CN101140285B - 一种检测血清中乙肝病毒核心抗原的酶联免疫测定试剂盒 - Google Patents
一种检测血清中乙肝病毒核心抗原的酶联免疫测定试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测血清中乙肝病毒核心抗原的酶联免疫测定试剂盒及其使用方法。该试剂盒的主要组分为：单克隆乙肝核心抗体预包被的微孔板、样本处理剂、辣根过氧化物酶标记的多克隆乙肝核心抗体。在使用时，将待检样本用样本处理剂预处理后，加到单克隆乙肝核心抗体预包被的微孔板中，加入酶标多克隆乙肝核心抗体，加入底物显色，再加终止液终止反应，最后比色测定结果。本发明能检测出血清中的乙肝病毒核心抗原，与HBV-DNA检测结果有很高的符合率，达到临床检验要求，并且具有简便、灵敏、稳定等特点，可以补充常规的乙肝“两对半”检测法，有较好的临床用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，尤其涉及一种检测血清中乙肝病毒核心抗原的酶联免疫测定试剂盒。
背景技术
乙型肝炎患者血清中存在三种形式的病毒颗粒，最多见的是直径约为17～25nm的小球形颗粒，而稍微少一些的是直径约为20～22nm、长度不一的管状或丝状颗粒，这两种颗粒属于亚病毒结构，均为过剩的病毒外壳，仅含乙肝病毒表面抗原而不含有HBV DNA，因此无感染性，还有一种病毒颗粒直径约为42nm，外层为HBV表面抗原(HBsAg)组成的包膜，内层是HBV核心抗原(HBcAg)构成的核衣壳，后者包裹HBV基因组和相关的聚合酶，这类病毒颗粒被称作丹氏颗粒(Dane particle)，是一种完整的可复制的乙肝病毒颗粒。由于HBcAg主要存在于乙肝病毒丹氏颗粒的核心和乙肝患者的肝细胞核内，因此被认为是乙肝病毒复制的直接指标，但血清内极少有游离的HBcAg存在，所以用常规方法难以检出。
有人曾报道过直接检测血清中HBcAg的方法，该方法将多克隆乙肝表面抗体和多克隆乙肝核心抗体同时包被到微孔板上，乙肝表面抗体与乙肝病毒丹氏颗粒上的表面抗原结合，然后在微孔板上加入裂解剂，丹氏颗粒裂解暴露出HBcAg，游离的HBcAg被预包被在微孔板上的多克隆乙肝核心抗体所吸附，再在微孔板中加入辣根过氧化物酶标记的多克隆乙肝核心抗体，过氧化物酶与后续加入的底物反应，最终达到检测HBcAg的目的。后来又有人对这一方法进行了改进，是将包被原料改换为单克隆乙肝表面抗体和单克隆乙肝核心抗体，酶结合物也改为酶标单克隆乙肝核心抗体，同时加入一步抗原与抗体结合的促进过程，增强了检测的灵敏度。
上述两种方法，其原理都是先将乙肝病毒丹氏颗粒固定在微孔板上，然后使其裂解释放出HBcAg，从而实现对HBcAg的检测，但在实际检测过程中，由于一些体内存在乙肝病毒复制的患者血清中含有很高浓度的乙肝亚病毒颗粒，这些亚病毒颗粒与丹氏颗粒竞争结合微孔板上的乙肝表面抗体，因此在一定程度上会抑制丹氏颗粒与微孔板的结合，最终降低了HBcAg检测的灵敏度，成为该类检测方法的应用障碍。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计一种操作简便、能达到实际临床检验要求的检测血清中乙肝病毒核心抗原的酶联免疫测定试剂盒。
本发明提供了一种可检测血清中乙肝病毒核心抗原的酶联免疫测定试剂盒。
本发明提供的乙肝病毒核心抗原酶联免疫测定试剂盒，其主要组分为：单克隆乙肝核心抗体预包被的微孔板，由1～10％(质量百分比)的SDS、0.5～5％(体积百分比)的Tween-60、0.1～1％(体积百分比)的巯基乙醇、0.05～0.2M、PH7.4的磷酸盐缓冲液组成的样本处理剂，辣根过氧化物酶标记的多克隆乙肝核心抗体；其次要组分为：阳性对照液、阴性对照液、20倍浓缩洗涤液、底物液A、底物液B及终止液。
本发明的技术方案是：于血清样本中加入样本处理剂，然后置于70℃环境中温育1小时，应用该方法处理之后，一方面血清中的抗-HBc抗体发生变性而失去与HBcAg特异性结合的能力，另一方面血清中的乙肝病毒丹氏颗粒被裂解而释放出游离的HBcAg，但HBcAg经过该方法处理之后也会发生变性。处理后的血清样本加入到有单克隆乙肝核心抗体预包被的微孔板中，样本中变性的HBcAg被单克隆乙肝核心抗体吸附，形成固相HBcAg·单克隆乙肝核心抗体免疫复合物，该复合物中的HBcAg可与加入的辣根过氧化物酶标记的多克隆乙肝核心抗体结合，形成双抗体夹心，辣根过氧化物酶与后续步骤中加入的底物反应，最终达到检测乙肝核心抗原的目的。
乙肝病毒核心抗原酶联免疫测定试剂盒中各组分的具体制备过程如下：
一、单克隆乙肝核心抗体预包被微孔板的制备
1、包被
Na2CO3 1.6g
NaHCO3 2.9g
去离子水 1000ml
调整PH至9.6，加入适量单克隆乙肝核心抗体，混匀后按每孔100ul的量加入到微孔板各孔中，于4℃环境下放置过夜，然后甩去孔内液体，拍干。
2、洗涤
NaHPO4.12H2O 3.72g
KH2PO4 0.43g
NaCl 6.8g
Tween-20 0.5ml
去离子水 1000ml
调整PH至7.2，按每孔150ul的量加入到微孔板各孔中，静置10秒后甩净、拍干，除去未与微孔板结合的残余单克隆乙肝核心抗体。
3、封闭
牛血清白蛋白 10g
NaHPO4.12H2O 3.72g
KH2PO4 0.43g
NaCI 6.8g
去离子水 1000ml
按每孔150ul的量加入到微孔板中，于4℃环境下放置过夜。
4、干燥
封闭好的微孔板甩去孔内液体、拍干，于25℃(室温)环境下放置过夜，然后放入有干燥剂的塑料袋封口，保存于4℃环境中。
二、样本处理剂的制备
SDS 1～10％
Tween-60 0.5～5％
巯基乙醇 0.1～1％
NaH2PO4.2H2O 1.9～7.7g
Na2HPO4 5.1～20.5g
去离子水 1000ml
保存于4℃环境中。
三、酶标抗体工作液的制备
牛血清白蛋白 5g
NaHPO4.12H2O 3.72g
KH2PO4 0.43g
NaCl 6.8g
去离子水 1000ml
调整PH至7.2，加入适量辣根过氧化物酶标记的多克隆乙肝核心抗体，保存于4℃环境中。
四、阳性对照液的制备
HBV DNA阳性且用本发明的乙肝核心抗原酶联免疫测定试剂盒测定为HBcAg阳性(A值>0.5)的人血清，于60℃放置1小时，加万分之五的硫柳汞，保存于4℃。
五、阴性对照液的制备
HBV DNA阴性且用本发明的乙肝核心抗原酶联免疫测定试剂盒测定为HBcAg阴性(A值<0.1)的人血清，于60℃放置1小时，加万分之五的硫柳汞，保存于4℃。
六、底物液A
Na2HPO4.12H2O 18g
柠檬酸.H2O 5g
3％H2O2 0.4ml
去离子水 1000ml
调整PH至5.2。
七、底物液B
将150mg EDTA加入到1000ml温度为90℃的双蒸水中，待溶解完全并冷却后加入1g柠檬酸，再加入5ml DMSO(内溶解有250mg TMB)。
八、终止液
浓H2SO4 100ml
双蒸水 800ml
九、20×浓缩洗涤液
Tris 24g
Nacl 150g
Tween-20 20ml
去离子水 1000ml
调整PH至7.2。
本发明的另一目的是提供一种检测血清中乙肝病毒核心抗原的方法。本发明的试剂盒在使用时可以按下列步骤操作：
1、将50ul样本处理剂加入到50ul待检血清样本中，混匀，70℃水浴1小时，然后置于室温环境下平衡5分钟；
2、取出单克隆乙肝核心抗体预包被的微孔板，加入50ul预处理过的待检血清样本，各板设阳性对照1孔(50ul)、阴性对照1孔(50ul)及空白对照1孔(加PBS50ul)，置于37℃环境中反应30分钟；
3、取出反应板甩去孔内液体，将各孔注入洗涤液(20倍浓缩洗涤液1ml+19ml去离子水即为工作洗涤液)，停留30秒钟后甩去洗涤液、拍干，重复洗涤5次；
4、每孔加入酶标多克隆乙肝核心抗体工作液50ul，置于37℃环境中反应30分钟；
5、重复步骤3。各孔滴加底物液A、B各50ul，置于37℃环境中避光显色10-15分钟后再每孔滴加终止液50ul，置酶标仪中450nm波长读数。
本发明具有如下特点：
1、应用样本处理剂对血清样本进行处理，可使血清中高滴度的抗-HBc变性而失去与HBcAg结合的能力，避免了抗-HBc对整个检测的干扰。
2、预包被在微孔板上的单克隆乙肝核心抗体直接在血清中吸附从乙肝病毒丹氏颗粒释放出的HBcAg，使整个检测的特异性和灵敏度得到提高。
3、操作简便，实用性强，可与乙肝‘两对半’试剂同步检测，适合各基层医疗单位使用。
具体实施方式
实例1、单克隆乙肝核心抗体预包被微孔板的制备
1、包被
Na2CO3 1.6g
NaHCO3 2.9g
去离子水 1000ml
调整PH至9.6，加入适量单克隆乙肝核心抗体，混匀后按每孔100ul的量加入到微孔板各孔中，于4℃环境下放置过夜，然后甩去孔内液体，拍干。
2、洗涤
NaHPO4.12H2O 3.72g
KH2PO4 0.43g
NaCl 6.8g
Tween-20 0.5ml
去离子水 1000ml
调整PH至7.2，按每孔150ul的量加入到微孔板各孔中，静置10秒后甩净、拍干，除去未与微孔板结合的残余单克隆乙肝核心抗体。
3、封闭
牛血清白蛋白 10g
NaHPO4.12H2O 3.72g
KH2PO4 0.43g
NaCl 6.8g
去离子水 1000ml
按每孔150ul的量加入到微孔板中，于4℃环境下放置过夜。
4、干燥
封闭好的微孔板甩去孔内液体、拍干，于25℃(室温)环境下放置过夜，然后放入有干燥剂的塑料袋封口，保存于4℃环境中。
实例2、样本处理剂的制备
样本处理剂①：
SDS 10g
Tween-60 2ml
巯基乙醇 1ml
NaH2PO4.2H2O 3.8g
Na2HPO4 10.2g
去离子水 1000ml
样本处理剂②：
SDS 1g
Tween-60 0.5ml
巯基乙醇 5ml
NaH2PO4.2H2O 1.9g
Na2HPO4 5.1g
去离子水 1000ml
样本处理剂③：
SDS 5g
Tween-60 1ml
巯基乙醇 5ml
NaH2PO4.2H2O 1.9g
Na2HPO4 5.1g
去离子水 1000ml
样本处理剂配制好以后，保存于4℃环境中。
实例3、酶标抗体工作液的制备
牛血清白蛋白 5g
NaHPO4.12H2O 3.72g
KH2PO4 0.43g
NaCI 6.8g
去离子水 1000ml
调整PH至7.2，加入适量辣根过氧化物酶标记的多克隆乙肝核心抗体，保存于4℃环境中。
实例4、阳性对照液的制备
HBV DNA阳性且用本发明的乙肝核心抗原酶联免疫测定试剂盒测定为HBcAg阳性(A值>0.5)的人血清，于60℃放置1小时，加万分之五的硫柳汞，保存于4℃。
实例5、阴性对照液的制备
HBV DNA阴性且用本发明的乙肝核心抗原酶联免疫测定试剂盒测定为HBcAg阴性(A值<0.2)的人血清，于60℃放置1小时，加万分之五的硫柳汞，保存于4℃。
实例6、底物液A
Na2HPO4.12H2O 18g
柠檬酸.H2O 5g
3％H2O2 0.4ml
去离子水 1000ml
调整PH至5.2。
实例7、底物液B
将150mg EDTA加入到1000ml温度为90℃的双蒸水中，待溶解完全并冷却后加入1g柠檬酸，再加入5ml DMSO(内溶解有250mg TMB)。
实例8、终止液
浓H2SO4 100ml
双蒸水 800ml
实例9、20×浓缩洗涤液
Tris 24g
Nacl 150g
Tween-20 20ml
去离子水 1000ml
调整PH至7.2。
实例10、本发明的试剂盒临床应用结果如下：
共收集临床血清标本352份，其中HBV DNA阳性血清302份，HBV DNA阴性血清50份，用本发明的“乙型肝炎病毒核心抗原酶联免疫测定试剂盒”进行HBcAg检测。结果显示，302份HBV DNA阳性血清中共检出HBcAg阳性276份，阳性率92.4％，且HBcAg阳性检出率随HBV DNA拷贝数的递增呈上升趋势，50份HBV DNA阴性血清中共检出HBcAg阳性0份，阴性率100％。具体检测结果见表一。
表一、HBcAg与HBV DNA的关系
以上结果表明，本发明用于检测血清中乙肝病毒核心抗原的灵敏度和特异性良好，与HBV—DNA探针检测有很高的符合率，可以达到实际临床检验要求，且操作简便，适合各基层医疗单位使用。
Claims (4)
1.一种检测血清中乙肝病毒核心抗原的酶联免疫测定试剂盒，其特征在于该试剂盒是由单克隆乙肝核心抗体预包被的微孔板、样本处理剂、辣根过氧化物酶标记的多克隆乙肝核心抗体、阳性对照液、阴性对照液、20倍浓缩洗涤液、底物液A、底物液B及终止液组成的；所述的样本处理剂是由1～10％质量百分比的SDS、0.5～5％体积百分比的Tween-60、0.1～1％体积百分比的巯基乙醇、0.05～0.2M及pH7.4的磷酸盐缓冲液组成的。
2.根据权利要求1所述的一种检测血清中乙肝病毒核心抗原的酶联免疫测定试剂盒，其特征在于包被微孔板的单克隆乙肝核心抗体在含1～10％质量百分比的SDS、0.5～5％体积百分比的Tween-60、0.1～1％体积百分比的巯基乙醇、0.05～0.2MpH7.4的磷酸盐缓冲液中特异性结合变性的乙肝病毒核心抗原。
3.根据权利要求1所述的一种检测血清中乙肝病毒核心抗原的酶联免疫测定试剂盒，其特征在于所述的阳性对照液是用HBV DNA阳性的人血清制备的。
4.根据权利要求1所述的一种检测血清中乙肝病毒核心抗原的酶联免疫测定试剂盒，其特征在于所述的阴性对照液是用HBV DNA阴性的人血清制备的。
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| CN109270259B (zh) * | 2018-09-12 | 2022-01-11 | 南方医科大学 | 一种检测内毒素的方法 |
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