KR0185295B1 - 피브리노겐-특이적인 항체 - Google Patents

Abstract

본원 발명은 단클론 항체를 생산하는 방법에 관계한다. 이 방법은 면역화된 구균동물을 이용한다. 또한 본 발명은 면역화된 무균 동물에서 유도된 단클론 항체와 다클론항체는 시험관 및 생체에서 임상적인 진단용 및 치료용으로 이용된다.

또한 본 발명은 피브린-특이적인 단클론 항체를 제공한다.

Description

[발명의 명칭]

피브리노겐-특이적인 항체

[기술분야]

본 발명은 단일클론의 항체의 제조방법에 관한 것이다. 본 방법은 면역된 무균동물을 이용한다. 본 발명은 또한 생체외와 생체내 임상학적 진단 및 치료를 목적으로 면역된 무균동물에서 수득된 이러한 단일클론의 항체와 다중클론의 항체를 사용하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 섬유소-특이한 단일클론의 항체를 제공한다.

[배경기술]

Kohler 와 Milstein는 첫 번째의 단일클론의 항체-생성 하이브리도마를 성공적으로 형성시킨 기술을 발명한 것으로 일반적으로 인식되고 있다 (G. Kohler and C. Milstein, 1975, Nature 256, 495-497; 1976, Eur. J. Jmmunol. 6, 511-519).

항체-형성세포(비장 B-임파구)를 골수종세포(뼈의 골수 원발성의 종양의 악성세포)로서 융합시켜서 단일의 융합된 세포 하이브리드(하이브리도마 또는 클론이라 칭하는)로부터 발생되는 하이브리드 세포 배양주를 발생시켰다. 이 하이브리도마는 임파구와 골수종 세포배양주의 두가지 모두의 어떤 형질을 유전하였다.

임파구와 같이 하이브리도마는 단일형태의 임뮤노글로빈을 분비하였고; 더욱이 골수종 세포와 같이 하이브리도마는 무한의 세포분열의 잠재력을 가졌다. 이러한 두가지 특징을 결합시켜 통상적인 항혈청 이상의 분명한 잇점을 제공하였다.

예방 접종한 동물로부터의 항혈청은 다중클론의 항체의 여러 가지 혼합물이며 이는 결코 똑같게 재생될 수 없다. 단일클론의 항체는 단일형태의 고도로 특이한 임뮤노글로빈이다. 하이브리도마로 분비된 단일형태의 임뮤노글로블린은 하나와 단 하나의 항원결정기에 또는 항원에서는 다수의 항원성 항원결정기를 가지는 에피토프에 특이성이 있다. 예를 들면, 만일 항원이 단백질이면, 하나의 항원성 항원결정기는 전체 단백질 분자중에서 많은 펩티드 배열순서중 하나가 될 수도 있다 (길이가 일반적으로 6-7아미노산; M.Z Atassi, 1980, Molec.Cell. Biochem. 32, 21-43) 여기서 단일항원에 대항하여 발생된 단일클론의 항체들은 이들의 형성을 유발한 항원결정기에 따라서 서로 별개의 것일 수도 있지만; 어떤 제시된 하이브리도마에 대해서는 이것이 생성시키는 모든 항체와 같다. 더욱이, 하이브리도마세포배양주는 생체외에서나 생체내에서 용이하게 번식되어서 극히 높은 농도로 단일클론의 항체를 수득한다.

단일클론의 항체를 탐침으로서 사용하여 그의 항원을 검출할 수 있다. 이와 같이 단일클론의 항체를 예를 들면 방사선 면역 검사법과 효소-결합된 면역검사법(ELISA)과 같은 생체외 진단과 예컨대 방사선 라벨이 된 단일 클론의 항체로 영상을 만드는 것과 같이 생체내 진단에 사용하였다. 또한 단일클론의 항체를 이러한 항체의 항원에 약물 투여하기 위한 담체로서 이용할 수가 있다.

그러나 단일클론의 항체를 이러한 목적으로 사용할 수 있기전에 단일클론의 항체가 예컨대 표적항원과 같은 문제의 항원에 결합 가능함이 필수적이다. 이 방법은 만일 있다면 어떤 하이브리도마가 표적항원에 결합할 수 있는 단일클론의 항체를 생성하는가를 측정하도록 형성되는 하이브리도마를 선별하여 실시한다. 이러한 선별방법은 예를 들면 표적항원을 결합시킬 수 있는 항체를 생성하는 하이브리도마를 확인하기전에 어쩌면 수천개의 단일클론의 항체를 선별해야 하는 것과 같이 매우 지루할 수 있다. 따라서, 하이브리도마가 표적항원에 결합하는 항체를 생성한다는 가능성을 증가시키는 단일클론의 항체의 제조방법을 개발할 필요가 있다.

[발명의 상세한 설명]

[발명의 요약]

본 발명은 다음을 포함하는 단일클론의 항체의 제조방법을 제공한다 :

(a) 무균동물에 항체-생성 세포가 전술한 항원에 결합하는 항체를 생성시키게 허용하는 전술한 항체로서 면역시키고, (b) 전술한 무균동물로부터 전술한 항체-생성 세포의 최소한 일부분을 제거하고, (c) 전술한 하이브리도마가 전술한 항원에 단일 클론의 항체를 생성시킬 수 있는 경우에 면역화 세포로서 전술한 항체-생성세포중 하나를 융합시켜 하이브리도마를 형성시키고, (d) 전술한 하이브리도마를 번식시키고, 그리고 (e) 전술한 하이브리도마에 의해서 생성된 단일클론의 항체를 수거한다.

본 발명은 또한 무균동물로부터 수득한 단일클론의 항체나 다중 클론의 항체를 이용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 단일클론의 항체를 이용하는 섬유-특이성 단일클론 항체와 방법을 제공한다.

[본 발명의 상세설명]

[무균동물]

본 발명은 단일클론의 항체를 제조하기 위하여 무균동물을 사용하는 것에 관련된다. 무균동물은 처음에 19세기말에 개발되었고 이후로 광범위하게 사용되었다.

무균동물은 박테리아, 비루스, 진균, 원생동물류 및 기타 기생사물이나 기생동물 형태를 비롯한, 모든 전치 가능한 관련형태의 생물에 없는 노토비오트(gnotobicote)이다. 노토비오트는 격리체 조건에서 그리고 만일 있다면 어떤 동물상과 식물상과 관련되는 조성물이 수용되는 현재의 방법론으로 완전히 정의되는 무균기술로 사육되고 계속 유지되는 계란의 무균부화 또는 무균 제왕절개에 의해서 수득되는 물이나 균주이다. (모든 쥐는 잠재성 백혈병 유발소 비루스를 보균하고 있으며 그러므로 무균이지만 이러한 백혈병 유발성 비루스가 있는 쥐는 본 발명의 목적에서 무균동물로서 간주한다는 것을 알아야 한다).

무균시스템의 요체는 불필요한 미생물 침입자에 대항하는 장벽을 제공하는 것이 된다. 이런 동물을 내포하는 플라스틱 금속, 고무 및 유리의 물리적 장벽 이외에도 이 시스템은 공기여과, 음식과 식수의 살균, 장갑을 끼고 하는 처치 등의 조작상의 장벽도 필요로 하며, 이는 장벽시스템의 완전한 부분을 형성한다. 또한, 격리체에 공급물을 넣을 때 살균조건에서 실시하여야 한다.

어떤 무균동물을 본 발명에 사용할 수 있다고 믿는다. 대부분의 통상으로 사용하는 동물은 새앙쥐, 돼지, 쥐, 토끼, 기니아돼지, 염소, 양, 영장류동물 및 가금이 되며 이중에서 새앙쥐가 바람직하고 특히 Balb/c 새앙쥐가 바람직하다.

[무균동물의 생산, 보호 및 유지]

무균동물의 생산, 보호 및 유지에 관련하여 많은 간행물이 발간되어 있다.

예를 들면 다음이 개시물이 있으며 이들은 여기서 참고로 제시한다. (Wostmann, B.S., Ed., Gnotobiotes: Standards and Guidelines for the Breeding, Care and Management of Laboratory Animals, National Research Council, National Academy of Sciences, Washington, D.C. 1970; Coates, M.E., et al., The Germfree Animal in Research, Academic Press, London, 1968; and Pleasants, J.R., Gnotobiotics, in Handbook of Lanoratory Animal Science, Vol., 1, Melby, E.C., et al., Eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 117, (1974) 다음은 무균의 쥐와 새앙쥐의 생산, 보호 및 유지를 기술하는 다음의 문헌에서 발기한 요약이다. (Wostmann, B.S. ed., (1970) Gnotobiotes Standards and Guidelines for the Breeding, Care and Management of Laboratory Animals, National Research Council, National Academy of Sciences, Washington, D.C.).

[실내환경]

설비, 장치 및 관리방법은 동물에 대해서 최대의 환결조절 그리고 최적의 안락과 복지를 제공하도록 설계되고 조작되어야 한다. 우리, 먹이 및 물은 식물과 식수가 용이하게 이용되고 그리고 세척과 소독을 실제적으로 효율적으로 하기 위하여 동물에 최대의 안락감을 주도록 설계하고 조립되어야 한다.

광범위한 무균 작업을 위한 바람직한 평면 계획은 다음의 구성 되어야 한다.

1. 격리기를 조립하고 살균할 수 있는 작업면적,

2. 격리기를 동물로서 유지시킬 수 있는 면적, 그리고

3. 노토비오트식 환경을 정기적으로 감시할 수 있는 실험실 면적.

평면계획에 사무실과 식이-제조 면적을 삽입하여야 한다.

노토비오트식 단리기를 유지하기 위한 실내환경은 통상적인 실험용 설치류 동물을 하우징하기 위해 설정된 표준을 충족시켜야 한다. 구조물은 곤충-방지되어야 하고, 벽과 마루는 습기를 방지 해야 한다. 조명은 년중을 통하여 같은 광도-어둠의 싸이클로 되어 균일해야 한다. 통풍은 화학적 살균으로 야기된 어떤 냄새나는 가스를 속히 제거해야 하고 기후는 아래에 제시한 것 같이 조절되어야 한다.

온도. 일반적으로 적용되는 21˚ -27˚C (70˚-80˚F)의 동물 실온은 22˚내지 26˚C(72˚내지 78˚F) 범위의 격리기 온도를 유지하도록 하향조절할 필요가 있다.

습도. 상대습도(RH) 는 40-60%의 사람 안락수준으로 유지되어야 한다. 그러나, 실내공기를 격리기를 통풍하는데 사용할 때에는 40-50% RH 가 적합하다.

통풍. 실내공기 변화는 화학 살균중에 발생한 어떤 냄새 가스를 급히 제거하는데 충분하여야 한다. 시간당 10 내지 15 공기변화를 권장한다. 신선공기-통풍장치가 달린 헤드 마스크를 써서 위험수준의 화학적 가스에 노출되는 사람을 보호할 수 있어야 한다.

무균장치(다음을 참조: See Sacquiet, E.1968, Equipment design and management: General technique of maintaining germ-free animals, p. 1-22 In M.E. Coates [ed]. the germfree animal in research. Academic Press, London; Trexler, P.C.1968. Equipment design and management: Transport of germ-free animals and current developments in equipment design, p.23-35 In M.E. Coates [ed.]. The germfree animal in research. Academic Press, London).

환경내의 미생물을 완전히 배제하려면 절대적 장벽을 필요로 한다. 격리기를 성공적으로 조작하려면 이 장벽을 항시 유지시켜야 한다. 일반적으로 금속과 플라스틱으로 된 두가지 형태의 격리기가 있다. 몇가지 금속제 장치는 20psi(1,406g/cm) 의 내부 증기압력을 견디도록 제작된다 (See Reyniers, J.A. 1959. Design and operation of apparatus for rearing germ-free animals. Ann. N.Y. Acad. Sci. 78:47; Miyakawa, M. 1959. The Miyakawa remote-control germfree rearing unit. Ann. N.Y. Acad. Sci. 78:37). 다른 것은 일반적으로 초기 살균목적의 대형압력솥에 넣는다 (See Gustafsson, B.E. 1959. Lightweight stainless steel systems for rearing germ-free animals. Ann. N.Y. Acad. Sci. 78:17).

유연한-필림의 격리기 (See Trexler, P.C., and L.I. Reynolds. 1957. Flexible film apparatus for the rearing and use of germfree animals. Appl. Microbiol. 5:406) 가 현재 가장 광범위하게 사용하는 장치이다. 이것은 통상적으로 유연한 적층물로 된 비닐로 만들고, 화학적으로 살균되어야 하고, 그리고 특이한 용도에 쉽게 적응시킬 수 있어야 한다. 또다른 형태는 나일론의 긴 튜브로 만들어지고, 각 단부가 매여지고 압력솥에서 살균할 수 있다 (See Lev, M. 1962. An autoclavable plastic unit for rearing animals under germfree conditions. J. Appl. Bacteriol 25:30). 플렉시글라스(Plexiglass) 격리기와 일회용 유연-필름장치도 또한 개발하였다. 이들의 대부분은 마루공간을 절약하도록 된 특징이 있는, 사료선반에 두,세개씩 쌓을 수 있도록 충분히 가볍다.

식품과 공급품을 살균하는 특별한 실린더는 일반적으로 열-민감성 단리기와 함께 사용한다. 이것은 고도-진공 압력솥에서 공기제거를 용이하게 하도록 큰 여과면적을 가지도록 설계되어야 한다. (See Trexler, P.C. 1963. An isolator system for control of contamination. Lab. Anim. Care. 13:572). 또한 이 실린더는 진공장치 없이도 살균중에 공기와 응축물을 대기중에 배출하기 위한 배수튜브를 장치할 수도 있다 (See Jaworski, N.E., and C.E. Miller.1963. Refinement of the cylinder technique for supplying germfree isolators. Lab. Anim. Care. 13:591).

[살균]

격리기에서 사용하는 모든 장치, 식품, 침구 및 공기는 철저하게 살균해야 한다. 사용하는 방법과 조건은 개개의 항목의 특성에 따라서 결정한다.

고압증기가 살균의 최적의 방법이다. 이것은 특별히 열안정성의 다공성 물질에 적합하다. 은신처 미생물로 모든 면적을 증기에 직접 접촉시켜야 한다. 노출시간은 사용하는 온도에 관련된다. 적치물(패키지의 중심)의 최소한의 접근부위가 121˚C(250˚F)에서 15분의 최소기간동안 노출하도록 권장한다. 고온이고 짧은 노출시간을 살균을 보장하는 주의깊은 시험후에 사용한다.

표준패키지 크기 및 식이물의 밀도, 침부 및 기타물질이 증기투과 시간이 일정하고 나타낼 수 있어야 함을 보장하는 것이 일차적으로 중요하다.

격리기용 공기공급의 살균에는 열공기 (dry heat)를 사용하였다 (See Miyakawa. M. 1959. The Miyakawa remote-control germfree rearing unit. Ann. N.Y. Acad. Sci. 78:37; Gustafsson, B.E. 1959. Lightweight stainless steel systems for rearing germ-free animals. Ann. N.Y. Acad. Sci. 78:17).

과아세트산(CH₃COOOH)을 얼-민감성, 비-다공성 재질, 특별히 유연한-필름 유닛에 광범위하게 사용한다. 이 산은 습윤제 세제와 함께 2% 용액으로 사용한다 (See Trexler, P.C., and L.I.Reynolds. 1957. Flexible film apparatus for the rearing and use of germfree animals. Appl. Microbiol. 5:406). 예컨대 액체트랩에 든 차아염소산염, 요오도포르(iodophor) 또는 사차암모늄 화합물과 같은 다른 화학약품을 부화전에 살균조건에서 계란에 주입하는 것 같은 특별한 상태에서 사용할 수 있다.

산화에틸렌(ETO)은 비습윤성 열-민감성 물품을 살균하는데 사용할 수도 있다. 살균시간은 ETO의 온도, 습도, 압력 및 농도에 따라 변한다. ETO는 침구와 식이성분과 화학적으로 반응하여 독성이나 불필요한 화합물을 생성한다. 인화성과 독성유해성 때문에, 살균목적으로 ETO의 정기적 사용은 ETO를 20% 이상 포함치 않는 시판물에 한정한다.

섬유 유리 여과기를 공기공급의 살균용으로 통상적으로 사용한다. 이들은 절대여과기로서의 역할을 한다.

액체의 막여과는 이러한 막이 예컨대 직경이 0.22㎛ 이상의 입자를 배제하는 여과기인, 절대여과기인 조건에서 열에 대한 노출을 피하는데 사용할 수 있다.

감마선이나 전자-비임 공급원에 의한 조사를 식이 또는 기타 특별한 물품을 살균하는데 사용할 수도 있다. 투여량은 2.5 내지 6×10⁶라드로 변하였다.

[내부환경]

온도. 내부 격리기 온도는 실내환경의 함수이며 22˚내지 26˚C(72˚내지 78˚F)의 범위로 유지되어야 한다.

습도. 격리기를 과부하, 부적합한 통풍 또는 양자 모두의 경우에 수분을 응축시키는 처리를 한다. 격리기로 들어가는 공기는 50% RH 이하와 바람직하게는 40% RH 이상이어야 한다.

공기공급. 격리기는 시간당 12 내지 20의 공기교환이 있고 3-5인치(8-13cm) 수두의 정압이어야 한다. 공기는 중앙 공급원이나 또는 각 유닛트에 대해서 개개의 송풍기로부터 공급될 수도 있다. 터빈-형태의 공기 압축기를 중앙 공기 공급 시스템용으로 권장하는데 그 이유는 기름 피스톤 형태는 공기공급 배관으로 기름을 분사시키는 경향이 있기 때문이다.

공기확산 격리기(See Trexler, P.C. 1968. Equipment design and management: Transport of germ-free animals and current developments in equipment design, p.23-35 In M.E. Coates [ed]. The germfree animal in research. Academic Press, London)를 정전의 경우 통풍의 손실을 일으키지 않는다. 그러나, 이런형태는 시간당 공기교환이 적은 결점이 있어서 장벽에 적은 파열이 발생할 경우 오염방지에 도움이 되는 보호성 정압이 부족한다.

비상안정장치. 정전이나 기계고장의 경우 격리기속의 공기압력을 유지하기 위한 적절한 조처를 공기공급에 수분이내의 단절이상이 없도록 해야한다. 비지지 필름 격리기의 붕괴도 결과적으로 동물의 질식을 초래하지만, 보다 긴급한 위험은 동물이 필름이나 글로브에 도달하여 손상을 입히는 것이 된다. 이것은 고무마개로서 공기도관을 막아서 임시로 방지한다. 개개의 격리기 공기공급의 조작은 비상전기 공급만을 필요로 한다. 중앙 공기공급은 스탠드 바이 공급을 위한 제2 터빈 압축기를 가져야 한다.

온도와 압력을 그래프식으로 기록하는 것을 권장한다. 시청악 경보장치를 정전이나 기계고장의 어느 한 경우에 도관압력의 하락으로 작동되도록 중앙 공기시스템에 삽입시켜야 한다. 유사한 경보 시스템은 공기공급의 온도에서 불필요한 요동을 나타낼 수 있어야 한다. 개개의 격리기 공기 시스템에 대해서, 실내환경의 계속적 그래프식 감시를 권장한다.

[케이징(caging) 및 내부장치]

장치. 격리기용 장치의 기본 명세는 안전뚜껑이 달린 케이지, 물병과 식품호퍼, 고무장갑용 보호천장갑, 추가의 창가스겟 또는 캡폐쇄링, 길다란 고무-경사장치된 핀셋, 지혈겸가, 가위, 타올, 가제스폰지, 계기를 잡아주는 2/4 갈론 캔, 뚜껑덮힌 4/4갈론 식이품 캔, 스푼, 배양튜브, 종이백, 더러운 침구용 수분방지백을 포함한다.

케이지는 평활한 내식성 재질로 조립하여야 한다. 이들은 액체에 대해 불통이어야 하고 쉽게 소독할 수 있어야 한다.

사용가능한 것으로 간주되는 재질은 플라스틱, 스테인리스강, 및 유리를 포함한다. 아연도금한 금속이 부식하였으므로 미량의 금속오염도 실험결과에 영향을 미치므로 추천할 수 없다.

케이지 크기는 통상적으로 출입배출구의 크기에 따라 제한을 받는다. 암컷 새앙쥐와 돼지 새끼에 대한 최소면은 50in²(970cm²) 이 된다. 많은 경우에서 마리당 더 큰 공간을 필요로 할 수도 있다.

표 1은 중량별로 분류한 새앙쥐와 쥐에 대해서 마리당 제시된 마루공간을 제시한다.

[여러 가지 권고]

소량누세를 알아내는 프레온 시험은 경계 시스템의 완전성을 보장하도록 권고한다.

각 유닛은 그의 조립시와 소독시부터의 유닛을 포함하는 모든 과정의 경시적 기록을 유지하는 그 자체의 조작일시가 비치되어 있어야 한다. 이러한 기록은 격리기 번호가 확인된 금속체 병원-차트 호울더에 편리하게 보관한다. 이들은 또한 예컨대 장갑 교체와 같은 정기보수의 기록도 포함하여야 한다. 사육-성능 기록도 같은 차트호울더에 보관하여야 한다.

격리기내의 살수 있는 공간이 한정된 때문에 종이와 호울딩 용기는 식이품과 침구, 그리고 소독통과와 연결된 격리기간의 동물의 이동에 대해서도 권장한다.

격리기내에서는 에테르를 사용해서는 아니되는데, 그 이유는 정전기 스파크가 발생될 때 폭발의 위험성이 있기 때문이다.

플루오탄(fluothane) 브로모클로로트리풀루오로에탄은 휘발성, 난연성 마취제로서 권장한다.

[식품, 침구 및 물]

[일반사항]

상업적으로 제조된 식품에 대한 완전한 형태는 방부제, 산화방지제 및 기타 첨가제를 포함하는 모든 성분과 농도를 제시하도록 제공되어야 한다. 제조년월일도 분명하게 나타내어야 한다. 제조자는 식품이 다음이 되도록 보증하여야 한다 :

1. 천연으로 발생하는 호르몬 활성도의 정상적인 허용범위내 이고,

2. 비정상적인 생리학적 조건을 유발하거나 또는 연구방법과 관련되는 약물, 호르몬, 항생물질 또는 기타물질을 함유하는 첨가제가 없고,

3. 통계적으로 선택된 시료를 기준한 살모넬라균이 없고,

4. 설치류 동물과 해충이 없고,

5. 병원균을 포함하는 정제하지 않은 육류 찌거기나 생선 음식이 전혀없다.

[식품의 영양가 강화]

무균동물의 식품은 비타민(특히 어떤 비타민 B 및 비타민 A와 D)의 그리고 단백질(수득되는 리신, 메티오닌, 아르기닌 및 트립토판의 감소)의 영양값의 열-살균 손실을 보충시킬 어떤 영양소의 정상적 요구량 이상을 포함하여야 한다. 또한 이들은 소요의 영양소를 제공해야 하는데, 이는 통상적인 동물에서 내장관에서 미생물적 합성을 통하여 수득한다 (See Reddy, B.S., B.S., Wostmann, and J. R. Pleasants. 1968 Nutritionally adequate diets for germ-free animals, p. 87-111 In M.E. Coates [ed]. the germ-free animal in research. Academic Press, London).

이러한 식품의 한 예는 L-485인데 이는 광범위하게 시험하고 (See Kellogg, T. F. ,and B.S. Wostmann. 1969. Rat and mouse stock diet L-485. Lab. Anim. Care). 상업적으로 제조할 수 있는(표2참조) 값싼 식품이다. 단백질의 총함량의 증가보다는 오히려 특이한 아미노산을 보충하여 단백질 품질에 손질을 보충시키는 수단이 되는 것으로 간주한다. 식품의 총단백질 함량을 증가시키면 물의 흡수와 배설이 증가하여 습윤상태로 만들어서 제한된 크기의 격리기속에 넣을 수 있는 동물의 마리수를 제한한다.

증기살균 (See Reddy, B.S., B.S., Wostmann, and J.R. Pleasants. 1968 Nnutritionally adequate diets for germ-free animals, p.87-111 In M.E. Coates [ed]. the germ-free animal in research. Academic Press, London).

실제 방법은 구득가능한 장치에 따라서 변한다. 세가지 인자가 일반적으로 중요하다:

1. 가능하면 최소한 20인치 Hg의 진공의 예비-살균이 대기로 배기되는 솥이나 실린더에서 식품을 증기 투과시키는데 도움을 준다. 실린더 공급을 대기로 배기시키지 않을 때에는 28인치 Hg의 진공이나 그이상을 권장한다.

2. 장치와 기능에 의해서 나타낸 추가의 안전성 여유를 가지고 전체적 살균을 보장하는 최단시간의 살균단계의 사용. 식품의 내부핵에서 측정된 온도는 최소한 121˚C(250˚C)에 도달하여야 한다. 이 온도에서 실제 살균단계는 최소한 15분이 되어야 한다.

더 높은 살균온도에서는 살균시간은 비교적 더 짧아진다.

3. 살균 후 진공은 식품의 온도하강을 가속화한다. 이것으로 영양분이 불필요하게 파괴되는 것을 피하게 된다. 그러나 장치의 설계와 성능보장은 이 단계의 조업중에 누세를 피하게 하는 것이 적합하다.

식품의 증기 살균에서, 불완전한 살균과 지나치게 오랫동안 가열하여 야기되는 불필요한 영양분 파손의 두가지 모두를 피하는 것이 목표가 된다. 비록 어느 정도의 영양분 손실이 불가피하다 하더라도, 다음을 조작하여 매우 만족스러운 결과를 얻을 수도 있다:

(a) 온도, 시간, 예비-살균 및 후-살균 진공 그리고 펠릿크기와 같은 기술적 방법.

(b) 식품의 수분함량. 수분함량이 증가하면 살균후의 B비타민의 회수가 양호해진다 (See Zimmerman, D.R., and B.S. Wostmann. 1963. Vitamin stability in diets sterilized for germfree animals. J. Nutr. 79:318). 고체식품에 대해서는, 25% 이하의 수분함량 또는 식품의 저장품에 적합할 정도로 높은 수분을 권장한다. 식품중의 수분함량의 변화가 있으면 식품이 살균온도에 도달하는 속도에서 새로운 시험을 하여야 한다. 방사선 살균 (See Reddy, B.S., B.S. Wostmann, and J.R. Pleasants. 1968. Nutritionally adequate diets for germ-free animals, p.87-111 In M.E. Coates [ed]. The germ-free animal in research. Academic Press, London; Ley, F.J., J Bleby, M.E. Coates, and J.S. Paterson. 1969. Sterilization of laboratory animal diets using gamma radiation. Lab. Anim. 3:221).

기술과 방사량계는 방사선의 장치와 형태에 따라서 변한다.

일반적으로 비록 방사선 살균이 영양분을 덜파괴시키는 것으로 간주되었지만 현재에는 식품을 증기로서 살균하는 것을 권장한다.

[살균에 대한 시험]

특이한 살균방법으로 성취한 살균을 감시하기 위하여 바실루스 스테아로테르 모필루스(Bacillus stearothermophilus) 포자띠를 사용하는 것을 권고한다.

이 띠는 식품의 코아속에 끼어넣어야 한다. 또한 격리기와 이의 동물은 주기적으로 미생물학적으로 감시 하여야 한다. 이러한 감시는 격리기 장벽의 파열이나 격리기 또는 이의 함유물의 부적절한 살균에서 유발되는 돌발적 오염을 시험하는데 필요하다. 이 시험은 다음에 기술된 것 같이 실시할 수 있다(Wostmann, B.S., Ed., Gnotobiotes: Standards and Guidelines for the Breeding Care and Management of Laboratory Animals, National Research Council, National Academy of Sciences, Washington, D.C., 1970, p28-39).

[살균시의 영양소 손실의 추정]

생명유지용 영양소의 손실에 대한 유용한 점검으로서, 식품에 첨가된 티아민의 회수의 지시계로서의 산-추출가능한 티아민의 측정을 권장한다(See Wostmann, B.S. and P.L. Knight. 1960. The effect of methyl alcohol on the conversion of thiamine to thiochrome. Experientia 16:500). 25% 이하의 회수는 식품의 일반적 영양소 품질의 심각한 손상을 나타낸다. 적절한 장치를 사용하고 주의를 기울이면, 50% 또는 그 이상의 회수를 얻을 수 있다.

[고체식품의 저장]

일반적으로 무균실험에 비용이 많이 들기 때문에 영양가가 현저히 감소된 식품을 결코 사용치 않도록 특별한 주의를 기울여야 한다. (a) 살균하지 않은 식품은 항상 냉동으로 저장해야 하고 결코 1개월 이상 저장해서는 아니되며, 그리고 (b) 격리기속에서의 살균한 식품의 저장기간은 1주일이나 그이하가 되어야 하고 그리고 10일을 초과해서는 아니된다는 것을 권장한다.

[침구]

침구는 최소한 일주일에 한번씩 교환해야 한다. 권장하는 바는 침구재질은 용이하게 살균하고 동물이 용이하게 먹을 수 있어서는 아니된다. 살균과 정의 결과로서 독성화합물이 생겨서는 아니된다. 먼지없는 백송칩(톱밥)과 대패밥을 추천한다. 참피나무와 포플과대패밥이나 파쇄 옥수수속이 적합하다. 규조토제품, 샴푸, 수지함유하는 나무 및 단단한 제목을 피해야 한다.

산화에틸렌 살균은 유해화합물의 형성가능성의 문제가 해결될 때 까지는 사용헤서는 아니된다.

[물]

음료수는 소독해야 한다. 음료수는 사각형 팩플라스크(pack flasks), 메이슨(mason) 항아리 또는 이 장치에 부착된 탱크에 든 압력솥이 될 수도 있다. 작은 공기공간을 각 용기속에 남긴다.

[그노토비오트의 제왕절개 유도의 원리]

어떤 제왕절개 수술의 성패는 부분적으로 만기전의 임신을 가지는 것에 좌우된다. 이것은 특별히 태아가 분만된 최종 24시간내에 그 중량의 20%를 얻는 경우의 짧은 임신기간의 동물에 대해서 사실이다. 시간이 맞는 짝지음이 이치상으로는 성공적이 되지만, 한배 새끼가 많은 동물(쥐와 새앙쥐)의 경우에는 절개수술을 진행시키기 전에 암놈이 첫 번째 새끼를 분만하도록 기다리는 것이 도움이 될 수도 있다. 기니아 피그에서, 대부분의 만족스러운 방법은 치골의 퍼짐을 측정하여 수술용 암놈을 선택하는 것이다(See Philips, B.P., P.A. Wolfe, and H.A. Gordon. 1959. Studies on rearing the guinea pig germfree. Ann. N.Y. Acad. Sci. 78:183).

제왕절개로 얻는 새끼는 첫 번째 호흡을 하기전에 무균환경에 분만되어야 한다. 이들은 절개된 무균장벽막을 통하여 무균격리기속으로의 제왕절개에 의하여, 또는 살균제가 있는 트랩을 통하여 무균격리기속으로의 자궁절제술에 의하여 모체로부터 직접 취할 수도 있다.

제왕절개수술전에 암놈에 대한 유용한 수술준비는 복부 털의 제거와 수술부위의 세척 및 소독을 포함한다.

마취는 비록 복부 중심선의 국소 마취 또는 일반적 마취도 또한 태아에 심각한 수준의 기능저하와 치사율을 초래함이 없이 사용할 수도 있지만, 쥐와 새앙쥐의 경부척추를 전위시켜 바람직하게 실시한다. 기니아 돼지에서, 수술은 일반적으로 진정 전후와 국소마취로 실시한다.

장벽막을 통하는 제와절개에 의한 새끼의 분만은 특수한 격리기 장치를 필요로 한다. 레미니르(Reyniers) 스테인리스-강 수술장비(See Reyniers, J.A, 1965. Germfree life methodology (gnotobiotics) and experimental nutrition. p.458-466 In Proc. 3rd Internat. Congr. Biochem., Bruxelles)를 장치의 상하격실을 분리시키는 조립된 수평 금속 분리기를 가진다.

이 분리기는 상부격실을 완전하게 유지하도록 마일라 플라스틱 필름으로 덮힌 원형부분을 포함한다. 수술할 수 있도록 준비된 암놈은 마일라로서 프레스된 복부를 가진 상태로 아래격실에 넣는다. 모든 수술기구는 상부격실에 준비하고, 수술은 이러한 살균면에서 실시한다. 절개는 전기소작기나 메스로서 플라스틱과 피부를 통해 실시한다. 자체-살균 전기소작기 칼날이 피부절개에 바람직하다. 피부와 메스의 가장자리는 함께 클램프하고 재귀시킨다. 살균포장은 복부위에 놓아서 피부의 절단 가장자리를 덮도록 하고 따뜻한 소독(염화벤즈알코늄 1:1000)을 복구공동을 열기전에 노출된 치상막에 바른다. 장속까지 절단되지 않도록 매우 조심을 해야 한다. 복강벽과 내장 사이에 한쌍의 겸자나 지혈겸자를 삽입하면 도움이 된다. 다음에 자궁을 열고 새끼를 꺼낸다. 태아막을 제거하고 탯줄을 클램프하고 절단한다. 새끼를 서서히 말리고 맛사지하여 호흡을 자극한다. 다음에 새끼를 후부장치로 옮겨서 유모에게 맡겨 먹이가나 손으로 먹인다. 메스의 또다른 시이트를 수술 배출구에 고정시키고 오염되는 심각한 위험이 없이 5 또는 6마리 정도의 암컷으로 위의 방법을 반복하였다. 또한 제왕절개분만은 수술장치로서 플라스틱 격리기나 장갑백을 사용하여 실시할 수도 있다. 격리기 마루의 외측표면을 예비 살균하고 동물의 복부에 접촉시키고, 이렇게 하여 위에서 기술한 것과 같은 메스 시이트와 같은 목적을 달성한다.

수술한 다음에 플라스틱 장벽속의 틈새를 살균한 테이프로 밀폐하고 다른 새끼 밴 암컷에 대해서 수술을 반복한다.

제왕절개에 의한 새끼의 분만은 플라스틱 격리기를 사용할 때에 더욱 보편화 되어있다. (See Foster, H. 1959. A Procedure for obtaining nucleus stock for a pathogen-free animal colony. Lab. Anim. Care 9:135). 자궁을 무균상태에 노출시키고 자궁경의 바로 앞에서 클램프한다. 절제된 자궁은 액체의 살균트랩을 통하여 무균장치로 옮긴다. 일단 격리기 안에 들면 새끼는 가능한한 빨리 분만하여 태아액의 흡입을 방지한다. 정상적으로는 새끼를 말리고 호흡을 시키고 탯줄을 클램프하고 절단한다.

다음에 유모에게 맡기거나 인공으로 사용한다.

제왕절개수술은 새앙쥐, 쥐 및 돼지에 대해서 성공적으로 이용된다. 그러나 기니아 돼지의 경우에는, 제왕절개가 바람직한데, 그 이유는 모체의 혈액공급과 격리기 속의 분만의 분리간의 2분 정도만 경과하면 치사율이 높기 때문이다.

[노토비오트 집단에서의 사육 시스템근친교배 균주]

통상적인 사육집단에서 사용하는 통상적인 형제X자매 교배 시스템은 또한 노토비오트 집단에서 사용할 수가 있다.

[근친교배 않은 종]

실제의 무작위 번식에는 동포와 첫째 사촌의 몇가지 교배를 포함한다. 비록 이러한 교배는 정상적으로는 비근친 번식 집단에서는 피한다 하더라도, 수득되는 교배 시스템은 근친교배의 율을 가능한 최대정도까지 감소시키지는 않는다. 최소 비근친의 어떤 시스템을 사용할 수 있다 (See Falconer, D.C. 1967. Genetic aspects of breeding methods. p. 72-96 In The UFAQ handbook on the care and management of laboratory animals, 3rd ed. E.and S Livingstone, LTd., London; National Research Council, Institute for Laboratory Animal Resources. 1969. A guide to genetic standards for laboratory animals. National Academy of Sciences, Washington, D.C.).

[비교되는 전형적 및 노토비오트 집단]

만일 비교의 목적으로 통상적인 것과 노토비오트식 집락의 두가지 모두를 유지하기를 바라면, 이들의 유사한 유전자 성분은 통상적인 집락의 효과적인 번식 모집단에서 얻은 제왕절개 동산군(litters)을 노토비오트 집락속으로 주입하여 유지할 수도 있다.

이것은 노토비오트가 아닌 쥐와 새앙쥐의 생산을 가장 강조하지만 단순한 미생물학적 감시가 되는 미생물학적 혈통표의 형성을 방지하는 결점이 있는 제조방법의 선택으로 보인다.

이상적으로는 이 방법은 통상적인 집락에 대한 사육종으로서 특이한 교배에서 얻는 동산군을 사용하고 그리고 노토비오트 집락에 사육종으로서 이러한 교배의 각각에서 얻는 사육종으로서 이러한 교배의 각각에서 얻는 다음의 동산군을 사용하여 실시 할 수 있었다. 만일 이 방법의 다음에 모든 제 2 또는 제3세대를 실시하면, 두가지 집락 모두의 유전자 성분은 매우 유사하게 남아야 하는데, 다만 각 집락에 대해서 같은 교배 시스템을 사용해야 한다는 조건부가 따른다.

또한, 노토비오트 집락의 효능있는 사육 모집단에서 얻는 동산 종을 통상적인 집락을 형성하거나 새로 보충하는데 사용할 수도 있다. 유전자 결과는 같은 방법을 따르는 한, 동일하게 된다.

기록-보관 (See Wolff, G.L. 1967. Practical mating systems and record-ke eping in a breeding colony. p.laboratory animals, 3rd ed.E. and S Livingstone, Ltd., London).

적절한 기록은 동물을 위해서나 그리고 격리기의 유지관리를 위해서 보관하여야 한다.동물에 대한 기록으로 동물의 조작의 효능과 생물학적 성능을 측정한다. 격리기 기록은 만일 오염사태가 발생하면 장벽을 파괴를 시킬 장소 결정에 도움을 주도록 격리기와 관련되는 사건의 역대기를 유지하여야 한다.

[항원-없는 동물]

본 발명의 바람직한 구체예에서, 화학적으로 정의된 (chemically defined)(CD), 저분자량의, 수용성, 한외여과된 식품에서 무균동물을 사육하는 것이 바람직하다. 이러한 식품으로 동물에 의한 영양분과 항원 섭취를 완전히 조절하는 것이 가능케된다고 믿어진다. 이러한 식품은 일반적으로 예컨대 아미노산, 단당, 지질, 비타민 및 무기물과 같이 화학적으로 정의할 수 있는 성분의 전부로서 만든다. 본 발명이 목적으로 화학적으로 정의된 식품은 아미노산, 단당, 지질, 비타민 및 무기물을 포함하며 분자량이 10,000달톤이상이 다른 성분은 포함치 않는다. 이와 같이, CD식품의 모든 성분은 저분자량이고 동물에서 자연적으로 순환되는 영양분이며 그러므로 이러한 성분은 면역응답을 자극하지 않는 것으,로 믿어진다. 최근의 문헌은 항원-없는 동물로서 CD식품에서 사육한 무균동물을 거론한다.

또한, 여과지 침구를 사용하는 것이 바람직한데, 그렇지 않은 경우에는 무균동물이 침구를 먹어서 면역응답을 유발케된다.

여과지 침구를 먹는 경우에는 면역응답을 유발치 않는 것으로 믿어진다.

어떤 종에 대한 특별한 CD 식품은 이러한 종에 대해서 공지된 영양요구량을 충족시키는 비율과 양으로서 이러한 성분을 사용한다. 무균새앙쥐용의 바람직한 CD식품의 조성과 제조는 다음과 같다 :

이용액을 5˚C로 냉각하고 두가지 모두를 한외여과 목적으로 모았다.

1. 표 3에 제시한 염35D 혼합물의 조성물

2. 염 35D에 아셀렌산 나트륨을 첨가한 이외에 첨가된

3. 표 4에 제시한 것같은 비타민 B 혼합물 11E5의 조성물

4. 비타민 B 혼합물 111E5에 비타민 B-12를 첨가한 이외에 첨가된 (다음의 실시예 참조)

이러한 조성물은 새앙쥐나 쥐 ad libitum에 주입한다.

* 는 정상 성인 투여량의 2배를 맞는 새앙쥐를 가리킨다.

1은 다음으로 구성됨 : 12% 팔미트산염, 1.5% 스테아린산염, 24% 올레인산염, 55% 리놀산염, 8% 리놀산염

CD식품의 상세한 기술은 여기서 참고로 제시하는 다음을 참조(Pleasants, J.R., et al., J.Nutr.,116, 1949-1964 (1986). Pleasants, J., et al., Germfree Research : Microflora Control and Its Application to the Biomedical Sciences, B.S.Wostmann, Ed., p.87, Liss, New York (1985); Wostmann, B.S., et al., J.Nutr., 112, 552 (1982); and Pleasants, J.R., et al., J.Nutr., 100, 498 (1970).

[단일클론의 항체의 제조]

다음에 무균의 동물을 단일클론의 항체의 제조에 사용한다.

무균 시스템은 비무균상태의 동물이 생성하는 어떤 항원에 대해서 단일클론의 항체를 제조하는 데 사용할 수 있다. 항원의 예시적 일람 표는 미국특허 제 3,935,074호에 나타나 있다. 그러나, 무균동물이 이 항원에 대해서 크게 증대된 면역응답을 제공하는 것으로 믿어진다. 이와 같이, 이 항원의 특이한 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 생성하는 B-임파구의 위치선정의 유사성을 증가시킬 수 있다. 이것이 본 발명의 주요장점이 된다. 또한 무균시스템이 다수의 에피토프를 가지는 이러한 항원에 대해 고도로 특이한 항체를 발생시키는데 특별히 유용하다고 믿어진다.

무균동물은 표준기술로서 면역시킬 수가 있다. 그러나, 무균동물은 각 면역 사이에 최소한 약 3주간의 간격을 두고 다음에 예비융합을 강화하여 최소한 세번면역시키는 것이 바람직하다. 이렇게 면역 수준의 증가는 것이 필요한데 그 이유는 관습적으로 두 번 면역시킨 후에 바람직한 1gG분비 B-임파구가 아닌 대부분이 IgM분비 B-임파구가 관찰되기 때문이다.

[체세포]

항체, 특별히는 B임파구를 생성시키는 잠재력 있는 무균동물의 체세포는 B-세포골수종계에 의한 융합에 적합하다. 분할되는 형질아구 단계에 있는 이러한 항체-생성 세포는 바람직하게 융합된다. 체세포는 프라임된 무균동물의 임파선종, 비장 및 말초혈액에서 얻고 그리고 임파관세포의 선택은 특별한 융합시스템에서의 경험적 유용성에 크게 의존한다. 그러나 비장에서 얻는 체세포가 일반적으로 바람직하다. 일단 프라임되거나 고도로 면역된, 무균의 동물을 항체-생성 임파구의 공급원으로서 사용할 수 있다. 새앙쥐의 임파구조 다음에 기술된 새앙쥐 골수종계로 안전하게 고도로 융합한다. 그러나, 다른 무균동물에서 얻는 항체-생성 세포의 사용도 또한 가능하다.

특별한 무균동물의 선택은 항원의 선택에 관련되는데, 그 이유는 무균동물이 이러한 항원에 대한 항체를 생성시킬 수 있는 B-임파구의 반복에서 B-임파구를 가지는 것이 반복에서 B-임파구를 가지는 것이 필수적이기 때문이다.

[죽지않는 세포]

특이한 골수종세포배양주는 하이브리도마-생성 융합법에서 사용하기 위해 임파구 종양으로부터 개발하였다(G. Kohler and C.Milstein, 1976, Eur. J. Immunol. 6:511-519; M. Schulman et tal., 1978, Nature 276:269-270). 이러한 세포배양주는 최소한 세가지 이유로서 개발하였다. 첫째이유는 융합된 골수종 세포의 선택을 용이하게 하는 것이다. 통상적으로, 이것은 하이브리도마의 성장을 지원하는 어떤 선택적 배지에서 성장할 수 없게 하는 면역 결핍증이 있는 골수종을 사용하여 실시한다.

두 번째 이유는 임파구 종양세포가 그자체의 항체를 고유한 능력에서 비롯된다. 단일클론의 기술을 사용하는 목적은 하이브리도마의 체세포 성분으로 유전학적으로 지정된 소요의 단일의 특이한 항체를 생성시키는 죽지않는 융합된 하이브리드 세포배양주를 얻는 것이다. 하이브리도마에 의한 종양세포 항체의 생성을 배제하기 위하여, 경질이나 중질의 임뮤노글로블린 시슬 또는 항체분비 메카니즘을 생성시킬 수 없는 골수종 세포 배양주를 사용한다. 이러한 세포배양주를 선택하는 세 번째 이유는 융합시의 안전성과 효율이 된다.

여러개의 골수종 세포배양주를 모두 새앙쥐에서 얻는 NS-1, X63-Ag8, NIS-Ag 4/1, MPC11-45, 6TSG1.7, X63-Ag8.653, Sp2/0-Agf14, FO 및 S194/5XXO.Bu.1 그리고 쥐에서 얻는 210-RCY3.Ag1.2.3를 포함하는 융합된 세포 하이브리드의 생성에 사용할 수 있다.(G.J. Hammerling, U.Hammerling and J.F. Kearnly, eds., 1981, Monoclonal antibodies and hybridomas In J.L. Turk, eds. Research Monographs in Immunology, Vol. 3,Elsevier/North Holland Biomedical Press, New York).

[융합]

항체-생성하는 비장이나 임파선종 세포 그리고 죽지않는 세포의 하이브리드를 발생시키는 방법은 일반적으로 세포막의 융합을 촉진시키는 약제나 약제들(화학, 비루스 또는 전기)의 존재하에 뇩 20:1 내지 약 1:1의 범위로 변할 수 있는 비율로 죽지 않는 세포로서 체세포를 혼합하는 것을 포함한다. 융합과정에서 사용되는 체세포와 죽지않는 세포의 공급원으로서 같은 종의 동물을 사용하는 것이 종종 바람직하다. 융합 방법은 Kohler와 Milstein (1975, Nature 256 : 495-497; 1976, Eur. J. Immunol. 6 : 511-519), Gefter et al. (1977, Somatic Cell Genet. 3 : -231-236) 및 Kozbpr et al., (1983, Immunology Today, 4, 72)에 기술하였다.

이들 연구자들이 사용한 융합-촉진제는 각각 센다이 비루스와 폴리에틸렌글리콜(PEG)이었다. 최근에 개발한 EBV-형질전화 기술(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., p. 77-96).

[클론의 단리와 항체검출]

융합방법은 일반적으로 약 1 x 10^-6내지 1 x 10^-8의 매우 낮은 빈도의 가변성 하이브리드를 생산한다. 수득되는 가변성 하이브리드의 매우 낮은 빈도 때문에, 나머지의 융합안된 세포, 특별히는 융합안된 골수종 세포에서 얻는 융합된 세포 하이브리드를 선택하는 수단을 가지는 것이 필수적이다. 기타의 수득되는 융합 세포 하이브리드중에서 소요의 항체-생성 하이브리도마를 검출하는 수단도 또한 필요하다.

일반적으로 융합된 세포는 예를 들면 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 HAT 배지와 같은 선택성 배지에서 배양한다.

HAT 배지는 하이브리드 세포의 증식을 허용하고 정상적으로는 무한한 분할을 계속하는 융합안된 골수종세포의 성장을 억제한다.

아미노프테린은 테트라히드로플레이트의 생성을 억제함으로서 푸린과 피리미딘 합성을 차단한다. 티미딘을 첨가하면 피리미딘 합성에서의 차단을 우회하고 한편으로 히포크산틴이 배지에 포함되어서 억제된 세포가 누클레오티드의 폐품이용 통로를 이용하여 푸린을 합성할 수가 있다. 사용된 골수종 세포는 히포크산틴 포스포리보실 전이효소(HPRT)가 부족한 돌연변이체이고 그리하여 폐품이용 통로를 사용할 수가 없다. 살아남은 하이브리드에는 B임파구가 이러한 효소를 생성하는 유전자 정보를 공급한다. B임파구 자체는 배양시에 제한된 수명기간(대략 2주간)을 가지기 때문에, HAT 배지에서 증식할 수 있는 유일한 세포는 골수종과 비장세포에서 형성된 하이브리드가 된다.

하이브리드에 의해 분비된 항체의 선별을 용이케하고 개개의 하이브리드가 과잉생장하는 것을 방지하기 위하여, 융합된 골수종과 B-임파구의 혼합물을 HAT 배지에서 희석시키고 미량적정 형판의 다수의 웰에서 배양한다. 2내지 3주후에 하이브리드 클론이 현미경으로 볼 수 있게 되면 하이브리드 클론을 포함하는 개개웰의 상청액을 특이성 항체 생성의 검사를 실시한다.

이 검사는 민감하고, 간단하고, 신속하여야 한다. 검사 기술에는 방사선 면역검사법, 효소면역검사법 세포독성 검사법 및 형판검사법이 포함된다.

[세포번식과 항체생산]

일단 소요의 융합된 세포 하이브리드를 선택하고 개개의 항체-생성 세포 배양주속으로 클론을 하면, 각 세포배양주는 두가지의 표준방법중 어느하나로 번식시킬 수가 있다. 이 하이브리도마의 시료를 원래의 융합용으로 체세포와 골수종세포를 제공하는데 사용한 형태의 조직 상용성 동물에 주사한다. 주사된 동물은 융합된 세포하이브리드로 생성된 특이한 단일클론의 항체를 분비하는 종양을 발생시킨다. 혈청이나 복수종 유체와 같은 동물의 체액을 천자하여 고농도의 단일클론의 항체를 제공한다.

또한, 개개의 세포배양주를 실험실의 배양용기에서 생체의 번식을 시킬 수가 있다. 고농도의 단일의 특이한 단일클론 항체를 포함하는 배양배지를 경사, 여과 또는 원심분리로 수거할 수가 있다.

[단일클론 항체의 사용]

본 발명의 방법으로 만든 단일클론의 항체를 공지된 어떤 기술이나 또는 장래에 단일클론의 항체를 사용하도록 개발될 기술에 사용할 수가 있다.

단일클론의 항체의 주요 용도는 면역검사법에 잉으며 이검사법은 항원-항체의 상호작용의 측정이다. 이러한 검사법은 일반적으로 이질적이거나 또는 균질적이다. 균질의 면역검사법에서 면역학적 반응은 통상적으로 특이한 항체, 라벨이 된 분석분해물 및 문제의 사료를 포함한다. 라벨에서 생기는 신호는 항체를 라벨이된 분석분해물에 결합시키는 즉시 직접이나 간접적으로 수식한다. 면역학적 반응과 이들의 검출정도의 두가지 모두를 균질용액에서 실시한다. 사용할 수 있는 면역화학적 라벨은 유리기, 형광염료, 효소, 박테리오파지, 조효소 등을 포함한다. 균질의 면역검사법의 장점은 특이한 항체를 라벨이된 분석분해물로부터 분리할 필요가 없다는 것이다.

이성질 면역검사법에서, 반응물은 통상적으로 피검물, 특이한 항체, 그리고 검출가능한 신호를 발생시키는 수단 등이 된다. 피검물은 일반적으로 평판이나 슬라이드와 같은 지지체 위에 놓고 액체상에서 항체와 접촉시킨다. 다음에 지지체를 액상에서 분리하고 지지상이나 액상의 어느 것을 이러한 신호를 발생시키는 수단을 사용하여 검출가능한 신호를 시험한다. 이 신호는 피검물속에든 분석분해물의 존재와 관련된다. 검출되는 신호를 발하는 수단은 방사선라벨, 형광체, 효소 등을 사용하는 것을 포함한다. 이성질 면역검사법의 예시는 방사선, 검사법, 면역형광방법 효소-결합된 면역검사법 등이 된다.

상기한 면역검사 기술은 보다 상세한 언급은(See Enzyme-Immunoassay, by Edward T. Maggio, CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla., 1980)을 참조한다. 또한 전부는 아니지만 예컨대 다음의 미국특허를 참조한다.(3,690,834; 3,791,932; 3,817,837; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,901,654;, 3,935,074; 3,984,,533; 3,996,345; 및 4,098,876).

단일클론의 항체의 또다른 주요용도는 생체내 영상과 치료가 된다. 이러한 단일클론 항체를 예를 들면 방사성 요오드와 같은 방사성 화합물로서 라벨을 하고, 정맥내로 환자에게 투여한다.

또한 이 항체를 자석 탐침으로 라벨을 할 수 있다. 다음에 NMR는 이 항원을 정확하게 가르키는데 사용할 수 있다. 이 항원에다 항체를 지정시킨 다음에, 항원은 방출 단면-X선 촬영 및 방사성핵 주사기술로 검출하고 그리하여 항원의 위치를 정확하게 지적한다.

설명의 목적으로 정제된 단일클론의 항체를 예컨대 식염수와 같은 적절한 담체에서 사람 알부민이 있거나 없이, 적절한 투여량으로 현탁시키고 여기서 참고로 제시하는(In Hybridomas in Cancer Diagnosis and Theraph (1982)에서 Miller 등이 기술한 것 같이 예컨대 수시산동안 정맥내로 계속적으로 주입하여 정맥내 투여한다.

본 발명의 단일클론의 항체를 치료용으로 사용할 수가 있다.

적절한 생물학적 성질을 가지는 항체는 치료제로서 유용한다, 또한, 이 항체독소에 결합시켜 면역독소를 형성시키거나 또는 방사성 물질이나 약물에 결합시켜 방사성 제약 또는 제약학적 물질을 형성시킨다. 항체의 면역독성 및 방사성 제약을 생성시키는 방법도 제공되어 있다(see, for example, Cancer Treatment Reports (1984) 68 : 317-328).

또한 무균동물에서 얻는 다중클론의 항체를 면역검사에 사용할 수 있으며 통상적인 동물에서 얻는 다중항체와 비교하여 향상된 결과를 제공한다고 믿어진다.

무균동물에서 얻는 다중클론의 항체는 위에서 기술한것 같이 무균동물과 위에서 기술한 면역기술을 사용하고 다음에 예컨대 동물에서 혈청을 분리하는 것 같이 통상적인 기술에 의하여 동물로부터 다중클론의 항체를 분리하여 만들 수 있다.

[피브린-특이성 단일클론의 항체]

[배경]

지혈메카니즘은 파열된 혈관의 손상을 고치는데 포함되는 복잡한 생리학적 응답 메카니즘이다. 지혈은 손상된 혈관의 벽, 도말 및 응집성 시스템간의 협동적 상호작용을 통하여 성취된다.

응집 시스템의 기능은 광범위한 피브린 망상조직을 제공하여 손상된 관의 내피하층 구성에 조성된 도말 플러그를 고정시킨다.

순환되는 피브리노겐으로부터의 불용성 피브린 기질의 형성은 필요한 부위에서 트롬빈의 폭발적 생성에서 축적되는 반응물의 복합배열순서의 결과이다. 응집은 효소의 연쇄반응을 포함하는 증폭과정이고 이때 전효소(응괴인자)가 차례로 활성화하여 효소를 활성화한다. 트롬부스 형상에 관련되는 피브린 중합과정을 조절하는 생리학적 메카니즘이 많이 있다. 이것은 트롬빈 억제 항트롬빈 III(ATIII), 단백질 C, 조직 플라스미노겐 활성제(t-PA)와 같은 피브리노 분해시스템의 프로스트실린 및 각종 성분, 그리고 이것의 신속작용 억제제 (PAI)를 포함한다.

1956년에 Astrup, T., Blood 11, 781-806 (1956)에서 Astrup이 제시한 지혈 작용 가설에 의하면 피브린 형성(응집)과 피브린 해리(피브리노용해)간에 평형이상의 상태가 존재한다. 정상적이거나 건강한 상태에서 이러한 기능은 균등하게 균형된다. 그러나, 지혈과정이 불균형이며, 응집과 피브리노 용해는 각각 혈전증과 출혈로서 생리학적으로 표현된다. 생리학적 혈전증과 혈전증 질병의 임상학적 증명은 극히 다양하고 유포된 맥관내의 응집(DIC), 깊은 정맥혈전증(DVT), 동맥 및 정맥의 혈전증을 포함한다. 다른 혈관질병(예컨대 아테롬성 동맥경화증)의 혈전색전증과 혈전성 복합성으로 주요 동맥에 폐색을 일으켜 조직 국소빈혈 및 소뇌혈관 재해(발작), 심근경색등과 같은 부수되는 생명에 위험을 주는 상태에 이르게 한다.

섬유소분해 과정은 비활성 효소모질 플라스미노겐을 플라스미노겐 활성화제로 알려진 약제의 작용을 통해 단백질 분해성 효소 플라스민으로 전환하는 것을 포함한다. 생리학적 섬유소분해의 분자 메카니즘은 완전하게 이해되지는 않지만 섬유소 형성중에 예컨대 t-PA와 같은 플라스미노겐 활성화제에 의해서 활성화될 수 있는 경우에 플라스민 발생은 플라스민, 알파-항플라스민의 주요 생리학적 억제제에 의하여 비활성화가 되지 않도록 보호받는 경우에 혈전속에서 진행한다.

플라스민에 노출되면, 섬유소원과 섬유소는 파쇄되어서 이들의 분해 생성물이 된다. 섬유소원은 단편 X 및 Y로 파괴되고 플라스민에 더욱 노출되면 단편 D와 E로 파괴된다. 섬유소는 비-가교결합의 섬유소로부터 단편 X,Y,D 및 E로 파괴되고 그리고 가교결합된 섬유소로 부터는 가교결합된 D-이량체, D-D/E 복합체, Y이량체, Y-D-이량체 및 X-올리고머로 파괴된다.

혈전증 질환의 표식에 대한 검사법은 극히 최근까지 방사선 면역 검사 및 라텍스 응집반응 형태의 검사법의 두가지 모두에서 다중클론의 항체를 사용하여 실시하였다. 이러한 검사법은 Gaffney (Gaffney, P.J., Ann,N.Y. Acad. Sci., 408, 407-423 (1983)가 극도로 신빈성이 없는 것으로 나타낸다. 단일클론의 항체를 사용하는 보다 특이하고 예민한 면역검사법(ELISAs와 같은)은 임상학 실험실에서 통상적인 실시법이 되고 있다. 이러한 진단 검사법에서 제한적 인자는 사용하는 특별한 단일클론의 항체의 특이성과 친화성이 된다. 손상된 지혈의 어떤 잠재성 지시계에 대해 고도로 특이한 항체의 발생은 정상적으로 혈장속에 매우 놓은 수준으로 존재하는 전구체와 특별한 표식과의 항원성 관련성과 지식계의 저수준에 의해서 방해를 받는다. 실시예는 효소와 예컨대 혈전-항혈전 III, 플라스민-알파₂-항플라스민, t-PA-PAL-1과 같은 이들의 억제제간의 복합체의 형성이 된다.

이러한 복합체 형성에 의해서 발생되는 새로운 항원 위치의 수는 극히 적어서 면역학적 탐침(단일클론의 항체와 같은)의 생성이 곤란하게 된다.

마찬가지로, 단일클론의 항체를 섬유소에 획득하는 것과 관련되는 주요 문제점은 섬유소와 이의 생리학적 전구체 섬유소원 사이의 구조적 및 등각의 유사성이었다. 섬유소원을 섬유소로 전환시킬 때 공유구조의 보존은 98% 이상이 되고 (Plow, E.F., et al., Semin Thromb Haemostas, 8, 36 (1982) 그리하여 섬유소분자에 있는 에피토프의 적은 %만이 실제로 새로운 항원이다 (그리고 섬유소에 대해서 독특하다). 섬유소 항체를 얻는데 사용한 많은 시도를 섬유소에서 신항원 위치를 모의로 노출시킨 가용성 섬유소 단편과 합성 펩티드로서 동물을 면역하는 것에 중점을 두었다. 다음을 참조한다 : (Hui, K.Y.,et al., Science 22, 1129-32 (1983), Scheefers-Borchel, V., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 7091-95 (1985), Elms, M.J., et al., Thromb. Haemostas, 50, 591-94 (1983, and Kurdryk, B., et al., Mol. Immul., 21, 89-94 (1984). 그러나, 믿기로는 이러한 항체의 결합위치가 섬유소 분해 과정중에 보존되어서 그러므로 이러한 항체가 섬유소 분해 생성물에 결합될 수 있다는 것이다.

본 발명은 완전히 다른 시도를 채택할 수 있게 하고 섬유소-특이성 단일클론의 생성에 대한 항원없는(AF) 동물의 증대된 면역학적 민감성과 관련하여 무자의 섬유소 항원을 사용케한다. 본 발명의 목적으로, 섬유소-특이성 단일클론의 항체는 섬유소에는 결합하지만 섬유소원, 섬유소와 분해 생성물이나 섬유소 분해 생성물에는 결합치 않는다.

[재료와 방법]

[동물]

무균의 BALB/cAnN 새앙쥐는 위스콘신 대학에 보관중인 무균 (AF) 집락에서 수득하였다. 이 동물을 GF 상태로서 본인들의 시설까지 운반하였다. 항원-없는(AF)집락은 새앙쥐를 화학적으로 정의된(CD) AF 식품에서 즉시 운반한 경우 천연성분의 식품 L-485(Pleasants, J.P., et al., J.Nutr. 116, 1949-1964 (1986) 참조)를 먹인 새끼밴 GF 새앙쥐를 움직여서 개시하였다. 천연 성분(NI) 식품을 직접 먹은 적이 없는 이들의 새끼를 모유에서 떼어서 CD 식품을 먹이고 첫 번째 AF세대라고 칭한다. AF새앙쥐를 암놈이 확실히 임신할 때까지 쌍으로 교배시킨; 다음에 숫놈을 떼어서 그 후에 암놈이 그의 일일 지질 보급을 완전히 받는 것을 확인한다. 새끼를 24일 됐을 때 젖을 뗀다.

[하우징]

AF 사육기를 28×17.8×12.7cm의 표준 폴리카보이네이트 새앙쥐 우리의 반쪽에 쌍으로 넣는다. 바닥을 절단하고 메쉬 스테인리스강의 거짓의 바닥으로 대체하였다. 시이트형의 스테인리스강으로 된 세로방향 분할기를 플라스틱 우리의 단부에 볼드로 고정시키고 스테인리스 와이어의 두껑을 제자리에 잡아 두도록 우리의 상하로 충분히 뻗어나게 한다. 정상적으로 우리속에 맞추어지는, 이러한 홈이 파인 두껑을 끼어 넣어서 거짓 바닥위에 더욱 적절한 머리부분 방을 제공한다. 적절한 크기로된 스테인리스 칼라를 두껑의 상부에 용접하여 60ml 식품병을 잡아준다.

네 개의 스테인리스강 컵을 거짓바닥과 상부사이의 반정도에서, 단부에 세로방향 분할기의 측면에 용접하였다(A picture of the cages appears in Pleasants, J.R., The germfree system for aging and immunity In : CRC Handbook of Immunology in Aging, (Kay, M.M. B.S. Makinodan, T., eds.), pp. 257-297, CRC Press, Boca Raton, F1. (1981). 식품병은 갈색유리로 만들었다. 식품과 물병의 두가지 모두는 그 중심에 구멍을 뚫은 플라스틱 두껑을 덮는다. 이병에 채우고 이들의 칼라속에 거꾸로 하였다. 지질 보충물은 스테인리스강 컵으로 날마다 측정하였다. 플라스틱팬을 각 우리 밑에 놓아서 폐기물을 받는다.

침구로서 그리소 섭취가능한 섬유로서의 두가지 모두의 역할을 하는 여과지는 클립으로서 판매하는(Sargent Welch) Whatman의 회분없는 여과지 제41호 이었다. 침구용으로는 종이를 스트립이 되게 절단하였다. 절단하지 않는 사각형의 종이는 격리기 내부의 청소용으로 사용하였다. 이 종이는 121℃에서 25분간 압력솥에 넣거나 또는 플라스틱 자루속에서 조사(4.5Mrad)하였다. 모든 새앙쥐는 우리의 한쪽단부를 덮는데 충분한 종이를 받았다. 이 누렇게 젖거나, 또는 더렵혀지면 바꾸어준다.

우리는 표준 노토비오트 기술(Wostmann, B.S., Ed., Gnotobiotes Standards and Guide Lines for thd Breeding, Care and Management of Laboratory Animals, National Research Council, National Academy of Sciences, Washington, D.C)을 사용하여 1.37×0.6×0.6M 크기의 Trexler 형태(Trexler, P.C., Lab. Anim. Care, 13, 572-581 (1963)의 유연한 격리기속에 보관한다.

이 격리기는 방에서 12h 밝기의 어두운 스케줄에서 21℃로 보관하였다. 직경이 2.5cm이고 길이가 7.55cm인 Tygon 튜브를 격리기의 상부에 밀봉시키고 상부와 바닥의 두 곳 모두를 비닐마개로 막는다. 이렇게 하여 식품, 물 및 기름의 살균여과 목적의 주입이된다.

[식품]

표 3은 식품성분과 한외여과한 밀리-Q 물(Millipore, MA)에 성분을 용해시키는 순서를 나타낸다. 아미노산과 포도당은 시그마조직 배양 등급이었다. 비타민도 또한 Hoffman-La Roche, Inc (Nutley, NJ)가 공급한, 순수한 그물형태의 팔미트산염을 제외하고는 Sigma에서 취하였다. 기타 반응물은 Fisher의 보증품이거나 또는 그와 동등한 품질이었다. 완전한 수용성 식품은 직경이 150mm인 세 개의 Pm10 막을 사용하는 Amicon Diaflo TC3 한외여과기를 통하여 차겁게 여과하였다.

한외여과막은 10,000달톤의 분자량 절단을 가졌다. 조립된 한외여과기 장치는 사용전에 0.15% 치아염소산 나트륨용액에 통과 시키고 다음에 철저히 세척하여 살균한다. 한외여과된 식품은 필요시까지 살균된 저장소에서 4℃로 저장한다.

식품은 제6번 네오프렌 마개속으로 삽입된 배출튜브가 달라니 압력솥 압력여과기 홀더에서 0.2㎛ 나일론(MSI) 여과기를 사용하여 AF격리기속으로 주입하였다. 이 목적을 위하여, 격리기의 상부에 밀봉된 Tygon 튜브로부터 상부 비닐마개를 제거하고 튜브의 내부를 0.1% 알킬-아릴 술폰산염을 포함하는 2% 과아세트산의 살균용액으로 분무하였다. 이 여과기 홀더 스토퍼를 상부 스토퍼의 제자리에 삽입하였다. 20분 후, 아래 스토퍼를 제거하고(격리기 안에서)식품이나 물을 20psi의 질소 분위기에서 격리기 속으로 여과하였다.

지질 보충물의 조성은 표 2에 제시한다. 콩 트리글리세리드는 메틸에스테르로부터 만든 제품으로서 이를 온도범위에서 증유하여 팔미트산염으로부터 리놀렌산염으로 에스테르를 수득한다. 다음에 이 에스테르를 글리세롤로서 에스테르전이시켜 혼합된 트리글리세리드를 형성시킨다(Nu-Chek Prep, Elysian, MN).

지방-가용성 비타민을 이 트리글리세리드 혼합물에 첨가하고 격리기속으로 여과하고 이때 50℃로 덮히고 식품의 수용성 부분에 사용한 것과 같은 방법으로 격리기속으로 여과하였다.

지질섭취는 0.375ml/일로 측정되었다. 지질 보충량을 증가시키면 새로 태어나는 새앙쥐의 치사량의 크게 감소되었다. 평균 동산군의 크기는 통상적으로 사육하는 마리수가 될 정도로 증가되었다. 암놈의 위치선정은 지질 보충량의 정상량의 2배를 받았다.

70℃에서 밀리-Q 수 108ml에 D-포도당, 무수물을 첨가하였다.

이 용액은 5℃로 냉각하고 둘 모두를 한외여과용으로 모았다.

1 표 5에 제시한 염 35D 혼합물의 조성물

2 염 35D에든 셀렌산 나트륨이외에 첨가된

3 비타민 B 혼합물 111E5(표6참조)의 조물

4 비타민 B 혼합물 111E5에든 비타민 B-12이외에 추가로 첨가된

* 라케이트(lactating) 새앙쥐는 정상적 큰쥐 투여량의 2배를 받았다.

1의 구성은 : 12% 팔미트산염, 1.5% 스테아린산염, 24% 올레인산염, 55% 리놀산염, 8% 리놀렌산염

물은 밀리-Q 한외여과한 품질이었고 식품에서처럼 한 것과 같은 방법으로 격리기속으로 여과하였다.

[미생물학적 검사]

항원-없는 시스템을 Wostmann, B.S. ed. (1970)이 설정한 지침에 따라서 미생물 오염시험을 하였다. 사육주의 사항과 실험동물의 관리에 관한 노토비오트 표준과 지침은 National Academy of Sciences, Washington, D.C 이었다. 간략히 설명하면, 격리기 내측으로부터의 식품과 물을 묻힌 자루걸레를 각 우리 아래에서 새앙쥐로부터 그리고 축적된 폐기물로부터의 수득한 새로히 얻은 배설물 얼룩을 얻는 데 사용하였다. 또한 얼룩은 특별히 입구주위의 격리기 벽에서 취하였다. 이중 얼룩도 항상 취하였다.

한세트는 그램 착색을 사용하여 박테리아와 진균에 대한 직접적 현미경 시험으로 시험하였다. 두 번째 세포의 자루걸레는 미생물의 검출에 사용하였다. 3주일이 경과된 다음에 배앙물은 음성으로 생각되었다.

미생물학적 시험은 매2주일마다 그리고 격리기에 새로이 넣은 후 2-3일에 실시하였다.

[항원-없는 새앙쥐를 사용하는 단일클론의 항체의 생산]

위에서 기술한 항원-없는 새앙쥐를 단일클론의 항체의 생산에서 임파구 공여체로서 사용하였다. 모든 항원의 용액은 적층류 후드에서 살균조건에서 제조하였다.

다음의 프로토콜은 AF 새앙쥐의 면역에 적용하였다. 항원(25-59μg)을 살균식염수(100μ1)에 용해시키고 같은 용적의 Freund의 완전한 보조약(FCA)으로 유탁화하였다.

인터페론(1000단위)를 항원의 용액에 첨가하여 유탁액을 제조하였다. 살균주사기와 바늘을 모든 면역에서 사용하였다.

주사기는 입구를 통하여 AF격리기에 옮기고 이때 과아세트산(2%)의 용액을 분무하여 살균하였다. 보강주사는 Freund의 불완전한 보조약으로 FCA를 대체하고 같은 양의 항원을 사용하여 제공하였다. 총세번의 보강면역을 3주간의 각 간격에 제고하였다. 최종보강(보조약 없이)은 융합의 4-7일전에 제공하였다. 모든 배열은 복강속으로 제공하였다. 새앙쥐를 융합한 날에 격리기로부터 꺼내어서 즉시 CO₂질식시켜 죽였다.

비장을 꺼내고 비세포는 표준 하이브리도마 기술을 써서 새앙쥐 골수염세포(NS1)로 융합하였다.

[섬유소-특이성 단일클론의 항체의 생산을 위한 항원-없는 동물시스템 사용]

항원-없는 시스템을 섬유소-특이성 단일클론의 항체를 발생시키는데 사용하였다. 이 항체는 고도로 특이성이 있으며 섬유소원, 섬유소 분해제품 또는 섬유 소원 분해제품을 인식하지 않는다. 하이브리도마 세포 배양주는 항원없는 BALB/c 새앙쥐로부터 얻는 비세포를 융합하여 생성시키고, 사람 섬유소와 NS1 골수종 세포로서 면역시켰다.

[면역스케줄]

세 마리의 8주된 암컷의 항원없는 새앙쥐를 33μg의 사람 섬유소 제품으로 면역하였다. 이 제품을 다음과 같이 제조한 섬유소의 냉동 파손시료이었다.

사람 섬유소원을 트롬빈과 인자 XIIIa로서 섬유소로 전환시켰다. 다음에 섬유소 덩어리를 액체질소에서 냉동하고 기계분쇄기로 극히 미세한 분말이 되게 분쇄하였다. 냉동 파쇄한 섬유소의 분산은 식염수에서 만들어서 1mg/mL의 최종농도로된 가교결합된 섬유소 XL-Fn의 맑은 용액을 만들었다. 33μ1의 섬유소 항원을 동물을 면역시키는데 사용하였다. 항원용액의 용적은 살균한 식염수로서 100μ1가 되게 조정하고, 다음에 마지막 항에서 기술한 것 같이 FCA로서 유탁화하였다.

두 개의 보강 면역물을 Freund의 불완전한 보조약에든 같은 수준의 항원을 사용하여 3주간의 간격으로 투여하였다. 최종 보강제는 융합된 4일에 제공하였다. 같은 수준의 항원을 사용하고 보조약은 식염수로 대체하였다.

[항체의 검출과 측정]

단일클론의 정상적 및 정량적 측정은 효소결합된 면역흡수 검사법 (ELISA)을 사용하여 실시하였다. ELISAs는 96웰 PVC형판(Costar0에 고정시킨 사람 섬유소를 사용하여 실시하였다.

섬유소를 피복한 형판은 100μ1의 섬유소원 용액(Kabi, 등급L)(50μg/ml 붕산염/식염수완충액)을 4℃에서 밤새껏 배양하여 제조하였다. 결합안된 섬유소원은 0.05% Tween 80(PBS-Tween)을 함유하는 PBS로서 세척하여 제거하였다. 각각의 플라스틱 웰에 피복된 섬유소원은 2mM CaC1₃를 포함하는 트롬빈용액(10NIH 단위/ml)의 100μ1로서 37℃로 1시간동안 배양하여 섬유소로 전환시켰다. 이 항체에 또한 표준 보정커브는 SDS-PAGE로서 균질화한 항체의 제품을 사용하여 구성하였다.

비-특이성 결합을 방지하기 위하여, 섬유소 피복된 형판은 PBS pH 7.4에든 1% BSA용액으로 배양하였다. 다음에 항체를 포함하는 용액1000μ1)을 첨가하고 37℃서 90분간 배양하였다. 이 과정에서 각 단계다음에 웰을 PBS-Tween으로 철저히 세척하였다.

결합된 항체는 PBS, 10% BSA pH8.0에 희석된 알칼리인산염효소(Sigma)에 콘쥬게이트된 토끼 항-새앙쥐 항체의 1000 희석물을 첨가하여 검출하였다.

[하이브리도마 융합의 제조]

새앙쥐를 CO₂질식으로 죽여서 즉시 비절개술을 실시하였다.

면역된 새앙쥐로부터의 비장세포는 융합제 폴리에틸렌 글리콜4000(3000-3700)로서 융합하였다. 이 세포를 T플라스크에서 HAT 선택배지에서 1주일간 배양하였다. 이 시간 다음에 세포를 5X96 웰형판에 도말하고 이로부터 93웰은 생장을 나타내었다. 물론 19웰은 섬유소 항원에 대해서 양성이었다. 이러한 클론중에서 하나인 F492D8(나중에 MH1이라 다시 명명한다)는 섬유소 항원은 인식하지만 섬유소원과는 가교반응치 않은 항체를 생성하였다. 이러한 특별한 클론, MH1을 웰당 1세포로서 실시한 삼차 클로닝상으로서 희석을 제한함으로서 세 번 재 클론하였다. 일단 이 세포배양주를 안정화하면, 이것은 혈청없는 배지에 이유시키고 이 세포 배양주는 대략 7.5mg/1 의 수준으로 항체를 생성하였다.

[단일클론항체의 정제]

정제전에 (41회분의)조직배양 상청액을 원심분리하여 세포파편을 제거하고 0.8㎛ 나일론막을 통해 여과하여 어떤 잔유의 입자물질을 제거하였다. 하이브리도마 상청액을 30,000의 분자량 절단을 가진 YM형막(Amicon)을 사용하는 나선형으로 감긴 한외여과 시스템을 사용하여 4℃에서 500ml의 용적이 되며 농축하였다.

20mM 2(N-모르폴린) 에탄술폰산(MES), pH6 (완충액A)에 완충액 교환은 제작자의 지시에 따라 투석여과로 실시하였다. 100㎖의 최종 용적이 되게 농축시킨 후, 항체용액을 0.451미크론 나일론 막을 통해 여과하고 다시 정제하였다. 농축된 항체용액을 7.75mmX10cm ABx 칼럼(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)를 사용하는 물 HPLC 크로마토그래피에서 액체 크로마토그래피로 정제하였다.

이 칼럼을 완충액A로 평형화하고 시료(100ml)를 1.0ml/분의 율로 사용하였다. 완충액A로 철저히 세척한 후, 항체를 1ml/분의 율로 완충액A로부터 100% 완충액B(1M 아세트산 나트륨 pH7)로 경사하는 칼럼에서 용출시켰다. 유분(2ml)을 수거하고 MAb(ELISA로 측정하여)것을 혼주하고 인산염 완충액 식염수(PBS) L20mM 인산나트륨, 150mM 염화나트륨, pH7.4)에 대해서 투석하고 1mg/m1이상의 농도에서 -20℃로 저장하였다. 이 ABx 칼럼을 150% 완충액B로 5분간 세척하고, 15칼럼 용적의 완충액A로 재-평형화하여 재생하였다.

[섬유소 특이성의 측정]

섬유소 특이성의 최초의 측정은 섬유소와 섬유소원이 피복된 미량적정 형판에서 별도로 하이브리도마 상청액을 선별하여 실시하였다. 섬유소원과 가교반응하지 않은 항체를 만드는 이러한 세포배양주만을 취하였다.

섬유소 특이성의 추가적 확인은 용액에서 섬유소원으로 경쟁적 검사법을 사용하고 그리하여 항체가 용액에서 섬유소유원을 인식하지 않는 것을 확인하여 측정하였다.

항체의 섬유소 특이성을 확인하는데 사용한 경쟁검사법은 용액에서 섬유소원으로 항체를 예비 배양하는 위에서 ELISA검사법으로서 기술한 것 같이 실시하였다.

간략히 설명하면, 하이브리도마 상청액을 섬유소원에 대한 항체의 비특이성 결합을 방지하기 위하여 BSA(10㎎/ml)을 포함하는 생리학적 농도(4mg/ml)로서 섬유소원의 용액으로 37℃에서 30분간 배양하였다. 다음에 이 섬유소원/항체 용액을 섬유소로 피복시킨 미량적정 형판의 웰에 옮겼다. GlyProArgPro(GPRP)를 섬유소원 억제제에 첨가하여 섬유소웰속의 잔유하느 트롬빈에 의한 섬유소원의 가능한 중합을 방지한다. 다음에 이 검사법은 고정시킨 항원에 결합된 항체에 대한 통상적인 ELISA검사법과 같이 실시한다. MH1항체의 섬유소 특이성을 시험하는 모든 실험에서 제2항체 45J를 기준으로서 사용하였다. 45J는 섬유소 및 섬유소원과 가교 반응한다.

[섬유소원과의 가교반응성의 측정]

[고정시킨 섬유소와 섬유소원]

세포배양주 MH1은 PVC 미량적정 검사법 평판의 표면에 고정될 때 섬유소와 가교반응하는 쥐의 단일클론의 항체를 생성한다(표 5).

같은 검사법에서 항체는 평판에 고정된 섬유소원을 인식하지 않는다. 표 5에 데이터가 나타내는 것 같이, 일단 섬유소원이 트롬빈에 의하여 섬유소로 전환되면 면역반응성이 극적으로 증가되어서, 섬유소 분자에 신에피토프가 분명히 노출되거나 형성됨을 나타낸다. 그러나 기준항체 45J는 섬유소원이 섬유소로 전환될 때 보존되는 에피토프를 분명하게 인식한다.

[섬유소와 섬유소원에 의한 경쟁적 검사법]

MH1 항체인, 이항체의 섬유소 특이성은 섬유소 피복된 웰에서 ELISA하기전에 섬유소원 용액(4mg/ml최종농도)로서 하이브리도마 상청액을 예비 배양하는 경쟁검사법에서 추가로 증명하였다. 이러한 경쟁검사법에서 이러한 고수준의 섬유소원(항체농도의 500배)를 사용했기 때문에, BSA(100mg/ml의 최종농도)를 이 혼합물에 첨가하였다. 펩티드 GPRP를 첨가하여 섬유소 피복된 웰에서 잔유 트롬빈에 의한 섬유소 중합을 방지하였다. 이러한 검사법의 결과는 MH1항체가 용액에서 섬유소원을 인식하지 않는 것을 나타낸다.

400ng의 섬유소가 미량적정 검사법 평판의 각웰에 결합한다고 가정할 때, 이러한 특별한 경쟁검사법에서 사용한 섬유소원 수준은 결합된 섬유소 항원보다 1,000배 이상을 나타낸다. 또한 이것은 조직 상청액에서 400배이상의 항체수준을 나타낸다.

[섬유소(OGEN) 분해생성물과의 가교반응성의 측정]

섬유소원 분해생성물(FDPs)는 플라스민으로서 섬유소원을 37℃에서 10분 내지 3시간범위의 기간동안 배양시켜 제조하였다.

소요의 시간에 섬유소원 분해는 트라실롤(Trasylol (ml당 100Kallikrein 억제제 단위)와 20mM 엡실론 아미노 카프론산 (EACA)을 첨가하여 정지시켰다.

가교결합된 섬유소 분해생성물(XLFDPs)는 10mM CaCl, 플라스미노겐(0.25mg/ml)와 유로키나제(50IU/ml)를 포함하는 트리스 완충된 식염수(TBS, pH7.4, 50mM 트리스 HCI, 150mM NaCl)에든 섬유소원 용액(5mg/ml)에 트롬빈(4NIH 단위/ml)를 첨가하여 제조하였다. 이 혼합물을 37℃에서 배양하고 플라스민 소화는 FDPs에 대해서 위에서 기술한 것 같은 시간 간격으로 정지시켰다.

섬유소 분해생성물과 섬유소원 분해생성물과 항체와의 가교 반응성을 측정하기 위하여, 적절한 분해생성물을 미량적정 평판에 피복하고 ELISA를 통상적인 방법으로 실시하였다. 표 7에서 결과를 나타낸 것 같이, MH1 항체는 어떤 플라스민 발생된 섬유소원 분해생성물과 가교반응치 않는다. 표 8에서 나타내는 것 같이, 이항체는 XL-섬유소 분해생성물과 반응치 않는다. 또한 이러한 관찰은 항체는 웨스턴 블롯분석으로 가교반응성을 시험할때에도 이루어졌다.

이 결론은 전구체 분자, 섬유소원의 표면에 존재하지 않거나 노출되지 않은 무자의 섬유소 분자의 에피토프를 인식한다고 유도한다. 이 에피토프는 표 8에서 데이터가 제시하는 것 같이 가교결합된 섬유소의 플라스민 소화에 의해서 분명히 파괴된다.

따라서, MH1 항체는 다음과 같이 정의할 수 있는 섬유소 특이성 단일클론의 항체이다:

본 발명의 목적을 위하여 섬유소-특이성 단일클론의 항체는 다음을 만족하는 단일클론의 항체이다 :

1. 위에서 기술한 것 같이 섬유소와 섬유소원과의 가교반응성을 측정하는 경쟁검사법에서 단일클론의 항체는 섬유소원을 섬유소에 비교하여 1,000배 과잉의 양으로 사용할 때 약 75% 더적은 바람직하게는 약 10% 더적은 가교반응성을 가진다.

2. 위에서 기술한 것 같이 가교결합된 섬유소와 섬유소분해 생성물과의 가교반응성을 측정하는 검사법에서, 플라스민으로서 세시간동안 소화시킨 섬유소와의 단일클론 항체의 반응성 0시간에서 섬유소와 단일클론의 항체와의 반응성보다 약 50% 더 적고, 바람직하게는 약 40% 더적고, 그리고

3. 위에서 기술한 것 같이 섬유소원과 섬유소원 분해생성물과의 가교반응성을 측정하는 검사법에서, 플라스민으로서 약 네시간 소화시킨 섬유소원과 단일클론의 항체와의 반응성은 영시간에 섬유소원과 단일클론의 항체와의 반응성 보다 더 크지 않다.

MH1 항체는 섬유소에 대한 친화성을 측정하는 것을 특징으로 한다. 이 친화성은¹²⁵I-라벨이된 MH1 항체를 사용하는 Scatchard분석(Frankel et al., Molecular Immunology, 16, 101-106(1979)으로 측정하였다. 해리상수 K_D에 대해 측정한 값은 6.7×10^-10이었다. 이러한 친화성은 섬유소에 대한 t-PA의 친화성에 대한 것 보다 약 5,000배가 된다.

또한 MH1 항체가 섬유소원의 Aα, Bβ 또는 감마사슬과 가교반응하지 않는 것이 웨스턴 면역블롯팅 분석으로 측정하였다.

또한 MH1 항체가 섬유소원의 트롬빈 처리한 Aα 또는 Bβ 사슬과 가교반응치 않음이 같은 분석방법으로 측정되었다(섬유소원을 트롬빈 처리하면 각각 Aα 사슬과 Bβ사슬로부터 피브리노 펩티드 A와 피브리노펩티드B를 방출시키며, 따라서 섬유소의 α 사슬과 β 사슬을 형성한다.

또한 표 7의 결과가 나타내는 것 같이, 기준항체인 45J 항체는 섬유소원에는 결합하지만 섬유소원 분해생성물과는 가교반응치 않는다. 따라서, 이러한 단일클론의 항체는 섬유소원-특이성 단일클론의 항체이고 본 발명의 또다른 특징을 나타낸다.

섬유소원-특이성 단일클론의 항체는 생체외에서 플라스마 섬유소원을 측정하는데 사용할 수 있는 어떤 면역검사법에 사용할 수 있다. 45J 항체는 45J 에피토프가 아미노산 약 206 내지 약 424의 범위에서 그리고 가장 가능성있기는 아미노산 약207 내지 231의 범위에서 섬유소원의 Aα 사슬에 있다는 것을 측정하는 또 다른 특징이 있다. 본 발명의 목적을 위하여 섬유소원-특이성 단일클론의 항체는 위에서 기술한 것 같은 섬유소원과 섬유소원 분해생성물과의 가교반응성을 측정하는 검사법에서 플라스민으로 약 40분간 소화시킨 섬유소원과 단일클론의 항체와의 반응성이 영시간에서 섬유소원과 단일클론의 항체와의 반응성의 약 50%보다 적다.

45J 하이브리도마는 새앙쥐를 섬유소로서 면역하는 경우의 통상적인 Balb/c 새앙쥐를 사용하는 통상적인 기술로서 만들었다. 그러나 또한 섬유소원은 항원으로서 사용할 수 있다.

[비-가교 결합된 섬유소와 비-가교결합된 섬유소 덩어리와의 가교반응성의 측정 ]

항체 MH1이 가교결합된 섬유소(XLFn) 뿐만 아니라 비가교 결합된 섬유소(NONXLFn)도 가교반응한다는 것을 ELISA로서 증명하였다. ELISA는 다음과 같이 실시하였다:

1. 96웰 미량적정 검사형판을 100μ1의 섬유소원 용액(붕산염 (pH8.5)식염수 완충액 ml당 50μg)으로서 4℃에서 밤새껏 피복하였다.

2. 가교결합된 섬유소를 2mM CaC1₂와 10mM 시스타인을 포함하는 트리스 완충된 식염수(TBS, pH 7.4, 50mM 트리스 HC1, 150mM NaC1)에서 트롬빈 용액(10NIH 단위/ml)로서 37℃로 1시간동안 배양하여 섬유소원 피복된 웰에서 형성시켰다.

3. 비가교 결합된 섬유소를 0.0125M의 최종농도가 되도록 EDTA를 포함하는 인산염완충액(pH 6.1)에서 트롬빈용액(10NIH 단위/ml)로서 37℃로 1시간동안 배양하여 섬유소원 피복된 웰에서 형성시켰다.

4, 결합된 항체는 항새앙쥐 알칼리 인산효소 콘쥬게이트로서 배양시켜 측정하였다. 결합된 콘쥬게이트는 알칼리 인산효소 기질을 첨가하여 측정하고 수득되는 비색반응으로 자동 평판 판독기에서 405nM로 감시하였다.

이 검사의 결과는 표 9에서 나타내고 이것으로 결론짓기는 가교 결합된 섬유소와의 항체가교 반응성은 비가교 결합된 섬유소와의 가교반응성 보다 크다는 것이다. 가교결합된 중합체 구조에 존재하는 공유가교 결합된 가장 간단한 설명으로 항체가 인식하는 구조를 잠그거나 동결시키게 한다. 비가교 결합된 종에서 이 구조는 비록 형성되기는 하지만 중합체의 공유결합에 의해서 안정화되지는 않는다.

또한 항체가 생체외에서 형성된 가교 결합되고 비가교 결합된 두가지 모두의 덩어리와 가교 반응하는 것으로 나타내었다. 가교결합된 섬유소는 섬유소원 용액(트리스(50mM, pH 7.4), CaC1₂(2mM)와 시스타인(10mM)을 포함하는 식염수)을 트롬빈(10MIH 단위/ml)로서 37℃에서 3시간동안 배양시켜 제조하였다. 비가교결합된 섬유소는 0.0125M의 최종농도를 EDTA를 포함하는 인산염완충액(pH6.1)에든 섬유소원용액(3mg/ml)을 트롬빈용액(10MIH 단위/ml)로서 37℃로 3시간동안 배양하여 형성시켰다.

덩어리를 형성시킨 다음에 이를 세척하고¹²⁵I-라벨이된 MH1 항체를 포함하는 1% BSA용액 400μ1로서 배양시켰다.

이 용액은 적은 분취량을 상이한 기간대에서 제거하고 취한 항체의 양은 감마 계수기에서 플라스마를 계수하여 측정하였다.

표 10은 비가교 결합된 및 가교결합된 덩어리의 두가지 모두의 의한 항체의 수득을 나타낸다.

[하이브리도마의 기탁]

MH1과 45J를 1988년 6월9일에 ATCC에 기탁하고 각각 기탁번호 HB 9739와 HB9740을 수령하였다. ATCC는 123이 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852에 위치한다. MH1 항체는 ㅋ파의 가벼운 사슬을 가진 IgG항체이고 이 MH1 항체가 사람 섬유소 뿐만 아니라 토끼 섬유소와도 가교반응하는 것으로 관찰되었다.

본 발명은 기탁된 하이브리도마로서 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 없으며 다만 여기서 정의한 것 같이 섬유소-특이성 단일클론의 항체와 섬유소원-특이성 단일클론의 항체를 생성시킨 하이브리도마의 하나의 설명으로서의 의도된 것이다. 기능적으로 동등한 어떤 세포배양주는 본 발명의 범위에 속한다. 용어 기능적으로 동등한는 항체가 MH1 항체가 결합하는 섬유소의 에피토프에 또는 45J 항체가 결합하는 섬유소원에 에피토프에의 결합에서 MH1 항체나 45J 항체와 경쟁할 수 있음을 의미한다.

또한, 이러한 용어는 여기서 기술한 것 같이 각각 MH1항체가 결합하고 45J 항체가 결합하는 것과는 상이한 에피토프에 결합하는 섬유소-특이성 단일클론의 항체와 섬유소원-특이성 단일클론의 항체를 포함한다.

[섬유소-특이성 단일클론의 항체에 대한 생체내 진단 및 치료농도 ]

[덩어리 /혈관 질병의 국한]

본 발명의 섬유소-특이성 단일클론의 항체는 생체내에서 섬유소 덩어리 또는 섬유소의 응집을 표적화할 수 있다. 그러므로, 이들은 조직이나 혈관의 손상의 국소화와 혈관질병의 감시에서 사람에 사용할 수 있다. 섬유소-특이성 단일클론의 항체는 이러한 용도에 특별히 바람직한데 그 이유는 이러한 단일클론의 항체가 섬유소원 섬유소 분해생성물 및 섬유소원 분해생성물에 결합하지 않아서, 배경을 감소시켜, 섬유소 덩어리나 섬유소의 응집을 보다 정밀하게 국소화하게 하기 때문이다.

이 용도를 위하여, 정제한 단일클론의 항체를 사용하는 것이 바람직하다.

바람직하게는 정제는 HPLC방법으로 실시할 수 있다.

사람에 투여하기 위한 단일클론의 항체의 정제로 또한 황산암모늄이나 황산나트륨 침전시키고 다음에 시기염수에 대한 투석과 여과살균시켜 실시할 수도 있다. 또한 면역친화력 크로마트그래피 기술을 단일클론의 항체의 정제에 사용할 수도 있다.

설명의 방법으로 정제한 단일클론의 항체를 사람 알부민이 있거나 없이 예컨대 식염수와 같은 적절한 담체에서 적절한 투여량으로 현탁시키고 환자에게 투여한다. 단일클론의 항체는 바람직하게는 예컨대 여러시간에 걸쳐서 계속적으로 정맥내 주입하여 정맥내로 투여한다.

[단일클론의 항체 콘쥬게이트에 의한 혈관질병의 치료]

본 발명의 단일클론의 항체를 광범위한 세포독성 반응물과 같은 제약학적 약제 및 예컨대 t-PA, 유로키나제 스트렙토키나제 및 섬유소를 용해시킬 수 있는 기타 단백질 효소와 같은 혈전분해 시약과 함께 사용할 수가 있다. 이러한 용도는 특별히 바람직한데 그 이유는 본 발명의 섬유소-특이성 단일클론의 항체로서 이러한 시약을 매우 효율적으로 사용할 수 있게 하기 때문인데, 그 이유는 이들 시약중 그 어느 것도 섬유소원, 섬유소 분해 생성물이나 섬유소와 분해생성물에의 결합으로 손실되지 않기 때문이다. 본 발명에 대한 여러 가지 참조는 다음을 한다(Bale etal., 1980, CancerResearch, 40:2965-297; Ghose and Blair, 1978, J, Natl. CancerIn st.,61(3) : 657-676; Gregoriadis, 1977, Nature, 265:407-411; Gregoriadis,1980 Pharmac. Ther., 10:103-108; and Trouet et al., 1980, Recent Results Cancer Res., 75:229-235).

단일클론의 항체분자에 이러한 약제를 결합시키는데 사용된 방법은 비-공유이거나 공유결합중 어느 것을 포함할 수 있다.

비-공유결합은 항체복합체가 표적위치에 도달하기 전에 파괴될 가능성이 크므로, 공유결합이 바람직하다. 예를 들면, 카르보디이미드 결합은 제약학적 약제의 카르복시 그룹과 항체분자의 아미노그룹의 사이에 형성시킬 수가 있다. 디알데히드 또는 이미노에스테르와 같은 이관능기 약제를 약물의 아미노그룹을 항체분자의 아미노그룹에 결합시키는데 사용할 수가 있다. Schiff 염기반응을 약물을 항체분자에 결합시키는데 사용할 수 있다. 이 방법은 글리콜이나 히드록시그룹을 포함하는 약물이나 세포독성 약제의 과요오드화물 산화를 포함하여서, 알데히드를 형성시키고 이를 다시 항체분자와 반응시킨다. 부착은 항체분자의 아미노그룹으로 Schiff 염기를 형성시켜 발생시킨다. 또한 반응성 술포히드릴 그룹을 가진 약물을 항체분자에 결합하였다.

Claims (9)

1. 섬유소원(fibrinogen)-특이성 단일클론 항체.
2. 제1항에 있어서, 섬유소원-특이성 항체를 생성시킬 수 있는 세포와 죽지 않는 세포를 융합시켜 만드는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
3. 제1항에 있어서, 죽지 않는 세포는 골수종세포인 것을 특징으로 하는 단일클론의 항체.
4. 제3항에 있어서, 골수종세포는 새앙쥐 골수종 세포인 것을 특징으로 하는 단일클론의 항체.
5. 제1항에 있어서, 단일클론 항체는 ATCC에 기탁된 기탁번호가 HB 9740인 하이브리도마에서 생산되는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
6. 섬유소원-특이적인 항체를 생산하는 연속 세포 배양주에 있어서, 연속 세포배양주는 죽지않는 세포와 섬유소원-특이성 항체를 생성시킬 수 있는 세포를 융합시켜 형성된 하이브리도마를 포함하는 것을 특징으로 하는 연속 세포배양주(continuous cell line).
7. 하이브리도마 세포배양주 ATCC HB 9740.
8. 시험관에서 혈장 섬유소원인 수준을 결정하는 면역검사 방법에 있어서, 혈장섬유소원과 단클론 항체를 접속시키고 이때 단클론 항체는 섬유소원-특이적인 단클론 항체를 이용하는 개선점을 가지는 것을 특징으로 하는 면역검사 방법.
9. 제8항에 있어서, 섬유소원-특이성 단일클론의 항체는 ATCC에 가틱된 기탁번호 ATCC HB 9740인 하이브리도마에서 생성되는 것을 특징으로 하는 면역검사 방법.