CN101138326B - 利用胚状体快速繁殖巴西橡胶树自根幼态无性系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用胚状体快速繁殖巴西橡胶树自根幼态无性系的方法，特征是包括花药胚性愈伤组织诱导过程、初生体细胞胚胎发生过程、次生胚状体的诱导过程和植株再生过程。本发明工艺流程简单，生产成本低，解决了传统方法不断采集花蕾或果实、不断诱导胚性愈伤组织的重复、低效、繁重的体力劳动，可大量、快速、持续、低成本的获得成熟的胚，实现了胚的增殖，从而实现了巴西橡胶树自根幼态无性系的高效扩繁，提高了自根无性系扩繁的效率，可以大大提高巴西橡胶树自根无性系植株工厂化生产的效率。
Description
技术领域
本发明涉及植物细胞工程技术领域，更具体涉及一种利用胚状体快速繁殖巴西橡胶树自根幼态无性系的方法。
背景技术
天然橡胶为四大工业原料之一，也是极为重要的战略资源。目前，在自然界大约2000余种产胶植物中，商品天然胶约99％来源于巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)。巴西橡胶树属大戟科橡胶树属多年生高大乔木，常规育种周期为30多年，超长的育种周期使巴西橡胶树新品种选育和更新受到了很大的限制。为了拓宽巴西橡胶树的育种途径和创新育种方法，从上个世纪50年代以来，世界各国的育种工作者开始研究生物技术在巴西橡胶树育种中的应用。花药和内珠被的体细胞胚胎发生和胚胎植株再生的成功使巴西橡胶树新型种植材料——自根无性系的利用成为现实可能。巴西橡胶树存在两个不同生理状态的发育阶段——幼态阶段和老态阶段，大田试验已经证明橡胶树幼态无性系比其同源老态无性系在生长和产胶方面都具有明显的优势，可增加干胶产量10～50％，而通过体细胞胚胎发生是目前获得自根幼态无性系的唯一可行方法。自根幼态无性系的大规模工厂化生产和商业化应用，将带来巴西橡胶树种植材料的革新和种苗生产模式的重大改变。
目前，巴西橡胶树自根无性系的生产能力，还只能提供小规模的实验应用，规模化生产受到了巴西橡胶树低效的胚胎发生、低效的植株再生和低效的自根无性系微繁三个方面的限制。巴西橡胶树的胚胎发生主要通过两种途径获得：花药和内珠被培养。其基本过程是：1)剥取单核靠边期花药或幼嫩种子内珠被进行愈伤组织诱导培养，约40-60天；2)将愈伤组织转入体胚发生培养基，进行体细胞胚胎发生诱导，约10-30天；3)经体胚发生诱导后，部分愈伤上会出现球形胚、子叶形胚等胚状体；4)将成熟的子叶形胚转入植株再生培养基上进行植株再生。这种方法需要不断的从大田中采集外植体，受到环境和气候的影响。自根无性系的微繁技术则是将通过上述途径获得的自根无性系的茎干切成几段，每一段都带有一个茎干芽，通过适当条件的培养诱导茎干芽萌发，从而实现无性系扩繁的目的。但，目前报道的结果显示此方法的扩增效率在2-3倍，效率明显偏低，特别是对于胚胎发生能力差的品种。
迄今，巴西橡胶树自根无性系植株在多个国家已经进入大田生产试验，与传统的芽接苗相比，自根无性系植株较芽接苗增产10-50％，这使得自根无性系植株将成为未来橡胶树主要种植材料。然而，目前巴西橡胶树自根无性系植株生产存在主要问题是：1、花药和内珠被的获得受季节的限制，无法持续的、长期的获得外植体；2、胚胎发生能力受到基因型的影响，一种诱导胚胎发生的体系对于一种或几种基因型最有效，不具有普遍通用性；3、目前自根无性系微繁技术扩繁效率低。这些问题严重阻碍了自根幼态无性系的规模化生产，因而无法满足大田生产对大量自根无性系幼态植株的需求。为此，必须建立能大量的、持续的、长期的和可快速扩繁的自根幼态无性系的技术体系，为工厂化生产自根幼态无性系植株寻求解决问题的新技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用胚状体快速繁殖巴西橡胶树自根幼态无性系的方法，它是利用成熟胚良好的胚胎发生能力，实现由胚到胚的循环增殖的方法，实现了自根幼态无性系大规模扩繁的目的。
本发明所设计的利用胚状体快速繁殖巴西橡胶树自根幼态无性系的方法包括花药胚性愈伤组织诱导过程、初生体细胞胚胎发生过程、次生胚状体的诱导过程和植株再生过程。
1、花药胚性愈伤组织诱导过程是以巴西橡胶树花蕾为外植体，将花蕾进行表面消毒，将消毒好的花蕾中的雄蕊剥出，将其接种到诱导愈伤的诱导愈伤培养基上进行暗培养；所述诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并将MS培养基中的磷酸二氢钾、无水氯化钙、四水硫酸锰、七水硫酸镁的含量进行调整，再附加2，4-D、KT、NAA、Phytagel、蔗糖和椰子水。
2、初生胚状体诱导过程是将经过诱导培养的愈伤组织接种到胚胎诱导培养基上进行暗培养，得到胚状体；所述胚胎诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并将MS培养基中的磷酸二氢钾、无水氯化钙、四水硫酸锰、七水硫酸镁的含量进行调整，再附加2，4-D、KT、NAA、Phytagel、蔗糖、活性碳和椰子水。
3、次生胚状体的诱导过程是将得到的胚状体切段，并接种到诱导愈伤培养基上进行暗培养；然后再接种到胚胎诱导培养基上进行暗培养，得到成熟子叶形胚。
4、植株再生过程是将成熟子叶形胚转移到出苗培养基上进行培养至出苗；所述出苗培养基是以MS培养基为基础培养基，并将MS培养基中的磷酸二氢钾、无水氯化钙、四水硫酸锰、七水硫酸镁的含量进行调整，再附加KT、GA3、IAA、Phytagel、蔗糖、活性碳和椰子水。
本发明的有益效果：
1、可大量、快速、持续的获得成熟的体细胞胚。目前巴西橡胶树体细胞胚胎发生频率较低，同时畸形胚出现比例较高。此方法以少量成熟胚状体为外植体，诱导次生胚胎发生，实现了胚的循环增殖，而且获得的成熟胚状体绝大部分为正常子叶形胚。此体系建立后，无菌环境中的成熟的胚可以作为外植体实现循环的胚胎发生诱导，解决了大量获得正常子叶形胚状体的难题。
2、实现了巴西橡胶树自根幼态无性系的高效扩繁，可以大大提高巴西橡胶树自根幼态无性系植株生产的效率。由于成熟的胚是在无菌的实验室环境中诱导发生的，解决了传统方法不断采集花蕾或果实、不断诱导胚性愈伤组织的重复、低效、繁重的体力劳动。而且，此方法扩繁胚状体的效率为8倍，大大提高了自根幼态无性系扩繁的效率。
3、此方法获得的幼态无性系具有胚根发育而来的主根。此方法能够实现自根无性系的扩繁是由于成熟的体细胞胚获得了增殖，因此每一再生植株都具有由胚根发育而来的根系，这种根系与实生苗根系相同，具有发达的主根，在大田中种植后有助于提高巴西橡胶树的抗倒伏能力。而通过微繁的方法获得的自根无性系的根是再生根，在大田中种植后能够发育成相似的主根，但主根与茎部的连接较脆弱，不利于巴西橡胶树抗倒伏。
在巴西橡胶树花药组培的基础上，本发明工艺流程简单，生产成本低。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
本发明所设计的利用胚状体快速繁殖巴西橡胶树自根幼态无性系的方法包括花药胚性愈伤组织诱导过程、初生体细胞胚胎发生过程、次生胚状体的诱导过程和植株再生过程：
1、花药胚性愈伤组织诱导过程：是以巴西橡胶树花蕾为外植体，将花蕾进行表面消毒，将消毒好的花蕾中的雄蕊剥出，将其接种到诱导愈伤培养基上于25-28℃的温度进行暗培养40-60天；所述诱导愈伤培养基是以MS培养基为基础培养基，并将MS培养基中的磷酸二氢钾、无水氯化钙、四水硫酸锰、七水硫酸镁的含量调整为磷酸二氢钾350-500mg/L、无水氯化钙150-400mg/L、四水硫酸锰10-40mg/L、七水硫酸镁400-600mg/L，并添加2，4-D 0.5-3mg/L、KT 0.5-3mg/L、NAA 0.5-3mg/L、Phytagel 2-3g/L、蔗糖50-90g/L。所述花蕾的消毒过程是将花蕾用75％酒精表面消毒30-60秒后，再用0.1％氯化汞消毒10-15分钟，最后用无菌水冲洗3-6次，每次3-5分钟。
2、初生胚状体诱导过程是将诱导的愈伤组织接种到胚胎诱导培养基上于25-28℃进行暗培养40-60天，得到胚状体；所述胚胎诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并将MS培养基中的磷酸二氢钾、无水氯化钙、四水硫酸锰、七水硫酸镁的含量调整为磷酸二氢钾350-500mg/L、无水氯化钙150-400mg/L、四水硫酸锰10-40mg/L、七水硫酸镁400-600mg/L，并添加2，4-D 0.5-3mg/L、KT 0.5-3mg/L、NAA 0.5-3mg/L、Phytagel 2-3g/L、蔗糖50-90g/L、活性碳和椰子水。
3、次生胚状体的诱导过程是将得到的胚状体切成0.2-0.5cm的切块，并接种到诱导愈伤培养基上于25-28℃的温度进行暗培养40-60天；然后再接种到胚胎诱导培养基上于25-28℃的温度进行暗培养40-60天，得到成熟子叶形胚。
4、植株再生过程是将成熟子叶形胚转移到出苗培养基上进行培养，每天16小时光照，温度为25-28℃，培养20天后开始出苗；所述出苗培养基是以MS培养基为基础培养基，并将MS培养基中的磷酸二氢钾、无水氯化钙、四水硫酸锰、七水硫酸镁的含量调整为磷酸二氢钾350-500mg/L、无水氯化钙150-400mg/L、四水硫酸锰10-40mg/L、七水硫酸镁400-600mg/L，并添加KT 0.1-1.0mg/L、GA30.5-3mg/L、IAA0.5-4mg/L、Phytagel 2-4g/L、蔗糖30-70g/L、活性碳0.5-3g/L、椰子水40-60ml。
实施例
利用胚状体快速繁殖巴西橡胶树自根幼态无性系的方法，具体步骤是：
1、花药胚性愈伤组织诱导过程
A、以巴西橡胶树花蕾为外植体，将花蕾用75％酒精表面消毒30秒后，再用0.1％氯化汞消毒15分钟，最后用无菌水冲洗3次，每次5分钟。
B、将消毒好的花蕾中的雄蕊剥出，将其接种到诱导愈伤培养基，培养基的有效成份为改良的MS培养基和附加成份，MS培养基中修改的成份为磷酸二氢钾350mg/L、无水氯化钙200mg/L、四水硫酸锰20mg/L、七水硫酸镁400mg/L，附加成份为2，4-D 2mg/L、KT 1mg/L、NAA 1.5mg/L、Phytagel 2g/L、蔗糖80g/L、椰子水40ml/L。
C、暗培养，温度为28℃，培养40天；
2、初生胚状体诱导过程
A、将诱导的愈伤组织接种到胚胎诱导培养基，培养基的有效成份为改良的MS培养基和附加成份，MS培养基中修改的成份为磷酸二氢钾350mg/L、无水氯化钙200mg/L、四水硫酸锰20mg/L、七水硫酸镁400mg/L，附加成份为2，4-D 1mg/L、KT 2mg/L、NAA 3mg/L、Phytagel 2.5g/L、蔗糖70g/L、活性碳、椰子水40ml/L。
B、暗培养，温度为28℃，培养50天，得到胚状体；
3、次生胚状体的诱导过程
A、将胚状体切成0.3cm的切块，并接种到诱导愈伤培养基上；
B、暗培养，温度为28℃，培养40天；
C、将愈伤组织接种到胚胎诱导培养基；
D、暗培养，温度为28℃，培养40天，得到成熟子叶形胚；
4、植株再生过程
将成熟子叶形胚转移到出苗培养基上，每天16小时光照，温度为28℃，培养20天后开始出苗。培养基是以MS培养基为基础培养基和附加成份，MS培养基中修改的成份为磷酸二氢钾350mg/L、无水氯化钙200mg/L、四水硫酸锰20mg/L、七水硫酸镁400mg/L，附加成份为KT 1mg/L、GA32mg/L、IAA 1mg/L、Phytagel 2.5g/L、蔗糖60g/L、活性碳1g/L、椰子水40ml/L。
Claims (1)
1.一种利用胚状体快速繁殖巴西橡胶树自根幼态无性系的方法，其特征在于：包括花药胚性愈伤组织诱导过程、初生体细胞胚胎发生过程、次生胚状体的诱导过程和植株再生过程：
1)、所述花药胚性愈伤组织诱导过程是以巴西橡胶树花蕾为外植体，将花蕾用75％酒精表面消毒30～60秒后，再用0.1％氯化汞消毒10～15分钟，最后用无菌水冲洗3～6次，每次3～5分钟；将消毒好的花蕾中的雄蕊剥出，将其接种到诱导愈伤培养基上于25～28℃的温度进行暗培养40～60天；所述诱导愈伤培养基是以MS培养基为基础培养基，并将MS培养基中的磷酸二氢钾、无水氯化钙、四水硫酸锰、七水硫酸镁的含量调整为磷酸二氢钾350～500mg/L、无水氯化钙150～400mg/L、四水硫酸锰10～40mg/L、七水硫酸镁400～600mg/L，并添加2，4-D 0.5～3mg/L、KT 0.5～3mg/L、NAA 0.5～3mg/L、Phytagel2～3g/L、蔗糖50～90g/L、椰子水40～60ml/L；
2)、所述初生胚状体诱导过程是将经过诱导培养的愈伤组织接种到胚胎诱导培养基上于25～28℃进行暗培养40～60天，得到胚状体；所述胚胎诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并将MS培养基中的磷酸二氢钾、无水氯化钙、四水硫酸锰、七水硫酸镁的含量调整为磷酸二氢钾350～500mg/L、无水氯化钙150～400mg/L、四水硫酸锰10～40mg/L、七水硫酸镁400～600mg/L，并添加2，4-D 0.5～3mg/L、KT 0.5～3mg/L、NAA 0.5～3mg/L、Phytagel 2～3g/L、蔗糖50～90g/L；
3)、所述次生胚状体的诱导过程是将得到的胚状体切成0.2-0.5cm的切块，并接种到诱导愈伤培养基上于25～28℃的温度进行暗培养40～60天；然后再接种到胚胎诱导培养基上于25～28℃的温度进行暗培养40～60天，得到成熟子叶形胚；
4)、所述植株再生过程是将成熟子叶形胚转移到出苗培养基上进行培养，每天16小时光照，温度为25～28℃，培养20天后开始出苗；所述出苗培养基是以MS培养基为基础培养基，并将MS培养基中的磷酸二氢钾、无水氯化钙、四水硫酸锰、七水硫酸镁的含量调整为磷酸二氢钾350～500mg/L、无水氯化钙150～400mg/L、四水硫酸锰10～40mg/L、七水硫酸镁400～600mg/L，并添加KT 0.1～1.0mg/L、GA30.5～3mg/L、IAA0.5～4mg/L、Phytagel 2～4g/L、蔗糖30～70g/L、活性碳0.5～3g/L、椰子水40-60ml/L。
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