CN101134772A - 一种哺乳类精子头后部膜蛋白的分离方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种哺乳类精子头后部膜蛋白的分离方法及其应用。该方法包括如下步骤：1)制备顶体反应后精子头；2)将步骤1)制备的顶体反应后的精子头在pH为7.2－7.6、浓度为10－20mM的Tris·Cl和100μg/ml PMSF组成的低渗液中冰浴，然后离心回收得到低渗精子头；3)将步骤2)回收的低渗精子头在三去污裂解液中冰浴，然后离心回收上清液即得到精子头后部膜蛋白组分。本发明的精子顶体后部质膜蛋白在受精前后和胚胎发育过程均有特异的作用，无论在科学研究领域还是在避孕等实用领域都具有重要意义。

Description

一种哺乳类精子头后部膜蛋白的分离方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种哺乳类精子头后部膜蛋白的分离方法及其应用。

背景技术

精子从精原细胞到精子的剧烈形变、雌性生殖道的酸性环境以及顶体反应时质膜和顶体外膜的破裂等变化都容易导致父系基因组DNA的丢失；在这过程中，顶体后部质膜蛋白在维持精子头部形态的完整中起到了重要的作用，并且构成稳固的顶体后部质膜与顶体内膜，共同保证了遗传物质的完整。

获能精子质膜蛋白在受精过程中有与卵母细胞透明带识别和结合的作用。在这一过程中，由于侧重对于透明带结合蛋白的研究，目前较为清楚的多功能性膜蛋白主要位于顶体区质膜，即透明带与精子最先识别的部位。对于顶体后部和精子尾部质膜蛋白而言，这方面的研究甚少，人们只是发现顶体后部质膜蛋白也影响体外和体内受精过程，与卵母细胞膜的融合相关，即顶体后部膜蛋白参与精卵融合过程。多数学者还认为：精子顶体后部质膜和精子尾部质膜蛋白与胚胎的早期发育也有关。顶体后部和精子尾部质膜蛋白也具有防止精子凝集的功能，如大鼠的SMA-4糖蛋白可防止尾与尾的凝聚。另外，顶体后部的蛋白通道可能与外源基因进入精子细胞有关。

精子质膜的肽类分子有数百种之多，蛋白质的纯化有一定的困难，相关的研究工作多处于探索阶段。精子表面的sp18族膜蛋白具有一定的生理功能，它无法独立用一种非离子型去污剂(NP-40或Triton X-100)提取得到，而必须依靠强去污剂SDS(0.1％)的协同才行，即使如此，仍有不溶性的sp18依然存在于膜上。

发明内容

本发明的目的是提供一种哺乳类精子头后部膜蛋白的分离方法及其应用。

本发明所提供的哺乳类(包括人)精子头后部膜蛋白的分离方法，包括下述步骤：

1)制备顶体反应后精子头；

2)将步骤1)制备的顶体反应后的精子头在由pH为7.2-7.6、浓度为10-20mM的Tris·Cl和100μg/ml PMSF组成的低渗液中冰浴，然后离心回收得到低渗精子头；

3)将步骤2)回收的低渗精子头在三去污裂解液中冰浴，然后离心回收上清液即得到哺乳动物精子头后部膜蛋白；所述三去污裂解液含有pH为8.0、浓度为50mM的Tris·Cl，150mM NaCl，0.1g/100ml SDS，体积百分含量为1％NP-40，0.5g/100ml去氧胆酸钠，100μg/ml PMSF，1μg/ml Aprotinin和0.02g/100ml NaN₃。

所述方法中，所述步骤1)中精子头的制备方法为：以牛精子的处理为例，可按照如下方法制备顶体反应后精子头：用添加10mM咖啡碱的BO溶液或者TALP溶液悬浮精子至10⁶个/ml，加入2-10μM钙离子载体A₂₃₁₈₇或者1-2μM的5-Br-A₂₃₁₈₇(Sigma B₇₂₇₂)，在38.5-39℃，5％CO₂条件孵育0.5-2小时进行充分的顶体反应，然后在1,000rpm(800g)以上转速离心，回收顶体反应后的精子；将顶体反应后的精子在冰水浴条件下超声波处理1-10分钟，在1,500-2,000rpm(1000-1500g)条件下离心洗涤多次，得到的沉淀即为精子头。

所述方法中，所述精子为哺乳类(包括人)精子，优选为牛精子；当所述精子为牛精子时，所述哺乳类精子头后部膜蛋白为牛精子头后部膜蛋白。

由上述处理精子头后部膜蛋白生产的多克隆抗体或单克隆抗体均属于本发明的保护范围。

所述单克隆抗体优选为杂交瘤细胞系sp18 mAb CGMCC No.0906分泌的单克隆抗体。

实验证明针对精子头后部sp18膜蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体不仅影响精子活力，而且抑制受精过程，参与胚胎的早期发育过程，可以作为一种精子疫苗的候选蛋白，应用到避孕技术中。

本发明还提供了一种精子疫苗。其活性成分是精子头后部的sp18抗原，即上述制备的哺乳类精子头后部膜蛋白。

本发明还提供了一株分泌上述哺乳类精子头后部膜蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为杂交瘤细胞系sp18 mAb CGMCC No.0906。所述杂交瘤细胞系sp18mAb CGMCC No.0906已于2003年3月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。

本发明首先利用顶体反应过程除去精子顶体部质膜蛋白和顶体内容物，然后在不影响精子头后部膜蛋白的情况下，采用温和的超声波水浴从颈部切断精子的头和尾，再用低速离心过程将精子头和尾完全分开后，用三种去污剂协同提取得到纯度极高的精子头后部膜蛋白成分。该精子顶体后部质膜蛋白在受精前后和胚胎发育过程均有特异的作用，无论在科学研究领域还是在避孕等实用领域都具有重要意义。

附图说明

图1为牛精子头后部sp18抗原的免疫组化定位

图2为早期杂交瘤细胞的HAT选择培养。

图3为杂交瘤细胞系sp18 mAb CGMCC No.0906的染色体分析(×1000)

图4为dot blot分析杂交瘤细胞系sp18 mAb CGMCC No.0906分泌的单克隆抗体的亚类结果。

图5为sp18 mAb对牛精子sp18族抗原的定位(间接免疫荧光法)。(×1000，TCS-NT Laser Confocal Microscopy，Leica)

图6为杂交瘤细胞系sp18 mAb CGMCC No.0906分泌的单克隆抗体对牛精子全膜蛋白的免疫印迹分析(15％分离胶)。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、牛精子头后部膜蛋白的提取

牛鲜精液购自北京市种公牛站，主要药品购自Sigma，Gibco，Promega和Boehringer公司

精子头后部质膜的稳定性远远超出顶体外的质膜部分，因此精子顶体后部质膜的稳定性不会被超声波水浴所破坏，从而将精子顶体后部质膜蛋白单独完整地分离出来。牛精子头后部膜蛋白的具体提取方法如下：

1、顶体反应后精子头的制备

新鲜牛精液经精子获能液(即BO溶液或者TALP溶液)离心洗三次，然后在4℃，10,000rpm(12,000g)，离心5min后，用添加10mM咖啡碱(Caffeine)的获能液重悬浮至10⁶个牛精子/ml，加入钙离子载体A₂₃₁₈₇(Sigma C₇₅₂₂)至终浓度为5μM或者加入5-Br-A₂₃₁₈₇(Sigma B₇₂₇₂)至终浓度为1μM，在38.5℃，5％CO₂条件孵育2小时进行充分的顶体反应，在4℃，3,000rpm(4,000g)，离心10min，回收顶体反应后的精子。将顶体反应后的精子用PBS(pH7.4)重悬至10⁵-10⁶个牛精子/ml，加至小烧杯中，然后做冰水浴超声处理，将烧杯置入盛水的超声波清洗槽(天鹏电子新技术(北京)有限公司)中，水浴超声数分钟，镜检直至95％以上的精子从颈部断开，在4℃，1,600rpm(2,000g)，离心5min，用PBS洗涤四至五次，得到的沉淀即为精子头。

2、低渗精子头的制备

将上述顶体反应后的精子头用4℃预冷低渗液(10mM，Tris·Cl，pH7.4+100μg/ml PMSF)稀释至10⁵个/ml，冰浴轻摇30min，4℃，3,000rpm(4,000g)，离心10分钟回收低渗精子头。

3、低渗精子头的免疫组化定位

(1)以低渗精子头为免疫原的兔多克隆抗体的制备

取上述的0.5ml(10⁸个)低渗鲜精子头与等量弗氏完全佐剂混匀，免疫新西兰白兔，四周后首次强化免疫0.5ml(10⁸个)低渗精子头与等量弗氏不完全佐剂混匀)，连续强化免疫三次后采血制备抗血清，饱和硫酸铵沉淀，透析获得粗提IgG，ELISA方法检测抗体效价，分装，-20℃保存。

(2)免疫组化定位

1ml(10⁵个精子/ml)鲜精子经PBS离心(4℃，2,200g，5min)洗涤三次，重悬至封闭液(PBS+0.05％(v/v)Tween 20+3％BSA)中，室温封闭1小时，洗涤三次，将精子重悬至按1∶100稀释的步骤(1)制备的兔多克隆抗血清+PBS+0.05％Tween20溶液中，室温反应1h，洗三次，再悬浮于FITC标记的羊抗兔IgG溶液中，室温反应1h，洗三次并悬浮至PBS，涂片，激光共聚焦荧光显微镜(Confocal LaserMicroscopy，Leica)观察并拍照(×1000)。结果如图1所示，结果表明抗体特异地识别精子头后部的精子蛋白。

4、牛精子头后部膜蛋白的制备

将步骤2回收的低渗精子头经50mM Tris·Cl，pH8.0，150Mm NaCl溶液离心洗涤三次后，用4℃预冷的三去污裂解液(50mM Tris·Cl，pH8.0，150mM NaCl，0.1％(0.1g/100ml)SDS，体积百分含量为1％的NP-40，0.5％(0.5g/100ml)去氧胆酸钠，100μg/ml PMSF，1μg/ml Aprotinin，0.02％(0.02g/100ml)NaN₃)重悬至10⁷个/ml，冰浴轻摇30min，离心(4℃，12,000g，5min)后的上清即为牛精子头后部膜蛋白裂解液，分装，保存于-20℃。

对此牛精子顶体后部(还是精子头后部)膜蛋白裂解液样品进行薄层扫描分析，结果表明sp18组的三种蛋白(分子量分别为18，16和14kD)，总称sp18族蛋白，占精子头后部质膜蛋白总量的64％左右，分别在3.14和3.36秒时测出为55.16％和8.76％，总计64％。

用激光共聚焦荧光显微镜(confocal)的方法检测上述得到的牛精子头后部膜蛋白，结果表明经过完全顶体反应、水浴超声和低渗处理三个环节后，除去了顶体前部质膜蛋白、顶体内容物和尾部质膜成分的影响，而顶体后部的膜蛋白不被上述生化和物理过程破坏。

5、牛精子头后部膜蛋白的SDS-PAGE和Western blot

按照SDS-蛋白质电泳的标准方法，将步骤4得到的牛是精子头后部膜蛋白样品在5％浓缩胶，12％分离胶中电泳(5v/cm)，然后再用转移缓冲液(39mM Glycine，48mMTris.Cl，pH8.3，0.037％(0.037g/100ml)SDS，20％(v/v)甲醇)中电转移(0.6mA/cm²)12h，将蛋白带从凝胶转移至硝酸纤维素膜上，硝酸纤维素膜用丽春红S(Ponseau S，Sigma)染色并标出蛋白Marker，将膜装入塑料杂交袋中，按1ml/10cm2加入封闭剂(1％BSA+TBS+0.05％Tween 20)，封口，室温轻摇，杂交1.5h，封闭非特异性结合位点。一抗结合：按1∶100将步骤3得到的兔血清抗体稀释于TBST(TBS+0.05％Tween 20)中，封入杂交袋中室温反应1h，轻摇。TBST溶液洗膜三次，5-10min/次，轻摇。二抗结合：膜与二抗(HRP标记)溶液(羊抗兔IgG溶于TBST)在杂交袋中共温育1hr，轻摇。TBST洗膜三次，5-10min/次，轻摇。TBS洗膜二次，5-10min/次，轻摇。膜浸入新配制的显色溶液中数分钟，当条带或斑点出现后，用去离子水洗膜数次，终止反应。

显色溶液：50μl 100mg/ml 4氯-1-萘酚(4-chloro-1-Naphol，Promega)溶于2ml甲醇，TBS补加10ml，混匀，再加入35μl 30％H₂O₂溶液充分混匀即可。拍照并避光保存膜。

结果表明，牛精子顶体后部(还是精子头后部)质膜蛋白主要有三种，分别为18，16和14kD，统称sp18(族)蛋白。薄层扫描结果表明它们占牛精子头后部质膜蛋白总量的64％左右，分别在3.14和3.36秒时测出为55.16％和8.76％，总计64％。在小鼠和兔精子上也有不同含量的存在。

实施例2、针对牛精子头后部质膜蛋白的单克隆抗体的制备

一、单抗原理

利用氨甲喋呤阻断遗传物质(G、A)前体的内源性合成通路时，补救旁路所需的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型的SP2/0细胞系(HGPRT-)全部死亡，但当其与野生型的脾脏B细胞(HGPRT+)融合后，杂交细胞仍然可以利用B细胞的补救旁路，以外源的次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷合成G和A得以生存，而且，这样的杂交瘤细胞不仅具有SP2/0细胞系的无限增殖能力，而且具有B细胞分泌抗体的能力。

二、材料

Balb/c系小鼠：购自中国医科院动物繁育场。

三、脾脏内免疫法(Intrasplenic Immunization)制备单克隆抗体

1、脾脏内免疫

自中国医科院动物繁育场购进无病源、健康的6周龄Balb/c系母鼠饲养二周，至八周龄。取二只鼠，每只分别注射0.2ml 1％戊巴比妥钠溶液麻醉，用碘酒和70％酒精消毒小鼠左背部，  消毒剪刀剪开皮肤，露出腹膜，切口长约1cm。剪开腹膜，露出长约1-1.5cm，长型，红褐色的脾脏，用镊子轻微挪动脾脏，按长轴方向朝外，用微量进样器针头按长轴方向深深地插入脾脏，轻轻地，便往外拔针边注入抗原溶液(100μl实施例1步骤4制备的牛精子精子头后部膜蛋白裂解液)，以保证抗原能尽可能地分布在大部分脾脏，共注入100μl/鼠。注射完成后，将脾脏小心地放入腹腔内，缝合肌肉层和皮肤。继续免疫饲养小鼠，四天后准备去脾脏细胞作融合。

融合用脾脏细胞悬液的制备：断颈处死两只脾内免疫四天(85小时左右)的Balb/c系小鼠，消毒，移入超净台。用无菌器材切开经酒精消毒的皮肤，用无菌的剪刀镊子打开腹腔并取出脾脏，将脾脏移入100cm培养皿。用一次性注射器吸取10ml无血清RPMI1640溶液，用注射器针头在脾脏上刺数个小孔，然后按长轴方向插入脾脏中，多点注射冲出脾细胞，将细胞吸至无菌玻璃管，静止5分钟，使组织块沉降下来。将这两只鼠的脾细胞溶液合并至50ml塑料离心管，1500rpm离心10min，弃上清，重悬浮于10ml无血清RPMI 1640溶液，脾细胞总数约为1.4×10⁸，准备融合。

2、SP2/0细胞系的解冻、培养和冻存：

1)解冻程序(thawing)

将装有SP2/0细胞系的液氮冷冻管放入37℃水浴解冻，直至悬液中只有一小片冰时取出，用甲醇灭菌，立即放入冰浴。逐渐加入4℃预冷的RPM1 1640+10％FBS培养液，边加边摇(前三分钟，逐滴加入1ml培养液；中间三分钟，逐滴加入2ml培养液；后三分钟，逐滴加入6ml培养液)，离心洗二次(1000rpm，10min)，按1-2×10⁵个/ml悬浮，用EB/AD(溴化乙锭/亚啶橙)或者1％trypan blue(台盼兰，曲利本栏)染色检查活细胞的比例，准备培养。

2)培养程序

按1-2×10⁵个/ml的密度移至25cm²的塑料瓶中培养，轻轻盖上盖子，平放在5％CO₂培养箱里。隔48hr换液一次，加新鲜培养液是细胞密度降至大约1×10⁵个/ml进入扩增或者维持生长。

取部分细胞用HAT培养液检查SP2/0(HGPRT-)细胞对氨甲喋呤(A，Aminopterin)的敏感性，如果细胞在HAT培养液中仍能正常生长，则应加入2×10^-5M8-氮杂鸟嘌呤(8-AG，8-azaguaine)培养数天，以保证SP2/o细胞在融合前对氨甲喋呤的敏感性(融合前应充分洗去8-AG)。

3)冻存程序：

对数生长期(log phase)的细胞计数，尽可能地弃去上清，细胞用4℃预冷的冻存液(RPMI 1640+10～20％FBS+5～10％DMSO或95％FBS+5％DMSO)悬浮至10⁶～10⁷个/ml。1ml分装至4℃预冷的灭菌液氮冷冻管中，-20℃保存小于≤lhr，-80℃过夜，液氮中贮存。

3、饲养用腹腔巨噬细胞的准备：

腹腔注射5ml无血清RPMI 1640溶液，数分钟后断颈处死成年小鼠(并非一定是Balb/c系)，浸入酒精中完全消毒，转移至超净台。

用无菌器材在小鼠腹下部切一小口，插入灭菌的巴斯德吸管(Pasteurpipette)，吸取腹腔溶液，约可得4～5ml。

细胞计数，每只鼠可获得10⁷个巨噬细胞，1500rpm离心5min。

融合前一天晚上，滴加至24-孔或96孔培养板，准备融合或者克隆。

4、杂交瘤细胞系的生产：

1)PEG介导的融合和早期杂交瘤的培养

取前一天晚上按照步骤3的方法准备的饲养用巨噬细胞(于RPMI 1640+20％FBS培养液中)，共四块24孔培养板(1×10⁵/孔，0.9ml/孔)。融合前镜检饲养细胞有无异常(不含上皮等杂细胞或发生污染)。脾内免疫约85hr的两只Balb/c系母鼠，获得的脾细胞溶解红细胞后的总数为1.4×10⁸个；融合用SP2/0处于对数生长期的细胞总数为1×10⁷个(EB/A6染色发现活率>99％)。两种细胞分别用无血清RPMI1640溶液离心(1000rpm，10min)洗二次，将此两个沉淀各自悬浮在5ml无血清RPMI1640中，彼此混合，1000rpm离心10min，尽可能弃去上清，轻敲管壁，使沉淀分散，置于37℃水浴。在一分钟内缓慢地逐滴加入0.8ml，37℃预热的50％(v/v)PEG1300-1600(Sigma)边加边轻摇。37℃保持1.5min。逐滴加入20ml 37℃预热的无血清RPMI 1640稀释，边加边轻摇(前面三分钟，逐滴加入1ml，中间三分钟，逐滴加入3ml，次后三分钟，逐滴加入6ml，最后一分钟，逐滴加入10ml)。稀释完成后，37℃恒温保持15min，1000rpm离心10min，轻轻悬浮至9.6ml RPMI 1640(+20％FBS)培养液中，接种到4块铺有巨噬细胞(已有0.9ml/孔)的24孔培养板上(0.1ml/孔)每个孔总量均为1ml。37℃，5％CO2培养箱培养24hrs(培养第一天)。然后每孔加入等体积(1ml)RPMI 1640+2×HAT+20％FBS选择培养液，继续培养，每天观察一次，第三、四天时即可看见细胞的集落。第六天时换一半HAT培养液。以后每隔2-3天换一半HAT培养液。依照各孔早期杂交瘤生长的快慢，在11-14天间作克隆阳性检测(检测前三天不换液)。阳性孔每隔一天即用HAT换掉一半的体积，以便逐渐洗去氨甲喋呤(Aminopterin，A)，持续七天。结果如图2所示，图2中a为融合后细胞混合物；b为培养第四天；c为培养第九天，融合当天为培养第一天。

对阳性孔杂交瘤细胞部分转移至25cm²培养瓶进行扩增培养。每个阳性孔细胞均冻存二支，冻存前检测，以保证仍能产生抗体。

2)单细胞显微操作克隆杂交瘤细胞系

取前一天晚上按照步骤3的方法准备的准备饲养用巨噬细胞(RPMI1640+20％FBS)共2块24孔培养板(1ml/孔，2.5×10⁵ml)，37℃，5％CO₂培养箱过夜，克隆前镜检饲养细胞有无异常。将步骤1)中得到的早期杂交瘤细胞用RPMI1640+20％FBS培养液稀释至每毫升数百个，取50μl，置Ф100mm无菌塑料培养皿中央；周边做八个50μl RPMI 1640+20％FBS液滴，如上准备3～4个克隆用培养皿。

取Ф1×150mm玻璃管在酒精灯上拉成孔径合适(镜检)的显微操作针，并安装在显微操作仪上。使用显微操作法每次吸取一个细胞，并快速转移至周边的RPMI1640+20％FBS液滴中，尽快完成8个液滴单细胞克隆。将8个单细胞液滴迅速转移到24孔板的八个孔内。如此重复上述操作，将2块24孔板接种完毕，37℃，5％CO₂培养。第五天，每孔各加1ml新鲜的RPMI 1640+20％FBS，以后每隔2天换液一次。依照生长情况，在第11～14天作ELISA检测。

每个早期阳性杂交瘤选取阳性最强，生长最好的3～4个孔克隆分别扩增，冻存(用RPMI 1640+10％FBS培养液)，收集阳性孔上清液或准备制备腹水。

3)E1ISA方法检测阳性克隆

用96孔酶标板(Nunc)，50μl/孔(100μg/ml)poly-l-lysine(150-300kd)(Sigma P1399)，37℃温育1-1.5hr。100μl/孔精子溶液(1～5×10⁶well-washedcells/ml)(PBS稀释)，4℃过夜包被。弃去精子溶液，用100μl/孔封闭液(1％BSAin PBS)置15min。4℃预冷的洗液(PBS+0.05％Tween 20)洗板三次。用100μl/孔杂交瘤上清液置室温1hr，4℃预冷的洗液洗板三次。100μ1/孔(HRP标记)的二抗置室温1hr，4℃预冷的洗液洗板三次。100μl/孔显色溶液置室温30min。(100ml显色液：40mg OPD(Sigma)；40μl 30％H₂O₂；24.3ml 0.1M柠檬酸；25.7ml0.2M Na₂HPO₄；50.Oml H₂O)450nm下检测(EIA，Bio-Rad 250型)或再加入50μl/well 2.5M H₂SO₄后在492nm波长下检测，阳性孔的颜色会变为棕黄色，效价越高，颜色越深。ELISA方法检测结果表明得到有数株效价较高的杂交瘤细胞，其中效价最高的一株杂交瘤细胞称为杂交瘤细胞系sp18 mAb，已于2003年03月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.0906。

4、单克隆抗体的生产

1)腹水的生产

选取20只Balb/c系公鼠或母鼠，每只鼠在注射杂交瘤细胞系sp18 mAb CGMCCNo.0906前10～20天时，腹腔各注射0.3～0.5ml降植烷(Pristan，Sigma)或者，在前3～4天腹腔注射0.3～0.5ml福氏不完全佐剂(iFA，Incomplete Freunds’sAdjuvant，Gibco)注射细胞当日，将杂交瘤细胞系sp18 mAb CGMCC No.0906用PBS(pH7.4)离心洗涤二次，PBS重悬至2×10⁶个/ml。每只处理鼠腹腔缓慢注射0.5ml，计1×10⁶个杂交瘤细胞系sp18 mAb CGMCC No.0906。

一周后注意观察小鼠腹部，腹部无膨大者重新注射1×10⁶/0.5ml细胞。

二周后，可以处死小鼠，收获腹水，1000rpm离心15min，上清即为腹水(腹水瘤细胞可以冻存或者重新注射到降植烷致敏的Balb/c小鼠体内继续产生腹水)。腹水2000rpm离心15min，上清即为纯净腹水。

贮存：4℃，加0.05％NaN3；或-20℃，加相对体积的甘油(50％)；或-20℃，贮存于生理盐水中。

2)IgG的纯化

1份腹水用2份4℃预冷的PBS稀释，置冰上，逐滴加入4℃预冷的饱和硫酸铵溶液(SAS，saturated ammonium sulphate)，使终浓度达45％(v/v)，(1ml样品需滴加0.818ml SAS)，冰浴搅拌30min。4℃，2500rpm离心15min，上清转移至干净的试管。

重新用SAS沉淀，终浓度为40％。4℃，2500rpm离心15min，沉淀溶于0.5ml PBS，4℃，5升PBS过夜透析。

4℃，2500rpm离心15min，得到杂交瘤细胞系sp18 mAb CGMCC No.0906分泌的针对精子头后部质膜蛋白的单克隆抗体，检测免疫球蛋白浓度，分装，贮存于-70℃。

5、杂交瘤细胞系sp18 mAb CGMCC No.0906的鉴定

1)杂交瘤细胞系sp18 mAb CGMCC No.0906的染色体计数

取对数生长期的细胞添加秋水仙碱(贮存液1mg/ml)，终浓度为0.4μg/ml，37℃，5％CO₂培养2.5～3hr，1000rpm离心10min，沉淀悬浮于10ml 37℃预热的新鲜配置的0.075M KCl溶液，1000rpm离心6min，缓慢悬浮于10ml新鲜配置的4℃预冷的固定液(3份甲醇加1份冰乙酸)，冰浴10min。重复固定两次，悬浮于适当体积的新鲜固定液，从半尺高处滴片，吹开细胞溶液。Giemsa溶液中浸染10min。(2％Giemsa in 0.01M Na₂HPO₄-KH₂PO₄，pH6.8)。40×和油镜观察，并拍照(图3)，染色体计数。结果表明杂交瘤细胞系染色体数为80.10±2.91(n＝21)，在70-110条的范围内，小鼠为40条染色体，SP2/0为70条。

2)亚类鉴定-dot blot

将抗鼠IgG各亚类的抗体溶液直接加至干燥的硝酸纤维素膜上(抗IgG亚类试剂盒购自华美公司)。将有斑点的硝酸纤维素膜放置TBS溶液(20mM Tris.Cl，Ph7.5，150mM NaCl Tris-buffered Saline)中，自下而上浸湿后，将整个膜没入TBS中10min。各1μl抗鼠IgG和IgG亚类在纤维素膜上点样，1％BSA封闭1hr，杂交瘤细胞系sp18 mAb CGMCC No.0906分泌的针对精子头后部质膜蛋白的单克隆抗体反应1hr，HRP标记的羊抗鼠IgG Fab竞争性结合后，用4-氯-1-萘酚显色。结果如图4所示，结果表明杂交瘤细胞系sp18 mAb CGMCC No.0906分泌的针对精子头后部质膜蛋白的单克隆抗体属于IgG₁亚类。

3)杂交瘤细胞系sp18 mAb CGMCC No.0906分泌的单克隆抗体对sp18抗原的定位

利用杂交瘤细胞系sp18 mAb CGMCC No.0906分泌的单克隆抗体对牛精子头后部质膜蛋白进行了精确定位，具体步骤为：新鲜精子经PBS离心(4℃，2,200g，5min)洗涤三次，重悬至封闭液(PBS+0.05％(v/v)Tween 20+3％BSA)中，室温封闭1小时，洗涤三次，将精子重悬至步骤4制备的腹水中，37℃反应1h，洗三次，再悬浮于FITC标记的羊抗鼠IgG溶液中，37℃反应1h，洗三次并悬浮至PBS，涂片，激光共聚焦荧光显微镜(Confocal Laser Microscopy，Leica)观察并拍照(×1000)。结果如图5所示，结果表明，sp18 mAb识别的抗原主要存在于精子的头后部区域。

4)杂交瘤细胞系sp18 mAb CGMCC No.0906分泌的单克隆抗体对精子全膜蛋白的免疫印迹分析(15％分离胶)。具体实验方法同实施例一的步骤5，其中的一抗换成步骤4制备的腹水。结果表明精子头后部质膜蛋白的三个组分(18，16和14kD)都可与杂交瘤细胞系sp18 mAb CGMCC No.0906分泌的单克隆抗体结合，结果如图6所示，结果表明这三种分子量的膜蛋白具有相同的抗原决定簇，结构相似，故统称sp18抗原。

5)抗精子头后部质膜蛋白的单抗和多抗的精子凝集实验

针对精子头后部质膜蛋白的多抗是以实施例1步骤4制备的牛精子头后部膜蛋白裂解液为免疫原，按常规方法免疫新西兰大白兔得到的多克隆抗体。

杂交瘤细胞系sp18 mAb CGMCC No.0906分泌的单克隆抗体(制备方法详见实施例2步骤4)和抗精子头后部质膜蛋白的多抗(制备方法详见实施例1步骤3)溶液分别添加到新鲜精子溶液中，然后在显微镜下观察精子的凝集情况，结果表明抗精子头后部质膜蛋白的单抗和多抗均明显地抑制牛、小鼠和兔精子的直线运动能力，即sp18蛋白与精子的运动能力密切相关。加入多抗后，三种精子均发生明显的凝集过程，主要以头对(并)头的方式，部分出现贴壁现象甚至尾部弯曲现象，随着时间的延长，凝集现象更趋明显。牛精子在最初一小时内发生明显的凝集，而且直线前进的精子数量减少，并且速度减慢，贴壁精子数较少，六小时后，部分贴壁，部分凝集，八小时后，BO溶液里无单个运动的牛精子，而对照和空白组均有半数以上的精子为直线前进状态；相比较而言，兔和鼠精子马上出现凝集，三小时后，部分贴壁，而凝集团的精子数减少，为数个或数百个精子凝集，溶液里无单个运动的精子。杂交瘤细胞系sp18 mAb CGMCC No.0906分泌的单克隆抗体对三种精子运动状态，初期不导致明显的凝集，而在数小时后有所变化。对牛精子而言，最初一小时内变化不明显，在六小时内有部分凝集，单个运动精子的轨迹并非直线前进，而是圆形轨迹，八小时也如此；相反，兔精子迅速出现贴壁现象或凝成大团，三小时后，溶液无单个的运动精子；小鼠的凝集和贴壁均不明显，但在三小时后，运动轨迹由直线式称为弧形轨迹。

5)抗精子头后部质膜蛋白的单抗和多抗对体外受精的抑制

以小鼠的体外受精实验为例，研究抗精子头后部质膜蛋白的单抗和多抗对小鼠体外受精的影响。首先，将小鼠的附睾精子进行获能孵育，然后将加入抗牛精子头后部质膜蛋白的多克隆抗体加至获能精子溶液中，抗体终浓度是0.364mg/ml，共同孵育15分钟后，把小鼠的M2期卵子移入受精液中，在37℃、5％CO₂条件下使其受精，6小时后，检查受精情况，具有双原核和排出第二极体的卵子视为受精成功。6次重复实验的结果表明，240枚卵子中，有122枚成功受精(受精率为50.8％)；而对照组别的509枚卵子中，有385枚受精(受精率为75.6％)，二者间差异显著(P<0.001)，结果说明，抗sp18的多克隆抗体能够降低小鼠精子的受精能力，即sp18抗原参与了受精过程，可能是一种功能性蛋白。

采用同样的方法，将杂交瘤细胞系sp18 mAb CGMCC No.0906分泌的单克隆抗体按0.05、0.1和0.2 mg/ml的终浓度分别加入受精溶液后，卵子的受精比例分别为91.3％、95.2％和97.1％，没有显著的差异(P>0.5)，但是，受精卵的发育能力受到了抑制，呈现剂量依赖性，具体结果见下面的表1(其中K单抗是作为对照的一种单克隆抗体，是制备杂交瘤细胞系sp18 mAb CGMCC No.0906的同时，得到一株阴性对照细胞株分泌的抗体)。结果说明，sp18抗原在胚胎的早期发育过程中仍然具有生物活性。推测精子的sp18膜蛋白可能在受精过程中随精子一起掺入到卵子上，并且作为细胞表面的一种活性成分，继续参与胚胎的早期发育过程。

表1、抗精子sp18单克隆抗体对小鼠体外受精卵早期发育的抑制作用

单克隆抗体(n＝3)	抗体浓度(μg/ml)	卵母细胞数	胚胎数(％)
							1—细胞期	2—细胞期	4—细胞期	囊胚期
			K单抗	200.0	94	86(91.5)					86(91.5)	85(90.4)	71(75.5)
杂交瘤细胞系sp18mAb CGMCCNo.0906分泌的单克隆抗体	50.0	104					95(91.3)	94(90.4)	91(87.5)	57(54.8**)
			100.0	105	100(95.2)	95(90.5)					81(77.1*)	44(41.9**)
	200.0	102					99(97.1)	96(94.1)	0***	0***

百分数差异比较用t检验；^*：p<0.05；^**：p<0.01；^***：p<0.001。

Claims (9)

1.哺乳类精子头后部膜蛋白的分离方法，包括以下步骤：

1)制备顶体反应后精子头；

2)将步骤1)制备的顶体反应后的精子头在由pH为7.2-7.6、浓度为10-20mM的Tris·Cl和100μg/ml PMSF组成的低渗液中冰浴，然后离心回收得到低渗精子头；

3)将步骤2)回收的低渗精子头在三去污裂解液中冰浴，然后离心回收上清液即得到哺乳类精子头后部膜蛋白；所述三去污裂解液含有pH为8.0、浓度为50mM的Tris·Cl，150mM NaCl，0.1g/100ml SDS，体积百分含量为1％NP-40，0.5g/100ml去氧胆酸钠，100μg/ml PMSF，1μg/ml Aprotinin和0.02g/100ml NaN₃。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述制备顶体反应后精子头的方法包括下述步骤：用添加10mM咖啡碱的BO液或者TALP溶液悬浮牛精子至10⁶-10⁷个/ml，加入2-10μM钙离子载体A₂₃₁₈₇或者1-2μM 5-Br-A₂₃₁₈₇，在38.5-39℃，5％CO₂条件孵呼育0.5-2小时进行充分的顶体反应，然后在4℃，800g以上，离心，得到的沉淀即为顶体反应后的精子；

将顶体反应后的精子用PBS重悬至10⁵-10⁶个精子/ml，然后做冰水浴超声处理直至95％以上的精子从颈部断开，在1000-1500g，离心，用PBS离心洗涤，得到的沉淀即为精子头。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述精子为牛精子，所述精子头后部膜蛋白为牛的精子头后部膜蛋白。

4.权利要求1-3中任意一项所述的方法制备的精子头后部膜蛋白。

5.由权利要求4所述的精子头后部膜蛋白得到的多克隆抗体。

6.由权利要求4所述的精子头后部膜蛋白得到的单克隆抗体。

7.根据权利要求6所述的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体为杂交瘤细胞系sp18 mAb CGMCC No.0906分泌的单克隆抗体。

8.一种精子疫苗，它的活性成分是权利要求4所述的精子头后部膜蛋白。

9.杂交瘤细胞系sp18 mAb CGMCC No.0906。

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