CN101143231B - 一种含肌细胞的组织工程皮肤及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种含肌细胞的组织工程皮肤及其制备方法，本发明的特点是，所制备的皮肤是由肌细胞、皮肤成纤维细胞、皮肤表皮细胞和生物支架材料制成，是将肌细胞和皮肤成纤维细胞复合于生物支架材料内部，在表面接种表皮细胞构建而成的具有活性的含肌细胞的组织工程皮肤。所制备的含肌细胞的组织工程皮肤，与人体皮肤成分接近，具有增强皮肤弹性和机械性能，防止体液流失并保护创面，促进创面愈合，抑制瘢痕形成的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物材料的组织工程技术领域，具体涉及含肌细胞组织工程皮肤的制备。
背景技术
随着组织工程技术的发展，组织工程皮肤已成为皮肤缺损治疗的热点，但至今仍然没有真正理想的皮肤替代物得以应用。目前，在医学美容、创伤、烧伤外科等领域中，随着对功能性恢复的要求和美观的考虑，对于某些深部的皮肤缺损仅仅达到创面上皮化已远远不够，人们仍在努力探索更合理的方法，使植皮区最终取得与全厚皮移植相同或相近的结果。目前存在的其主要问题是植入的人工皮肤在很长时间内外观板硬、缺乏弹性。
肌细胞最基本的功能是将化学能转变为机械能，产生张力和收缩力。肌细胞广泛存在于机体各组织中，为其所在器官的运动提供动力，使之保持或改变器官的形状和张力。肌细胞含有丰富的弹性蛋白和张力纤维，会使皮肤具有一定的弹性和伸展性，以及抗拉能力。它在收缩以及胶原分泌中有重要作用，肌细胞的分化与伤口愈合的质量和速度密切相关；它通过分泌趋化因子、生长因子、细胞外基质和蛋白酶，使其在器官的发生、组织损伤的修复、器官纤维化及器官重塑的过程中占有重要地位；在创面收缩过程中，肌细胞是收缩的动力源，肌细胞中微丝、微管系统及张力纤维等骨架结构主动收缩，使细胞收缩并带动周围基质，引起创面收缩；由于创面收缩过程中受张力影响，成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，产生收缩伤口效应，收缩过程中张力增加，细胞内肌动蛋白骨架按张力方向排列，共同参与伤口收缩。目前对组织工程皮肤的研究，仅包含表皮层和真皮层，不含有肌细胞，所构建的皮肤不具有理想的弹性和机械强度，影响创面愈合的质量和速度。
目前，国内外尚未见有含肌细胞的组织工程皮肤的研制报道和应用。
发明内容
针对目前已有技术所存在的问题，本发明的目的是提供一种含有肌细胞的组织工程皮肤及其制备方法。使所制备的含肌细胞的组织工程皮肤具有增强皮肤弹性和机械性能、防止体液流失并保护创面、促进创面愈合、抑制瘢痕形成的优点。
本发明提出的含肌细胞的组织工程皮肤，其特征在于：是由肌细胞、皮肤成纤维细胞、皮肤表皮细胞和生物支架材料制成，是将肌细胞和皮肤成纤维细胞复合于生物支架材料内部，在表面接种表皮细胞构建而成的具有活性的含肌细胞的组织工程皮肤。所述的生物支架材料是可被机体接受的生物可降解材料，包括胶原蛋白、细胞外基质复合物、透明质酸、硫酸软骨素、聚乳酸、聚羟基乙酸的任一种或几种组合；所述的细胞外基质复合物包含胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白成分。所述的肌细胞为平滑肌或骨骼肌细胞，或可向肌细胞分化的成体干细胞，包括骨髓间充质干细胞、造血干细胞、皮肤干细胞、肝脏干细胞、神经干细胞的一或几种。所述肌细胞是有序排列在真皮层下方或无序分布在真皮层内，真皮层是由皮肤成纤维细胞复合于生物支架材料内部构成。
本发明所述含肌细胞组织工程皮肤的制备方法，包括有培养基的配制、生物支架材料的制备、及组织工程皮肤的三维培养，具体步骤如下：
步骤1.培养基的配制：按9∶1的体积比将DF12商用培养液与胎牛血清混合为基础液；再按500ml基础液标准加入胰岛素2～50ng，氢化可的松10～500μg，表皮细胞生长因子2～10μg，碱性成纤维细胞生长因子2～50ng，转化生长因子β5～50ng，腺嘌呤10～20mg，转铁蛋白1～10mg，维生素C5～30mg，制备成基础培养基；再用基础培养基配制以下培养基，其中添加物的浓度为终浓度：
培养基a 基础培养基+牛垂体提取液25μg/ml
培养基b 基础培养基+氯化钙15～150μg/ml
培养基c 基础培养基+氯化钙150～250μg/ml
培养基d 基础培养基+氯化钙250～350μg/ml
步骤2.生物支架材料的制备：在4℃条件下，按质量比将胶原7～10∶透明质酸2～3∶硫酸软骨素0.5～1混合，用0.5M的醋酸将其配制成浓度为4mg/ml～20mg/ml溶液，冰浴下紫外线照射，再按其体积分别加入10％的胎牛血清和10％的浓度为110mg/ml的DF12培养液，调pH至7.2～7.4，制成凝胶溶液，即支架材料；再将尼龙膜浸透凝胶溶液后，置于培养皿中固化形成支撑膜；
步骤3.将体外培养的肌细胞按1×105～1×106个/ml的浓度混入凝胶溶液，将其滴加至已固化的支撑膜表面，固化后形成肌肉细胞层；
步骤4.将体外培养的成纤维细胞按1×105～1×106个/ml的浓度混入凝胶溶液中，将其滴加至已固化的肌肉细胞层表面，固化后形成真皮层；加入基础培养基培养2～4天，每天换液；
步骤5.在真皮层表面，按1×105～5×105个/cm2的密度接种表皮细胞，加入培养基a培养1天，形成皮肤雏形；
步骤6.皮肤的成熟和角化：把制备的皮肤雏形放在培养支架表面，另置于一培养器皿中，加入培养基a淹没皮肤表面，培养2天后更换为培养基b，淹没皮肤表面，培养1～2天后更换为培养基c，液面与皮肤表面平齐，培养1～2天后更换为培养基d，液面与培养支架表面平齐，培养2～4天，培养期间每天换液；完成含肌细胞的组织工程皮肤的制备，所制备皮肤的肌细胞是有序排列在真皮层下方。
本发明技术方案中所述的步骤3和步骤4可以合并按以下操作：将体外培养的肌细胞和成纤维细胞分别按1×105～1×106个/ml的浓度混入凝胶溶液中，将其滴加至已固化的支撑膜表面，固化后加入基础培养基培养2～4天，每天换液。所制备皮肤的肌细胞是无序分布在真皮层内。
本发明制备的含肌肉层的组织工程皮肤具有一定的弹性与机械强度，与人体皮肤成分接近，表皮层分化层次清晰，基底膜连续完整，表皮层下方的成纤维细胞和肌细胞混合排列在一起伸展性良好。所制备的含肌肉层组织工程皮肤，由于肌细胞在三维培养中产生弹性蛋白，并形成弹性纤维可促进表皮细胞生长爬行、真表皮连接形成，能改善移植物的机械性能和美容效果，使其弹性、机械强度更接近正常皮肤；其组成成份及交联物质可改变，增加对胶原酶的耐受性；在皮肤重建过程中具有重要作用，可增强创面愈合后的皮肤弹性、柔韧性及机械耐磨性，防止体液流失并保护创面，减少瘢痕增生，控制挛缩，改善愈合质量，提高表皮的移植成功率；而且制备方法简便、可大量生产、长期贮存。所制备的含肌细胞的组织工程 皮肤可以直接应用于炎症、溃疡、烧创伤、医源性等原因造成的皮肤缺损的修复，具有一定的弹性、韧性，其形状大小和厚度能根据具体需求制备。
具体实施方式
以下结合实验将本发明技术方案做进一步的详细说明。
实施例1、
步骤1.配制培养基：按9∶1的体积比将DF12商用培养液与胎牛血清混合为基础液；再按500ml基础液标准加入胰岛素2ng，氢化可的松10μg，表皮细胞生长因子2μg，碱性成纤维细胞生长因子2ng，转化生长因子β10ng，腺嘌呤12mg，转铁蛋白5mg，维生素C5mg，制备成基础培养基；再用基础培养基配制以下培养基，其中添加物的浓度为终浓度：
培养基a： 基础培养基+牛垂体提取液25μg/ml
培养基b： 基础培养基+氯化钙100μg/ml
培养基c： 基础培养基+氯化钙200μg/ml
培养基d： 基础培养基+氯化钙300μg/ml
步骤2.制备生物支架材料：在4℃条件下，按质量比将胶原7∶透明质酸2∶硫酸软骨素1混合，用0.5M的醋酸将其配制成浓度为8mg/ml溶液，冰浴下紫外线照射，再按其体积分别加入10％的胎牛血清和10％的浓度为110mg/ml的DF12培养液，用NaOH调节pH值为7.2～7.4，形成凝胶溶液；再将准备好的尼龙膜(使用前裁剪成与所需皮肤的大小相适应，并消毒)浸透凝胶溶液，置于培养器皿中37℃环境固化45分钟，形成支撑膜；
步骤3.将体外培养的肌细胞和成纤维细胞分别按5×105个/ml的浓度混入凝胶溶液中，再将其滴加至已固化的支撑膜表面，在37℃、5％CO2条件下固化50分钟形成真皮层，加入基础培养基培养3天，每天换液；
步骤4.在真皮层表面，按3×105个/cm2的密度接种表皮细胞，加入培养基a，培养1天，形成皮肤雏形；
步骤5.皮肤的成熟和角化：将不锈钢培养支架(表面有通透网格、下面有支腿的平板支架，高0.5～3mm，可由不锈钢、塑料、玻璃、高分子材料或生物材料制作，并已消毒)另置一培养器皿中，把制备的皮肤雏形取出置于培养支架表面，加入培养基a淹没皮肤表面，培养2天后更换为培养基b，淹没皮肤表面，培养1天后更换为培养基c，液面与皮肤表面平齐，培养1天后更换为培养基d，液面与支架表面平齐，培养2天，培养期间每天换液；形成含肌细胞的组织工程皮肤。该皮肤厚度适中、韧性较好；使用前揭掉皮肤下方的尼龙膜。
实施例2：
步骤1.配制培养基：按9∶1的体积比将DF12商用培养液与胎牛血清混合为基础液；再按500ml基础液标准加入胰岛素40ng，氢化可的松10μg，表皮细胞生长因子8μg，碱性成纤维细胞生长因子8ng，转化生长因子β10ng，腺嘌呤12mg，转铁蛋白5mg，维生素C20mg；制备成基础培养基。再用基础培养基配制以下培养基，其中添加物的浓度为终浓度：
培养基a： 基础培养基+牛垂体提取液25μg/ml
培养基b： 基础培养基+氯化钙50μg/ml
培养基c： 基础培养基+氯化钙160μg/ml
培养基d： 基础培养基+氯化钙300μg/ml
步骤2.生物支架材料制备：在4℃条件下，按质量比将胶原10∶透明质酸3∶硫酸软骨素1混合，用0.5M的醋酸将其配制成浓度为15mg/ml溶液，冰浴下紫外线照射；再按其体积分别加入10％的胎牛血清和10％的浓度 为110mg/ml的DF12培养液，用NaOH调pH为7.2～7.4，形成凝胶溶液；再将准备好的尼龙膜浸透凝胶溶液，置于培养器皿中37℃环境固化50分钟，形成支撑膜；
步骤3.将体外培养的已向肌细胞方向分化的骨髓间充质干细胞按4×105个/ml的浓度混入凝胶溶液中，将其滴加至已固化的支撑膜表面，在37℃、5％CO2条件下固化后形成肌肉细胞层；
步骤4.将体外培养的成纤维细胞按4×105个/ml的浓度混合于凝胶溶液中，再将其滴加至已固化的肌肉细胞层表面，在37℃、5％CO2条件下固化50分钟形成真皮细胞层；加入基础培养基培养4天，每天换液；
步骤5.在真皮层表面，按5×105个/cm2的密度接种表皮细胞，加入培养基a，培养1天，形成皮肤雏形；
步骤6.将玻璃培养支架另置一培养器皿中，把制备的皮肤雏形取出置于培养支架表面，加入培养基a淹没皮肤表面，培养2天后更换为培养基b，淹没皮肤表面，培养2天后更换为培养基c，液面与皮肤表面平齐，培养1天后更换为培养基d，液面与培养支架表面平齐，培养3天，培养期间每天换液；形成含肌细胞层的组织工程皮肤。该皮肤表皮层和肌细胞层都比较厚，皮肤厚度较大、弹性较好；使用前揭掉皮肤下方的尼龙膜。
Claims (3)
1.一种含肌细胞的组织工程皮肤，其特征在于：是由肌细胞、皮肤成纤维细胞、皮肤表皮细胞和生物支架材料制成，是将肌细胞和皮肤成纤维细胞复合于生物支架材料内部，在表面接种表皮细胞构建而成；其中，肌细胞是有序排列在真皮层下方或无序分布在真皮层内，真皮层是由皮肤成纤维细胞复合于生物支架材料内部构成；所述的生物支架材料是可被机体接受的生物可降解材料，为胶原蛋白、细胞外基质复合物、透明质酸、硫酸软骨素、聚乳酸、聚羟基乙酸的任一种或几种组合；所述的细胞外基质复合物包含胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白成分；所述的肌细胞为平滑肌或骨骼肌细胞，或可向肌细胞分化的成体干细胞。
2.制备权利要求1所述的含肌细胞组织工程皮肤的方法，包括有培养基的配制、生物支架材料的制备、及组织工程皮肤的三维培养，其特征在于，具体步骤如下：
步骤1.培养基的配制：按9∶1的体积比将DF12商用培养液与胎牛血清混合为基础液；再按500ml基础液标准加入胰岛素2～50ng，氢化可的松10～500μg，表皮细胞生长因子2～10μg，碱性成纤维细胞生长因子2～50ng，转化生长因子β5～50ng，腺嘌呤10～20mg，转铁蛋白1～10mg，维生素C5～30mg，制备成基础培养基；再用基础培养基配制以下培养基，其中添加物的浓度为终浓度：
培养基a 基础培养基+牛垂体提取液25μg/ml
培养基b 基础培养基+氯化钙15～150μg/ml
培养基c 基础培养基+氯化钙150～250μg/ml
培养基d 基础培养基+氯化钙250～350μg/ml
步骤2.生物支架材料的制备：在4℃条件下，按质量比将胶原7～10∶透明质酸2～3∶硫酸软骨素0.5～1混合，用0.5M的醋酸将其配制成浓度为4mg/ml～20mg/ml溶液，冰浴下紫外线照射，再按其体积分别加入10％的胎牛血清和10％的浓度为110mg/ml的DF12培养液，调pH至7.2～7.4，制成凝胶溶液，即支架材料；再将尼龙膜浸透凝胶溶液后，置于培养皿中固化形成支撑膜；
步骤3.将体外培养的肌细胞按1×105～1×106个/ml的浓度混入凝胶溶液中，将其滴加至已固化的支撑膜表面，固化后形成肌肉细胞层；
步骤4.将体外培养的成纤维细胞按1×105～1×106个/ml的浓度混入凝胶溶液中，将其滴加至已固化的肌肉细胞层表面，固化后形成真皮层；加入基础培养基培养2～4天，每天换液；
步骤5.在真皮层表面，按1×105～5×105个/cm2的密度接种表皮细胞，加入培养基a培养1天，形成皮肤雏形；
步骤6.把制备的皮肤雏形放在培养支架表面，另置于一培养器皿中，加入培养基a淹没皮肤表面，培养2天后更换为培养基b，淹没皮肤表面，培养1～2天后更换为培养基c，液面与皮肤表面平齐，培养1～2天后更换为培养基d，液面与培养支架表面平齐，培养2～4天，培养期间每天换液；完成含肌细胞的组织工程皮肤的制备。
3.根据权利要求
所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤3和步骤4合并按以下操作：将体外培养的肌细胞和成纤维细胞分别按1×105～1×106个/ml的浓度混入凝胶溶液中，将其加至已固化的支撑膜表面，固化后加入基础培养基培养2～4天，每天换液。
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