両方において１つ以上のインターフェロン応答マーカーをコードするｍＲＮＡの
量を測定することにより、１つ以上のインターフェロン応答マーカーの発現における変化としてインターフェロンの作用を定量すること、１つ以上のインターフェロン応答マーカーの発現に対するインターフェロンの定量された作用を、対照個体のパネルの発現レベルにおける変化の平均として計算される、１つ以上のインターフェロン応答マーカーの発現に対するインターフェロンの正常な作用と比較すること、および、個体における１つ以上のインターフェロン応答マーカーの発現における変化と、対照個体パネルにおける１つ以上のインターフェロン応答マーカーの発現における平均の変化との間の有意差を識別することにより、個体の潜在的応答性を特徴づけること、を含む方法が提供される。個体における発現の変化が、対照個体パネルにおける変化より実質的に大きい場合には、個体はインターフェロンに対して潜在的に応答性があり、個体における発現の変化が、対照個体パネルにおける変化より実質的に小さい場合には、個体はインターフェロンに対して潜在的に非応答性である。幾つかの実施形態においては、１つ以上のインターフェロン応答マーカーは、インターフェロンへの応答に応じて増大するマーカーを含む。幾つかの実施形態においては、１つ以上のインターフェロン応答マーカーは、インターフェロンへの応答に応じて減少するマーカーを含む。

個体の潜在的応答性は、第１の全血試料中の１つ以上のインターフェロン応答マーカーの発現と、第２の全血試料中の１つ以上のインターフェロン応答マーカーの発現との間の有意差を識別することにより特徴づけられる。第１の血液試料由来のインターフェロン応答マーカーをコードする１つ以上のｍＲＮＡの量が、第２の血液試料由来の同じインターフェロン応答マーカーをコードするｍＲＮＡの量と比較して有意に増大している場合、個体はインターフェロンに対して潜在的に応答性がある。第１の血液試料由来のインターフェロン応答マーカーをコードする１つ以上のｍＲＮＡの量が、第２の血液試料由来の同じインターフェロン応答マーカーをコードするｍＲＮＡの量と比較して有意に減少している場合、個体はインターフェロンに対して潜在的に非応答性である。

幾つかの実施形態においては、個体におけるインターフェロン療法の薬効を測定する方法であって、インターフェロン投与の前に、個体から全血の第１の試料を得ること、インターフェロン投与の後に、個体から全血の第２の試料を得ること、第１の全血試料及び第２の全血試料の両方における、１つ以上のインターフェロン応答マーカーをコードするｍＲＮＡの量を測定することにより、１つ以上のインターフェロン応答マーカーの発現を定量すること、および、第１の全血試料中と及び第２の全血試料中における、１つ以上のインターフェロン応答マーカーの発現を比較することにより、インターフェロン療法の薬効を測定すること、を含む方法が提供される。

幾つかの実施形態においては、第２の血液試料において、第１の血液試料と比較して、
インターフェロン応答マーカーの１つ以上の発現が有意に異なる場合に、インターフェロン療法が有効であると決定される。幾つかの実施形態においては、第１の血液試料と比較して、第２の血液試料との間でインターフェロン応答マーカーの１つ以上の発現が異ならない場合に、インターフェロン療法は有効ではない。

幾つかの実施形態においては、１つ以上のインターフェロン応答マーカーは、ＣＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＧＢＰ、ＸＡＦｌ、ＳＯＣＳｌ、Ｇ１Ｐ２、ＢＳＴ２、ＩＲＦ７、ＴＮＦＳＦ５、ＩＬ８、ＩＬ２３、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＮＦＳＦ６、ＴＮＦＳＦ８、ＴＮＦＳＦ１５、ＣＣＬ２０、ＣＸＣＬｌ、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＩＬ１Ｂ、ＩＦＮγ、ＶＥＧＦ、ＩＳＧ１５、ＳＴＡＴ１、ＩＣＯＳ及びＡＩＭ２よりなる群から選択される。

幾つかの実施形態においては、インターフェロンは、Ｉ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロン、及びＩＩＩ型インターフェロンよりなる群から選択される。幾つかの実
施形態においては、インターフェロンが、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγ、これらの組み合わせ、及びこれらのサブタイプよりなる群から選択される。幾つかの実施形態においては、インターフェロンは、インターフェロンα２ｂである。幾つかの実施形態においては、インターフェロンα２ｂは、約１〜約１００，０００ユニット／ｍＬの濃度で存在する。幾つかの実施形態においては、インターフェロンα２ｂは、約５，０００〜約１５，０００ユニット／ｍＬの濃度で存在する。幾つかの実施形態においては、インターフェロンα２はウィルス感染を治療するために投与される。幾つかの実施形態においては、ウィルス感染が肝炎ウィルスにより起因する。他の実施形態においては、インターフェロンα２ｂは抗癌療法として投与される。

幾つかの実施形態においては、溶媒はリン酸緩衝生理食塩水又は他の同様の比較的負活性な生理学的物質（例えば標準食塩水又は蒸留水）である。幾つかの実施形態においては、サンプルのインターフェロン又は溶媒への試料の曝露は、１時間から７時間まで行われる。１つの実施形態においては、曝露は４時間行う。幾つかの実施形態においては、曝露は約３７℃で行う。

幾つかの実施形態においては、全血は哺乳類より得られ、そして幾つかの実施形態においては、全血はヘパリン処理される。一部の実施形態においては、哺乳類はヒトである。一部の実施形態においては、第１及び第２の試料は肝炎、自己免疫疾患、又は癌の１つ以上を有し、そしてそのための治療が必要な個体から得られる。

同様に提供されるものは、全血試料中の１つ以上のインターフェロン応答マーカーをコードするｍＲＮＡを定量するための装置を作成するための方法であって、全血の第１の試料及び第２の試料を得ること、第１の試料中の白血球を、溶媒中で、刺激剤で刺激すること、第２の試料中の白血球を、刺激剤非存在下の溶媒に曝露すること、第１及び第２の試料の各々を、フィルタプレートに添加すること、濾過により、第１及び第２の試料の各々から、赤血球及び白血球以外の血液成分を除去することにより、第１及び第２の試料の各々に由来する白血球をフィルタプレート上に得ること、試料中に存在するインターフェロン応答マーカーをコードするｍＲＮＡにハイブリダイズするプライマー及び第１の試料に由来するｍＲＮＡを含む第１の溶解物、並びに、プライマー及び第２の試料に由来するｍＲＮＡを含む第２の溶解物を産生するために、インターフェロン応答マーカーをコードするマーカーに関する少なくとも１つのリバースプライマーを含む溶解緩衝液を用いてフィルタプレート上の第１及び第２の試料の各々に由来する白血球を溶解すること、および、プライマーが結合しているｍＲＮＡを含む、第１及び第２の試料の両方に由来するｍＲＮＡを捕捉するために、オリゴ（ｄＴ）−固定化プレートに第１及び第２の溶解物を移すこと、を含む方法である。

ＩＦＮα−２ｂによる刺激への応答性に関する種々のｍＲＮＡ分子種のエクスビボでのスクリーニング。各バーは平均±標準偏差（ｎ＝９）を示す。有意な増大は「＊」で示し、有意な減少は「▼」で示す。括弧：０．５から２までの増加倍率。 ＩＦＮα−２ｂに対する、種々のｍＲＮＡのエクスビボでの用量応答関係。各データポイントは平均±標準偏差（ｎ＝９）で示す。有意な増大は「＊」で示し、有意な減少は「▼」で示す。 ＩＦＮα−２ｂに対する、種々のｍＲＮＡのエクスビボでの用量応答関係。各データポイントは平均±標準偏差（ｎ＝９）で示す。有意な増大は「＊」で示し、有意な減少は「▼」で示す。 ＩＦＮα−２ｂに対する、種々のｍＲＮＡのエクスビボでの用量応答関係。各データポイントは平均±標準偏差（ｎ＝９）で示す。有意な増大は「＊」で示し、有意な減少は「▼」で示す。 ＩＦＮα−２ｂに対する、種々のｍＲＮＡのエクスビボでの用量応答関係。各データポイントは平均±標準偏差（ｎ＝９）で示す。有意な増大は「＊」で示し、有意な減少は「▼」で示す。 ＩＦＮα−２ｂに対する、種々のｍＲＮＡのエクスビボでの用量応答関係。各データポイントは平均±標準偏差（ｎ＝９）で示す。有意な増大は「＊」で示し、有意な減少は「▼」で示す。 ＩＦＮα−２ｂに対する、種々のｍＲＮＡのエクスビボでの用量応答関係。各データポイントは平均±標準偏差（ｎ＝９）で示す。有意な増大は「＊」で示し、有意な減少は「▼」で示す。 ＩＦＮα−２ｂに対する、種々のｍＲＮＡのエクスビボでの用量応答関係。各データポイントは平均±標準偏差（ｎ＝９）で示す。有意な増大は「＊」で示し、有意な減少は「▼」で示す。 ＩＦＮα−２ｂに対する、種々のｍＲＮＡのエクスビボでの用量応答関係。各データポイントは平均±標準偏差（ｎ＝９）で示す。有意な増大は「＊」で示し、有意な減少は「▼」で示す。 種々のｍＲＮＡ発現と、ＩＦＮα−２ｂ刺激との間のエクスビボでの用量動態関係。「○」はＰＢＳを示し、「●」は１０⁵ユニット／ｍＬ ＩＦＮα−２ｂを示す。各データポイントは平均±標準偏差（ｎ＝３）を示す。 種々のｍＲＮＡ発現と、ＩＦＮα−２ｂ刺激との間のエクスビボでの用量動態関係。「○」はＰＢＳを示し、「●」は１０⁵ユニット／ｍＬ ＩＦＮα−２ｂを示す。各データポイントは平均±標準偏差（ｎ＝３）を示す。 種々のｍＲＮＡ発現と、ＩＦＮα−２ｂ刺激との間のエクスビボでの用量動態関係。「○」はＰＢＳを示し、「●」は１０⁵ユニット／ｍＬ ＩＦＮα−２ｂを示す。各データポイントは平均±標準偏差（ｎ＝３）を示す。 種々のｍＲＮＡ発現と、ＩＦＮα−２ｂ刺激との間のエクスビボでの用量動態関係。「○」はＰＢＳを示し、「●」は１０⁵ユニット／ｍＬ ＩＦＮα−２ｂを示す。各データポイントは平均±標準偏差（ｎ＝３）を示す。 種々のｍＲＮＡ発現と、ＩＦＮα−２ｂ刺激との間のエクスビボでの用量動態関係。「○」はＰＢＳを示し、「●」は１０⁵ユニット／ｍＬ ＩＦＮα−２ｂを示す。各データポイントは平均±標準偏差（ｎ＝３）を示す。 種々のｍＲＮＡ発現と、ＩＦＮα−２ｂ刺激との間のエクスビボでの用量動態関係。「○」はＰＢＳを示し、「●」は１０⁵ユニット／ｍＬ ＩＦＮα−２ｂを示す。各データポイントは平均±標準偏差（ｎ＝３）を示す。 種々のｍＲＮＡ発現と、ＩＦＮα−２ｂ刺激との間のエクスビボでの用量動態関係。「○」はＰＢＳを示し、「●」は１０⁵ユニット／ｍＬ ＩＦＮα−２ｂを示す。各データポイントは平均±標準偏差（ｎ＝３）を示す。 種々のｍＲＮＡ発現と、ＩＦＮα−２ｂ刺激との間のエクスビボでの用量動態関係。「○」はＰＢＳを示し、「●」は１０⁵ユニット／ｍＬ ＩＦＮα−２ｂを示す。各データポイントは平均±標準偏差（ｎ＝３）を示す。 種々のｍＲＮＡ発現と、ＩＦＮα−２ｂ刺激との間の倍増変化関係。図３に示すデータは増加倍率に変換されている。各データポイントは平均±標準偏差（ｎ＝９）を示す。 種々のｍＲＮＡ発現と、ＩＦＮα−２ｂ刺激との間の倍増変化関係。図３に示すデータは増加倍率に変換されている。各データポイントは平均±標準偏差（ｎ＝９）を示す。 種々のｍＲＮＡ発現と、ＩＦＮα−２ｂ刺激との間の倍増変化関係。図３に示すデータは増加倍率に変換されている。各データポイントは平均±標準偏差（ｎ＝９）を示す。 種々のｍＲＮＡ発現と、ＩＦＮα−２ｂ刺激との間の倍増変化関係。図３に示すデータは増加倍率に変換されている。各データポイントは平均±標準偏差（ｎ＝９）を示す。 種々のｍＲＮＡ発現と、ＩＦＮα−２ｂ刺激との間の倍増変化関係。図３に示すデータは増加倍率に変換されている。各データポイントは平均±標準偏差（ｎ＝９）を示す。 種々のｍＲＮＡ発現と、ＩＦＮα−２ｂ刺激との間の倍増変化関係。図３に示すデータは増加倍率に変換されている。各データポイントは平均±標準偏差（ｎ＝９）を示す。 種々のｍＲＮＡ発現と、ＩＦＮα−２ｂ刺激との間の倍増変化関係。図３に示すデータは増加倍率に変換されている。各データポイントは平均±標準偏差（ｎ＝９）を示す。 種々のｍＲＮＡ発現と、ＩＦＮα−２ｂ刺激との間の倍増変化関係。図３に示すデータは増加倍率に変換されている。各データポイントは平均±標準偏差（ｎ＝９）を示す。 ＩＦＮα−２ｂ刺激後のエクスビボでのｍＲＮＡ発現。各データポイント（○：Ｐｔ．＃１，Δ：Ｐｔ．＃２，ｘ：Ｐｔ．＃３，□：Ｐｔ．＃４）は平均値を示す。 ｍＲＮＡ発現と、インビボでのＩＦＮα−２ｂ刺激との間の関係。各データポイント（○：Ｐｔ．＃１，Δ：Ｐｔ．＃２）は平均値（ｎ＝９）を示す。有意な増大は「＊」で示し、有意な減少は「▼」で示す。括弧：０．５から２までの増加倍率。 図７Ａ−７Ｄはエクスビボでのアッセイ操作法。 エクスビボでのｍＲＮＡスクリーニングの結果。 はＩＦＮα−２ｂ刺激に対する、種々のｍＲＮＡのエクスビボでの用量応答関係。 ＩＦＮα−２ｂ刺激に対する、種々のｍＲＮＡのエクスビボでの用量応答関係。 ＩＦＮα−２ｂ刺激に対する、種々のｍＲＮＡのエクスビボでの用量応答関係。 ＩＦＮα−２ｂ刺激に対する、種々のｍＲＮＡのエクスビボでの用量応答関係。 ＩＦＮα−２ｂ刺激に対する、種々のｍＲＮＡのエクスビボでの用量応答関係。 ＩＦＮα−２ｂ刺激に対する、種々のｍＲＮＡのエクスビボでの用量応答関係。 ＩＦＮα−２ｂ刺激に対する、種々のｍＲＮＡのエクスビボでの用量応答関係。 ＩＦＮα−２ｂ刺激に対する、種々のｍＲＮＡのエクスビボでの用量応答関係。 種々のｍＲＮＡ発現と、ＩＦＮα−２ｂ刺激との間のエクスビボでの用量動態関係。 種々のｍＲＮＡ発現と、ＩＦＮα−２ｂ刺激との間のエクスビボでの用量動態関係。 種々のｍＲＮＡ発現と、ＩＦＮα−２ｂ刺激との間のエクスビボでの用量動態関係。 種々のｍＲＮＡ発現と、ＩＦＮα−２ｂ刺激との間のエクスビボでの用量動態関係。 種々のｍＲＮＡ発現と、ＩＦＮα−２ｂ刺激との間のエクスビボでの用量動態関係。 種々のｍＲＮＡ発現と、ＩＦＮα−２ｂ刺激との間のエクスビボでの用量動態関係。 種々のｍＲＮＡ発現と、ＩＦＮα−２ｂ刺激との間のエクスビボでの用量動態関係。 種々のｍＲＮＡ発現と、ＩＦＮα−２ｂ刺激との間のエクスビボでの用量動態関係。 ｍＲＮＡ発現に基づいた応答者及び非応答者の患者の識別。 ＩＦＮα−２ｂ投与による、種々のｍＲＮＡのインビボでの誘導。 ＩＦＮα−２ｂ投与による、種々のｍＲＮＡのインビボでの誘導。 ＩＦＮα−２ｂ投与による、種々のｍＲＮＡのインビボでの誘導。 ＩＦＮα−２ｂ投与による、種々のｍＲＮＡのインビボでの誘導。 ＩＦＮα−２ｂ投与による、種々のｍＲＮＡのインビボでの誘導。 ＩＦＮα−２ｂ投与による、種々のｍＲＮＡのインビボでの誘導。 ＩＦＮα−２ｂ投与による、種々のｍＲＮＡのインビボでの誘導。 ＩＦＮα−２ｂ投与による、種々のｍＲＮＡのインビボでの誘導。 ＩＦＮα−２ｂ投与による、種々のｍＲＮＡのインビボでの誘導。 ＩＦＮα−２ｂ投与による、種々のｍＲＮＡのインビボでの誘導。 ＩＦＮα−２ｂ投与による、種々のｍＲＮＡのインビボでの誘導。 ＩＦＮα−２ｂ投与による、種々のｍＲＮＡのインビボでの誘導。 ＩＦＮα−２ｂ投与による、種々のｍＲＮＡのインビボでの誘導。 ＩＦＮα−２ｂ投与による、種々のｍＲＮＡのインビボでの誘導。 ＩＦＮα−２ｂ投与による、種々のｍＲＮＡのインビボでの誘導。 ＩＦＮα−２ｂ投与による、種々のｍＲＮＡのインビボでの誘導。 ＩＦＮα−２ｂ投与による、種々のｍＲＮＡのインビボでの誘導。 ＩＦＮα−２ｂ投与による、種々のｍＲＮＡのインビボでの誘導。 ＩＦＮα−２ｂ投与による、種々のｍＲＮＡのインビボでの誘導。 ＩＦＮα−２ｂ投与による、種々のｍＲＮＡのインビボでの誘導。 臨床経過（インビボ）のモニタリング。 臨床経過（インビボ）のモニタリング。

本明細書に記載した幾つかの実施形態において、ＩＦＮの投与に対する宿主の応答性のエクスビボで特徴づけるための方法が提供される。幾つかの実施形態においては、方法は潜在的に応答のある個体からの末梢全血の採取、及び、ＩＦＮ応答マーカーのパネルの発現における変化に関してスクリーニングするためにＩＦＮによる全血の刺激を包含する。幾つかの実施形態においては、１つ以上のＩＦＮ応答マーカーをコードするｍＲＮＡの変化の検出は、ＩＦＮ投与に対する個体の潜在的応答性に関係する。他の実施形態において、ＩＦＮの投与に対する個体の、現在進行の応答性をモニタリングするための方法が提供される。一部の実施形態においては、末梢全血をＩＦＮ投与前および後に個体から採取し、そしてＩＦＮ応答マーカーのパネルの発現における変化について評価する。次に発現の変化を用いて、ＩＦＮ投与に対する、個体の現在進行の応答性及びその薬効を評価する。幾つかの実施形態においては、本明細書に記載した方法は、肝炎感染、又は、関連若しくは無関連の悪性疾患を治療するために、ＩＦＮ投与に対する応答性を予測するか、又はその薬効をモニタリングするために使用される。一部の実施形態においては、個体に投与されたＩＦＮは、Ｉ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロン、又はＩＩＩ型インターフェロンに分類される。一部の実施形態においては、投与されるインターフェロンはＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ω、ＩＦＮ−γ、これらの組み合わせ、及びこれらのサブタイプよりなる群から選択される。特定の実施形態においては、投与されるＩＦＮは、ＩＦＮ−α、又はＩＦＮ−γの何れかである。そのような実施形態の一部においては、ＩＦＮ−αはＩＦＮ−α２ｂである。

ＨＢＶは、２０億超の世界人口の約３分の１に感染していることが知られている。これらの感染個体のうち、３．５億人超が慢性ウィルスのキャリアである。急性Ｂ型肝炎は種々の症状、例えば肝臓の炎症、嘔吐、黄疸を起こすが、死亡例は稀である。しかしながら
慢性Ｂ型肝炎は、最終的には肝瘢痕形成（線維症及び／又は硬変）及び肝癌、即ち化学療法の投薬法に対して応答性が不良であることが知られている癌に至る場合がある。

ＨＢＶは、ウィルス粒子の外表面上に存在するウィルスタンパク質の上に存在する抗原性エピトープに基づいて４種の血清型（ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｒ、ａｙｗ）の１つに分類できる。更にまた、ＨＢＶの全体的ヌクレオチド配列の変異に応じて８種の遺伝子型のＨＢＶが存在する。各遺伝子型は異なる地理的分布を有し、そしてウィルスの進化及び感染を研究及び分類するためにしばしば使用されている。しかしながら臨床的には、遺伝子型間の変異は感染の重症度、治療への全体的応答、感染の再発、及び長期合併症の危険性に大きく影響する場合がある。

急性のＣ型肝炎はしばしば無症性であるが、ＨＣＶは慢性感染を樹立させてしまう傾向が高く、そして進行性瘢痕（硬変）を包含しうる肝臓病をもたらす。一部の場合においては、肝硬変を伴っている例は、肝不全、又はその他の肝硬変の合併症、例えば肝癌を発症することになる。ＨＣＶは宿主内で速いターンオーバー速度を有し、そしてエラープローン複製を呈することも知られており、これはウィルスが長期にわたって宿主の免疫応答を免れる原因となる場合がある。

ＨＢＶと同様、ＨＣＶは使用する方法の種類に応じて、６〜１１の総数となる多くの異なる遺伝子型として存在する。治療への応答性は遺伝子型を横断して変動し、そして感染に対抗して正の応答を誘発するために必要な治療期間にも影響する場合がある。

種々の形態又は組み合わせ（ＩＦＮα−２ｂを包含）におけるＩＦＮ療法は、肝炎の感染を有する患者の治療において重要な役割を果たす。これは種々の他の治療剤と組み合わせて使用される場合が多いが、ＩＦＮを投与できない患者においては、良好な治療は遥かにより困難である。更にまた、慢性ＨＣＶ感染は、世界的に蔓延中の疾患である肝細胞癌の主要な病因要素である。研究によれば、ＩＦＮ治療は、単独又は他剤と組み合わせて使用した場合に、肝細胞癌の発生を低減する場合があることが示されている。

ＩＦＮ療法はまた、他の型の癌、例えば黒色腫、ヘアリーセル白血病、及びカポジ肉腫等においても使用される。既知の免疫調節及び抗ウィルス機能に加えて、インターフェロンは抗血管形成性であるとも考えられており、これはそれらの抗腫瘍活性において役割を果たしている場合がある。機序的には、ＩＦＮα−２ｂはＪＡＫ（ヤーヌスチロシンキナーゼ）／ＳＴＡＴ（シグナル伝達兼転写活性化因子）のシグナル伝達経路に影響すると考えられている。特に、ＩＦＮα−２ｂによるＳＴＡＴ３のダウンレギュレーションは抗腫瘍作用に関連している。しかしながら、多くの他の分子がＩＦＮの抗ウィルス及び／又は抗腫瘍作用に関与している場合がある。例えば、サイトカイン、インターロイキン及び／又はインターロイキン受容体、及び種々のシグナル分子もまた、ＩＦＮの抗ウィルス及び／又は抗腫瘍作用において役割を果たしている場合がある。表１は、特定の実施形態においてＩＦＮの抗ウィルス及び／又は抗腫瘍作用に関与している種々の分子に関するプライマー配列を包含する。

有益な治療作用にも関わらず、ＩＦＮ治療の副作用は重度の場合がある。症状は、血小板数減少（これは出血／挫傷の問題をもたらす）、抑鬱、疲労、感染の危険性の上昇、投与後の感冒様の症状（発熱、寒気、頭痛、筋肉痛、下痢）、及び投与部位における組織損傷の可能性を包含する場合がある。他の報告されている副作用は食欲不振、鬱血、心拍数増大、錯乱状態、白血球数減少、赤血球数減少、肝酵素類及び／又はトリグリセリドの上昇、皮膚発疹、軽度の脱毛、局所及び／又は全身性のむくみ（浮腫）、咳又は呼吸困難を包含する。このような副作用は、潜在的には健常個体にとって有害であり、感染、悪性疾患、又は他の治療剤に起因する副作用に既に罹患している個体に対しては壊滅的である。

即ち、明確な作用を伴わないＩＦＮの投与は、ＩＦＮに非応答性の患者においては望ましくない不必要な副作用を単に誘発することになるため、ある個体がＩＦＮ療法から利益を被るかどうかを予測する必要が存在する。更にまた、大人数が肝炎又はある型の癌を有するとして、ＩＦＮ応答個体を発見するための手段は、利益を享受する者に対してテイラーメイドの治療法を行うこと、そして、非応答個体に対しては有利となる代替の治療レジメンを探求できるようすることを支援することになる。更にまた、応答及び非応答の個体のカテゴリー化を可能にするマーカーを発見することは、医療従事者が、現在進行状態で治療の薬効をモニタリングできるようにし、そしてＩＦＮ療法に対して難治性の応答を発生させる個体の識別を支援する場合がある。

従って幾つかの実施形態においては、ＩＦＮの投与に対して、個体が正又は負に応答するかどうかを予測するための方法が提供される。特定の実施形態においては、予測は臨床状況において行われ、そして他の実施形態においては、予測は研究目的のためとなる。

幾つかの実施形態においては、個体から得た全血のＩＦＮ刺激（又は個体へのＩＦＮ投与）は、１つ以上の疾患状態に関連する１つ以上のマーカーの発現を改変する。特定の実施形態においては、マーカーの１つ以上の発現が誘導され、他の実施形態においてはマーカーの１つ以上の発現がダウンレギュレートされる。特定の実施形態においては、マーカーの１つ以上の発現の誘導、又はダウンレギュレーションは、ｐ＜０．０５を統計学的に有意な変化と見なす標準的な統計学的分析で測定した場合に統計学的に有意である。幾つかの実施形態においては、１つ以上のＩＦＮ応答マーカーの発現の有意な増大は、個体がＩＦＮ投与に応答することになることの指標である。幾つかの実施形態においては、１つ以上のＩＦＮ応答マーカーの発現の有意な減少は、個体がＩＦＮ投与に応答できない場合があることの指標である。

一部の実施形態においては、ＩＦＮα−２ｂを包含するＩＦＮに応答するマーカーは、１つ以上のＴＮＦＳＦ（腫瘍壊死因子スーパーファミリー）１（リンホトキシンａ）、ＴＮＦＳＦ２、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０）、ＴＮＦＲＳＦ５（ＣＤ４０受容体）、ＴＮＦＳＦ６（Ｆａｓリガンド）、ＴＮＦＳＦ８、ＴＮＦＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ−ＴＮＦ−関連アポトーシス誘導リガンド）、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１５、ＣＣＬ（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド）２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ３、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ２０、ＣＸＣＬ（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド）１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＩＬ（インターロイキン）ＩＢ、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１７、ＩＬ２３、ＦＯＸＰ３（フォークヘッドボックスＰ３）、ＣＤ（分化抗原群）２５、ＣＴＬＡ４（細胞傷害性Ｔ−リンパ球抗原４）、グランザイムＢ、ＣＤ８Ａ、ＣＤ１６、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ６４、ＩｇＧＦｃ、ＡＲＧ（アルギナーゼ）、ＭＰＯ（ミエロペルオキシダーゼ）、ＴＬＲ（トール様受容体）２、ＴＬＲ４、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、ＩＦＮｙ、ＴＧＦ（トランスフォーミング増殖因子）β、ＣＤ４、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）、ＰＯＭＣ（プロオピオメラノコルチン）、ＧＢＰ（グアニル酸結合タンパク質）、ＸＡＦｌ（Ｘ連鎖アポトーシス抑制タンパク質（ＸＩＡＰ）−関連因子１）、ＡＩＭ２（アブセントインメラノーマ２）、ＳＨＰ２、ＳＯＣＳ１（サイトカインシグナル抑制因子１）、ＳＬＰ７６、Ｇ１Ｐ２（ユビキチン様修飾因子）、ＢＳＴ２、ＩＲＦ７（インターフェロン調節因子）、及びＬＣＫを包含する。

幾つかの実施形態においては、ＩＦＮの投与はウィルス感染の治療のためである。特定の実施形態は、例えばＢ及びＣ型肝炎を包含する肝炎の治療における、ＩＦＮ投与に対する応答性の予測において使用される。幾つかの実施形態においては、ＩＦＮの投与は癌の
治療のためである。特定の実施形態は、有毛状細胞性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、濾胞性骨髄腫、カルチノイド腫瘍、及び悪性黒色腫を包含するが、これらに限定されない癌の治療において、ＩＦＮ投与への応答性を予測する場合に使用される。特定の他の実施形態は、他の型の癌の治療におけるＩＦＮ投与に対する応答性を予測する場合に使用される。更に他の実施形態においては、ＩＦＮは潜在的に有効な薬物をスクリーニングするために寧ろ投与され、ＩＦＮ又は他の潜在的に有効な薬物を投与されている個体を特に治療するためではない。

幾つかの実施形態においては、血液は哺乳類、好ましくはヒトから採取される。一部の実施形態においては、採取される血液は全血である。薬物に応答するマーカーの発現スクリーニングを調べることを目的とした多数の実験プロトコルが、単離された白血球標本において実施されている。そのような単離された集団がしばしば好ましい理由は、全血中の種々のリンパ球は、リンパ球の小サブセット中の特定のｍＲＮＡの誘導の検出を排除する場合があるためである。更にまた、多数の型のリンパ球の間の多くの複雑な生化学的相互作用があるため、全血標本の使用が、誘導及び測定反応を阻害又は変調させる可能性がある。更にまた、幾つかの実施形態において使用される特定の刺激剤（例えばＩＦＮ）が、血漿タンパク質又は血漿因子と相互作用することにより、減少又は低減された活性を呈する場合がある。しかしながら、本明細書に記載する通り幾つかの実施形態において示す通りに使用されれば、全血は意外にも、ＩＦＮに対する個体の将来、又は現在進行の応答性の特徴づけを可能にする再現性のある、正確で生理学的に妥当な結果をもたらす。しかしながら、好ましい実施形態は全血を使用しているが、他の実施形態においては血漿から分離した血球もまた、単離された白血球標本と同様に使用する場合がある。

幾つかの好ましい実施形態においては、採取された全血は採取時にヘパリン処理される。幾つかの実施形態においては、採取された血液は刺激プロトコルまで４℃で保存される。

幾つかの実施形態においては、血液試料をＩＦＮ及び／又は対照剤と組み合わせる。幾つかの実施形態においては、対照剤は血液試料における応答を殆ど又は全く誘導しない。特定の実施形態において、対照剤はＩＦＮを扱うために使用される溶媒と同じものである。上記した通り、一部の実施形態においては、種々のＩＦＮ、例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ω，ＩＦＮ−γ、これらの組み合わせ及びそのサブタイプを使用する。特定の実施形態においては、対照剤はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。他の実施形態において、他の不活性な対照剤、例えば対照ＩｇＧ（抗体である刺激剤に対する対照として使用）又はＤＭＳＯを使用してよい。幾つかの実施形態においては、血液採取と同日に、少量の白血球をＩＦＮ（又は対照剤）と混合し、そして所定時間３７℃でインキュベートする。一部の実施形態においては、インキュベーション時間は約４時間である。一部の実施形態においては、インキュベーションを４時間超実施し、別の実施形態においては、インキュベーションを４時間未満実施する。インキュベーションの後、全血液試料を分析時まで−８０℃で凍結保存する。

幾つかの実施形態においては、各試料由来の以前に刺激された血液の少量を、血中の１つ以上のＩＦＮマーカーをコードするｍＲＮＡのレベルの測定が可能になるように処理する。一部の実施形態においては、１つ以上のＩＦＮ応答マーカーをコードするｍＲＮＡのレベルは、ＩＦＮのインキュベーションに応答して有意に変化することになる。これらのｍＲＮＡレベルを測定するためには、赤血球、及び白血球以外の血液成分を全血試料から除去する。好ましい実施形態においては、白血球はｍＲＮＡを単離及び増幅するための装置を用いて単離する。この装置の実施形態は米国特許出願１０／７９６，２９８、１１／５２５，５１５、１１／３７６，０１８、１１／８０３，５９３、１１／８０３，５９４及び１１／８０３，６６３により詳細に説明されており、これらの各々は参照により全体
が本明細書に組み込まれる。

要すれば、装置の特定の実施形態は複数の試料送達ウェルを含有するマルチウエルプレート、ウェル下部の白血球捕捉フィルタ、及び固定化されたオリゴ（ｄＴ）を含有するフィルタ下部のｍＲＮＡ捕捉区画を含む。特定の実施形態においては、装置はまた、フィルタプレートを受容するように採用された真空ボックスを含むことにより、プレートとボックスの間に密閉状態を作り、これにより真空圧が適用されれば、白血球捕捉フィルタを通過して、試料送達ウェルから血液が引き込まれ、その結果、白血球が捕捉され、非白血球血液成分はフィルタ洗浄により除去される。別の実施形態においては、試料ウェルの外に白血球捕捉フィルタを通過して血液を引き出す他の手段、例えば遠心分離又は陽圧を使用する。好ましい実施形態においては、白血球は共に積層されている複数のフィルタメンブレン上に捕捉される。幾つかの実施形態においては、捕捉された白血球は、その後、溶解緩衝液で溶解され、これにより捕捉された白血球からｍＲＮＡを放出する。次にｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ捕捉区域に固定化されたオリゴ（ｄＴ）にハイブリダイズされる。幾つかの実施形態において使用してよい溶解緩衝液の組成に関するより詳細な記述は、現在係属中であり参照により全体が本明細書に組み込まれる２００６年３月１５日出願の米国特許出願１１／３７６，０１８に記載されている。幾つかの実施形態においては、ｃＤＮＡをオリゴ（ｄＴ）固定化ｍＲＮＡから合成する。好ましい実施形態においては、その後、感染関連マーカーの増幅のために特に設計されたプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲを用いて、ｃＤＮＡを増幅する。このような実施形態において使用するプライマーを表１に示す。一部の実施形態において使用するＰＣＲに関するより詳細な説明は米国特許出願１１／３７６，０１８にも記載されている。

ＰＣＲ終了後、１つ以上のＩＦＮマーカーに関するｍＲＮＡ（検出されたＰＣＲ増幅ｃＤＮＡの量により示される）を定量する。特定の実施形態においては、定量は１つ以上のＩＦＮマーカーをコードするｍＲＮＡの量をレファレンス値と比較することにより計算する。幾つかの実施形態においては、レファレンス値は非刺激試料（例えば溶媒対照曝露血液試料）である。他の実施形態において、レファレンス値は刺激剤により誘導されない遺伝子、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルである。そのような特定の実施形態において、βアクチンをレファレンス値として使用する。当該分野でよく知られている多くの他のハウスキーピング遺伝子もレファレンス値として使用してよい。他の実施形態においては、最良の比較が、１つ以上のＩＦＮマーカーの非誘導（対照）試料に由来する同じマーカーと比較した場合の誘導発現レベルとなるように、ハウスキーピング遺伝子を補正因子として使用する。また別の実施形態において、１つ以上のＩＦＮマーカーの定量が絶対数として示されるように、レファレンス値をゼロとする。幾つかの実施形態においては、１つ以上のＩＦＮ応答マーカーの発現を溶媒対照と比較した比を求める。更に他の実施形態においては、規格化を行わない。一部の実施形態においては、対象由来の第１の試料を溶媒中のインターフェロンに曝露し、そして第２の試料をインターフェロン非含有の溶媒に曝露する。次に、１つ以上のインターフェロン応答マーカーの発現の変化を、対象に由来する第１及び第２の試料の両方におけるこれらのマーカーをコードするｍＲＮＡの量を測定し、計算することにより、インターフェロンの作用を定量する。幾つかの実施形態においては、この定量された作用を、１つ以上インターフェロン応答マーカーの発現に対して、インターフェロン曝露が有する通常の作用と比較する。通常の作用は、対照個体から採取した２つの試料（インターフェロン及び溶媒対照）の間の発現の変化として計算される（例えば複数の個体から測定された１つ以上のマーカーの発現における平均の変化）。最後に、対象の試料の定量された発現の変化と、対照個体のパネルのインターフェロン応答マーカーの発現の平均の変化との間の有意差を識別することにより、対象の潜在的応答性を特徴づける。インターフェロンへの潜在的応答性は、対照個体のパネルの変化より実質的に高値である対象における発現変化により識別される。潜在的非応答性は、対照個体のパネルの変化より実質的に低値である対象における発現変化により識別される。

幾つかの実施形態においては、本明細書に記載する方法を用いて、現在進行のＩＦＮ投与に対する個体の応答性をモニタリングする。一部のそのような実施形態においては、第１の血液試料を個体から得る。一部の実施形態においては、第１の血液試料は、個体へのＩＦＮの投与の前に第１の血液試料を得る。他の実施形態において、個体は過去にＩＦＮを投与されており、そして将来再度投与されることになる。一部の実施形態においては、第１の血液試料は、２回のＩＦＮα−２ｂの投与の間の時点において、好ましくは投与の直前に得る。第２の血液試料は、ＩＦＮ投与後のある時点において個体から得る。特定の実施形態においては、この時点は数時間であるが、別の実施形態においては、数週間、そして一部の実施形態においては数ヶ月である。他の実施形態において、数ヶ月の過程に渡って連続して追加的試料を採取する。次に個体から得た血液試料を上記した通り実施される発現分析まで凍結する。即ち、ＩＦＮ応答マーカーの発現レベルの評価は、ＩＦＮ投与の経過（即ち薬効）をモニタリングするために使用できる。一部の実施形態においては、ＩＦＮ投与後の血液試料とＩＦＮ投与前の血液試料との間で、１つ以上のＩＦＮ応答マーカーの発現に有意差があれば、療法が有効であることを示している。他の実施形態において、ＩＦＮ投与後の血液試料とＩＦＮ投与前の血液試料との間で、１つ以上のＩＦＮ応答マーカーの発現に何れかの有意差もない場合は、療法が有効ではないことを示している。更に他の実施形態において、このプロトコルは他の想定上の治療剤の薬効をモニタリングするために採用される。

以下の実施例を参照しながら特定の実施形態を説明するが、これは限定的ではなく説明
的な意味において捉えられなければならない。

実施例１ ＩＦＮα−２ｂに応答するマーカーのエクスビボスクリーニング
血液を単一の健常者ドナーよりヘパリンチューブ内に採取し、使用時まで４℃で保存した。採血と同日、ＩＦＮα−２ｂ（保存溶液濃度５×１０⁶ユニット／ｍＬ)をＰＢＳで１：１０に希釈し、そして単一の８ウェルチューブストリップの３ウェルには希釈したＩＦＮα−２ｂ１．２μＬを、そして別の３ウェルにはＰＢＳを分注した。次に、６０μＬの保存全血各々を６ウェル全てに添加し（ＩＦＮα−２ｂ及びＰＢＳの両方につき３連）、そして４時間、３７℃でインキュベートした。インキュベーションの後、全血液試料を−８０℃で凍結保存した。以前に報告されている通りＳＹＢＲグリーンリアルタイムＰＣＲを使用することにより種々のｍＲＮＡを定量した（Mitsuhashi M等、Clin. Chem. 52:634-642, 2006）。

要すれば、９６ウェルフィルタプレートに白血球除去メンブレン（Ｌｅｕｋｏｓｏｒｂ；Ｐａｌｌ）を組み込み、そしてオリゴ（ｄＴ）固定化採集プレート上に置いた。１５０μＬの５ｍｍｏｌ／Ｌ トリス（ｐＨ７．４）を適用してフィルタメンブレンを湿潤させた。４℃で１分間１２０ｇで遠心分離することにより、メンブレンからトリスを除去した後、刺激された全血試料５０μＬを各ウェルに適用し、そして、すぐに４℃で２分間１２０ｇで遠心分離した。次にウェルを、リン酸緩衝生理食塩水３００μＬで１回洗浄した。４℃で５分間２０００ｇで遠心分離して食塩水を除去した後、１０ｍＬ／Ｌの２−メルカプトエタノール（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、０．５ｇ／ＬのプロテイナーゼＫ（Ｐｉｅｒｃｅ）、０．１ｇ／Ｌのサケ精子ＤＮＡ（５ Ｐｒｉｍｅ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ／Ｂｒｉｎｋｍａｎ）、０．１ｇ／Ｌの大腸菌ｔＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ）、５ｎｍｏｌ／Ｌの各特異的リバースプライマー及び１０¹⁰分子／Ｌの合成ＲＮＡ３４（外標準として）を添加した保存溶解緩衝液［５ｇ／ＬのＮ−ラウロイルサルコシン、４×標準食塩水クエン酸塩、１０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ、１ｍＬ／ＬのＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０（ＮＰ−４０の代替品）、１．７９ｍｏｌ／Ｌのグアニジンチオシアネート（全入手元：Ｓｉｇｍａ）］６０μＬを、フィルタプレートの各ウェルに添加した。次にプレートを１０分間３７℃でインキュベートし、オリゴ（ｄＴ）固定化採集マイクロプレート（ＧｅｎｅＰｌａｔｅ；ＲＮＡｔｕｒｅ）上に置き、そして４℃で５分間２０００ｇで遠心分離した。４℃でオーバーナイトの保存をした後、マイクロプレートを３回１００μＬの無添加溶解緩衝液で、そして次に３回１５０μＬの洗浄緩衝液［０．５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ，１０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス（ｐＨ７．４），１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ］で、４℃において洗浄した。

３０μＬの１×逆転写緩衝液を含有する緩衝液［５０ｍＭのＫＣ１、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｎＬ／μＬのＴｗｅｅｎ２０］、
１．２５ｍＭの各デオキシヌクレオシド三リン酸、４ユニットのｒＲＮａｓｉｎ、及び８０ＵのＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ；プライマー非含有）の添加、及び２時間、３７℃のインキュベーションにより、各ウェル中で直接ｃＤＮＡを合成した。各３０μＬ反応液から、４μＬのｃＤＮＡを直接３８４ウェルＰＣＲプレートに写し、そして５μＬのＴａｑＭａｎユニバーサルマスター混合物（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、及び１μＬの５μΜ各ＩＦＮ誘導マーカー用フォワード、及びリバースプライマー又はβアクチン（表１参照）を添加した。ＰＣＲはＰＲＩＳＭ７９００ＨＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、９５℃で１０分間を１サイクル、ついで、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、そして６０℃で１分、を４５サイクルで実施した。各遺伝子は別個のウェル中で増幅させた。サイクル閾値（Ｃｔ）、即ち特定の量のＰＣＲ産物（蛍光に基づく）が発生するサイクルを分析ソフトウエア（ＳＤＳ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて求めた。ＰＢＳ投与対照試料の各Ｃｔから、ＩＦＮα−２ｂ投与試料の各Ｃｔを減算することによりΔＣｔを求め、そして増加倍率は２＾−ΔＣｔにより計
算した。

図１に示す通り、ＩＦＮα−２ｂで刺激した３種のハウスキーピング遺伝子（ＡＣＴＢ、Ｂ２Ｍ、及びＧＡＰＤＨ）試料は、全てそれらの対応する対照試料からは０．５〜２倍の変化の範囲内であり、ＩＦＮα−２ｂ刺激に応答した発現の有意な変化を示さなかった。一方、ＴＮＦＳＦ１、ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＮＦＳＦ６、ＣＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＩＦＮγ、ＳＴＡＴ１、ＧＢＰ（１と２の両方で共通）、ＸＡＦ１、ＳＯＣＳ１、Ｇ１Ｐ２、ＢＳＴ２及びＩＲＦ７においては、発現の有意な増大が検出された。ＴＮＦＳＦ５、ＴＮＦＳＦ８、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１５、ＣＣＬ３、ＣＣＬ２０、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＩＬ２３、ＴＬＲ２、ＶＥＧＦおよびＬＣＫに関しては、発現の有意な減少が計算された。ＴＮＦＳＦ１０、グランザイムＢ、ＣＤ６４、及びＭＰＯは全て有意に増大した発現の方向性を示したが、計算された増大は統計学的に有意ではなかった。これらの結果は、多数のサイトカイン、免疫応答エレメント、シグナル伝達因子、及び他のカテゴリーのマーカーが、ＩＦＮα−２ｂ刺激に対して有意に応答することを示している。

実施例２ ＩＦＮα−２ｂによるエクスビボでの刺激への用量応答
実施例１の結果に基づいて、全血試料を刺激するために使用されたＩＦＮα−２ｂの用量との関連における発現の変化に関して、ＩＦＮα−２ｂに応答する選択されたマーカーを評価した。

上記した通り採取された全血を４時間、０〜１０⁶ユニット／ｍＬの範囲の種々の用量
のＩＦＮα−２ｂで刺激し、次に分析時まで−８０℃で凍結保存した。分析は上記したとおりに実施し、その結果を図２に示した。

図２に示す通り、ＩＦＮα−２ｂ刺激は、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＧＢＰ１／２、及びＴＮＦＳＦ１０の用量依存的増加を誘導した。同様に、発現の用量依存的減少が、ＣＸＣＬ２及びＣＣＬ２０に関して検出された。ＩＦＮα−２ｂ刺激の作用は、約１０⁵〜１０⁶ユニット／ｍＬのＩＦＮα−２ｂでプラトーとなった。更にまた、ＩＦＮγ遺伝子発現は、ＩＦＮα−２ｂが１０⁵ユニット／ｍＬ近傍という狭小な濃度範囲
において応答する場合があると考えられた。これらの実験は、１０⁵ユニット／ｍＬのＩ
ＦＮα−２が応答マーカーにおける遺伝子発現変化を誘発するために最適な濃度である可能性を示唆している。実施例２で使用した８種のマーカーは、同様に実施例３においても使用した。

実施例３ ＩＦＮα−２ｂによるエクスビボでの刺激への速度論的応答
実施例２の結果に基づいて、１０⁵ユニット／ｍＬの用量のＩＦＮα−２に応答する８
種のマーカーを、全血試料の刺激後の速度論的発現の変化に関して評価した。

上記した通り、採取した全血を０〜７時間の範囲の時間に渡り、１０⁵ユニット／ｍＬ
のＩＦＮα−２（又はＰＢＳ単独）で刺激し、次に分析時まで−８０℃で凍結保存した。ｍＲＮＡ発現分析を上記した通り実施し、その結果を図３（Ｃｔ）及び４（倍増変化）に示した。

図３に示す通り、βアクチン（ＡＣＴＢ）のＣｔ値は、７時間のインキュベーションに渡って、ＰＢＳ（○）とＩＦＮα−２ｂ（●）の間で不変であった。しかしながら、１０⁵ユニット／ｍＬのＩＦＮα−２ｂは、ＩＦＮα−２ｂ投与試料のＣｔが、ＰＢＳ対照よ
り低値であることによりわかるとおり、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＴＮＦＳＦ１０、ＧＢＰらのｍＲＮＡの発現における有意な誘導を誘導していた。一方、ＩＦＮα−２ｂはCXCL2及びCCL20 mRNAのレベルを有意に減少させた。有意な変化は１時間の
インキュベーションという早期に観察された。これらのｍＲＮＡの発現の変化（増大及び減少の両方）は初回刺激後急速に起こっている。発現の変化は１〜２時間程度でピークに達し、そして約４時間後には発現のプラトーに達していると観察された。これらのデータに基づき、今後の分析についてはインキュベーション時間として４時間を選択した。

実施例４ エクスビボでのＩＦＮα−２ｂ刺激
上記した通り、成人ドナーから全血を採取した。血液試料を３７℃で４時間、１０⁵ユ
ニット／ｍＬのＩＦＮα−２で刺激し、次に分析時まで−８０℃で保存した。ｍＲＮＡ発現の分析を上記した通り実施し、その結果を図５に示した。

ハウスキーピング遺伝子βアクチンの発現は、ＩＦＮα−２による刺激により有意に変化しなかった。一方、４個体各々において測定したｍＲＮＡのほぼ全てが、ＩＦＮα−２による刺激により有意に誘導された。これは４個体全員がＩＦＮα−２療法に応答することを示唆している。分析した大部分のｍＲＮＡで増大が検出されたものの、個体間にはかなりの変動があった。このことは、ＩＦＮα−２応答集団であっても応答性の程度には変動があることを示している可能性がある。例えば、患者＃４（□）は、評価したｍＲＮＡの多くに関してｍＲＮＡレベルのより頑強な増大を呈していると考えられ、この個体がより高度にＩＦＮα−２応答する可能性を示唆している。

実施例５ ＩＦＮα−２ｂ投与に対するインビボの応答
全血を、現在実施中のＩＦＮα−２ｂ療法を受けている患者２人から得た。各患者から２試料を、第１の試料はＩＦＮα−２ｂ投与前、第２の試料はＩＦＮα−２ｂ投与の２４時間後に得た。ＲＮＡをＰＡＸｇｅｎｅ法により製造元のプロトコルに従って単離した。結果を図６及び表２に示す。これらの患者試料については、１つのハウスキーピング遺伝子であるＢ−２ミクログロブリンの発現レベルが、ＩＦＮα−２ｂ前とＩＦＮα−２ｂ後の試料の間で２倍を超えていたため、発現の倍増変化を計算する場合に規格化を行わなかった。

図６に示す通り、ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＣＬ８、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＳＴＡＴ１、ＧＢＰ、ＸＡＦｌ、ＡＩＭ２、ＳＯＣＳｌ、Ｇ１Ｐ２、ＢＳＴ２及びＩＲＦ７は、患者＃１及び患者＃２の両方においてＩＦＮα−２ｂの投与により有意に誘導された。一方、ＴＮＦＳＦ５、ＩＬ８、ＩＬ２３及びＬＣＫｍＲＮＡの発現は、ＩＦＮα−２ｂの投与後は両方の例において有意に減少した。数種のマーカーに関しては、患者＃２は患者＃１と比較して、ＩＦＮα−２ｂ投与後の発現において、より大きい変化を示した。表２は、インビボでのＩＦＮα−２ｂ投与により影響を受けた種々のｍＲＮＡ分子種、及びエクスビボでのＩＦＮα−２ｂ刺激の影響を示す。エクスビボ試験の結果は、インビボ試験の場合と良好な相関を示していた。表１に示す通り、ＣＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＧＢＰ、ＸＡＦｌ、ＳＯＣＳｌ、Ｇ１Ｐ２、ＢＳＴ２及びＩＲＦ７は、ＩＦＮα−２ｂに媒介される増大の信頼性があるマーカーであり、そしてＴＮＦＳＦ５、ＩＬ８及びＩＬ２３はＩＦＮα−２ｂに媒介される減少の信頼性があるマーカーであった。これらの実験に基づいた場合に、明確な相関を示さなかった残りのマーカーは、相関を明確化するために現在の実験プロトコルの最適化、又は代替のプロトコルが必要であるかどうかを調べる追加的試験に付されている。

しかしながら、実施例１〜３を通して明確化された相関に基づけば、本明細書に記載したエクスビボでの刺激、及び分析の特定の実施形態は、ＩＦＮα−２ｂ療法に対しての応答者／非応答者の予測に関する診断試験を提供するものである。同様に、本明細書に記載したインビボでの分析の特定の実施形態は、ＩＦＮα−２ｂ療法のモニタリングのための診断試験を与えるものである。

実施例６ 他のインターフェロンの使用
実施例１〜４に記載した実験を、ＩＦＮα−２ｂの代わりに、ＩＦＮγ及び他のインターフェロンを用いながら反復した。同様の結果が観察された。

実施例７ インターフェロン応答ｍＲＮＡのエクスビボ誘導によるインターフェロンへの宿主の応答性の特徴づけ
インターフェロン（ＩＦＮ）は感染性疾患（Ｂ型及びＣ型肝炎）、自己免疫疾患（多発性硬化症）及び悪性新生物（白血病、リンパ腫、黒色腫）を有する患者に対して臨床的に有効であり得る。しかしながら、ある個体がＩＦＮ投与に対して、そして応答の薬物力学評価のために、応答するはずである可能性を評価する必要性が残っている。本実施例においては、ヘパリン処理した全血の、各々０．０６ｍｌの３連の小分量を、ＩＦＮ（ＩＦＮα２ｂ、ＩＦＮβ−１ａ、ＩＦＮγ）又は溶媒対照で、２時間のみ刺激し、次に種々のＩＦＮ応答ｍＲＮＡを高スループットアッセイにより定量した。有意な誘導は、ＣＣＬケモカイン−８、ＣＸＣＬケモカイン−９、１０、１１、腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）−１０、グアニル酸結合タンパク質１（ＧＢＰｌ）、ＸＩＡＰ関連因子１（ＸＡＦｌ）、サイトカインシグナリング１のサプレッサー（ＳＯＣＳ１）、ＩＳＧ１５ユビキチン様修飾因子（ＩＳＧ１５、Ｇ１Ｐ２）、骨髄支質細胞抗原２（ＢＳＴ２）及びインターフェロン調節因子７（ＩＲＦ７）に関して確認されたのに対し、ＴＮＦＳＦ５、インターロイキン（ＩＬ）−８及びＩＬ２３のレベルは減少した。これらのｍＲＮＡの増大又は減少は急速に起こり、そして２〜４時間後にはプラトーに達した。反応は１０⁴〜１
０⁵ユニット／ｍｌのＩＦＮα２ｂで用量依存性であった。エクスビボでの結果を確認す
るために、ＩＲＢ認可プロトコルの下に、ＩＦＮα２ｂの前および後にＰＡＸｇｅｎｅチューブ内に血液を採取した。全ＲＮＡを有核細胞から抽出し、エクスビボアッセイと同じ方法を用いてｍＲＮＡを測定するために使用した。その結果、上記したｍＲＮＡの増大及び減少が本インビボアッセイにおいて確認された。ＩＦＮ投与後４時間以内に、ＴＮＦＳＦ１０、ＳＯＣＳ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、Ｇ１Ｐ２及びＧＢＰｌらのｍＲＮＡの３２倍超の誘導が確認された。更にまた、これらのｍＲＮＡマーカーのレベルは、臨床過程の間に変化しており、これはＩＦＮ及び／又は他の療法及び免疫調節剤に対する宿主の応答性をモニタリングするためにアッセイが使用できることを示唆している。アッセイのスループットシームレスプロセスは、多くの試料の操作を同時に可能とし、そして３連の試料の間で変動が小さいことは、各ｍＲＮＡに関して統計学的有意性をもって５０％変化を検出する感度をもたらしている。

方法
エクスビボ
治験審査委員会（ＩＲＢ）認可ヘパリン処理血液試料を、Ａｐｅｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｔｕｓｔｉｎ、ＣＡ）から入手した。６０μＬの全血を、予め種々の刺激物質及び対照物質を分注しておいた８ウェルストリップマイクロチューブ内に添加した（図７Ａ）。キャップを閉じた後、これらのストリップを０〜７時間、３７℃でインキュベートし、次に−８０℃で凍結保存した。解凍した血液をフィルタプレートに移し、白血球をメンブレン上に捕捉し、次に溶解緩衝液を各ウェルに添加した（図７Ｂ）。溶解物をｐｏｌｙ（Ａ）＋ ｍＲＮＡの単離のためにオリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレートに移し、その後、同じプレート上でｃＤＮＡ合成を行った（図７Ｃ）。サーマルサイクラー（ＰＲＩＳＭ ７９００、ＡＢＩ）中のｉＴａｑＳＹＢＲ（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いたリアルタイムＰＣＲのために３８４ウェルプレートにｃＤＮＡ溶液を移した（図７Ｄ）。ＰＣＲ条件は、９５℃で１０分、その後６５℃で１分、及び９５℃で３０秒、を５０サイクルとした。溶融曲線を常時分析することにより、ＰＣＲシグナルが単一のＰＣＲ産物から誘導されていることを確認した。サイクル閾値（Ｃｔ）を分析ソフトウエア（ＳＤＳ、ＡＢＩ）により求め、そして統計学的なｐ値を、刺激物質及び対照物質の各々３Ｃｔ値を用いたｔ検定により計算した。薬物投与３連試料のＣｔを、対照試料の平均Ｃｔ値に
よりそれぞれ減算することによりΔＣｔを計算し、そして増加倍率を２＾（−ΔＣｔ）として計算した。

インビボ
研究プロトコルはＩＲＢ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃ）により認可されている。血液を、ＩＮＦ療法の前および後で、患者からＰＡＸｇｅｎｅチューブに採取した。全ＲＮＡを有核細胞から抽出し、そしてｐｏｌｙ（Ａ）＋ ＲＮＡを更にオリゴ（ｄＴ）固定化マクロプレートを用いながら単離し、その後、エクスビボ測定で示したとおりＲＴ−ＰＣＲを行った。データを規格化するために、各ｍＲＮＡのＣｔ値を、ＡＣＴＢのＣｔ値により減算することによりΔＣｔを計算し、そして％ＡＣＴＢを２＾（−ΔＣｔ）×１００として求めた。

結果
全血を４時間、３７℃で、ＰＢＳ又はＩＮＦａ２ｂ（終濃度１０５ユニット／ｍＬ）で刺激し、次に、方法において記載したとおり、種々のｍＲＮＡを定量した。３種の対照遺伝子（ＡＣＴＢ、Ｂ２Ｍ及びＧＡＰＤＨ）の増加倍率は全て０．５〜２．０の間であった。統計学的に有意な誘導（黄色バー、「＊」によっても識別される）が、ＴＮＦＳＦ１、６、ＴＮＦＲＳＲ５、ＣＣＬ８、ＣＸＣＬ９、１０、１１、ＩＦＮＧ、ＳＴＡＴ１、ＧＢＰ、ＸＡＦ１、ＳＯＣＳ１、Ｇ１Ｐ２、ＢＳＴ２及びＩＲＦ７について確認されたのに対し、有意な減少（緑色バー、「▼」によっても識別される）は、ＴＮＦＳＦ５、８、１４、１５、ＣＣＬ２０、ＣＸＣＬ１、２、３、５、ＩＬ１Ｂ、８、１０、２３、ＴＲＬ２、ＶＥＧＦ及びＬＣＫについて確認された。図８を参照されたい。

ｍＲＮＡのＩＦＮα２ｂ誘導増大（ＣＸＣＬ９、１０、１１、ＴＮＦＳＦ１０、ＧＢＰ）及び減少（ＣＸＣＬ２及びＣＣＬ２０）の両方とも、同様に用量依存性であり、１０⁵
ユニット／ｍＬのＡＣＴＢにおけるピークはＩＮＦａ２ｂ刺激により変化しなかった。インキュベーションは４時間とした。図９を参照されたい。

ｍＲＮＡのＩＦＮα２ｂ誘導増大（ＣＸＣＬ９、１０、１１、ＴＮＦＳＦ１０、ＧＢＰ
）及び減少（ＣＸＣＬ２及びＣＣＬ２０）は共に急速に起こり、ピークは約１〜２時間であり、その後は少なくとも７時間はプラトーであった。１０⁵ユニット／ｍＬのＩＮＦα
２ｂを使用した。図１０を参照されたい。

４人の成人ボランティア由来の血液試料を、１０⁵ユニット／ｍＬのＩＦＮα２ｂを用
いながら、ｍＲＮＡのエクスビボでの誘導に関して試験した。一人の個体（Ｘ）は、ＩＦＮα２ｂ誘導ＴＮＦＳＦ１０、ＳＯＣＳ１、ＢＳＴ２、ＡＩＭ２、ＸＡＦ１、ＩＲＦ７及びＴＮＦＲＳＦ５を示すことができなかったが、ＣＸＣＬ９、ＧＢＰ及びＧ１Ｐ２は誘導された。図１１を参照されたい。

ＩＦＮα２ｂ注射の前、及び４時間（４ｈ）（ｎ＝３）又はオーバーナイト（ＯＮ）（ｎ＝４）の後に血液を採取し、そして種々のｍＲＮＡを定量し、％ＡＣＴＢとして表わした。ＳＴＡＴ１、ＩＲＦ７、ＸＡＦ１及びＧ１Ｐ２ｍらのＲＮＡのレベルは、４ｈ及びＯＮの両方について高値であったのに対し、ＴＮＦＳＦ１０、ＣＸＣＬ１０、ＳＯＣＳ１及びＩＣＯＳの増大は、一過性であった。１人の患者はＯＮにおいてＧＢＰ、ＢＳＴ２、ＴＮＦＳＦ１０及びＣＸＣＬ１０の減少を示した。図１２を参照されたい。

ＩＦＮα２ｂ（３×１０６ユニット／ｍ２）を第８〜１２日及び第１５〜２８日に皮下注射した。第１、第１５〜１９及び第２２〜２６日に、ナトリウムスチボグルコネート（ＳＳＧ）（４００ｍｇ／ｍ２／ｄａｙ）を静脈内投与した。第１、８、１５及び２６日（症例＃１）において、ＩＦＮα２ｂ／ＳＳＧ注射の前及び４時間後に採血し、種々のｍＲ
ＮＡを定量し、そして％ＡＣＴＢとして表した。症例＃１においてはＧ１Ｐ２、ＧＢＰ、ＢＳＴ２及びＸＡＦ１の誘導は、ＩＦＮα２ｂ投与の初回（第８日）及び２回目（第１５日）のシリーズの両方について観察された。ＣＸＣＬ１０は初回投与では誘導されなかったが、２回目投与では誘導された。投与期間（第１５〜２８日）の間、これらのｍＲＮＡのレベルは高値に維持された。症例＃２においては、ＢＳＴ２、ＧＢＰ及びＣＸＣＬ１０のレベルは初回投与では減少したのに対し、５種のｍＲＮＡ全てが２回目投与では誘導された。例えば図１３Ａ及び１３Ｂを参照されたい。

予備的な結論
エクスビボ及びインビボの両方において、ＩＦＮα２ｂ投与後の全血白血球において種々のｍＲＮＡが誘導され、そしてそのようなｍＲＮＡの誘導はＲＴ−ＰＣＲにより良好に検出できた。

ＩＦＮα２ｂの作用はエクスビボ（１〜２時間）（図１０）及びインビボ（４時間）（図１２）の両方において極めて急速であった。

ＩＦＮα２ｂの作用は、試験した個体全てに渡って普遍的には観察されず、そしてかなりの個体間変動、又は応答者／非応答者が確認された（図１１〜１３のＢＳＴ２、ＧＢＰ、ＴＮＦＳＦ１０及びＣＸＣＬ１０）。そのような変動を示したｍＲＮＡは、恐らくは将来における個人化医療診断薬のための識別候補マーカーとなりえる。

幾つかの実施形態においては、インターフェロンは、Ｉ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロン、及びＩＩＩ型インターフェロンよりなる群から選択される。幾つかの実施形態においては、インターフェロンが、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγ、これらの組み合わせ、及びこれらのサブタイプよりなる群から選択される。幾つかの実施形態においては、インターフェロンは、インターフェロンα２ｂである。幾つかの実施形態においては、インターフェロンα２ｂは、約１〜約１００，０００ユニット／ｍＬの濃度で存在する。幾つかの実施形態においては、インターフェロンα２ｂは、約５，０００〜約１５，０００ユニット／ｍＬの濃度で存在する。幾つかの実施形態においては、インターフェロンα２ｂはウィルス感染を治療するために投与される。幾つかの実施形態においては、ウィルス感染が肝炎ウィルスにより起因する。他の実施形態においては、インターフェロンα２ｂは抗癌療法として投与される。

幾つかの実施形態においては、溶媒はリン酸緩衝生理食塩水又は他の同様の比較的不活性な生理学的物質（例えば標準食塩水又は蒸留水）である。幾つかの実施形態においては、サンプルのインターフェロン又は溶媒への試料の曝露は、１時間から７時間まで行われる。１つの実施形態においては、曝露は４時間行う。幾つかの実施形態においては、曝露は約３７℃で行う。

本明細書に記載した幾つかの実施形態において、ＩＦＮの投与に対する宿主の応答性のエクスビボで特徴づけるための方法が提供される。幾つかの実施形態においては、方法は潜在的に応答のある個体からの末梢全血の採取、及び、ＩＦＮ応答マーカーのパネルの発現における変化に関してスクリーニングするためにＩＦＮによる全血の刺激を包含する。幾つかの実施形態においては、１つ以上のＩＦＮ応答マーカーをコードするｍＲＮＡの変化の検出は、ＩＦＮ投与に対する個体の潜在的応答性に関係する。他の実施形態において、ＩＦＮの投与に対する個体の、現在進行の応答性をモニタリングするための方法が提供される。一部の実施形態においては、末梢全血をＩＦＮ投与前および後に個体から採取し、そしてＩＦＮ応答マーカーのパネルの発現における変化について評価する。次に発現の変化を用いて、ＩＦＮ投与に対する、個体の現在進行の応答性及びその薬効を評価する。幾つかの実施形態においては、本明細書に記載した方法は、肝炎感染、又は、関連若しくは無関連の悪性疾患を治療するために、ＩＦＮ投与に対する応答性を予測するか、又はその薬効をモニタリングするために使用される。一部の実施形態においては、個体に投与されたＩＦＮは、Ｉ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロン、又はＩＩＩ型インターフェロンに分類される。一部の実施形態においては、投与されるインターフェロンはＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ω、ＩＦＮ−γ、これらの組み合わせ、及びこれらのサブタイプよりなる群から選択される。特定の実施形態においては、投与されるＩＦＮは、ＩＦＮ−α、又はＩＦＮ−γの何れかである。そのような実施形態の一部においては、ＩＦＮ−αはＩＦＮα−２ｂである。

一部の実施形態においては、ＩＦＮα−２ｂを包含するＩＦＮに応答するマーカーは、１つ以上のＴＮＦＳＦ（腫瘍壊死因子スーパーファミリー）１（リンホトキシンａ）、ＴＮＦＳＦ２、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０）、ＴＮＦＲＳＦ５（ＣＤ４０受容体）、ＴＮＦＳＦ６（Ｆａｓリガンド）、ＴＮＦＳＦ８、ＴＮＦＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ−ＴＮＦ−関連アポトーシス誘導リガンド）、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１５、ＣＣＬ（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド）２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ２０、ＣＸＣＬ（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド）１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＩＬ（インターロイキン）１Ｂ、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１７、ＩＬ２３、ＦＯＸＰ３（フォークヘッドボックスＰ３）、ＣＤ（分化抗原群）２５、ＣＴＬＡ４（細胞傷害性Ｔ−リンパ球抗原４）、グランザイムＢ、ＣＤ８Ａ、ＣＤ１６、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ６４、ＩｇＧＦｃ、ＡＲＧ（アルギナーゼ）、ＭＰＯ（ミエロペルオキシダーゼ）、ＴＬＲ（トール様受容体）２、ＴＬＲ４、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、ＩＦＮｙ、ＴＧＦ（トランスフォーミング増殖因子）β、ＣＤ４、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）、ＰＯＭＣ（プロオピオメラノコルチン）、ＧＢＰ（グアニル酸結合タンパク質）、ＸＡＦｌ（Ｘ連鎖アポトーシス抑制タンパク質（ＸＩＡＰ）−関連因子１）、ＡＩＭ２（アブセントインメラノーマ２）、ＳＨＰ２、ＳＯＣＳ１（サイトカインシグナル抑制因子１）、ＳＬＰ７６、Ｇ１Ｐ２（ユビキチン様修飾因子）、ＢＳＴ２、ＩＲＦ７（インターフェロン調節因子）、及びＬＣＫを包含する。

要すれば、装置の特定の実施形態は複数の試料送達ウェルを含有するマルチウェルプレート、ウェル下部の白血球捕捉フィルタ、及び固定化されたオリゴ（ｄＴ）を含有するフィルタ下部のｍＲＮＡ捕捉区画を含む。特定の実施形態においては、装置はまた、フィルタプレートを受容するように採用された真空ボックスを含むことにより、プレートとボックスの間に密閉状態を作り、これにより真空圧が適用されれば、白血球捕捉フィルタを通過して、試料送達ウェルから血液が引き込まれ、その結果、白血球が捕捉され、非白血球血液成分はフィルタ洗浄により除去される。別の実施形態においては、試料ウェルの外に白血球捕捉フィルタを通過して血液を引き出す他の手段、例えば遠心分離又は陽圧を使用する。好ましい実施形態においては、白血球は共に積層されている複数のフィルタメンブレン上に捕捉される。幾つかの実施形態においては、捕捉された白血球は、その後、溶解緩衝液で溶解され、これにより捕捉された白血球からｍＲＮＡを放出する。次にｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ捕捉区域に固定化されたオリゴ（ｄＴ）にハイブリダイズされる。幾つかの実施形態において使用してよい溶解緩衝液の組成に関するより詳細な記述は、現在係属中であり参照により全体が本明細書に組み込まれる２００６年３月１５日出願の米国特許出願１１／３７６，０１８に記載されている。幾つかの実施形態においては、ｃＤＮＡをオリゴ（ｄＴ）固定化ｍＲＮＡから合成する。好ましい実施形態においては、その後、感染関連マーカーの増幅のために特に設計されたプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲを用いて、ｃＤＮＡを増幅する。このような実施形態において使用するプライマーを表１に示す。一部の実施形態において使用するＰＣＲに関するより詳細な説明は米国特許出願１１／３７６，０１８にも記載されている。

図２に示す通り、ＩＦＮα−２ｂ刺激は、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＧＢＰ１／２、及びＴＮＦＳＦ１０の用量依存的増加を誘導した。同様に、発現の用量依存的減少が、ＣＸＣＬ２及びＣＣＬ２０に関して検出された。ＩＦＮα−２ｂ刺激の作用は、約１０^５〜１０^６ユニット／ｍＬのＩＦＮα−２ｂでプラトーとなった。更にまた、ＩＦＮγ遺伝子発現は、ＩＦＮα−２ｂが１０^５ユニット／ｍＬ近傍という狭小な濃度範囲において応答する場合があると考えられた。これらの実験は、１０^５ユニット／ｍＬのＩＦＮα−２ｂが応答マーカーにおける遺伝子発現変化を誘発するために最適な濃度である可能性を示唆している。実施例２で使用した８種のマーカーは、同様に実施例３においても使用した。

実施例３ ＩＦＮα−２ｂによるエクスビボでの刺激への速度論的応答
実施例２の結果に基づいて、１０^５ユニット／ｍＬの用量のＩＦＮα−２ｂに応答する８種のマーカーを、全血試料の刺激後の速度論的発現の変化に関して評価した。

上記した通り、採取した全血を０〜７時間の範囲の時間に渡り、１０^５ユニット／ｍＬのＩＦＮα−２ｂ（又はＰＢＳ単独）で刺激し、次に分析時まで−８０℃で凍結保存した。ｍＲＮＡ発現分析を上記した通り実施し、その結果を図３（Ｃｔ）及び４（倍増変化）に示した。

実施例４ エクスビボでのＩＦＮα−２ｂ刺激
上記した通り、成人ドナーから全血を採取した。血液試料を３７℃で４時間、１０^５ユニット／ｍＬのＩＦＮα−２ｂで刺激し、次に分析時まで−８０℃で保存した。ｍＲＮＡ発現の分析を上記した通り実施し、その結果を図５に示した。

ハウスキーピング遺伝子βアクチンの発現は、ＩＦＮα−２ｂによる刺激により有意に変化しなかった。一方、４個体各々において測定したｍＲＮＡのほぼ全てが、ＩＦＮα−２ｂによる刺激により有意に誘導された。これは４個体全員がＩＦＮα−２ｂ療法に応答することを示唆している。分析した大部分のｍＲＮＡで増大が検出されたものの、個体間にはかなりの変動があった。このことは、ＩＦＮα−２ｂ応答集団であっても応答性の程度には変動があることを示している可能性がある。例えば、患者＃４（□）は、評価したｍＲＮＡの多くに関してｍＲＮＡレベルのより頑強な増大を呈していると考えられ、この個体がより高度にＩＦＮα−２ｂ応答する可能性を示唆している。

結果
全血を４時間、３７℃で、ＰＢＳ又はＩＮＦα２ｂ（終濃度１０ ^５ ユニット／ｍＬ）で刺激し、次に、方法において記載したとおり、種々のｍＲＮＡを定量した。３種の対照遺伝子（ＡＣＴＢ、Ｂ２Ｍ及びＧＡＰＤＨ）の増加倍率は全て０．５〜２．０の間であった。統計学的に有意な誘導（黄色バー、「＊」によっても識別される）が、ＴＮＦＳＦ１、６、ＴＮＦＲＳＲ５、ＣＣＬ８、ＣＸＣＬ９、１０、１１、ＩＦＮＧ、ＳＴＡＴ１、ＧＢＰ、ＸＡＦ１、ＳＯＣＳ１、Ｇ１Ｐ２、ＢＳＴ２及びＩＲＦ７について確認されたのに対し、有意な減少（緑色バー、「▼」によっても識別される）は、ＴＮＦＳＦ５、８、１４、１５、ＣＣＬ２０、ＣＸＣＬ１、２、３、５、ＩＬ１Ｂ、８、１０、２３、ＴＲＬ２、ＶＥＧＦ及びＬＣＫについて確認された。図８を参照されたい。

ＩＦＮα２ｂ（３×１０ ^６ ユニット／ｍＬ）を第８〜１２日及び第１５〜２８日に皮下注射した。第１、第１５〜１９及び第２２〜２６日に、ナトリウムスチボグルコネート（ＳＳＧ）（４００ｍｇ／ｍＬ／ｄａｙ）を静脈内投与した。第１、８、１５及び２６日（症例＃１）において、ＩＦＮα２ｂ／ＳＳＧ注射の前及び４時間後に採血し、種々のｍＲＮＡを定量し、そして％ＡＣＴＢとして表した。症例＃１においてはＧ１Ｐ２、ＧＢＰ、ＢＳＴ２及びＸＡＦ１の誘導は、ＩＦＮα２ｂ投与の初回（第８日）及び２回目（第１５日）のシリーズの両方について観察された。ＣＸＣＬ１０は初回投与では誘導されなかったが、２回目投与では誘導された。投与期間（第１５〜２８日）の間、これらのｍＲＮＡのレベルは高値に維持された。症例＃２においては、ＢＳＴ２、ＧＢＰ及びＣＸＣＬ１０のレベルは初回投与では減少したのに対し、５種のｍＲＮＡ全てが２回目投与では誘導された。例えば図１３Ａ及び１３Ｂを参照されたい。

Claims (31)

1. インターフェロンの投与に対する個体の潜在的応答性を特徴づけるためのエクスビボでの方法であって、
   該方法は、
   個体由来の全血の第１の試料を、溶媒中のインターフェロンに、該インターフェロンが１つ以上のインターフェロン応答マーカーの発現を改変するために十分な時間、曝露すること；
   個体由来の全血の第２の試料を、インターフェロン非含有の溶媒に、該時間、曝露すること；
   該第１の全血試料及び該第２の全血試料の両方において１つ以上のインターフェロン応答マーカーをコードするｍＲＮＡの量を測定することにより、該１つ以上のインターフェロン応答マーカーの発現における変化として該インターフェロンの作用を定量すること；
   該１つ以上のインターフェロン応答マーカーの発現に対するインターフェロンの定量された作用を、対照個体のパネルでの発現レベルにおける変化の平均として計算される、該１つ以上のインターフェロン応答マーカーの発現に対するインターフェロンの正常な作用と比較すること；および
   該個体における該１つ以上のインターフェロン応答マーカーの発現における変化と、該対照個体パネルにおける該１つ以上のインターフェロン応答マーカーの発現における平均の変化との間の有意差を識別することにより、該個体の潜在的応答性を特徴づけること；
   を含み、
   該個体における発現の変化が該対照個体パネルにおける変化より実質的に大きい場合には、該個体はインターフェロンに対して潜在的に応答性があり、該個体における発現の変化が該対照個体パネルにおける変化より実質的に小さい場合には、該個体はインターフェロンに対して潜在的に非応答性である、方法。
2. 前記１つ以上のインターフェロン応答マーカーが、インターフェロンへの応答に応じて増大するマーカーを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記１つ以上のインターフェロン応答マーカーが、インターフェロンへの応答に応じて減少するマーカーを含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記インターフェロンが、Ｉ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロン、及びＩＩＩ型インターフェロンよりなる群から選択される、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
5. 前記インターフェロンが、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγ、これらの組み合わせ、及びこれらのサブタイプよりなる群から選択される、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
6. 前記インターフェロンが、インターフェロンα２ｂである、請求項１に記載の方法。
7. 前記インターフェロンα２ｂが、約１〜約１００，０００ユニット／ｍＬの濃度で存在する、請求項６に記載の方法。
8. 前記インターフェロンα２ｂが、約５０００ユニット〜約１５，０００ユニット／ｍＬの濃度で存在する、請求項７に記載の方法。
9. 前記溶媒がリン酸緩衝生理食塩水である、請求項１〜８の何れか１項に記載の方法。
10. 前記曝露が、１時間から７時間までの間で行われる、請求項１〜９の何れか１項に記載の方法。
11. 前記曝露が、４時間行われる、請求項１０に記載の方法。
12. 前記曝露が、約３７℃で行われる、請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。
13. 前記１つ以上のインターフェロン応答マーカーが、ＣＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＧＢＰ、ＸＡＦｌ、ＳＯＣＳｌ、Ｇ１Ｐ２、ＢＳＴ２、ＩＲＦ７、ＴＮＦＳＦ５、ＩＬ８、ＩＬ２３、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＮＦＳＦ６、ＴＮＦＳＦ８、ＴＮＦＳＦ１５、ＣＣＬ２０、ＣＸＣＬｌ、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＩＬ１Ｂ、ＩＦＮγ、ＶＥＧＦ、ＩＳＧ１５、ＳＴＡＴ１、ＩＣＯＳ及びＡＩＭ２よりなる群から選択される、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
14. 前記全血が哺乳類から得られる、請求項１〜１３の何れか１項に記載の方法。
15. 前記哺乳類がヒトである、請求項１〜１４の何れか１項に記載の方法。
16. 前記全血がヘパリン処理される、請求項１〜１５の何れか１項に記載の方法。
17. 前記第１及び第２の試料が、肝炎、自己免疫疾患、又は癌の１つ以上を有し、そのための治療が必要な個体から得られる、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
18. 個体におけるインターフェロン療法の薬効を測定する方法であって、
    インターフェロン投与の前に、個体由来の全血の第１の試料を得ること；
    インターフェロン投与の後に、個体由来の全血の第２の試料を得ること；
    該第１の全血試料及び該第２の全血試料の両方における、１つ以上のインターフェロン応答マーカーをコードするｍＲＮＡの量を測定することにより、該１つ以上のインターフェロン応答マーカーの発現を定量すること；および
    該第１の全血試料中及び該第２の全血試料中における、該１つ以上のインターフェロン応答マーカーの発現を比較することにより、インターフェロン療法の薬効を測定すること、を含む方法。
19. 前記第２の血液試料において、前記第１の血液試料と比較して、前記インターフェロン応答マーカーの１つ以上の発現が有意に異なる場合に、インターフェロン療法が有効である、請求項１８に記載の方法。
20. 前記第１の血液試料と比較して、前記第２の血液試料との間で、前記インターフェロン応答マーカーの１つ以上の発現が異ならない場合に、インターフェロン療法が有効ではない、請求項１８に記載の方法。
21. 前記１つ以上のインターフェロン応答マーカーが、ＣＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＧＢＰ、ＸＡＦｌ、ＳＯＣＳｌ、Ｇ１Ｐ２、ＢＳＴ２、ＩＲＦ７、ＴＮＦＳＦ５、ＩＬ８、ＩＬ２３、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＮＦＳＦ６、ＴＮＦＳＦ８、ＴＮＦＳＦ１５、ＣＣＬ２０、ＣＸＣＬｌ、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＩＬ１Ｂ、ＩＦＮγ、ＶＥＧＦ、ＩＳＧ１５、ＳＴＡＴ１、ＩＣＯＳ及びＡＩＭ２よりなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
22. 前記インターフェロンが、Ｉ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロン、及びＩＩＩ型インターフェロンよりなる群から選択される、請求項１８〜２１の何れか１項に記載
    の方法。
23. 前記インターフェロンが、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγ、これらの組み合わせ、及びこれらのサブタイプよりなる群から選択される、請求項１８〜２１の何れか１項に記載の方法。
24. 前記インターフェロンがインターフェロンα２ｂである、請求項２４に記載の方法。
25. 前記インターフェロンα２ｂがウィルス感染を治療するために投与される、請求項２４に記載の方法。
26. 前記ウィルス感染が肝炎ウィルスに起因する、請求項２５に記載の方法。
27. 前記インターフェロンα２ｂが抗癌療法として投与される、請求項２４に記載の方法。
28. 前記第１及び第２の試料が、肝炎、自己免疫疾患、又は癌の１つ以上を有し、そのための治療が必要な個体から得られる、請求項１８〜２３の何れか１項に記載の方法。
29. 全血試料中の１つ以上のインターフェロン応答マーカーをコードするｍＲＮＡを定量するための装置を作成するための方法であって、
    全血の第１の試料及び第２の試料を得ること；
    第１の試料中の白血球を、溶媒中で、刺激剤で刺激すること；
    第２の試料中の白血球を、刺激剤非存在の溶媒に曝露すること；
    第１及び第２の試料の各々を、フィルタプレートに添加すること；
    濾過により、第１及び第２の試料の各々から、赤血球及び白血球以外の血液成分を除去することにより、第１及び第２の試料の各々に由来する白血球をフィルタプレート上に得ること；
    試料中に存在するインターフェロン応答マーカーをコードするｍＲＮＡにハイブリダイズするプライマー及び第１の試料に由来するｍＲＮＡを含む第１の溶解物、並びに、該プライマー及び第２の試料に由来するｍＲＮＡを含む第２の溶解物を産生するために、インターフェロン応答マーカーをコードするマーカーに関する少なくとも１つのリバースプライマーを含む溶解緩衝液を用いて、フィルタプレート上の第１及び第２の試料の各々に由来する白血球を溶解すること；および
    プライマーが結合しているｍＲＮＡを含む、第１及び第２の試料の両方に由来するｍＲＮＡを捕捉するために、オリゴ（ｄＴ）−固定化プレートに第１及び第２の溶解物を移すこと、を含む方法。
30. 前記１つ以上のインターフェロン応答マーカーが、ＣＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＧＢＰ、ＸＡＦｌ、ＳＯＣＳｌ、Ｇ１Ｐ２、ＢＳＴ２、ＩＲＦ７、ＴＮＦＳＦ５、ＩＬ８、ＩＬ２３、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＮＦＳＦ６、ＴＮＦＳＦ８、ＴＮＦＳＦ１５、ＣＣＬ２０、ＣＸＣＬｌ、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＩＬ１Ｂ、ＩＦＮγ、ＶＥＧＦ、ＩＳＧ１５、ＳＴＡＴ１、ＩＣＯＳ及びＡＩＭ２よりなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
31. 前記第１及び第２の試料が、肝炎、自己免疫疾患、又は癌の１つ以上を有し、そのための治療が必要な個体から得られる、請求項２９に記載の方法。