JPH03505816A - 無菌動物を用いるモノクローナル抗体の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 無菌動物を用いるモノクローナル抗体の製法１、発明の分野 本発明はモノクローナル抗体の製造方法に関する。

本方法は免疫した無菌動物を利用するものである。また本発明は、かかるモノク ローナル抗体および免疫した無菌動物から得られたポリクローナル抗体をインビ ボおよびインビトロで臨床的診断および治療に利用するための方法を提供するも のである。また本発明はフィブリン特異的モノクローナル抗体をも提供する。

２、発明の背景 ＫｏｈｌｅｒとＭｉ　１ｓｔｅｉｎが、初めて成功裡１ｍ％／クローナル抗体産 生性ハイブリドーマを生成させる技法を考案したと一般に考えられている（Ｇ、 　ＫｏｈｌｅｒおよびＣ２Ｍ１ｌｓｔｅｉｎ、　１９７５．　Ｎａｔｕｒｅ　２ ５６．４９５−４９７；　１９７６、　Ｅｕｒ。

Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　６．５１１−５１９）。抗体生成細胞（膵臓Ｂリンパ球 ）をミエローマ細胞（骨髄原発性腫瘍の悪性細胞）と融合させることによって、 単一の融合細胞ハイブリッド（ハイブリドーマまたはクローンと称される）から 生じたハイブリッド細胞系を作成した。このハイブリドーマはリンパ球とミエロ ーマ細胞系の両方の特定の性質を受は継いていた。ハイブリドーマはリンパ球と 同様に免疫グロブリンの一タイプを分泌し、さらにミエローマ細胞と同様に無限 に細胞分裂を起こす能力を有していた。これら二つの特徴を合わせ持つことは従 来の抗血清をしのぐ明かな利点を提供した。

ワクチン接種した動物から得られる抗血清は、決して同一に再生産することので きないポリクローナル抗体の変動性混合物である。モノクローナル抗体は、単一 タイプの高度に特異的な免疫グロブリンである。ハイブリドーマにより分泌され る免疫グロブリンの単一タイプは、多数の抗原決定基を有する複合分子である抗 原上の一つのそして唯一の抗原決定基、すなわちエピトープに特異的である。た とえば、抗原がタンパク質である場合、抗原決定基はタンパク質分子全体の内に ある多くのペプチド配列（一般に６−７アミノ酸の長さである；Ｍ、　Ｚ、　Ａ ｔａｓｓｉ、　１９８０．　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　３２．２ｌ−４３）のうちの一つであろう。したがって、単 一の抗原に対して生じた複数のモノクローナル抗体は、その抗体を生じさせた決 定基に応じて相互に異なる可能性がある。しかし、任意の所定のハイブリドーマ については、それが生産するすべての抗体が同一である。さらに、ハイプリドー マ細胞系はインビトロまたはインビボで容易に増殖し、極めて高濃度のモノクロ ーナル抗体を生成する。

モノクローナル抗体をプローブとして使用してその抗原を検出することができる 。したがってモノクローナル抗体は、インビトロ診断例えばラジオイムノアッセ イおよびエンザイムリンクトイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、およびインビボ診 断例えば放射性標識モノクローナル抗体を用いるインビボ像形成に利用されてい る。また、モノクローナル抗体をかかる抗体の抗原へ向けてのドラッグデリバリ −のための輸送担体として利用することもできる。

しかしながら、モノクローナル抗体をかかる目的に利用できる前提として、必須 なことはそのモノクローナル抗体が、関心の対象となる抗原、すなわち標的抗原 と結合する能力を有することである。この方法は、作成されたハイブリドーマを スクリーニングして、もしあるとすればどのハイブリドーマが標的抗原と結合で きるモノクローナル抗体を生産するかを決定することによって実施される。この スクリーニング方法は非常に冗長であると考えられ、標的抗原に結合しうる抗体 を生産するハイブリドーマが同定されるまでに、移しい数の、例えば、おそらく 数十個のモノクローナル抗体をスクリーニングしなければならないかもしれない 。従って、ハイブリドーマが標的抗原に対する抗体を生産する可能性を高めるモ ノクローナル抗体の製造方法が必要とされている。

３、発明の要約 本発明は以下を含んでなる抗原に対するモノクローナル抗体の製法を提供する： （ａｌ　　無菌動物を該抗原で免疫して、抗体生産細胞に該抗原に対する抗体を 生産させ、 （ｂ）　　該無菌動物から該抗体産生細胞の少なくとも一部分を取り出し、 （Ｃ）　　前記抗体産生細胞の一つを不死化細胞と融合させることによって、前 記抗原に対するモノクローナル抗体を生成しつるハイブリドーマを形成させ、（ ｄ）　　前記ハイブリドーマを増殖させ、そして（ｅ）　　前記ハイブリドーマ により生成されたモノクローナル抗体を収穫する。

本発明は無菌動物由来のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を利用す る方法をも提供するものである。また本発明はフィブリン特異的モノクローナル 抗体およびかかるモノクローナル抗体の利用方法をも提供する。

４、発明の詳細な説明 ４．１．無菌動物 本発明は、モノクローナル抗体生産のための無菌動物の使用に関する。無菌動物 は１９世紀後期に最初に開発され、それ以来広範に利用されてきている。

無菌動物は、細菌、ウィルス、真菌、原生動物、および他の非病原性または寄生 性形態物を包含するあらゆる論証可能な生命の関連形を含有しないノドパイオー トである。ノドパイオートは無菌的帝王切開または卵の無菌昇化により得られた 動物または系統であり、アイソレーター条件下で無菌技法により飼育され連続的 に維持される。このような動物に於いては、関連するあらゆる動物相および植物 相の組成は、もし存在するとしても、一般に認められている現行の方法論によっ て完全に限定されている。（以下の点を銘記すべきである。すなわち、すべての マウスは潜伏性白血病誘発ウィルスを担持しており、従ってこのような白血病誘 発ウィルスについて以外は無菌的であるマウスは本発明の目的に関して無菌的で あると見なされるべきである。） 無菌系の核心は、欲せざる微生物の侵入に対する障壁を用意することである。動 物を囲うプラスチック、金属、ゴムおよびガラスの物理的障壁に加えて、無菌系 は空気の濾過、食物及び水の滅菌、手袋による操作といった操作上の障壁を必要 とし、このような障壁か障壁系の不可欠の部分をなす。また、アイソレーターへ の物資の搬入は無菌条件下で行うへきである。

あらゆる無菌動物が本発明に利用できると考えられる。最も一般的な無菌動物は マウス、ブタ、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ、ヒツジ、霊長類、および家 禽であり、マウス、特にＢａ１ｂ／ｃマウスが好ましい。

４．２．無菌動物の生産、ケアおよび維持無菌動物の生産、ケアおよび維持に関 しては移しい刊行物がある。例えば、Ｗｏｓｔｍａｎｎ、　Ｂ、　Ｓ、編、Ｇｎ ｏｔｏ−ｂｉｏｔｅｓ：　　５ｔａｎｄａｒｄｓ　ａｎｄ　Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ。

Ｃａｒｅ　ａｎｄ　Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｎ ｉｍａｌｓ、　　ＮａｔｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｕｎｃｉｌ、　　Ｎ ａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ。

Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　　Ｄ、　Ｃ，１９７０；　Ｃｏａｔｅｓ、　Ｍ、　　 Ｅ、ら、ＴｈｅＧｅｒｍｆｒｅｅ　Ａｎｉｍａｌ　　ｉｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｌｏｎｄｏｎ、　１９６８；およびＰｌｅａｓａｎｔｓ、　Ｊ、　Ｒ，、Ｇｎｏ ｔｏｂｉｏ−ｔｉｃｓ、　　ｉｎ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　１ａｂｏｒａｔｏ ｒｙ　Ａｎｉｍａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ。

第１巻、　Ｍｅｌｂｙ、　Ｅ、　Ｃ，ほか編、ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　Ｂｏｃａ　 Ｒａｔｏｎ。

Ｆｌａ、、　１１７．　（１９７４）　、以上の刊行物は参照としテココにとり 込まれる。

以下は、Ｗｏｓｔｍａｎｎ、　Ｂ、Ｓ、編、Ｇｎｏｔｏｂｉｏｔｅｓ：　５ｔａ ｎｄａｒｄｓａｎｄ　Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｒｅｅｄｉｎ ｇ、　Ｃａｒｅ　ａｎｄ　Ｍａｎａ−ｇｅｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　Ａｎｉｍａｌｓ、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＣｏｕｎｃｉ１． 　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｗａｓｈｉ ｎｇｔｏｎ。

Ｄ、　Ｃ，の無菌ラットおよびマウスの生産、ケアおよび維持を記述する論文の 要約である。かかる生産、ケアおよび維持は他の動物についても同様である点に 留意すべきである。

室内環境 施設、設備、および管理方法は、最大の環境制御と最適の快適さおよび福利を動 物に供与するよう設計され、運営されるべきである。ケージ、給餌器および給水 器は、動物に最大の快適さを供与し、食物及び水が容易に摂取できるようにし、 そして清掃および滅菌が実行可能で効率的であるように設計および組み立てられ るべきである。

大規模な無菌作業のための望ましいフロアプランは以下からなるべきである： １、アイソレーターを組み立てそして滅菌するための作業領域、 ２、動物の入っているアイソレーターを維持する領域、および ３、ノドパイオートの環境を日常的に監視するための実験室領域。

事務室および飼料調製領域をフロアプランに組み込んでもよい。

ノドパイオートのアイソレーターを維持するための室内環境は従来の実験用舊歯 類の収容に関して確立された基準に合致しなければならない。その構造は昆虫を 通さず、壁および床は防水性であるべきである。光線は年間を通じて同一の明暗 周期で一定不変であるべきである。換気装置は、化学的な滅菌により生じたあら ゆる煙霧を速やかに除去しなければならず、気候条件は以下に詳述するように制 御されるべきである。

温度。アイソレーターの温度を２２°Ｃから２６℃の間（７２から７８下の間） に保つために、一般に認められている動物の室温、２１−２７°Ｃ（７０−８０ 下）を下方調整する必要があろう。

湿度。相対湿度（ＲＨ）は、ヒトが快適なレベルである４０−６０パーセントに 保つべきである。しかしながら、アイソレーターの換気に室内空気を使用する場 合には、４０−５０パーセントのＲｆ（が推奨される。

換気。室内の空気交換は化学滅菌の間に生じたあらゆる煙霧を速やかに除去する のに十分でなければならない。１時間当り１０から１５回の空気交換が推奨され る。

危険なレベルの化学性煙霧に曝される職員を防護するために、新鮮空気換気装置 のあるヘッドマスクが利用可能であるべきである。

無菌設備（Ｓａｃｑｕｉｅｔ、　Ｅ、　１９６８．　Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ　ｄｅ ｓｉｇｎａｎｄ　ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ：　Ｇｅｎｅｒａｌ　ｔｅｃｈｎｉｑｕ ｅ　ｏｆ　ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ　ａｎｉｍａｌｓ、　ｐ 、１−２２　Ｉｎ　Ｍ、　Ｅ、　Ｃｏａｔｅｓ　１Ｍ、ｔｈｅ　ｇｅｒｍｆｒｅ ｅ　ａｎｉｍａｌ　ｉｎ　ｒｅ−ｓｅａｒｃｈ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓ ｓ。

Ｌｏｎｄｏｎ：　Ｔｒｅｘｌｅｒ、　Ｐ、Ｃ，１９６８，Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ　 ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄｍａｎａｇｅｍｅｎｔ：　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｏｆ　ｇ ｅｒｍ−ｆｒｅｅ　ａｎｉｍａｌｓ　ａｎｄｃｕｒｒｅｎｔ　　ｄｅｖｅｌｏｐ ｍｅｎｔｓ　　ｉｎ　　ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ　　ｄｅｓｉｇｎ、　　ｐ、２３− ３５　Ｉｎ　Ｍ、　Ｅ、　Ｃｏａｔｅｓ　纒、Ｔｈｅ　ｇｅｒｍｆｒｅｅ　ａｎ ｉｍａｌ　１ｎｒｅｓｅａｒｃｈ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｌｏｎ ｄｏｎ参照）環境中の微生物を完全に排除するには絶対的な障壁が必要である。

アイソレーター操作の成功は、常にそのような障壁を維持することにかかってい る。金属とプラスチックの二種類の一般的な種類のアイソレータ−がある。金属 性ユニットのなかには、２０ｐｓｉ　（１，４０６ｇ／ｃｍ”）の内部蒸気圧に 耐えられるように建造されているものもある。（Ｒｅｙｎｉｅｒｓ、　Ｊ、　Ａ 、　１９５９．　Ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄａｎｉｍａｌｓ、　Ａｎ、　Ｎ、　Ｙ、 　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、　７８：　４７；　Ｍｉｙａｋａｗａ。

Ｍ、　　１９５９．　Ｔｈｅ　Ｍｉｙａｋａｗａ　ｒｅｍｏｔｅ−ｃｏｎｔｒｏ ｌ　ｇｒｅｍｆｒｅｅｒｅａｒｉｎｇ　ｕｎｉｔ、　Ａｎｎ、　Ｎ、　Ｙ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　　７８：　３７参照）。

また、最初の滅菌のために、大きなオートクレーブ内に設置されているものもあ る（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ、　Ｂ、Ｅ、　１９５９゜Ｌｉｇｈｔｗｅｉｇｈｔ　 ５ｔａｉｎｌｅｓｓ　５ｔｅｅｌ　ｓｙｓｔｅｍｓ　ｆｏｒ　ｒｅａｒｉｎｇｇ ｅｒｍ−ｆｒｅｅ　ａｎｉｍａｌｓ、　Ａｎｎ、　Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　７８：　１７参照）。

現在量も広く用いられているユニットはフレキシブルフィルムアイソレーターで ある（Ｔｒｅｘｌｅｒ、　Ｐ、　Ｃ，およびり、　１．　Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、　 １９５７．　Ｆｌｅｘｉｂｌｅ　ｆｉｌｍａｐｐａｒａｔｕｓｆｏｒ　ｔｈｅ　 ｒｅａｒｉｎｇ　ａｎｄ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｇｅｒｍｆｒｅｅ　ａｎｉｍａｌｓ、 　Ａｐｐｌ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５：　４０６参照）。このアイソレーターは、通常、伸 縮自由の積層のビニルからなり、化学的に滅菌されなけらばならず、容易に特定 の要求に適応できる。別の種類はナイロンの大きなチューブからできていて、そ れぞれの末端が縛られており、オートクレーブ内で滅菌できるｏ　（Ｌｅｖ、　 Ｍ、　１９６２．　Ａｎ　ａｕｔｏｃｌａｖａｂｌｅｐｌａｓｔｉｃ　ｕｎｉｔ 　ｆｏｒ　ｒｅａｒｉｎｇ　ａｎｉｍａｌｓ　ｕｎｄｅｒ　ｇｅｒｍｆｒｅｅｃ ｏｎｄｉｔｉｏｎｓ、　Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　２５：　３ ０参照）。プレキシガラスアイソレーターおよび使い捨てフレキシブルフィルム ユニットも開発されている。これらの多くは十分軽いのでラック上に２，３個積 み重ねることができ、フロアスペースを節約する特徴がある。

熱に弱いアイソレーターでは、一般に食物および供給物を滅菌するための特別な シリンダーが用いられる。

このシリンダーは高圧オートクレーブ内で容易に脱気できるよう、大きな濾過部 分を有するよう設計されるべきである（Ｔｒｅｘｌｅｒ、　Ｐ、Ｃ，１９６３， Ａｎ　１ｓｏｌａｔｏｒ　ｓｙｓｔｅｍｆｏｒ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｃｏｎ ｔａｍｉｎａｔｉｏｎ、　Ｌａｂ、　Ａｎｉｍ、　Ｃａｒｅ。

１３：　５７２参照）。あるいはまた、減圧によらずに脱気しそして滅菌中に高 圧化するために、シリンダーに大気中に開口したドレインチューブを設けること もできるｏ　　（Ｊａｗｏｒｓｋｉ、　Ｎ、　Ｅ、およびＣ，Ｅ、　Ｍｉｌｌｅ ｒ、　１９６３゜Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｙｌｉｎｄｅｒ　ｔ ｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｆｏｒ　ｓｕｐｐｌｙｉｎｇｇｅｒｍｆｒｅｅ　１ｓｏｌａ ｔｏｒｓ、　Ｌａｂ、　Ａｎｉｍ、　Ｃａｒｅ、　１３：　５９１参照）。

滅菌 アイソレーター内で使用する設備、食物、下敷、水および空気はすべて完全に無 菌でなければならない。

用いられる方法および条件は個々のアイテムの特性によって決定される。

加圧蒸気は最も良く知られた滅菌法である。この方法は熱に安定な多孔質アイテ ムに特に適する。微生物が潜んでいると考えられ得るあらゆる部分を蒸気に直接 接触させなければならない。蒸気に曝す時間は用いられる温度に関係する。一度 に滅菌する量のうちで最も到達しにくい部分（パッケージの中心部分）を１２１ ’Ｃ（２５０＋　１　）で最低１５分間蒸気に曝すことが推奨される。

無菌性を確保するために注意深く検査した後、より高い温度およびより短い暴露 時間を用いてもよい。標準的なパッケージサイズおよび飼料、下敷、その他の材 料の詰め込み密度は、蒸気の浸透時間が一定で予測可能であることを保証するた めには非常に重要である。

乾熱はアイソレーター用の空気供給の滅菌に用いられている（Ｍｉｙａｋａｗａ 、　Ｍ、　１９５９．　Ｔｈｅ　Ｍｉｙａｋａｗａ　ｒｅｍｏｔｅ−ｃｏｎｔｒ ｏｌ　ｇｅｒｍｆｒｅｅ　ｒｅａｒｉｎｇ　ｕｎｉｔ、　Ａｎｎ、　Ｎ、　Ｙ、 　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　７８：　３７；　Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ、　Ｂ、　Ｅ、　１９５９． 　Ｌｉｇｈｔｗｅｉｇｈｔｓｔａｉｎｌｅｓｓ　５ｔｅｅｌ　ｓｙｓｔｅｍｓ　 ｆｏｒ　ｒｅａｒｉｎｇ　ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅａｎｉｍａｌｓ、　Ａｎｎ、　Ｎ 、　Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７８：　１７参照）。

過酢酸（ＣＨ，Ｃ００ＯＨ）は、熱に弱く、非多孔質の、特にフレキシブルフィ ルムユニットに広く用いられる。

この酸は湿潤剤（界面活性剤）を用いて２％溶液として使用される（Ｔｒｅｘｌ ｅｒ、　Ｐ、　Ｃ，およびり、　１．　Ｒｅｙｎｏｌｄｓ。

１９５７、　Ｆｌｅｘｉｂｌｅ　ｆｉｌｍ　ａｐｐａｒａｔｕｓ　ｆｏｒ　ｔｈ ｅ　ｒｅａｒｉｎｇ　ａｎｄｕｓｅ　ｏｆ　ｇｅｒｍｆｒｅｅ　ａｎｉｍａｌｓ 、　Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５：　４０６参照）。特別な状況に対 しては他の化学物質例えば、次亜塩素酸塩、ヨードフォア、または第四級アンモ ニウム化学物を、子宮摘出術により得られた新生仔を入れる液体トラップに用い ることができ、またはＨｇＣＩ２を群化前に卵を滅菌状態にするために用いるこ とができる。

湿らすことのできない、熱に弱いアイテムを滅菌するためには、エチレンオキシ ド（ＥＴＯ）を用いることができる。滅菌時間は温度、湿度、圧力、およびＥＴ Ｏ濃度によって決まる。ＥＴＯは下敷および飼料成分と化学的に反応して育毒な または望ましくない化合物を生成する可能性がある。ＥＴＯは引火性で、中毒の 危険があるため、滅菌に日常的にＥＴＯを使用することは２０パーセント以下の ＥＴＯＬか含有しない市販のガス混合物に制限すべきである。

空気供給物の滅菌にはファイバーガラスフィルターが通常用いられる。このフィ ルターは完璧な濾過装置として機能しなければならない。

メンプランが直径０．２２マイクロメ一ター以上の粒子を排除するフィルターの ように完璧なフィルターであるならば、熱に曝すことを避けるために、液体のメ ンプラン濾過を用いることができる。

飼料または他の特別なアイテムの滅菌にはガンマ線または電子ビーム源による照 射を用いることができる。

用いる線量は２．５−６Ｘ１０’ラドまてである。

内部環境 温度。内部のアイソレータ一温度は室内環境の関数てあり、２２から２６°Ｃ（ ７２から７８１１　）の間に維持すべきである。

湿度。アイソレーターは過剰な負荷、不適切な換気、あるいはその両方の場合に 、水分の凝縮を受は易い。

アイソレーターに入る空気は相対湿度５０パーセント以下そして好ましくは４０ パ一セント以上であるべきである。

空気供給。アイソレーターは時間当り１２から２０回の換気を行い、３−５イン チ（８−１３ｃｍ）水柱の正圧でなければならない。空気は中央の給源から、あ るいはそれぞれのユニット用の個々のブロワ−から供給できる。中央換気システ ムとしてはタービン型ニアコンプレッサーが推奨されるが、これはオイルピスト ン型ではオイルを空気供給管路中に噴霧する傾向があるためである。

空気拡散アイソレーター（Ｔｒｅｘｌｅｒ、　Ｐ、　Ｃ，１９６８゜Ｅｑｕｉｐ ｍｅｎｔ　ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ：　Ｔｒａｎｓｐｏｒ ｔ　ｏｆｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ　ａｎｉｍａｌｓ　ａｎｄ　ｃｕｒｒｅｎｔ　ｄｅ ｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎｅｑｕｉｐｍｅｎｔ　ｄｅｓｉｇｎ、　ｐ、２３− ３５．　Ｉｎ　Ｍ、　Ｅ、　Ｃｏａｔｅｓ　、ｉＴｈｅｇｅｒｍｆｒｅｅ　ａｎ ｉｍａｌ　ｉｎ　ｒｅｓｅａｒｃｈ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｌｏｎｄｏｎ）は、停電の場合にも換気中断には陥りに（い。

しかしながら、この種類は時間当りの換気回数が比較的少ないという欠点があり 、万−障壁内に小さな破損部分ができた場合に汚染を防ぐのに役立つ保護のため の正圧に欠ける。

緊急時安全装置。停電や機械的な故障が生じたときにアイソレーター内の空気圧 を維持するための適切な設備が空気供給の遮断から２，３分以内に供給されなけ ればならない。非固定フィルムアイソレーターの崩壊は、結局動物の窓息に帰着 するが、より緊急の危険は動物がフィルムや手袋に到達しこれを損なう恐れがあ ることである。ゴムストッパーを用いて空気の導管を塞ぐことによってこれを一 時的に防ぐことができる。

個々のアイソレーターの空気供給の作動に必要なのは、唯一、緊急時の電力供給 である。中央換気システムは、非常用空気供給のために、第二のタービンコンプ レッサーを有すべきである。

温度および圧力の測定記録を取ることが推奨される。

電力不足や機械的な故障が生じた場合にライン圧力の低下によって作動するオー ディオビジュアル警報システムを中央換気システムに組み込むべきである。同様 の警報システムが空気供給の温度の望ましからざる変動を知らせるべきである。

個々のアイソレーターの換気システムについては、室内環境について継続的に記 録して監視することが推奨される。

ケージングおよび内部備品 備品。アイソレーター用の基本的な備品リストには、しっかりした蓋のついたケ ージ、水容器および給餌器、ゴム手袋のだめの布製保護手袋、エキストラドアガ スケットまたはキャップをしめるリング、先端にゴムのついた長いピンセット、 止血鉗子、はさみ、タオル、ガーゼスポンジ、道具類を入れるための２クオ一ト 缶、蓋付き４クオ一ト食餌缶、スプーン、培養試験管、紙袋、および汚れた下敷 用の耐水バッグが包含される。

ケージは、滑らかな耐腐食性の材質で作るべきである。ケージは液体を通さず、 滅菌が容易でなければならない。許容できると考えられる材質にはプラスチック 、ステンレス鋼、およびガラスが包含される。亜鉛メッキは徐々に腐食し、微量 金属の混入が実験結果に影響を与える可能性があるため望ましくない。

ケージの大きさは通常、入口部分の大きさで制限される。雌マウスおよび仔のた めの最低の面積は、５０平方インチ（９７０ｃｍっである。多くの状況では、動 物当りもっと広いスペースが必要であろう。

第１表は重量分類によるマウスおよびラットの一匹当りの推奨される床面積を示 す。

（本頁以下余白） 第１表 ケージに収容されたマウスおよびラットについて推奨される動物当りの床面積 区分　　体　　重　　動物当りの　　　ケージ当りの番号　　（ｇ）　　　　面 積ｉｎ、”（ａり　　最大個体数１　　１０まで　　　６　（４０）　　　　　 　４０４　　　ｏｖｅｒ　２５　　　１５　（９５）　　　　　　１６鼠 １　　５０まで　　　１５　（９５）　　　　　　５０６　　　ｏｖｅｒ　３０ ０　　　４０　（２６０）　　　　　　２５その他の注意点 バリアーシステムの完全性を確保するために、微少な漏れに関するフレオンテス トが勧められる。

各ユニットを組み立てて滅菌したときから、そのユニットに関するすべての操作 の時間を追った記録を継続するために、各ユニットはそれ自身の運転記録に備え るべきである。かかる記録はアイソレータ一番号で区別される金属の病院−チャ ードホルダーに保管すると便利である。この記録は例えば手袋の交換といった日 常的な保守に関する記録も含むべきである。飼育記録も同じチャートホルダーに 保管することができる。

アイソレーター内部で使用できるスペースが限られているため、飼料および下敷 用に、そして無菌通路でつながっているアイソレーター間の動物の移動のために 、紙製で折りたたみ式のコンテナーが望ましい。

静電スパークが生じた場合は爆発するかもしれないのでアイソレーター内ではエ ーテルを使用すべきでない。揮発性で不燃性の麻酔剤としてフルオツン（ブロモ クロロトリフルオロエタン）が推奨される。

飼料、下敷および水 一般的な注意点 商品として製造された飼料に関する完全な配合が、防腐剤、抗酸化剤、および他 の添加物を含めたすべての成分およびその濃度を列挙して提供されるべきである 。製造日が明示されるべきである。製造者は飼料が以下の通りであることを保証 すべきである：１、天然に存在するホルモン活性が正常な許容限度内である。

２、薬物、ホルモン、抗生物質、または異常な生理的状況をつくり出す可能性が あるかあるいは研究操作を妨げる可能性のある他のあらゆる物質を含有する添加 物を含まない。

３、統計学的に選択されたサンプルに基づいてサルモネラ菌を含まない。

４、舊歯類および置数の汚染がない。

５、病原体を含む可能性のある脂肪融出していない肉片や魚肉をまったく含まな い。

飼料の栄養強化 無菌動物の飼料は加熱滅菌によるビタミンの損失（特にビタミンＢ群の一部とビ タミンＡおよびＤ）およびタンパク質の栄養価の低下（利用可能なリジン、メチ オニン、アルギニン、およびトリプトファンの減少）を補うために、正常な要求 量以上にある種の栄養分を含有しなければならない。また、無菌動物飼料は、通 常の動物では胃腸管内での微生物合成によって利用可能である要求栄養素も提供 しなければならない（Ｒｅｄｄｙ、　Ｂ、　Ｓ、、　Ｂ、　Ｓ、　Ｗｏｓｔｍａ ｎｎ、およびＪ、　Ｒ。

Ｐｌｅａｓａｎｔｓ、　１９６８　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｌｙ　ａｄｅｑｕａ ｔｅ　ｄｉｅｔｓ　ｆｏｒｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ　ａｎｉｍａｌｓ、　ｐ、８７− １１１．　Ｍ、　Ｅ、　Ｃｏａｔｅｓｌｉ、　Ｔｈｅｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ　ａｎ ｉｍａｌ　ｉｎ　ｒｅｓｅａｒｃｈ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｌｏｎｄｏｎ参照）。かかる飼料の例がＬ−４８５であり、これは大規模に検査 され（Ｘｅｌｌｏｇｇ、　Ｔ、　Ｆ、およびＢ、　Ｓ。

Ｗｏｓｔｍａｎｎ、　１９６９．　Ｒａｔ　ａｎｄ　ｍｏｕｓｅ　５ｔｏｃｋ　 ｄｉｅｔ　Ｌ−４８５゜Ｌａｂ、　Ａｎｉｍ、　Ｃａｒｅ、参照）、商業的に生 産できる安価な飼料である（第２表参照）。タンパク質の質の低下を補うための 手段として、全タンパク質含量を増加させるよりむしろ特定のアミノ酸を補うこ とを考慮すべきである。飼料の全タンパク質含量を増加させると水の消費および 排泄が増加し、湿った状況を引き起こし、それによって一定の大きさのアイソレ ーター内に収容できる動物数が制限される。

（本頁以下余白） 第２表 ラットおよびマウス用飼料Ｌ−４８５の比較成　　　　　　　分　　　　　　　 　ｋｇ当りの量ビタミン混合物 蒸気滅菌（Ｒｅｄｄｙ、　Ｂ、　Ｓ、、　Ｂ、　Ｓ、　Ｗｏｓｔｍａｎｎ、およ びＪ。

Ｒ，Ｐｌｅａｓａｎｔｓ、　　１９６８　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｌｙ　ａｄｅ ｑｕａｔｅ　ｄｉｅｔｓｆｏｒ　ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ　ａｎｉｍａｌｓ、　　ｐ 、８７−１１１　Ｉｎ　Ｍ、　　Ｅ、　　Ｃｏａｔｅｓ［纒］、　　ｔｈｅ　ｇ ｅｒｍ−ｆｒｅｅ　ａｎｉｍａｌ　ｉｎ　ｒｅｓｅａｒｃｈ、　　Ａｃａｄｅｍ ｉｃＰｒｅｓｓ、　Ｌｏｎｄｏｎ参照） 実際の方法は利用できる設備によって異なる。三つの要因が一般に重要である： １、可能な限りいつでも最低２０センチＨｇの滅菌前減圧を行うことによって、 外気に開口したクレープまたはシリンダー内の飼料の蒸気浸透が容易になる。用 いるシリンダーが外気に開口されていない場合には２８インチＨｇまたはそれ以 上の減圧が望ましい。

２、完全な無菌度を保証する最短の滅菌フェーズを使用する。設備および技術に 応じて安全のだめの余裕を加える。飼料の中心部で測定した温度が最低１２１° Ｃ（２５０１１’）に達しなければならない。その温度での実際の滅菌フェーズ は最低１５分持続しなければならない。

もっと高い滅菌温度では、滅菌時間は相対的に短くなる。

３、滅菌後の減圧は飼料温度の低下を速めるであろう。これは、栄養素の不必要 な熱破壊を防ぐであろう。

しかしなから、装置の設計および性能は、この操作段階を行う間の漏れを防ぐの に適していなければならない。

飼料の蒸気滅菌に於いては、目標は不完全な滅菌、および過度に長く加熱するこ とによる不必要な栄養の損失の双方を避けることである。ある程度の栄養素の損 失は避けられないが、以下をたくみに操作することによってかなり満足できる結 果を得ることができる二（ａ）　　温度、時間、滅菌前および滅菌後減圧、およ びペレットの大きさのような技術的手順。

（ｂ）　　飼料中の水分含量。水分含量が増加すると滅菌後のビタミンＢの回収 が改善される（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ、　Ｄ。

Ｒｏ、およびＢ、Ｓ、　Ｗｏｓｔｍａｎｎ、　１９６３．　Ｖｉｔａｍｉｎ　５ ｔａｂｉｌｉｔｙｉｎ　ｄｉｅｔｓ　５ｔｅｒｉｌｉｚｅｄ　ｆｏｒ　ｇｅｒｍ ｆｒｅｅ　ａｎｉｍａｌｓ、　Ｊ、　Ｎｕｔｒ。

７９：　３１８）。固形飼料については、２５％までの水分含量、あるいは飼料 の貯蔵品質と両立すると判明する限り高い水分含量が望ましい。飼料の水分含量 を変化させた後は、その飼料が滅菌温度に到達する速度をあらためて検査すべき である。

照射滅菌　（Ｒｅｄｄｙ、　Ｂ、　Ｓ、、　Ｂ、　Ｓ、　Ｗｏｓｔｍａｎｎおよ びＪ。

Ｒ，Ｐｌｅａｓａｎｔｓ、　１９６８　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｌｙ　ａｄｅｑ ｕａｔｅ　ｄｉｅｔｓｆｏｒ　ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ　ａｎｉｍａｌｓ、　ｐ、８ ７−１１１　　Ｍ、　Ｅ、　Ｃｏａｔｅｓ編、Ｔｈｅ　ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ　ａ ｎｉｍａｌ　ｉｎ　ｒｅｓｅａｒｃｈ、　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、　Ｌｏ ｎｄｏｎ；　Ｌｅｙ、　Ｆ、　Ｊ、、　Ｊ、　Ｂｌｅｂｙ、　Ｍ、　Ｅ、　Ｃｏ ａｔｅｓ。

およびＪ、Ｓ、　Ｐａｔｅｒｓｏｎ、　１９６９５ｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ　 ｏｆ　１ａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ　ａｎｉｍａｌ　ｄｉｅｔｓ　ｕｓｉｎｇ　ｇａ ｍｍａ　ｒａｄｉａｔｉｏｎ、　Ｌａｂ。

Ａｎｉｍ、　３：　２２１参照） 技法および線量は照射の設備および種類によって異なる。一般に、照射滅菌は結 果的に栄養素の破壊がより少ないと考えられるが１．現時点では飼料は蒸気で滅 菌するのが望ましい。

無菌度に関する検査 任意の特定の滅菌方法で達成された無菌度を監視するためには、バチルス・ステ アロサーモフィルス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ ｕｓ）胞子片の使用が推奨される。この胞子片を飼料の中心部に埋め込む必要が ある。また、アイソレーターおよびその中の動物も定期的に微生物学的に監視す べきである。かかる監視は、アイソレーターのバリアーの破れに起因するかある いはアイソレーターまたはその内容物の不適切な滅菌に起因する、偶発的な汚染 を検出するのに必要である。

これは、Ｗｏｓｔｍａｎｎ、　Ｂ、Ｓ、纒、Ｇｎｏｔｏｂｉｏｔｅｓ：　５ｔａ ｎｄａｒｄｓａｎｄ　Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｒｅｅｄｉｎ ｇ、　Ｃａｒｅ　ａｎｄ　Ｍａｎａ−ｇｅｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　Ａｎｉｍａｌｓ、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＣｏｕｎｃｉｌ、 　　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｗａｓｈ ｉｎｇｔｏｎ。

Ｄ、　Ｃ，、１９７０，ｐｐ、２８−３９の記載にしたがって行うことができる 。

滅菌中の栄養偏損失の測定 重要な栄養素の損失に関する有用な検査法としては、飼料添加チアミンの回収の 指漂として酸で抽出可能なチアミンの定量が勧められる（Ｗｏｓｔｍａｎｎ、　 Ｂ、Ｓ−およびＰ、　　Ｌ、　　Ｋｎｉｇｈｔ、　　１９６０．　Ｔｈｅ　ｅｆ ｆｅｃｔ　ｏｆ　ｍｅｔｈｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌｏｎ　　ｔｈｅ　　ｃｏｎｖｅ ｒｓｉｏｎ　ｏｆ　　ｔｈｉａｍｉｎｅ　　ｔｏ　　ｔｈｉｏｃｈｒｏｍｅ。

Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ　１６：　５００参照）。２５％以下の回収率は、飼料 の全体的な栄養の質がかなり害われていることを示す。適当な設備および注意に よって、５０％またはそれ以上の回収率を達成しなければならない。

固形飼料の貯蔵 無菌実験は一般にコストが高いため、栄養偏の有意に低下した飼料を決して使用 しないよう特別の注意を払うべきである。（ａ）滅菌していない飼料は常に冷蔵 で保存し、決して一ヶ月より長くならないこと、および（ｂ）滅菌済み飼料のア イソレーター内部での貯蔵期間は一週間またはそれ以下とし、決して１０日を越 えてはならないこと、が望ましい。

下敷 下敷は最低週に一回交換すべきである。下敷の材質は滅菌が容易で、動物によっ て容易には食べられないことが望ましい。滅菌操作の結果として育毒化合物を生 じてはならない。はこりの立たないストローブマツの破片（のこぎりくず）およ びかんなくずが望ましい。

シナツキおよびポプラのかんなくず、またはつぶしたトウモロコシの柵軸は許容 できる。珪藻土製品、スギ、樹脂を含む木材、および堅木は望ましくない。酸化 エチレン滅菌は、有害な化合物が形成される可能性についての疑問が解明される までは用いられるへきてない。

水 飲料水は滅菌されなければならない。角型バック容器、メイソンジャー、または ユニットに接続したタンク内でオートクレーブすることができる。各容器の内部 に小量の空気スペースを残す必要がある。

ノドパイオートの帝王切開出産の原理 あらゆる帝王切開の成功の鍵は、一部は妊娠を満期まで進行させることである。

このことは妊娠期間の短い動物に特に当てはまり、このような動物では胎仔は分 娩前の最後の２４時間にその体重の２０％を獲得することができる。時宜的な交 配はほどほどに成功するが、比較的大きな仔を産む動物（ラットおよびマウス） では、手術を行う前に、雌が最初の仔を分娩するのを待つことが有用であろう。

モルモットでは、最も満足できる方法は、恥骨の広がりを測定することによって 手術する雌を選択することである（Ｐｈｉｌｉｐｓ、　Ｂ、　Ｐ、、　Ｐ。

Ａ、　Ｗｏｌｆｅ、およびＨ，Ａ、　Ｇｏｒｄｏｎ、　１９５９．５ｔｕｄｉｅ ｓ　ｏｎｒｅａｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｇｕｉｎｅａ　ｐｉｇｇｅｒｍｆｒｅｅ、　 Ａｎｎ、　Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　７８：　１８３参照）。

帝王切開で引き出された仔が最初の呼吸をする前に、仔は無菌的な環境中に生み 出されなくてはならない。

仔は、母体から直接、子宮切開によって切開した無菌バリアーである膜を通って 無菌のアイソレーターの中へ、または子宮適圧によって殺菌トラップを通って無 菌のアイソレーターの中へ、取り出される。帝王切開手術前の雌の通常の手術準 備には腹部の毛の除去および手術部位の清拭および消毒が包含される。腹部正中 線局所麻酔または全身麻酔も危険なレベルの胎児機能低下や胎児死亡を招くこと なく用いることができるが、ラットおよびマウスでは頚椎の脱臼によって麻酔を 行うのが望ましい。モルモットでは、手術は一般に予め鎮静後に局所麻酔のもと で行われる。

子宮切開によってバリアー膜を通って仔を出産するためには特別のアイソレータ ー設備が必要である。レニアーズ　ステンレス製外科用ユニット（Ｒｅｙｎｉｅ ｒｓ。

Ｊ、　Ａ、　１９６５．　Ｇｅｒｍｆｒｅｅ　１ｉｆｅ　ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇ ｙ　（ｇｎｏｔｏｂｉｏ−ｔｉｃｓ）　ａｎｄ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｎ ｕｔｒｉｔｉｏｎ、　ｐ、４５８−４６６、　Ｐｒｏｃ。

３ｒｄ　Ｉｎｔｅｒｎａｔ、　Ｃｏｎｇｒ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　Ｂｒｕｘｅ ｌｌｅｓ参照）には、ユニットの上下のコンパートメントを分ける組み込み型の 水平金属仕切りがある。この仕切りには上部コンパートメントの完全な形を維持 するためにマイラープラスチックフィルムでおおわれた円形の入口がある。手術 の準備をした雌を下部コンパートメントに置き、腹部をマイラーに押しつける。

すべての手術道具は上部コンパートメントにあり、この無菌領域で手術を行う。

電気メスまたは小力を用いて、プラスチックおよび皮膚を通して切開を行う。そ れ自身により滅菌する電気メスの刃が皮膚切開には好ましい。皮膚およびマイラ ーの端を一緒にしっかりととめ、反転させる。

皮膚の切断端を覆うために腹部に滅菌した掛は布を掛けそして腹腔を開く前にあ られになった筋膜に暖かい消毒液（ベンザルコニウムクロライド１　：　１，０ ００）をかける。腸を切らぬよう細心の注意を払うべきである。

一対の鉗子または止血鉗子を腹膜壁と内臓の間に挿入することが有用であろう。

次に、子宮を關き仔を取り出す。胎膜を除去し、腹帯を縛って切断する。仔をそ っと乾かし、呼吸を刺激するためにマツサージする。

その後仔は飼育ユニットに移され、養い親の世話を受け、または手で給餌される 。別のマイラーシートを手術用開口部上にしっかりととめ、以上の手順を５．６ 匹はどの雌について、汚染の重大を危険もなく繰り返すことができる。また、手 術用ユニットとしてプラスチックアイソレーターまたはグローブバッグを用いて 、帝王切開出産を行うこともできる。アイソレーターの床の外側表面を予め滅菌 し、動物の腹部と接触させ、このようにして上記のマイラーシートと同じ目的を 果たす。手術後、プラスチックバリアーのスリットは滅菌テープで閉じることか でき、そして別の妊娠している雌について、手術手順を繰り返すことができる。

プラスチックアイソレーターを用いる場合には子宮切開による仔の出産かより一 般的である（Ｆｏｓｔｅｒ、　Ｈ。

１９５９、　　Ａ、　　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｆｏｒ　ｏｂｔａｉｎｉｎｇ　ｎ ｕｃｌｅｕｓ　５ｔｏｃｋｆｏｒ　ａ　ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ　ａｎｉｍ ａｌ　　ｃｏｌｏｎｙ、　　Ｌａｂ、　　Ａｎｉｍ。

Ｃａｒｅ　９：　１３５参照）。子宮を無菌的に露出させ、子宮頚のすぐ前方で 縛る。切り取った子宮を液体の殺菌トラップを通して無菌ユニット内に移す。− たんアイソレーター内に入ると、羊水を吸い込むのを防ぐためにできる限り速や かに仔を取り出す。調帯を縛り切断する前に通常仔を拭い、よく呼吸させる。次 に仔を養い親に与えまたはヒトが飼育する。

マウス、ラットおよびブタでは子宮切開が用いられ成功する。しかしながら、モ ルモットでは、もし母親の血液供給遮断とアイソレーター内での出産の間に２分 も経過すると高度の胎児死亡が起こるため、子宮切開が好ましい。

ノドパイオート集団の繁殖システム 近文系 従来の繁殖集団で用いられた通常の兄弟姉妹間交配系を、ノドパイオート集団で も用いることができる。

非近交系 まったくランダムな繁殖には、兄弟姉妹の交配および従兄弟のある程度の交配が 包含される。非近親勾配繁殖集団では通常かかる交配を避けるが、結果として得 られる交配システムは、可能な限り最大限までは近親交配の割合を低下させるも のではない。近親交配が最低であるような任意のシステムを利用できる（Ｆａｌ ｃｏｎｅｒ、　Ｄ、Ｃ，１９６７、Ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　ｂ ｒｅｅｄｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓ、　ｐ、７２−９６１ｎ　Ｔｈｅ　ＵＦＡＱ　ｈ ａｎｄｂｏｏｋ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｃａｒｅａｎｄ　ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　ｏｆ 　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ａｎｉｍａｌｓ、第３版、Ｅ。

およびＳ　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、　ＬＴｄ、、　Ｌｏｎｄｏｎ：　Ｎａｔｉ ｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｕｎｃｉｌ、　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ＡｎｉｍａｌＲｅｓｏｕｒｃｅｓ、　１９６９．　Ａ　 ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔａｎｄａｒｄｓ　ｆｏｒｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ　ａｎｉｍａｌｓ、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃ ｉｅｎｃｅｓ。

ＷａＳｈｉｎｇｔＯｎ、　Ｄ、　Ｃ，参照）。

比較可能な従来型集団およびノドパイオート集団。

もし比較目的で従来型集団とノドパイオート集団の両方を維持することが望まし い場合は、従来型集団の有効な繁殖集団からノドパイオート集団へ帝王切開で生 まれた仔を導くことによって、これらの２集団は同様の遺伝的素質を維持するこ とができる。これが、非ノドバイオ−トラットおよびマウスの生産に最も重点を 置く生産者の選択方法であると思われるが、微生物学的な監視を簡易化する微生 物学的系統の確立を妨げる短所を育する。理想的にはこれは、特定の交配からの 仔を従来型集団の繁殖系統として用い、そしてこれら各々の交配からの次の仔を ノドパイオート集団の繁殖系統として用いることによって達成される。もし２． ３世代毎にこの方法にしたがうならば、両方の集団の遺伝的素質は非常に類似す るはずである（もちろん同じ交配システムをそれぞれの集団に用いる場合）。

あるいはまた、ノドパイオート集団の有効繁殖集団から得られた仔を、従来型集 団の確立または補充に用いることもできる。同じ方法にしたがうならば、遺伝的 な結果は同一となるであろう。

記録管理　（Ｗｏｌｆｆ、　Ｇ、　Ｌ、　１９６７、　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ｍ ａｔｉｎｇｓｙｓｔｅ＋ｎｓ　ａｎｄ　ｒｅｃｏｒｄ−ｋｅｅｐｉｎｇ　ｉｎ　 ａ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｃｏｌｏｎｙ。

ｐ、９７−１１３　Ｉｎ　ｔｈｅ　ＵＦＡＩＶ　ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｎ　ｔｈ ｅ　ｃａｒｅ　ａｎｄｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　ｏｆ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ａ ｎｉｍａｌｓ、第３版、Ｅ、およびＳ、　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、　Ｌｔｄ、 、　Ｌｏｎｄｏｎ参照）。

動物およびアイソレーターの保守に関する適正な記録を保管すべきである。動物 の記録は、手術の有効性および動物の生物学的な行動を判定するべきである。

アイソレーターの記録は、時間を追ってアイソレーターに関する出来事を記録し 続けるべきであり、汚染が生じた場合バリアーのひび割れ箇所を突き止めるのに 役立つ。

４．３．無抗原動物 本発明の好ましい実施態様に於ては、化学的に定義された（ＣＤ）低分子量で水 溶性の限外濾過された飼料で無菌動物を飼育することが好ましい。かかる飼料に よって、動物による栄養素および抗原の摂取の完全な制御が可能になると考えら れる。一般に、このような飼料はアミノ酸、単糖類、脂質、ビタミンおよびミネ ラルのような化学的に定義できる成分のみで構成されている。本発明の目的のた めには化学的に定義された飼料はアミノ酸、単糖類、脂質、ビタミンおよびミネ ラルを含んでなり、そして約１０．０００ダルトン以上の分子量を有する他の成 分は含まない。したがって、ＣＤ飼料の全成分は低分子量であり、動物体内で自 然に循環する栄養素であって、それゆえかかる成分は免疫応答を刺激しないと考 えられる。最近の文献はＣＤ飼料で飼育された無菌動物を「無抗原動物」と呼ぶ 。

また、濾紙の下敷を用いるのが好ましい。そうしないと無菌動物が下敷を食べて 免疫応答を引き起こす可能性がある。濾紙の下敷を食べても免疫応答は生じない と考えられる。

特定の種のための特別なＣＤ飼料は、かか°る種について知られている栄養要求 を満たすような割合および量の成分を泪いる。無菌マウス眉の好ましいＣＩＩＭ 料の組成および調製は以下の通りである： 化学的に限定された餌料Ｌ４８９Ｅ１４Ｓｅの組成および調製 １９２ｍ１のＭｉｌｌｉ−Ｑ水に７０°Ｃで以下のものを加える：イソロイシン 　　　　　　　　　　　　　１．０８アスパラギン　　　　　　　　　　　　　 　０６９１アルギニンＨＣＩ　　　　　　　　　　　　　Ｏ，８ｉヒスチジンＨ ＣＩ　　　　　　　　　　　　　０．７４溶液を４５℃に冷やして以下のものを 加える：グルタミン酸ナトリウム　　　　　　　　　３．４ＯＬ−チロシンエチ ルエステルＨＣＩ　　　　　　０．６２グルコン酸第−鉄　　　　　　　　　　 　０．０５塩類３５Ｄ　’　　　　　　　　　　０．１０５亜セレン酸ナトリウ ム”　　　　　　　　　０．０７４溶液を５°Ｃに冷やして以下のものを加える ：グリセロリン酸カルシウム　　　　　　　　５．２２グリセロリン酸マグネシ ウム　　　　　　　１．４３（６８０ｍｇ　ＫＩ金含有　　　　　　　０．０８ ６ビタミンＢ混合物１１１Ｅ５　”　　　０．０９ビタミンＢ１２　’　　　　 　　　　　　　　　　１．２０　ｍｇ塩化コリン　　　　　　　　　　　　　　 ０．３１酢酸カリウム　　　　　　　　　　　　　　１．８５１０８ｍｌのＭｉ ｌｌｉ−Ｑ水に７０℃で無水Ｄ−デキストロースを加えた。　　　　　　　　７ １．２８溶液を５°Ｃに冷却し、両者を合一して限外濾過した。

１　塩類３５Ｄの混合物の組成は第３表に示す。

２　塩類３５Ｄ中のセレン酸ナトリウムに加え添加された。

３　第４表記載のビタミンＢ混合物１１１Ｅ５の組成。

４　ビタミンＢ混合物１１１Ｅ５のビタミンＢ１２に加え添加された（以下の実 施例参照）。

かかる組成物をマウスまたはラットに自由に食べさ精製大豆トリグリセリド’　 　０．３３ｇパルミチン酸レチしル　　　６．４５ｍｇ（１１，７１，Ｕ、）コ レカルシフェロール　　　０．０２８８ｍｇ（１，１５１，Ｕ、）２−了ンボー アルフＴトコフェロール　　　　　　　　　　３．３ｍｇ２−了ンボーアルファ トコフェ叶ルアセテート　　　　　６．６ｍｇフィロキノン　　　　　　　７２ ｍｇ ＊授乳期マウスは通常の成体量の２倍与えられる。

１成分は：１２％パルミテート １．５％ステアレート ２４％オレエート ５５％　リルエート ８％　リルネート ＣＤＢ料の詳細な説明についてはＰｌｅａｓａｎｔｓ、　Ｊ、　Ｒ。

ら、Ｊ、　Ｎｕｔｒ、、　　１１６．　１９４９−１９６４　（１９８６）、　 Ｐｌｅａｓａｎｔｓ。

Ｊ、ら、Ｇｅｒｍｆｒｅｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ：　Ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ　Ｃｏ ｎｔｒｏｌ　ａｎｄＩｔｓ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｍ ｅｄｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｂ、Ｓ。

Ｗｏｓｔｍａｎｎ、　Ｅｄ、、　ｐ。８７．　Ｌｉ５ｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　 （１９８５）；　Ｗｏｓｔ−ｍａｎｎ、　Ｂ、Ｓ、ら、Ｊ、　Ｎｕｔｒ、、　１ １２．５５２　（１９８２）；およびＰｌｅａｓａｎｔｓ、　Ｊ、　Ｒ，ら、Ｊ 、　Ｎｕｔｒ、　１００．４９８　（１９７０）を参照されたい。これら開示は 参照としてここにとり込ま４．４．モノクローナル抗体の生産 次に、無菌動物をモノクローナル抗体の生産に利用する。無菌系を利用して、無 菌状態でない動物が生産できるあらゆる抗原に対するモノクローナル抗体を生産 できる。抗原の例示リストは米国特許第３　、９３５．０７４号に明らかである 。しかしながら、無菌動物は抗原に対して非常に増強された免疫応答を示すと考 えられる。

したがって、抗原の特異的なエピトープに結合しうる抗体を生産するＢ−リンパ 球を突き止める確率を高めることができる。これが本発明の主要な利点である。

さらに、無菌系は、多数のエピトープを有する抗原に対して高度に特異的な抗体 を生産するのに特に有用であると考えられる。

無菌動物は標準技法によって免疫することができる。

しかしながら、無菌動物を各免疫処理の間に最低３週間おいて最低３回免疫処理 し、そのあと融合前追加免疫することか好ましい。免疫処置のこのような増加は 、通常の２回免疫後に好ましいｆｇＧ分泌性Ｂリンパ球ではなく、なお主として ＩｇＭ分泌性Ｂリンパ球の存在が観察されているため、必要であると考えられる 。

４．５９体細胞 抗体生産能のある無菌動物の体細胞、とりわけＢリンパ球はＢ細胞ミニローマ系 との融合に適する。分裂期の形質芽球抗体産生細胞が優先的に融合する。体細胞 は感作無菌動物のリンパ節、膵臓および末梢血液から得ることができ、そしてリ ンパ系細胞の選択は、相当程度まで、特定の融合システムでの経験的な有用性に 依存する。しかしながら、膵臓由来の体細胞が一般に望ましい。ひとたび感作ま たは高度免疫されると、無菌動物は抗体産生リンパ球源として使用できる。マウ スリンパ球は、高い割合で以下に記載のマウスミエローマ系との安定な融合を生 ずる。しかしながら、他の無菌動物由来の抗体産生細胞の使用も可能である。

特定の無菌動物の選択は、抗原の選択によって決まる。

これは、その無菌動物が用意するいくつかのＢリンパ球の中に、かかる抗原に対 する抗体を生産できるＢリンパ球のあることが必須であるためである。

４．６．不死化細胞 特定の目的に適したミエローマ細胞系が、ハイブリドーマ産生性融合法で用いる ためにリンパ球腫瘍から開発されている（Ｇ、　ＫｏｈｌｅｒおよびＣ，Ｍｉｌ ｓｔｅｉｎ、　１９７６゜Ｅｕｒ、　　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　６：　５１ １−５１９；　Ｍ、　Ｓｃｈｕｌｍａｎら、１９７８゜Ｎａｔｕｒｅ　２７６＋ 　２６９−２７０）。この細胞系は少なくとも三らの理由から開発された。第一 の理由は融合したミエローマ細胞の選択を容易にするためである。通常、ハイブ リドーマの成長を支持する特定の選択培地で成長できなくするような酵素欠乏を 育するミエローマを用いることによって、これを達成することができる。第二の 理由は、リンパ球腫瘍細胞の、それ自身の抗体を生産する固有能力から生ずる。

モノクローナル技術を使用する目的は、所望の単一の特異抗体（これはハイブリ ドーマの体細胞成分によって遺伝的に指示される）を生産する不死の融合ハイブ リッド細胞系を得ることである。ハイブリドーマによる腫瘍細胞抗体の生産を排 除するために、免疫グロブリンの軽鎖または重鎮を生産できないミエローマ細胞 系または抗体分泌機構の欠失した同細胞系が用いられる。この細胞系を選択した 第三の理由はその融合への適性および効率である。

融合細胞ハイブリッドの生産にいくつかのミエローマ細胞系が使用でき、これに はマウス由来のＮ５−１゜Ｘ６３−Ａｇ３．　Ｎｌ５−Ａｇ４／１．　ＭＰＣＩ Ｉ−４５，６ＴＧ１．７．　Ｘ６３−Ａｇ３．６５３゜Ｓｐ２１０−Ａｇｆ１４ ．　ＦＯ，および５１９４１５ＸＸＯ，Ｂｕ−１，、およびラット由来の２１０ −、　ＲＣＹ３．　Ａｇ１．２．３が包含される。（Ｇ、　Ｊ。

Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ、　Ｕ、　ＨａｍｍｅｒｌｉｎｇおよびＪ、Ｆ、　Ｋｅａ ｒｎｌｙ。

編、１９８１．　　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　ｈ ｙｂｒｉｄｏｍａｓ　ＩｎＪ、Ｌ、　　Ｔｕｒｋ、　　纒、Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　 Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ。

Ｖｏｌ、　３　、　　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ　Ｂｉｏ ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ） ４．７．融合 抗体産生性膵臓またはリンパ節細胞と不死化細胞とのハイブリッドを生成させる 方法は一般に細胞膜の融合を促進する作用剤（類）（化学物質、ウィルスまたは 電気）の存在下において約２０：１〜約１：１まで変動しつる割合で体細胞と不 死化細胞とを混合することから成る。同種の動物が融合操作に用いられる体細胞 および不死化細胞の供給源として役立てられるのがしばしば好ましい。融合法は ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉ　１ｓｔｅｉｎ（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ　２５６：　 ４９５−４９７；　　１９７６、　　Ｅｕｒ、　　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

６：　５１１−５１９）、　　Ｇｅｆｔｅｒ　ら、（１９７７、Ｓｏｍａｔｉｃ 　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ。

３：　２３１−２３６）およびＫｏｚｂｏｒら、１９８３．　　Ｉｍｍｕｎｏｌ ｏｇｙＴｏｄａｙ、　４．７２に記載されている。これらの研究者により使用さ れた融合促進剤はそれぞれセンダイウィルスおよびポリエチレングリコール（Ｐ ＥＧ）であった。

また最近開発されたＥＢＶ形質転換法も利用できる（Ｃｏｌｅら、１９８５．　 Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓおよびＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐ ｙ、　Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、、　ｐｐ、７７−９６）。

４．８．クローンの単離および抗体検出融合方法は通常的Ｉ　Ｘｌ０−”−Ｉ　 Ｘｌ０−”の非常に低い頻度でしか生存能力あるハイブリッドを生成しない。

生存しつるハイブリッドを得られる頻度が低いので、残った未融合細胞、特に未 融合ミニローマ細胞から融合細胞ハイブリッドを選択する手段を有することが必 須要件である。生成した他の融合細胞ハイブリッドの中から所望の抗体産生ハイ ブリドーマを検出する方法もまた必要である。

一般に、融合細胞は選択培地、例えばヒボキサンチン、アミノプテリンおよびチ ミジンを含有するＨＡＴ培地中で培養する。ＨＡＴ培地はハイブリッド細胞の増 殖を可能にしそして通常無限に分裂を続ける未融合ミエローマ細胞の増殖を阻止 する。アミノプテリンはテトラヒドロ葉酸の産生を阻害することにより新たなプ リンおよびピリミジン合成を阻止する。チミジン添加はピリミジン合成の遮断を 迂回し、一方ヒボキサンチンが培地に包含されているので阻害された細胞はヌク レオチドサルベージ経路を用いてプリンを合成できる。

使用されたミエローマ細胞はヒボキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ （ＨＰＰＴ）を欠く変異種でありしたがってサルベージ経路を利用できない。生 存ハイブリッドにおいては、Ｂリンパ球がこの酵素生産遺伝情報を供給する。Ｂ リンパ球自体は、培養では限定された寿命しか育しないので（約２週間）、ＨＡ Ｔ培地中で増殖できる唯一の細胞がミエローマおよび膵臓細胞から形成されたハ イブリッドである。

ハイブリッドにより分泌された抗体のスクリーニングを促進し、そして個々のハ イブリッドが他のものより増殖するのをふせぐために、融合したミエローマおよ びＢリンパ球の混合物をＨＡＴ培地で希釈しそしてマイクロタイタープレートの 多重ウェルで培養した。２−３週間して、ハイブリッドクローンが顧微鏡で見え るようになったところでハイブリッドクローンを含有する個々のウェルの上溝液 を特異的抗体産生に関してアッセイする。

アッセイは感度が良く、簡単で迅速でなければならない。アッセイ法にはラジオ イノムアッセイ、酵素イムノアッセイ、細胞毒性アッセイおよびプラークアッセ イが包含される。

４．９．細胞増殖および抗体産生 ひとたび所望の融合細胞ハイブリッドが選択され、個々の抗体産生細胞系にクロ ーン化されると、各細胞系は２つの漂準法のうちいずれかで増殖できる。ハイブ リドーマの試料を最初の融合に体細胞およびミエローマ細胞を提供するのに用い られた種類の組織適合性動物に注射てきる。注射された動物は融合細胞ハイブリ ッドにより産生された特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を生ずる。血清 または腹水液のような動物の体液を採り、高濃度のモノクローナル抗体を得る。

別の方法としては、個々の細胞系を実験室培養器でインビトロ増殖させることが できる。単一の特異的モノクローナル抗体を高濃度に含有する培養培地をデカン テーション、濾過または遠心により収集できる。

４．１０゜モノクローナル抗体の使用 本発明の方法により作られたモノクローナル抗体はモノクローナル抗体を使用す る既知または将来開発されるべき任意の方法で使用できる。

モノクローナル抗体の主要な用途は抗原−抗体相互作用の測定であるイムノアッ セイである。かかるアッセイは一般に不均質または均質である。均質イムノアッ セイにおいては、免疫的反応は特異的抗体、標識した被分析物、および関心のあ る試料を通常必要とする。

標識から生ずるシグナルは抗体を標識被分析物に結合させると直接または間接に 改変される。免疫反応およびその程度の検出のいずれも均質溶液中で行なわれる 。

使用できる免疫化学的標識にはフリーラジカル、蛍光染色、酵素、バクテリオフ ァージ、補酵素その他が包含される。均質イムノアッセイの主な利点は、特異的 抗体が標識被分析物から分離される必要がないことである。

不均質イムノアッセイにおいては、試薬は通常検査試料、特異的抗体、および検 出できるシグナルを生成させる手段である。検査試料は一般にプレートまたはス ライドのような支持体上に載せ、モして液相中の抗体と接触させる。続いて支持 体を液相から分離しそして支持槽かまたは液相をかかるシグナルを生成する手段 を使用して、検出できるシグナルについて検査すぎ。

シグナルは検査試料中の被分析物の存在に関連している。検出できるシグナルを 生成させる手段には放射性標識、蛍光物質、酵素その他の使用が包含される。不 均質イムノアッセイの例をあげればラジオイノムアッセイ、免疫蛍光法、エンザ イムリンクトイムノアッセイ等である。

上記のイムノアッセイ法のさらに詳しい考案についてはＥｄｗａｒｄ　Ｔ、　Ｍ ａｇｇｉｏ、　ＣＲＣＰｒ５ｅｅ、　Ｉｎｃ、、　ＢｏｃａＲａｔｏｎ、　Ｆｌ ａ、、　１９８０による　“エンザイムイムノアッセイ”を参照。また、例えば 、全てを網羅しているのではないが、米国特許第３．６９０．８３４；　３，７ ９１，９３２．３，８１７゜８３７；３．８５０，５７８：　３，８５３．９８ ７；　３，８６７．５１７：　３，９０１，６５４；３、９３５．０７４．３． ９８４．５３３．３．９９６．３４５．および４．０９８．８７６号を参照。

モノクローナル抗体のもうひとつの主要な用途はインビボ像形成および治療剤で ある。モノクローナル抗体を放射性化合物、例えば放射性ヨウ素で標識し、患者 に静脈投与できる。抗体は磁気プローブでも標識できる。続いてＮＭＲを使用し て抗原を正確に探し当てることができる。抗体が抗原のところに局在化した後、 抗原を放射トモグラフィーおよび放射性核走査法により検圧でき、それにより抗 原の位置を正確に探り当てることができる。

説明すると、精製されたモノクローナル抗体をヒトアルブミンを含有するかまた は含有しない適切な担体、例えば食塩水中に適切な用量で懸濁し、そして静脈投 与例えばＭｉｌｌｅｒら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ　ｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｉａ ｇｎｏｓｉｓａｎｄ　Ｔｈｅｒａ＄）Ｙ　（１９８２Ｘここに参照としてとり込 まれる）に記載されているように数時間にわたって継続的に静脈注入することに より投与する。

本発明のモノクローナル抗体は治療上使用できる。

適切な生物学的性質を育する抗体は治療剤としてすぐに役に立つ。あるいはまた 、抗体を毒素と結合させて免疫毒素を形成させるかまたは放射性物質または薬物 に結合させて放射性薬剤または薬剤を形成させる。抗体の免疫毒素および放射性 薬剤を生成させる方法はよく知られている（例えばＣａｎｃｅｒ　Ｔｒｅａｔｍ ｅｎｔ　Ｒｅｐｏｒｔｓ（１９８４）　６８：　３１７−３２８参照）。

無菌動物由来のポリクローナル抗体はまたイムノアッセイにも使用できそして従 来の動物白米のポリクロ前記した無菌動物、前記免疫処理法を用い、続いて従来 法、例えば動物から血清を分離することにより動物からポリクローナル抗体を分 離することにより作製かできる。

５、フィブリン特異性モノクローナル抗体５．１．背景 止血メカニズムは破損した血管の損傷治癒に係わる複雑な生理学的応答メカニズ ムである。止血は損傷した血管、血小板および凝血系の共同作業的相互作用によ り達成される。凝血系の役割は損傷した血管の内皮下の構造物上に組み立てられ ている血小板プラグを安定化しつなぎとめるための大量のフィブリン網を提供す ることである。循環フィブリノーゲンからの不溶性フィブリンマトリックスの形 成は必要とされる部位でのトロンビンの爆発的生産で最高潮に達する複雑な連続 反応の結果である。凝血はプロ酵素（凝塊因子）が連続的に活性化されて活性酵 素となるまでの連鎖的酵素反応を伴う増幅過程である。血栓形成に係わるフィブ リン重合過程を制御する多数の生理学的メカニズムが存在する。これらにはトロ ンビンインヒビターアンチトロンビンＩ［Ｉ　（ＡＴＩ）　、プロティンＣ、プ ロスタサイクリンおよび繊維素溶解系の種々の成分例えば組織プラスミノーゲン アクチベーター（ｔ−ＰＡ）およびその即効インヒビターか包含される。

Ａｓｔｒｕｐ　１９５６　Ａｓｔｒｕｐ、　Ｔ、、　Ｂｌｏｏｄ　１１．７８１ −８０６　（１９５６）により提案された止血仮説は、フィブリン形成（凝血） とフィブリン溶解（繊維素溶解）との間にある平衡が存在すると述べている。正 常または健康な状態においてはこれらの機能は等しく均衡している。しかしなが ら、止血過程がそこなわれると、凝血および繊維素溶解がそれぞれ血栓症および 出血として病的に発現される。病的血栓症または血栓性疾患の臨床的徴候は極度 に多様であり、そして播種住血管内凝血（ＤＩＣ）、深部静脈血栓症（ＤＶＴ） 、動脈および静脈血栓症が包含される。他の血管疾患の血栓塞栓症および血栓性 合併症（例えばアテローム性動脈硬化症）は主要　動脈の閉塞を生じて臓器虚血 および、脳血管の発作（卒中）、心筋梗塞、その他のような付随する生命をおび やかす状態につながりうる。

繊維素溶解過程はブラスミノーゲンアクチベーターとして知られる作用剤の作用 により不活性酵素前駆体プラスミノーゲンをタンパク分解酵素プラスミンに変換 することを必要とする。生理学的繊維素溶解の分子メカニズムは完全には理解さ れていないが、フィブリン形成の間にプラスミノーゲンがフィブリンに結合しそ こてそれがブラスミノーゲンアクチベーター例えばｔ−ＰＡにより活性化されう ることが知られている。この様式でプラスミン生成が血栓内で進行する。血栓内 ではプラスミン生成はプラスミンの主要な生理学的インヒビター、α２−抗プラ スミンによる不活性化から保護されている。

プラスミンにさらされると、フィブリノーゲンおよびフィブリンは分解されてそ れらの分解産物を生ずる。

フィブリノーゲンはフラグメントＸおよびＹに、そしてプラスミンにさらにさら されると、フラグメントＤおよびＥに分解される。フィブリンは非架橋フィブリ ンからフラグメントＸ、　Ｙ、　ＤおよびＥに、そして架橋フィブリンから架橋 Ｄ−ダイマー、Ｄ−Ｄ／Ｅ複合体、Ｙ−ダイマー、Ｙ−Ｄ−ダイマーおよびＸオ リゴマーに分解される。

血栓性障害のマーカーに関するアッセイはラジオイムノアッセイおよびラテック ス凝集型のアッセイの両アッセイにおいてポリクローナル抗体を使用してつい最 近まで行なわれている。これらのアッセイはＧａｆｆｎｅｙ（Ｇａｆｆｎｅｙ、 　Ｐ、Ｊ、、　Ａｎｎ、　Ｎ、Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　４０８．４０７ −４２３　（１９８３）により、全熱信頼てきないものであることか示されてい る。モノクローナル抗体を用いるより特異的でかつ感度のよいイムノアッセイ（ 例えばＥＬ＋ＳＡ）か臨床実験室において日常性なわれるようになってきている 。これら診断アッセイにおける限定的要因は使用される特定のモノクローナル抗 体の特異性およびアフィニティである。損なわれた止血の任意のありうるインジ ケーターに対する高度に特異的な抗体の生成は、インジケーターのレベルの低さ および血漿中ではるかに高いレベルで通常存在するその前駆体と特定のマーカー との抗原関連性の両方により阻止される。実施例は、酵素およびそのインヒビタ ーとの間の複合体例えばトロンビン−アンチトロンビン■、プラスミン−α２− 抗プラスミン、ｔ−ＰＡ−ＦＡＩ−１の形成である。かがる複合体形成により生 成される新しい抗原部位の数は極度に少なく、免疫学的プローブ（例えばモノク ローナル抗体）の生産を困難にしている。

同様に、フィブリンに対するモノクローナル抗体を得ることに関連する主要な問 題はフィブリンとその生理学的前駆体フィブリノーゲンとの間の構造的およびコ ンホーメーション的相似性である。フィブリノーゲンがフィブリンに変換される 場合の共育構造の保存は９８％以上と推定されており（Ｐｌｏｗ、　Ｅ、　Ｆ、 、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｓｅｍ１ｎ、　Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、　８．３６　（１９８２ ）したかってフィブリン分子のエピトープの少ない割合だけか事実新生抗原（そ してフィブリンに特育）である。フィブリン抗体を得るために採用されている多 くの方法は可溶性フィブリンフラグメントおよび、フィブリン上の露出した新生 抗原部位に似せた合成ペプチドを用いて動物を免疫することに集中している。Ｈ ｕｉ、　Ｋ、　Ｙ、、　　ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２２．１１２９−３２　（１９ ８３）、　５ｃｈｅｅｆｅｒｓ−Ｂｏｒｃｈｅｌ、　Ｖ、。

ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、　　８２ ．７０９１−９５　（１９８５）、　　Ｅｌｍｓ、　　Ｍ、　　Ｊ、、ら、　Ｔ ｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、　　５０．　５９１−９４　（１９８３， およびＫｕｒｄｒｙｋ、　Ｂ、ら、Ｍｏ１．　Ｉｍｍｕｌ、、　２１゜８９−９ ４　（１９８４）を参照。しかしなからかかる抗体の結合部位はフィブリン分解 過程中にも保存されておりしたがってかかる抗体もフィブリン分解産物に結合す ることができると考えられている。

本発明はフィブリン特異的モノクローナル抗体を産生ずるのに全く異なる方法を 取ることを可能にしそして無抗原（ＡＰ）動物の増強された免疫学的感受性と結 合した無傷のフィブリン抗原を利用するものである。

本発明の目的のためには、フィブリン特異的モノクローナル抗体はフィブリノー ゲン、フィブリノーゲン分解産物またはフィブリン分解産物でなくフィブリンに 結合する。

５．２．材料および方法 ５．２．１．動物 無菌ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮｖウスはｔｈｅ　Ｌｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉ ｓｃｏ−ｎｓｉｎて維持された無菌（ＧＦ）群体より得た。この動物をＧＦ条件 下で我々の研究所に輸送した。無抗原（ＡＰ）群体を天然成分食餌Ｌ−４８５（ Ｐｌｅａｓａｎｔｓ、　Ｊ、　Ｐ、、ら、Ｊ。

Ｎｕｔｒ、　１１６．１９４９−１９６４　（１９８６）参照）を与えた妊娠中 のＧＦマウスをＡＦアイソレイターに移すことから始めた。

ＡＦアイソレイターでは直ちにマウスを化学的に限定された（ＣＤ）　ＡＦ食餌 に変えた。天然成分（Ｎｌ）食餌に決して直接接触していないそれらの子供を母 乳から離乳させてＣＤ飼料にしそして第−ＡＦ世代と称した。このＡＰマウスを 、雌が妊娠しているとわかるまで組にしてつかわせた。次に雄を取り出し雌がそ れからは日常の脂質補充物を確実に全部受取れるようにした。子供は２４日令で 離乳させた。

５　、２．２．飼育舎 ＡＦ育生種を標準ポリカーボネートマウスケージ２８Ｘ　１７．８　Ｘ　１２． ７ｃｍの半分に対して飼った。底を切り取り網目のステンレス鋼の偶成に取り替 えた。ステンレス鋼板の縦方向の仕切りをプラスチックケージの端にボルトで止 め、ケージをこえて充分上に突き出てステンレス鋼製網のふたを所定の場所に保 持できるようにした。通常ケージの内部に収まるこのへこんだふたを逆にして偽 底上に十分な高さの空間を提供できるようにした。適切な大きさのステンレス鋼 製輪を６０ｍ１餌料用ビンを保持するためにふたの上に溶接した。４個のステン レス鋼製カップを偶成および上部との中間で、縦方向仕切りの両側末端に溶接し た（ケージの写真はＰｌｅａｓａｎｔｓ、　Ｊ、　Ｒ，、Ｔｈｅ　ｇｅｒｍｆｒ ｅｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ａｇｉｎｇａｎｄ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ　Ｉｎ：　 ＣＲＣＨａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　ｆ＋ｍｕｎｏｌｏｇｙ　ｉｎＡｇｉｎｇ、　　 （Ｋａｙ、　　Ｍ、Ｍ、　　Ｂ、Ｓ、　　Ｍａｋｉｎｏｄａｎ、　　Ｔ、、　　 纒）、　　Ｉ）り。

２５７−２９７．　ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、　Ｆｌ、　　 （１９８１）に示されている。餌料用ビンは茶色のガラスであった。餌料および 水用のビンの両方はその中心にドリルであけた穴を有するプラスチックのふたを 有した。ビンを満たし、その輪に倒置した。脂質補充物をステンレス鋼製カップ に毎日測り入れた。プラスチック皿を各ケージの下に置き排泄物を受けるように した。

下敷きとしておよび摂取しつる繊維としての両方の役をする濾紙はクリッピング （Ｓａｒｇｅｎｔ　Ｗｅｌｃｈ）として購入したＷｈａｔｍａｎ　ａｓｈｌｅｓ ｓ　ｆｉｌｔｅｒ　ｐａｐｅｒ　Ｎｏ、４１である。下敷きにはその紙を細片に 切断した。切断していない正方形の紙をアイソレーターの内部の清掃に使用した 。紙と１２１°Ｃで２５分間オートクレーブするかまたはプラスチックバッグ中 で照射（４，５Ｍｒａｄ）　した。全てのマウスはケージの片端をおおうのに充 分な紙を与えられた。それがぬれたり、黄色になるかまたは汚れた場合は取り替 えた。

ゲージは標準ノドパイオート法（Ｗｏｓｔｍａｎｎ、　Ｂ、　Ｓ、。

纒、Ｇｎｏｔｏｂｉｏｔｅｓ　５ｔａｎｄａｒｄｓ　ａｎｄ　Ｇｕｉｄｅ　Ｌｉ ｎｅｓ　ｆｏｒｔｈｅ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ、　Ｃａｒｅ　ａｎｄ　Ｍａｎａｇｅ ｍｅｎｔ　ｏｆ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌｓ、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｕｎｃｉｌ、　ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ　ｏｆ 　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、　Ｃ，）を用いＴｒｅｘ 　ｌｅｒ型（Ｔｒｅｘｌｅｒ、　Ｐ、　Ｃ，、Ｌａｂ、　Ａｎｉｍ、　Ｃａｒｅ 、　　１３゜５７２−５８１　（１９６３））の１．３７Ｘ　０．６　Ｘ　０． ６　Ｍのフレキシブルアイソレーター内に維持した。アイソレーターは１２時間 明暗の時間割で２１°Ｃて室内に維持した２、５ｃｍ直径の７．５５ｃｍ長さの タイボン（Ｔｙｇｏｎ）チューブをアイソレーターの頂部にはめこみそして上部 および下部両方でビニール栓で閉じた。これは飼斜、水および油の滅菌濾過の入 口を提供する。

５．２．３．餌料 第１表は餌料組成物および限外濾過Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、　 ＭＡ）中に成分を溶解させる順序を示す。

アミノ酸およびデキストロースはＳｉｇｍａ組織培養等級であった。ビタミン類 もＨｏｆｆｍａｎ−Ｌａ　Ｒｏｃｈｅ、　　Ｉｎｃ。

（Ｎｕｔｌｅｙ、　ＮＪ）の善意により供給された純パルミチン酸しチニルを除 いてはＳｉｇｍａからのものであった。他の試薬はＦｉｓｈｅｒ保証または同等 品であった。完全に水溶性の食餌を直径１５０ｍｍの３枚のＰｍ１Ｏ膜（Ａｍｉ ｃｏｎ）を使用しＡｍ１ｃｏｎ　Ｄｉａｆｌｏ　ＴＣ３限界濾過器で冷時濾過し た。

限外濾過膜は分子量カットオフ１０．０００ダルトンを有した。組立てられた限 外濾過装置を使用に先立ち０，１５％次亜塩素酸ナトリウム溶液を通過させるこ とにより滅菌にし、続いて充分に洗浄した。限外濾過餌料は必要時まで無菌貯蔵 器中４°Ｃで保存した。餌料はＮｏ６ネオプレン栓に挿入された配送用チューブ を有するオートクレーブずみ加圧フィルターホルダー中の０．２μｍナイロン（ ＭＳＩ）を使用してＡＦアイソレーターに導入した。この目的には、アイソレー ターの上部にさしこまれたタイボンチューブから上部のビニール栓を取りはずし 、チューブの内部を０．１％アルキル−アリールスルホネートを含育する２％過 酢酸の滅菌溶液てスプレーした。フィルターホルダー栓を上部栓の場所に挿入し た。２０分後、下部の栓を取りはずしくアイソレーターの内部）そして餌料また は水を２０ｐｓｉの窒素下でアイソレーターに濾過して入れた。

脂質補充物の組成を第２表に示す。大豆のトリグリセリドはパルミテートからリ ルネートまでのエステルを生成する温度範囲で真空蒸留したそれらのメチルエス テルからつくられた調製物であった。これらのエステルを続いてグリセリンとエ ステル交換して混合トリグリセリドを形成させた。（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ　Ｐｒｅｐ 、　Ｅｌｙｓｉａｎ。

ＭＮ）。この混合物をアイソレーターに濾過して入れる（その時には混合物は５ ０°Ｃに加温）に先立ちこのトリグリセリド混合物に脂溶性ビタミンを加えそし て餌料の水溶性部分について用いたと同じ方法によりアイソレーター中に濾過し て入れた。

脂質の摂取料は０．３７５ｍ１／日と測定された。脂質補充物を増大させること により、新生マウスの死亡率が著しく減少した。平均の仔寸法も従来通り飼育し た動物のそれまで増加した。授乳中の雌は正常量の２倍の脂質補充物を与えられ た。

（本貫以下余白） 第１表 化学的に限定された餌料Ｌ４８９ＥＩＳｅの組成および調製７０°ＣのＭｉｌｌ ｉ−Ｑ水１９２ｍ１に下記のものを添加した：アルギニンＨＣＩ　　　　　　　 　　　　　　　０．８１ヒスチジンＨＣＩ　　　　　　　　　　　　　０．７４ 溶液を４５°Ｃに冷やし、下記のものを添加した：グルタミン酸ナトリウム　　 　　　　　　　３．４ＯＬ−チロシンエチルエステル）（Ｃ１０，６２グルコン 酸第−鉄　　　　　　　　　　　　０．０５塩３５Ｄ　’　　　　　　　　　　 　０．１０５セレン酸ナトリウム’　　　　　　　　　　　０．０７４溶液を５ °Ｃに冷やし、下記のものを添加した：グリセロリン酸カルシウム　　　　　　 　　５．２２グリセロリン酸マグネシウム　　　　　　　１．４３塩化カルシウ ム２）１２０　　　　　　　　　　０．１８５塩化ナト１功ムーヨウ化カリウム （Ｋｌ）混合物０．０８６（６８０ｍｇ　Ｋｌ含有） ビタミンＢ混合物１１１Ｅ５　”　　　　　　　　　０．０９ビタミンＢ１２　 ’　　　　　　　　　　　　　　　１．２０　ｍｇ塩化コリン　　　　　　　　 　　　　　　０．３１酢酸カリウム　　　　　　　　　　　　　　１．８５７０ °ＣのＭｉｌｌｉ−Ｑ水１０８ｍ１に７０°Ｃで無水Ｄ−デキストロースを添加 した。

溶液を５°Ｃに冷やし両者を混合して限外濾過した。

１　塩３５Ｄ混合物の組成は第３表に示す。

２　塩３５Ｄ中の亜セレン酸ナトリウムに加え添加。

３　ビタミンＢ混合物１１１Ｅ５の組成（第４表参照）４　ビタミンＢ混合物１ １１Ｅ５中のビタミンＢ−１２に加え添加。

第２表 （０，３７５ｍ１） 精製大豆トリグリセリド’　　　０．３３ｇパルミチン酸レチしル　　　　６． ４５ｍｇ（１１，７１，Ｕ、）コレカルシフェｏ−ル　　　　、０２８８ｍｇ（ １，１５１，Ｕ、）２　アンボーα−トコフェロール　　　　　　　　　　　　 ３．３ｍｇ２　アンボーα−トコフェロールアセテート　　　　　　　６．６ｍ ｇフィロキノン　　　　　　　　７２ｍｇ本授乳中のマウスには標準成体マウス 量の２倍を与えた。

ｌ成分は２１２％パルミテート 第３表 ３５Ｄ塩混合物の組成 Ｍｎ（アセテート）２４８２０　　　　　　　　　　　　　　　５５．４ＺｕＳ Ｏ４Ｈ２０４０，６ Ｃｕ（アセテート）２　８２０　　　　　　　　　　　　　　　　　３，７Ｃｒ （アセテート）３　８２０　　　　　　　　　　　　　　　　　２．５ＮａＦ　 　　　　　　　　　　　　　　２．　ｌ５ｎＳＯ４２Ｈ２００，３７ （ＮＨ４）８　ＭｏｔＯ□、　４Ｈ２００，３７ＮｉＣ１□３Ｈ２００，３７ Ｃｏ（アセテート）２　４Ｈ２００，１１（本頁以下余白） 第４表 ビタミンＢ混合物の１１１Ｅ５の組成 チアミンＭＣＩ　　　　　　　　　　　１．２３ピリドキシンＨＣ１１，５４ ビオチン　　　　　　　　　　　　０．２５葉酸　　　　　　０．３７ ビタミン８１２　　　　　　　　　　０．３７リボフラビン　　　　　　　　　 　１．８５ナイアシンアミド　　　　　　　９．２１−イノシトール　　　　　 　　　６１．９パントテン酸カルシウム　　　　１２．３水はＭｉｌｌｉ−Ｑ限 外濾過等級であり、餌料と同じ方法でアイソレーターに濾過して入れた。

５．２゜４．微生物学的監視 無抗原系を微生物汚染についてＷｏｓｔｍａｎｎ、　Ｂ、Ｓ、纒（１９７０）　 Ｇｎｏｔｏｂｉｏｔｉｃｓ　５ｔａｎｄａｒｄｓ　ａｎｄ　ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｓ　ｆｏｒｔｈｅ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｃａｒｅ　ａｎｄ　ｍａｎａｇｅｍｅｎ ｔ　ｏｆ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙａｎｉｍａｌｓ、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ　Ｃｏｕｎｃｉｌ、　ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃ ｉｅｎｃｅｓ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、　Ｃ，に記載されたガイドライ ンに従い検査した。要約すると、アイソレーター内部からの餌料および水で湿っ たスワブを用いて、マウスからおよび各ゲージの下の蓄積した排泄物から新しく 排泄物の塗抹標本を得た。また塗抹標本はアイソレーターの壁、特に入口周辺か らも採取した。

常に二通り塗抹標本を取った。そのひとセットを、グラム染色を用いて細菌およ び真菌について直接顕微鏡検査により検査した。スワブの第２組は微生物の検出 に用いた。培養物が陰性であると見られるまで二連間経過させた。

微生物学的検査は約２週間ごとにまたはアイソレーターに新しい加入がなされた ２−３日後に行った。

５．３．無抗原マウスを用いるモノクローナル抗体の生産 前記無抗原マウスをモノクローナル抗体生産におけるリンパ球ドナーとして用い た。全抗原の溶液は層流フード中で無菌条件下に調製した。

下記プロトコールをＡＰマウスの免疫化に採用した。

抗原（２５−５０μｇ）を無菌食塩水（１００μりに溶解させ、そして同量のフ ロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）で乳化した。インターフェロン（１０００ 単位）を乳濁液調製に先立ち抗原の溶液に添加した。無菌注射器および針を全て の免疫処置に使用した。注射器を入口を通してＡＰアイソレーターに搬入し、そ こで過酢酸（２％）の溶液でスプレーすることにより滅菌した。ブースター注射 は同量の抗原を用い、ＦＣＡをフロインド不完全アジュバントで置き換えて行っ た。全部で３回のブースター免疫を各３週間間隔で行った。最後のブースター（ アジュバントなし）は融合の４−７日前に行った。

全ての免疫処置は腹腔内に行った。マウスを融合の当日にアイソレーターから取 り出しそしてＣ０２窒息によりすぐに殺した。膵臓を取り出して牌細胞を標準ハ イブリドーマ法を用いてマウスミエローマ細胞（ＮＳ　１　）と融合させた。

５．４．フィブリン特異的モノクローナル抗体生産のだめの無抗原動物系の使用 無抗原系を用いてフィブリン特異的モノクローナル抗体を生成させた。抗体は特 異性が高く、そしてフィブリノーゲン、フィブリン分解産物またはフィブリノー ゲン分解産物を認識しない。ハイブリドーマ細胞系はヒトフィブリンで免疫化し た無抗原ＢＡＬＢ／ｃマウスの牌細胞およびＮＳ１ミエローマ細胞の融合により 生成させた。

５．４．１．免疫処置日程 ８週令の３匹の雌の無抗原マウスをヒトフィブリン調製物３３μｇで免疫処置し た。この調製物は、下記のように調製されたフィブリンのフリーズフラクチャー 試料であった： ヒトフィブリノーゲンをトロンビンおよび第ＸＩ［Ｉａ因子によりフィブリンに 変換した。次にフィブリン凝塊を液体窒素中で凍結させそして機械的破壊により 非常に微細な粉末となした。フリーズフラクチャーしたフィブリンの分散液を食 塩水中に生成させて最終濃度１ｍｇ／ｍｌを有する架橋フィブリンＸＬ−Ｆｎの 透明溶液を得た。このフィブリン抗原の３３μｌを動物の免疫化に使用した。抗 原溶液の量を無菌食塩水で１００μ！に調整し、次に前項記載のようにしてＦＣ Ａで乳化した。２回のブースター免疫処置をフロインド不完全アジュバント中の 同レベルの抗原を用い、３週間間隔で投与した。

最後のブースターは融合４日前に行った。同レベルの抗原を用いそしてアジュバ ントを食塩水で置き換えた。

５　、４．２．抗体の検出および測定 モノクローナル抗体の定性的および定量的測定はエンザイムリンクトイムノソル ベントアッセイ（ＥＩｊＳＡ）を用いて行った。ＥＬＩＳＡは９６ウエルＰＶＣ プレート（Ｃｏｓｔａｒ）上に固定化したヒトフィブリンを用いて実施した。フ ィブリン被覆したアッセイブレートはフィブリノーゲン溶液（Ｋａｂｉ、等級Ｌ ０５０μｇ　／ｍｌポレート／食塩緩衝液）の１００μｌを４°Ｃにて一夜イン キユベートすることにより調製した。未結合フィブリノーゲンは０．０５％ツイ ーン８０を含有するＰＢＳ　（ＰＢＳ−ツイーン）で洗浄することにより除去し た。各プラスチックウェル上に被覆したフィブリノーゲンを２ｍＭ　ＣａＣｌ２ を含有するトロンビン溶液（ＩＯＮＩＨ単位／［１１１）　１００μｌと３７° Ｃて１時間インキュベートすることによりフィブリンに変換した。抗体の標準検 量曲線は５ＤＳ−ＰＡＧＥによれば均質である抗体調製物を用いて作成した。

非特異的結合を阻止するために、フィブリンを被覆したプレートをＰＢＳ　ｐＨ ７，４中のＢＳＡの１％溶液とインキュベートした。次に抗体含有溶液（１００ μりを添加し、３７°Ｃで９０分間インキュベートした。手順の各工程後、ウェ ルをＰＢＳ−ツイーンで充分に洗浄した。結合された抗体は１％ＢＳＡを含有す るＰＢＳ、　ｐ）Ｉｓ、　Ｃ１中で希釈したアルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍ ａ）接合ウサギ抗−マウス抗体の１ｏｏｏ倍希釈物を添加することにより検出し た。

５．４．３．ハイブリドーマの産生−融合マウスをＣＯ□窒息により殺しそして 直ちに膵臓摘出を行った。免疫化マウスの膵臓細胞を融合剤ポリエチレングリコ ール４０００（３，０００−３，７００）を用いて融合した。

細胞をＴフラスコ中のＨＡＴ選択培地で１週間インキュベートシた。この期間の 後、細胞を５個の９６ウエルプレートに塗布すると、そのうち９３ウエルか増殖 を示した。これらのうち、１９ウエルはフィブリン抗原に関して陽性であった。

これらのクローンのうちのひとつＦ４９２Ｄ８　（後にＭＨＩと改称）は、フィ ブリン抗原は認識するかフィブリノーゲンと交差反応しない抗体を産生じた。こ の特別のクローン、ＭＨＩを限界希釈法で３回再クローンし、第三のクローニン グ期は１ウエル１細胞て行った。細胞系が、いったん安定化されると、無血清培 地に移した。この細胞系は約７．５　ｍｇ／　ルベルで抗体を産生ずる。

５　、４．４．モノクローナル抗体の精製精製に先立ち（４ｊ７バツチの）組織 培養上清を遠心して細胞層を除去し、そして０．８μＭナイロン膜で濾過してす べての残留微粒子物質を除去した。ハイブリドーマ上清は分子量カットオフ３０ ．０００を有するＹＭ型の膜（Ａｍｉｃｏｎ）を用いてらせん巻き限外濾過装置 を使用して４°Ｃにて５００ｍ１量まで濃縮した。２０ｍＭ　２　（Ｎ−モルホ リン）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ｐＨ６（緩衝液Ａ）への緩衝液交換は製造 業者の説明書に従いダイアフィルトレージョン（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ） により達成した。最終容量１００ｍ１となるまでさらに濃縮した後、抗体溶液を さらに精製する前に０．４５１ミクロンナイロン膜で濾過した。濃縮した抗体溶 液を７．７５ｍｍＸ　１０Ｃｍ　ＡＢｘカラム（Ｊ、　Ｔ、　Ｂａｋｅｒ、　Ｐ ｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、　ＮＪ）を用いるＷａｔｅｒＳＨＰＬＣクロマトグラ フィーての液体クロマトグラフィーにより精製した。カラムを緩衝液Ａで平衡化 し、試料（］、０００ｍ１を１．０ｍｌ／分の流速で注いだ。緩衝液Ａで充分に 洗浄した後、抗体を緩衝液Ａから１００％緩衝液Ｂ（１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ７ ）のグラシイエンドを用いてカラムから１　ｍｌ／分で溶出させた。フラクショ ン（２ｍｌ）を収集し、ＭＡｂ　（ＥＬＩＳＡにより測定）を含有するものをプ ールしてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）　（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｆ５０ｍ Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７、４）で透析し、１ｍｇ／ｒｎ１以上の濃度で一２０ °Ｃにて保存した。

ＡＢＸカラムは１００％緩衝液Ｂで５分間洗浄し続いて１５カラム量の緩衝液Ａ で再度平衡化することにより再生した。

５．５．フィブリン特異性の測定 フィブリン特異性の最初の測定はハイブリドーマ上清をフィブリンおよびフィブ リノーゲン被覆マイクロタイタープレートで別々にスクリーニングすることによ り行った。フィブリノーゲンと交差反応しない抗体を産生ずる細胞系のみが受容 された。

フィブリン特異性のそれ以上の確認は溶液中のフィブリノーゲンとの競合アッセ イを用いて測定され、それによりこの抗体が溶液中のフィブリノーゲンを認識し ないことが確認された。

抗体のフィブリン特異性を確認するのに用いられる競合アッセイは前記ＥＬ　Ｉ 　ＳＡアッセイで記載されるようにして行われ、抗体を溶液中のフィブリノーゲ ンとブレインキュベーションした。要約すると、ノ１イブリドーマ上清を、抗体 のフィブリノーゲンへの非特異的結合を阻止するためにＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ ）を含有する生理学的濃度のフィブリノーゲン溶液（４ｍｇ／ｍｌ）と３７°Ｃ て３０分間インキュベートした。次にフィブリノーゲン／抗体溶液を、フィブリ ンを被覆したマイクロタイタープレートのウェルに移した。ＧｌｙＰｒｏＡｒｇ Ｐｒｏ（ＧＰＲＰ）を、フィブリンウェル中に残留するトロンビンによるフィブ リノーゲンのありうる重合防止するためにフィブリノーゲンインヒビターに添加 した。次にアッセイを固定化抗原に結合された抗体に関する慣用のＥＬＩＳＡア ッセイと同様にして実施した。ＭＨＩ抗体のフィブリン特異性を検査する全ての 実験において、第２の抗体４５Ｊを対照として用いた。４５Ｊはフィブリンおよ びフィブリノーゲンと交差反応する。

５．５．１．　　フィブリノーゲンとの交差反応の測定５．５゜１．１．固定化 されたフィブリンおよびフィブリノーゲン 細胞系ＭＨＩは、フィブリンかＰｖＣマイクロタイターアッセイプレートの表面 に固定化された場合、それと交差反応するマウスモノクローナル抗体を産生ずる （第５表）。同じアッセイにおいて、この抗体はプレートに固定化されたフィブ リノーゲンを認識しない。

第５表のデータが示すように、フィブリノーゲンかいったんトロンビンによりフ ィブリンに変換されると免疫反応は劇的に増大し、このことはフィブリン分子土 の新しいエピトープの露出または形成を明らかに示している。しかしながら対照 抗体である４５Ｊはフィブリノーゲンかフィブリンに変換された場合に保存され ているエピトープを明らかに認識する。

５．５．１．２．　　フィブリンおよびフィブリノーゲンとの競合アッセイ 抗体、ＭＨＩ抗体のフィブリン特異性は、／Ｓイブリドーマ上清をフィブリン被 覆ウェル上でのＥＬＩＳＡに先立ちフィブリノーゲン溶液（最終濃度４ｍｇ／ｍ ｌ）とブレインキュベートする競合アッセイでさらに示された。

かかる高レベルのフィブリノーゲンをこの競合アッセイに用いたので（抗体濃度 のＸ　５００）、ＢＳＡ　（最終濃度１０ｍｇ／ｍｌ）を混合物に添加した。フ ィブリン被覆ウェル上の残留トロンビンによるフィブリン重合を阻止するために ペプチドＧＰＲＰを添加した。このアッセイの結果は、Ｍ旧抗体が溶液中のフィ ブリノーゲンを認識しないことを示している（第６図）。

フィブリン４００１ｇがマイクロタイターアッセイプレートの各ウェルに結合す ると仮定すると、この特別の競合アッセイに使用されたフィブリノーゲンレベル は結合フィブリン抗原よりもｉ、　ｏｏｏ倍過剰である。さらに、これは組織上 溝中の抗体レベルの４００倍過剰である。

（本頁以下余白） 第５表 フィブリノーゲンおよびフィブリン抗原ＭＡｂ　　　　　　　　　　Ａ４゜ｓ− ／３０分ＭＨ１、９００，２５ ４５Ｊ　　　　　　　１．６５　　　　　１．５０第６表 フィブリノーゲンの存在下におけるＭＨＩ抗体ＭＡｂ　　　　　　　　　　Ａ４ ゜Ｓ、、／３０分ＭＨＩ　　　　　１．２４　　　　　　　　１．２７４５Ｊ　 　　　　０．４３８　　　　　　　　１．７４（本頁以下余白） ５　、５．２．　　フィブリン（プラスミノーゲン）分解産物との交差反応性の 測定 フィブリノーゲン分解産物（ＦＤＰ）はフィブリノーゲンをプラスミンと３７° Ｃで１０分〜３時間インキュベートすることにより調製した。所望の時間にトラ シロール（ＴｒａｓｙｌｏｌＸ１００カリクレインインヒビタ一単位／ｍ１）お よび２０ｍＭイプシロンアミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）の添加によりフィブリノ ーゲン分解を停止させた。

架橋フィブリン分解産物（ＸＬＦＤＰ）は、１０ｍＭ　ＣａＣｌ□、プラスミノ ーゲン（０，２５ｍｇ／ｍｌ）およびウロキナーゼ（５０ｆＵ／ｍｌ）を含育す るトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ、　ｐ）ｉ７．４．５０ｍＭ　）リスＨＣＩ、　１ ５０ｍＭ　ＮａＣ１）中のフィブリノーゲン溶液（５ｍｇ／ｍりにトロンビン（ ４ＮＩＨ単位／ｍｌ）を添加することにより調製した。この混合物を３７°Ｃて インキュベートしそしてプラスミン消化を前記ＦＤＰで記載したようにして種々 の時間間隔で終了させた。

抗体とフィブリン分解産物およびフィブリノーゲン分解産物との交差反応性を測 定するためには、適当な分解産物をマイクロタイタープレートに被覆しそして常 法によりＥＬＩＳＡを行った。第７表の結果か示すように、ＭＨＩ抗体はプラス ミンにより生成されたフィブリノーゲン分解産物のいずれとも交差反応しない。

第８表が示すとおり、この抗体はＸＬ−フィブリン分解産物と反応しない。また 、抗体をウェスタンブロッティング分析により交差反応性について検査した場合 にもこの観察がなされた。

抗体は、前駆体分子フィブリノーゲンの表面上に存在しないか露出されていない 無傷のフィブリン分子のエピトープを認識するという結論が導き出されうる。

このエピトープは第８表のデータが示唆するとおり、架橋フィブリンのプラスミ ン消化により明らかに破壊される。

従って、ＭＨＩ抗体は以下のように定義されつるフィブリン特異的モノクローナ ル抗体である。

すなわち本発明の目的にとって、フィブリン特異的モノクローナル抗体は次のよ うなモノクローナル抗体である： １、前記した、フィブリンおよびフィブリノーゲンとの交差反応性を測定するた めの競合アッセイにおいて、このモノクローナル抗体はフィブリノーゲンかフィ ブリンと比較して１０００倍過剰量で用いられた場合にフィブリノーゲンと約７ ５％以下、そして好ましくは約１０％以下の交差反応性しか存しない、２、前記 した、架橋フィブリンおよびフィブリン分解産物との交差反応性を測定するため のアッセイにおいて、このモノクローナル抗体と、プラスミンて約３時間消化し たフィブリンとの反応性はモノクローナル抗体とフィブリンとのゼロ時間におけ る反応性の約５０％以下、そして好ましくは約４０％以下である、および ３、前記した、フィブリノーゲンおよびフィブリノーゲン分解産物との交差反応 性を測定するためのアッセイにおいて、このモノクローナル抗体と、プラスミン で約４時間消化したフィブリノーゲンとの反応性はゼロ時間でのこのモノクロー ナル抗体とフィブリノーゲンとの反応性より決して大きくない。

ＭＨＩ抗体は、そのフィブリンに対するアフィニティを測定することによりさら に特性決定されている。アフィニティは１２５Ｉ標１１１ｉＭ）］　１抗体を用 いスカッチャード分析（Ｆｒａｎ’ｋｅｌら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎ ｏｌｏｇｙ、　１６．１０１−１０６　（１９７９））により測定した。解離定 数ＫＩｌ＋について得られた値は６．７　Ｘ　１０−”Ｍであった。かかるアフ ィニティはフィブリンに対するｔ−ＰＡのアフィニティのそれの約５．０００倍 である。

Ｍｌ−ＩＩ抗体かフィブリノーゲンのＡα、Ｂβまたはガンマ鎖と交差反応しな いこともウェスタンブロッティング分析により測定されている。また、ＭＨＩ抗 体かフィブリノーゲンのトロンビン処理ＡαまたはＢβ鎖と交差反応しないこと も同じ分析法により測定されている。　（フィブリノーゲンのトロンビン処理は 、Ａα鎖およびＢβ鎖からそれぞれフィブリノペプチドＡおよびフィブリノペプ チドＢの放出を生じ、それゆえフィブリンのα鎖およびβ鎖が形成される。）第 ７表 フィブリノーゲン分解産物とのＭＨＩ抗体の交差反応性０　　　　　　０．１５ 　　　　　１．０３７１０　　　　　　０．１０　　　　　　ｎｍ２０　　　　 　　０．１１　　　　　１．０２４０　　　　　　０、１１　　　　　０．４１ ０６０　　　　　　０、１０　　　　　０．３３０２４０　　　　　　０、０９ 　　　　　０．３００第８表 フィブリン分解産物とのＭＨＩ抗体の交差反応性０　　　　　　０、８９０　　 　　１．４０３　　　　　　０．３５４　　　　１．０５　　　　　　０．３１ ０　　　　０．７７加えて、第７表の結果か示すとおり、対照抗体４５Ｊ抗体は フィブリノーゲンに結合しそしてフィブリノーゲン分解産物とは交差反応しない 。従って、かかるモノクローナル抗体はフィブリノーゲン特異的モノクローナル 抗体であって本発明のもう一つの観点を表わすものである。フィブリノーゲン特 異的モノクローナル抗体は、インビトロで血漿フィブリノーゲンレベルを測定す るのに利用できる任意のイムノアッセイに使用てきる。４５Ｊ抗体は、４５Ｊエ ピトープがフィブリノーゲンのＡα鎖のアミノ酸およそ２０６からおよそ４２４ までの領域にあり、そしておよそ２０７からおよそ２３１までの領域にある可能 性が最も高いことが測定されているという点でさらに特性決定されている。本発 明の目的にとって、フィブリノーゲン特異的モノクローナル抗体は前記したよう に、フィブリノーゲンおよびフィブリノーゲン分解産物との交差反応性を測定す るアッセイにおいて、プラスミンで約４０分間消化したフィブリノーゲンとその モノクローナル抗体との反応性かモノクローナル抗体とフィブリノーゲンとのゼ ロ時間での反応性の約５０％以下である抗体である。

４５Ｊハイブリドーマはフィブリンで免疫した慣用のＢａ１ｂ／Ｃマウスを用い る常法により作られた。しかしながら、フィブリノーゲンも抗原として利用でき る。

５　、５．３．非架橋フィブリンおよび非架橋フィブリン凝血塊との交差反応性 の測定 抗体ＭＨＩは架橋フィブリン（ＸＬＦｎ）とのみならず非架橋フィブリン（ＮＯ ＮＸＬＦｎ）とも交差反応することかＥＬＩＳＡにより示されている。ＥＬＩＳ Ａは以下のようにして行われた。

１．９６ウエルマイクロタイターアツセイプレートをｉｏｏμｌのフィブリノー ゲン溶液【ボレー）　（ｐＨ８，５）食塩水緩衝液中５０μｇ／ｍｌ）で４℃で 一夜被覆した。

２、架橋フィブリンは、２ｍＭ　ＣａＣ１ｚおよび１０ｍＭシスティンを含有す るトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ、　ｐＨ７，４，５０ｍＭ　）リスＨＣＩ、　１５ ０ｍＭ　ＮａＣ１）中のトロンビン溶液（ＩＯＮＩＨ単位／ｍｌ）と３７°Ｃで １時間インキュベーションすることによりフィブリノーゲン被覆ウェル中で形成 された。

３、非架橋フィブリンはＥＤＴＡを最終濃度０．０１２５Ｍまで含有するりん酸 塩緩衝液（ｐＨ６，１）中のトロンビン溶液（ＩＯＮＩＨ単位／ｍ１）と３７° Ｃで１時間インキュベーションすることにより、フィブリノーゲン被覆ウェル中 で形成された。

４、結合された抗体は抗マウスアルカリホスファターゼ接合体とインキュベーシ ョンすることにより測定した。結合された接合体はアルカリホスファターセ基質 を添加することにより測定しそして生ずる比色反応を自動式プレート読みとり話 中４０５ｎＭて監視しアッセイの結果を第９表に示し、そして架橋フィブリンと の抗体の交差反応性はそれと非架橋フィブリンとのそれより大きいと結論できる 。最も簡単な説明は架橋重合体状構造中に存在する共有架橋が抗体が認識するコ ンホーメーションを固定または凍結させる役目をするということである。非架橋 種ではコンボーメ−ジョンは形成されはするが重合体の共有結合によって安定化 されていない。

この抗体がインビトロで形成された架橋および非架橋凝血塊の両方と交差反応す ることも示されている。

架橋フィブリンは、フィブリノーゲン溶液（ＣａＣｌ　２　（２ｍＭ）およびシ スティン（ＩＱｍＭ）を含有するトリス（５０ｍＭ、ｐＨ７，４）食塩水中）を トロンビン（ＩＯＮＩＨ単位／ｍｌ）と３７°Ｃて３時間インキュベートするこ とにより調製した。非架橋フィブリンは、ＥＤＴＡを最終濃度０．０１２５Ｍま で含有するりん酸塩緩衝液（ｐ）１６．１）中のフィブリノーゲン溶液（３ｍｇ ／ｍｌ）をトロンビン溶液（ＩＯＮＩＨ単位／ｍｌ）と３７°Ｃて３時間インキ ュベートすることにより形成された。凝血塊の形成後、これらを洗浄しそして＋ ２５１−標識Ｍ旧抗体を含有する１％ＢＳＡ溶液４００μｌと３７°Ｃてインキ ュベートした。種々の時点て少量の溶液をとり出しそして抗体とり込みの量をガ ンマカウンター中で血漿を計測することにより測定した。

第１Ｏ表は非架橋および架橋凝血塊の両方による抗体のとり込みを示す。

第９表 架橋および非架橋フィブリン とのＭＨＩ抗体の交差反応性 （ｎｇ、　／ｍ１．　）　　　　　（４０５ナノメーターでの吸収）１００、０ ００　　　　０．７６４　　　　　　０．４０９５０、０００　　　　０．４６ ０　　　　　　０．３１９２５、０００　　　　０．３０５　　　　　　０．１ ５４１２、５００　　　　０．　Ｉ７４　　　　　　０．０７４６．２５０　　 　　０．０６９　　　　　　０．０００第１０表 架橋および非架橋フィブリン凝血塊 とのＭＨＩ抗体の交差反応性 架橋　　　　７９％ 非架橋　　　　　　　　７６％ ５．６．ハイブリドーマの寄託 ＭＨＩおよび４５Ｊは１９８８年６月９日にアメリカン　タイプカルチャーコレ クション（ＡＴＣＣ）に寄託されておりそしてそれぞれ受託番号ＨＢ　９７３９ およびＨＢ　９７４０を与えられた。ＡＴＣＣは１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ 　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。

ＭＤ、　２０８５２にある。Ｍ旧抗体はカッパ軽鎖を有するＩｇＧ。

抗体でありそしてＭ旧抗体はヒトフィブリンのみならずウサギフィブリンとも交 差反応することが観察されている。

本発明は寄託されたハイプリドーマにその範囲が限定れることを意図するもので はなく、これらはここに定義されるようにフィブリン特異的モノクローナル抗体 およびフィブリノーゲン特異的モノクローナル抗体を生成したハイブリドーマの 単一の説明例であることが意図される。機能的に同等なすべての細胞系か本発明 の範囲内にある。“機能的に同等”なる用語は、ＭＨＩ抗体か結合するフィブリ ンのエピトープへの結合または４５Ｊ抗体か結合するフィブリノーゲンのエピト ープへの結合においてそれぞれＭ旧抗体または４５Ｊ抗体とその抗体か競合しう ろことを意味する。さらに、かかる用語にはここに記載されるように、ＭＨＩ抗 体か結合しそして４５Ｊ抗体か結合するエピトープとは異なるエピトープに結合 するフィブリン特異的モノクローナル抗体およびフィブリノーゲン特異的モノク ローナル抗体かそれぞれ包含される。

５．７．フィブリン特異的モノクローナル抗体のインヒポ診断用途および治療用 途 ５．７．１．凝血塊／血管病所在確認 本発明のフィブリン特異的モノクローナル抗体はインビボでフィブリン凝血塊ま たはフィブリン集塊を標的ねらいしつる。それゆえこれらはヒトのありうる組織 または血管損傷の局在判定および血管疾患の監視に用いることができる。フィブ リン特異的モノクローナル抗体は、かかるモノクローナル抗体がフィブリノーゲ ン、フィブリン分解産物およびフィブリノーゲン分解産物に結合せず、それによ りバックグラウンドを低下させ、このことによりフィブリン凝血塊またはフィブ リンの集塊物をより正確に所在確認できるので、この用途に特に好ましい。

この応用にとっては、精製モノクローナル抗体の使用か好ましい。精製はＨＰＬ Ｃ法でなされるのが好ましい。

ヒトへの投与用のモノクローナル抗体の精製はまた硫酸アンモニウムまたは硫酸 ナトリウム沈澱に続く食塩水での透析および濾過滅菌によっても達成できる。あ るいはまた、イムノアフィーティクロマトグラフィー法をモノクローナル抗体の 精製に用いることもできる。

精製モノクローナル抗体は放射性化合物例えば、＋２Ｊ、１２ｓ１、…Ｉ、”ｍ Ｔｃ、ｌ　ｌ　Ｉ　Ｉｎで標識しそして患者に静脈投与することができる。抗体 は磁気プローブで標識することもてきる。次に凝血塊の位置を正確に指摘するの にＮＭＲを利用できる。凝血塊またはフィブリン集塊物での抗体の局在確認後、 それらを放射形トモグラフィー法および放射性核走査法により検出し、それによ り例えば血栓またはフィブリンによりカプセル化された腫瘍の位置を正確に指摘 できる。

例示するには、精製モノクローナル抗体を適当な担体例えばヒトアルブミンを含 有または含有しない食塩水中に適当な用量で懸濁させ、そして患者に投与する。

このモノクローナル抗体は好ましくは静脈投与、例えば数時間にわたり連続して 静脈注入することにより投与される。

５　、７．２．血管疾患のモノクローナル抗体接合体を用いる治療 本発明のモノクローナル抗体は広範囲の薬剤例えば細胞毒剤および血栓溶解剤例 えばｔ−ＰＡ、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、およびフィブリンを溶解さ せつる他のプロテアーゼと一緒に使用できる。かかる使用は特に好ましい、何故 なら本発明のフィブリン特異的モノクローナル抗体は、かかる試薬のどれもフィ ブリノーゲン、フィブリン分解産物またはフィブリノーゲン分解産物への結合に よって失われないであろうからかかる試薬の非常に効率的な使用ができようから である。この点に関する種々の概説はＢａ１ｅら、１９８０．　ＣａｎｃｅｒＲ ｅｓｅａｒｃｈ、　４０：　２９６５−２９７；　ＧｈｏｓｅおよびＢｌａｉｒ 、　１９７８゜Ｊ、Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、、　６１（３）：　 ６５７−６７６；　Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ。

１９７７、　Ｎａｔｕｒｅ、　２６５：　４０７−４１１；　Ｇｒｅｇｏｒｉａ ｄｉｓ、　１９８０゜Ｐｈａｒｍａｃ、　Ｔｈｅｒ、、　　１０：　１０３−１ ０８；　　およびＴｒｏｕｅｔ　ら、１９８０、　Ｒｅｃｅｎｔ　Ｒｅ５ｕｌｔ ｓ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　７５：　２２９−２３５を参照されたい。

これら薬剤をモノクローナル抗体分子に結合させるのに用いられる方法は非共有 または共有結合を包含しつる。非共有結合は抗体複合体が標的部位に到達する以 前に破壊される可能性がより高そつなので、共存結合か好ましい。例えば、カル ボジイミド結合は薬剤のカルボキシ基と抗体分子のアミノ基との間で形成されう る。ジアルデヒドまたはイミドエステルのような二官能剤を薬物のアミノ基を抗 体分子のアミノ基に結合させるのに使用できる。シップ塩基反応は薬物を抗体分 子に結合させるのに使用できる。この方法はグリコールまたはヒドロキシ基を含 有する薬物または細胞毒剤の過ヨウ素酸塩醇化、従ってアルデヒドの形成を包含 し、次にこれが抗体分子と反応する。結合は抗体分子のアミノ基とのシッフ塩基 形成を介して起る。さらに、反応性スルフヒドリル基を有する薬物も抗体分子に 結合されている。

微生物 アメリカンタイプカルチャーコレクション１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒ ｉｖｅＲｏｃｋｖｉｌｌｅ　ＭＤ　２０８５２　ＬＩＳＡ１９８８年６月９日寄 託、受託番号ＨＢ　９７４０手続補正書彷功 平成　３年　９月２６日 特許庁長官　　深　沢　　亘　　殿 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０２５４５ 平成１年特許願第５０６６１０号 ２、発明の名称 無菌動物を用いるモノクローナル抗体の製法３、補正をする者 事件との関係　　特　許　出　願　人 名　称　　アメリカン　バイオジエンチック　サイエンシズ。

住　所　東京都港区虎ノ門１丁目１５番７号平成３年８月２７日（発送日） ６、補正の対象 （１）特許法施行規則第３８条の２の規定による様式第５２にそってタイプ印書 して浄書した明細書及び請求の範国際調査報告 １ｍＮＭｌ呻ｅａｌ　Ａ−ｃａｍｅｈａ　　ｐｒＴ／１ＩＱＧＩＱ／Ｃ５７’ｓ Ａ＊ＰＣＴ／υ５８９１０２５４５ Ａｔｔａｃ　　ｅｎｔ　　ｏ　　ｏｒｍ　　　　　Ｓ＾　　ＯＰａ　　　。

υＪ、　ＣＬ、・　　４３５／６Ｂ、　　２４０．２７：　　４３６１５０１． 　４２４／９．　８５．８．Ｅ１５．９１゜５３０／３Ｅ１７．３９１ ＰＣＴ／υ９８９１０２５４５ Ａ　　　ｈｍｅｎｔｔｏＦ’ｏ　　　Ｐ　　　　　　　ＯＰａｔｈ：ＰＣＴ／Ｕ Ｓ８９１０２５４５ ｔｔｃ　　ｅｔｔｏ　　ｏ　　　ＣＴ　　ＳＡ２　　　Ｐ　　ｔＶＩ；ＰＣＴ／ υ５８９１０２５４５ Ｄｅｔａｉｌｅｄ　Ｒｅａｓｏ　　　ｆｏ　　Ｈｏ１ｄｉｎ　　　　ｋ　ｏｆ　 Ｕｎｉｔ　　ｏｆ　　Ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ

Claims (46)

【特許請求の範囲】
1. １．抗原に対するモノクローナル抗体を製造するにあたり、 （ａ）無菌動物を該抗原で免疫して、抗体産生細胞に該抗原に対する抗体を生成 させ、 （ｂ）該無菌動物から該抗体産生細胞の一部分を取り出し、 （ｃ）抗体産生細胞の一種を不死化細胞と融合させることにより、前記抗原に対 するモノクローナル抗体を生産しうるハイブリドーマを形成させ、（ｄ）前記ハ イブリドーマを増殖させ、そして（ｅ）前記ハイブリドーマにより生産されたモ ノクローナル抗体を収穫する、 ことを含んでなる方法。
2. ２．前記無菌動物が抗原不含動物である請求の範囲１記載の方法。
3. ３．前記抗原不含動物がマウス、ラット、ブタ、モルモット、家禽、ヤギ、ヒツ ジ、霊長類およびウサギからなる群から選択される請求の範囲２記載の方法。
4. ４．前記抗原不含動物がマウスである請求の範囲３記載の方法。
5. ５．前記マウスがＢａｌｂ／ｃマウスである請求の範囲４記載の方法。
6. ６．抗原を抗体と接触させることからなる該抗原の存在を判定するためのイムノ アッセイにおいて、該抗体に無菌動物由来の抗体を用いることからなる改良。
7. ７．前記抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲６記載のイムノアッセイ。
8. ８．前記抗体が血清中のポリクローナル抗体である請求の範囲６記載のイムノア ッセイ。
9. ９．前記無菌動物が抗原不含動物である請求の範囲７または８記載の方法。
10. １０．前記抗原不含動物がマウス、ラット、ブタ、モルモット、家禽、ヤギ、ヒ ツジ、霊長類およびウサギからなる群から選択される請求の範囲９記載の方法。
11. １１．前記抗原不含動物がマウスである請求の範囲１０記載の方法。
12. １２．前記マウスがＢａｌｂ／ｃマウスである請求の範囲１１記載の方法。
13. １３．好適な担体と一緒にモノクローナル抗体をヒトに投与しそして該モノクロ ーナル抗体の局在を検出することからなるインビボで抗原を局在判定する方法に おいて、該モノクローナル抗体に無菌動物由来のモノクローナル抗体を用いるこ とからなる改良。
14. １４．前記無菌動物が抗原不含動物である請求の範囲１３記載の方法。
15. １５．前記抗原不含動物がマウス、ラット、ブタ、モルモット、家禽、ヤギ、ヒ ツジ、霊長類およびウサギからなる群から選択される請求の範囲１３記載の方法 。
16. １６．前記抗原不含動物がマウスである請求の範囲１５記載の方法。
17. １７．前記マウスがＢａｌｂ／ｃマウスである請求の範囲１６記載の方法。
18. １８．治療を必要とするヒトにモノクローナル抗体を投与することからなる、治 療的にモノクローナル抗体を利用する方法において、かかるモノクローナル抗体 に無菌動物由来のモノクローナル抗体を用いることからなる改良。
19. １９．前記無菌動物が抗原不含動物である請求の範囲１７記載の方法。
20. ２０．前記抗原不含動物がマウス、ラット、ブタ、モルモット、家禽、ヤギ、ヒ ツジ、霊長類およびウサギからなる群から選択される請求の範囲１９記載の方法 。
21. ２１．前記抗原不含動物がマウスである請求の範囲２０記載の方法。
22. ２２．前記マウスがＢａｌｂ／ｃマウスである請求の範囲２１記載の方法。
23. ２３．フィブリン特異的モノクローナル抗体。
24. ２４．不死化細胞をフィブリン特異的抗体を生産しうる細胞と融合させることに より生成された請求の範囲２３記載のモノクローナル抗体。
25. ２５．前記フィブリン特異的抗体を生産しうる細胞が抗原不含動物から得られる 請求の範囲２４記載のモノクローナル抗体。
26. ２６．前記抗原不含動物がマウスである請求の範囲２５記載のモノクローナル抗 体。
27. ２７．前記抗原不含動物がＢａｌｂ／ｃマウスである請求の範囲２６記載のモノ クローナル抗体。
28. ２８．前記不死化細胞がミエローマ細胞である請求の範囲２４記載のモノクロー ナル抗体。
29. ２９．前記ミエローマ細胞がマウスミエローマ細胞である請求の範囲２４記載の モノクローナル抗体。
30. ３０．前記モノクローナル抗体がハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ９７３９により産 生されたモノクローナル抗体の同定特性を有するモノクローナル抗体である請求 の範囲２３記載のモノクローナル抗体。
31. ３１．フィブリン特異的抗体を産生しうる細胞を不死化細胞と融合させることに より形成されたハイブリドーマからなる、フィブリン特異的モノクローナル抗体 を産生する連続細胞系。
32. ３２．ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＨＢ９７３９。
33. ３３．像形成剤または治療剤に接合された請求の範囲２３記載のモノクローナル 抗体。
34. ３４．好適な担体と一緒にモノクローナル抗体を投与しそして該モノクローナル 抗体の局在を検出することからなるインビボでフィブリン凝血塊またはフィブリ ン集塊の局在を確定する方法において、該モノクローナル抗体にフィブリン特異 的モノクローナル抗体を用いることからなる改良。
35. ３５．治療を必要とするヒトに血栓溶解剤と一緒にモノクローナル抗体を投与す ることからなる、血栓の治療に血栓溶解剤と一緒にモノクローナル抗体を利用す る方法において、該モノクローナル抗体にフィブリン特異的モノクローナル抗体 を用いることからなる改良。
36. ３６．治療を必要とするヒトに細胞毒剤と一緒にモノクローナル抗体を投与する ことからなる、フィブリンカブセル化腫瘍の治療に細胞毒剤と一緒にモノクロー ナル抗体を利用する方法において、該モノクローナル抗体にフィブリン特異的モ ノクローナル抗体を用いることからなる改良。
37. ３７．前記フィブリン特異的モノクローナル抗体が請求の範囲３０記載のモノク ローナル抗体である請求の範囲３４、３５または３６記載の方法。
38. ３８．フィブリノーゲン特異的モノクローナル抗体。
39. ３９．不死化細胞をフィブリノーゲン特異的抗体を生産しうる細胞と融合させる ことにより生成された請求の範囲３８記載のモノクローナル抗体。
40. ４０．前記不死化細胞がミエローマ細胞である請求の範囲３８記載のモノクロー ナル抗体。
41. ４１．前記ミエローマ細胞がマウスミエローマ細胞である請求の範囲４０記載の モノクローナル抗体。
42. ４２．前記モノクローナル抗体がハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ９７４０により産 生されたモノクローナル抗体の同定特性を有するモノクローナル抗体である請求 の範囲３８記載のモノクローナル抗体。
43. ４３．フィブリノーゲン特異的抗体を産生しうる細胞を不死化細胞と融合させる ことにより形成されたハイブリドーマからなる、フィブリノーゲン特異的モノク ローナル抗体を産生する連続細胞系。
44. ４４．ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＨＢ９７４０。
45. ４５．血漿フィブリノーゲンをモノクローナル抗体と接触させることからなるイ ンビトロ血漿フィブリノーゲンレベルを測定するためのイムノアッセイにおいて 、該モノクローナル抗体にフィブリノーゲン特異的モノクローナル抗体を用いる ことからなる改良。
46. ４６．前記フィブリノーゲン特異的モノクローナル抗体がハイブリドーマＡＴＣ ＣＨＢ９７４０により産生されたモノクローナル抗体の同定特性を有するモノク ローナル抗体である請求の範囲４５記載の方法。