JPH08110339A - 無菌動物を用いたモノクローナル抗体及びその利用 - Google Patents
無菌動物を用いたモノクローナル抗体及びその利用Info
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Abstract
(57)【要約】
【構成】抗原を抗体と接触させることからなる該抗原の
存在を判定するためのイムノアッセイにおいて、改良点
が該抗体として無抗原動物由来の抗体を用いることから
なるイムノアッセイ、無菌動物由来のモノクローナル抗
体またはポリクローナル抗体を利用する方法、フィブリ
ン特異的モノクローナル抗体およびかかるモノクローナ
ル抗体の利用方法。 【効果】本発明により、抗原を抗体と接触させることか
らなる該抗原の存在を判定するためのイムノアッセイ、
モノクローナル抗体および免疫した無菌動物から得られ
たポリクローナル抗体を臨床的診断および治療に利用す
るための方法、並びにフィブリン特異的モノクローナル
抗体が提供される。
存在を判定するためのイムノアッセイにおいて、改良点
が該抗体として無抗原動物由来の抗体を用いることから
なるイムノアッセイ、無菌動物由来のモノクローナル抗
体またはポリクローナル抗体を利用する方法、フィブリ
ン特異的モノクローナル抗体およびかかるモノクローナ
ル抗体の利用方法。 【効果】本発明により、抗原を抗体と接触させることか
らなる該抗原の存在を判定するためのイムノアッセイ、
モノクローナル抗体および免疫した無菌動物から得られ
たポリクローナル抗体を臨床的診断および治療に利用す
るための方法、並びにフィブリン特異的モノクローナル
抗体が提供される。
Description
【産業上の利用分野】本発明は、抗原を抗体と接触させ
ることからなる該抗原の存在を判定するためのイムノア
ッセイ、モノクローナル抗体および免疫した無菌動物か
ら得られたポリクローナル抗体をインビボおよびインビ
トロで臨床的診断および治療に利用するための方法を提
供するものである。また本発明はフィブリン特異的モノ
クローナル抗体をも提供する。
ることからなる該抗原の存在を判定するためのイムノア
ッセイ、モノクローナル抗体および免疫した無菌動物か
ら得られたポリクローナル抗体をインビボおよびインビ
トロで臨床的診断および治療に利用するための方法を提
供するものである。また本発明はフィブリン特異的モノ
クローナル抗体をも提供する。
【従来の技術】ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎが、初
めて成功裡にモノクローナル抗体産生性ハイブリドーマ
を生成させる技法を考案したと一般に考えられている
（Ｇ．ＫｏｈｌｅｒおよびＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９
７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７；１９７
６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，５１１−５１
９）。抗体生成細胞（牌臓Ｂリンパ球）をミエローマ細
胞（骨髄原発性腫瘍の悪性細胞）と融合させることによ
って、単一の融合細胞ハイブリッド（ハイブリドーマま
たはクローンと称される）から生じたハイブリッド細胞
系を作成した。このハイブリドーマはリンパ球とミエロ
ーマ細胞系の両方の特定の性質を受け継いでいた。ハイ
ブリドーマはリンパ球と同様に免疫グロブリンの一タイ
プを分泌し、さらにミエローマ細胞と同様に無限に細胞
分裂を起こす能力を有していた。これら二つの特徴を合
わせ持つことは従来の抗血清をしのぐ明かな利点を提供
した。ワクチン接種した動物から得られる抗血清は、決
して同一に再生産することのできないポリクローナル抗
体の変動性混合物である。モノクローナル抗体は、単一
タイプの高度に特異的な免疫グロブリンである。ハイブ
リドーマにより分泌される免疫グロブリンの単一タイプ
は、多数の抗原決定基を有する複合分子である抗原上の
一つのそして唯一の抗原決定基、すなわちエピトープに
特異的である。たとえば、抗原がタンパク質である場
合、抗原決定基はタンパク質分子全体の内にある多くの
ペプチド配列（一般に６−７アミノ酸の長さである；
Ｍ．Ｚ．Ａｔａｓｓｉ，１９８０，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２，２１−４３）のうちの一つ
であろう。したがって、単一の抗原に対して生じた複数
のモノクローナル抗体は、その抗体を生じさせた決定基
に応じて相互に異なる可能性がある。しかし、任意の所
定のハイブリドーマについては、それが生産するすべて
の抗体が同一である。さらに、ハイブリドーマ細胞系は
インビトロまたはインビボで容易に増殖し、極めて高濃
度のモノクローナル抗体を生成する。モノクローナル抗
体をプローブとして使用してその抗原を検出することが
できる。したがってモノクローナル抗体は、インビトロ
診断例えばラジオイムノアッセイおよびエンザイムリン
クトイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、およびインビボ診
断例えば放射性標識モノクローナル抗体を用いるインビ
ボ像形成に利用されている。また、モノクローナル抗体
をかかる抗体の抗原へ向けてのドラッグデリバリーのた
めの輸送担体として利用することもできる。しかしなが
ら、モノクローナル抗体をかかる目的に利用できる前提
として、必須なことはそのモノクローナル抗体が、関心
の対象となる抗原、すなわち標的抗原と結合する能力を
有することである。この方法は、作成されたハイブリド
ーマをスクリーニングして、もしあるとすればどのハイ
ブリドーマが標的抗原と結合できるモノクローナル抗体
を生産するかを決定することによって実施される。この
スクリーニング方法は非常に冗長であると考えられ、標
的抗原に結合しうる抗体を生産するハイブリドーマが同
定されるまでに、夥しい数の、例えば、おそらく数千個
のモノクローナル抗体をスクリーニングしなければなら
ないかもしれない。従って、ハイブリドーマが標的抗原
に対する抗体を生産する可能性を高めるモノクローナル
抗体の製造方法が必要とされている。
めて成功裡にモノクローナル抗体産生性ハイブリドーマ
を生成させる技法を考案したと一般に考えられている
（Ｇ．ＫｏｈｌｅｒおよびＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９
７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７；１９７
６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，５１１−５１
９）。抗体生成細胞（牌臓Ｂリンパ球）をミエローマ細
胞（骨髄原発性腫瘍の悪性細胞）と融合させることによ
って、単一の融合細胞ハイブリッド（ハイブリドーマま
たはクローンと称される）から生じたハイブリッド細胞
系を作成した。このハイブリドーマはリンパ球とミエロ
ーマ細胞系の両方の特定の性質を受け継いでいた。ハイ
ブリドーマはリンパ球と同様に免疫グロブリンの一タイ
プを分泌し、さらにミエローマ細胞と同様に無限に細胞
分裂を起こす能力を有していた。これら二つの特徴を合
わせ持つことは従来の抗血清をしのぐ明かな利点を提供
した。ワクチン接種した動物から得られる抗血清は、決
して同一に再生産することのできないポリクローナル抗
体の変動性混合物である。モノクローナル抗体は、単一
タイプの高度に特異的な免疫グロブリンである。ハイブ
リドーマにより分泌される免疫グロブリンの単一タイプ
は、多数の抗原決定基を有する複合分子である抗原上の
一つのそして唯一の抗原決定基、すなわちエピトープに
特異的である。たとえば、抗原がタンパク質である場
合、抗原決定基はタンパク質分子全体の内にある多くの
ペプチド配列（一般に６−７アミノ酸の長さである；
Ｍ．Ｚ．Ａｔａｓｓｉ，１９８０，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２，２１−４３）のうちの一つ
であろう。したがって、単一の抗原に対して生じた複数
のモノクローナル抗体は、その抗体を生じさせた決定基
に応じて相互に異なる可能性がある。しかし、任意の所
定のハイブリドーマについては、それが生産するすべて
の抗体が同一である。さらに、ハイブリドーマ細胞系は
インビトロまたはインビボで容易に増殖し、極めて高濃
度のモノクローナル抗体を生成する。モノクローナル抗
体をプローブとして使用してその抗原を検出することが
できる。したがってモノクローナル抗体は、インビトロ
診断例えばラジオイムノアッセイおよびエンザイムリン
クトイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、およびインビボ診
断例えば放射性標識モノクローナル抗体を用いるインビ
ボ像形成に利用されている。また、モノクローナル抗体
をかかる抗体の抗原へ向けてのドラッグデリバリーのた
めの輸送担体として利用することもできる。しかしなが
ら、モノクローナル抗体をかかる目的に利用できる前提
として、必須なことはそのモノクローナル抗体が、関心
の対象となる抗原、すなわち標的抗原と結合する能力を
有することである。この方法は、作成されたハイブリド
ーマをスクリーニングして、もしあるとすればどのハイ
ブリドーマが標的抗原と結合できるモノクローナル抗体
を生産するかを決定することによって実施される。この
スクリーニング方法は非常に冗長であると考えられ、標
的抗原に結合しうる抗体を生産するハイブリドーマが同
定されるまでに、夥しい数の、例えば、おそらく数千個
のモノクローナル抗体をスクリーニングしなければなら
ないかもしれない。従って、ハイブリドーマが標的抗原
に対する抗体を生産する可能性を高めるモノクローナル
抗体の製造方法が必要とされている。
【発明が解決しようとする課題】本発明は、抗原を抗体
と接触させることからなる該抗原の存在を判定するため
のイムノアッセイ、モノクローナル抗体および免疫した
無菌動物から得られたポリクローナル抗体をインビボお
よびインビトロで臨床的診断および治療に利用するため
の方法を提供することを目的とする。また本発明は、フ
ィブリン特異的モノクローナル抗体をも提供することを
目的とする。
と接触させることからなる該抗原の存在を判定するため
のイムノアッセイ、モノクローナル抗体および免疫した
無菌動物から得られたポリクローナル抗体をインビボお
よびインビトロで臨床的診断および治療に利用するため
の方法を提供することを目的とする。また本発明は、フ
ィブリン特異的モノクローナル抗体をも提供することを
目的とする。
【課題を解決するための手段】本発明は、以下を含んで
なるイムノアッセイを提供する：抗原を抗体と接触させ
ることからなる該抗原の存在を判定するためのイムノア
ッセイにおいて、改良点が該抗体として無抗原動物由来
の抗体を用いることからなるイムノアッセイ。本発明は
無菌動物由来のモノクローナル抗体またはポリクローナ
ル抗体を利用する方法をも提供するものである。本発明
はまた、フィブリン特異的モノクローナル抗体およびか
かるモノクローナル抗体の利用方法をも提供する。以
下、本発明を詳細に説明する。 Ｉ． 抗原を抗体と接触させることからなる該抗原の存
在を判定するためのイムノアッセイにおいて、改良点が
該抗体として無抗原動物由来の抗体を用いることからな
るイムノアッセイ：無菌動物由来のモノクローナル抗体
またはポリクローナル抗体を利用する方法 （１）無菌動物 本発明は、モノクローナル抗体生産のための無菌動物の
使用に関する。無菌動物は１９世紀後期に最初に開発さ
れ、それ以来広範に利用されてきている。無菌動物は、
細菌、ウイルス、真菌、原生動物、および他の非病原性
または寄生性形態物を包含するあらゆる論証可能な生命
の関連形を含有しないノトバイオートである。ノトバイ
オートは無菌的帝王切開または卵の無菌孵化により得ら
れた動物または系統であり、アイソレーター条件下で無
菌技法により飼育され連続的に維持される。このような
動物に於いては、関連するあらゆる動物相および植物相
の組成は、もし存在するとしても、一般に認められてい
る現行の方法論によって完全に限定されている。（以下
の点を銘記すべきである。すなわち、すべてのマウスは
潜伏性白血病誘発ウイルスを担持しており、従ってこの
ような白血病誘発ウイルスについて以外は無菌的である
マウスは本発明の目的に関して無菌的であると見なされ
るべきである。） 無菌系の核心は、欲せざる微生物の侵入に対する障壁を
用意することである。動物を囲うプラスチック、金属、
ゴムおよびガラスの物理的障壁に加えて、無菌系は空気
の濾過、食物及び水の滅菌、手袋による操作といった操
作上の障壁を必要とし、このような障壁が障壁系の不可
欠の部分をなす。また、アイソレーターへの物資の搬入
は無菌条件下で行うべきである。あらゆる無菌動物が本
発明に利用できると考えられる。最も一般的な無菌動物
はマウス、ブタ、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ、
ヒツジ、霊長類、および家禽であり、マウス、特にＢａ
ｌｂ／ｃマウスが好ましい。 （２）無菌動物の生産、ケアおよび維持 無菌動物の生産、ケアおよび維持に関しては移しい刊行
物がある。例えば、Ｗｏｓｔｍａｎｎ，Ｂ．Ｓ．編、Ｇ
ｎｏｔｏ−ｂｉｏｔｅｓ：Ｓｔａｎｄａｒｄｓａｎｄ
Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｒｅｅｄｉ
ｎｇ，Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ．Ｎａｉｉｏ
ｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ，Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，
Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９７０；Ｃｏａｔ
ｅｓ，Ｍ．Ｅ．ら、Ｔｈｅ Ｇｅｒｍｆｒｅｅ Ａｎｉ
ｍａｌ ｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９６８；およびＰｌｅａ
ｓａｎｔｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｇｎｏｔｏｂｉｏ−ｔｉｃｓ，
ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｉａｂｏｒａｔｏｒｙ
ＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，第１巻，Ｍｅｌｂｙ，
Ｅ．Ｃ．ほか編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａ
ｔｏｎ，Ｆｌａ．，１１７，（１９７４）、以上の刊行
物は参照としてここにとり込まれる。以下は、Ｗｏｓｔ
ｍａｎｎ，Ｂ．Ｓ．編、Ｇｎｏｔｏｂｉｏｔｅｓ：Ｓｔ
ａｎｄａｒｄｓａｎｄ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｍａ
ｎａ−ｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎ
ｉｍａｌｓ，Ｎａｈｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏ
ｕｎｃｉ１，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．
の無菌ラットおよびマウスの生産、ケアおよび維持を記
述する論文の要約である。かかる生産、ケアおよび維持
は他の動物についても同様である点に留意すべきであ
る。 室内環境 施設、設備、および管理方法は、最大の環境制御と最適
の快適さおよび福利を動物に供与するよう設計され、運
営されるべきである。ケージ、給餌器および給水器は、
動物に最大の快適さを供与し、食物及び水が容易に摂取
できるようにし、そして清掃および滅菌が実行可能で効
率的であるように設計および組み立てられるべきであ
る。大規模な無菌作業のための望ましいフロアプランは
以下からなるべきである： １．アイソレーターを組み立てそして滅菌するための作
業領域、２．動物の入っているアイソレーターを維持す
る領域、および３．ノトバイオートの環境を日常的に監
視するための実験室領域。事務室および飼料調製領域を
フロアプランに組み込んでもよい。ノトバイオートのア
イソレーターを維持するための室内環境は従来の実験用
齧歯類の収容に関して確立された基準に合致しなければ
ならない。その構造は昆虫を通さず、壁および床は防水
性であるべきである。光線は年間を通じて同一の明暗周
期で一定不変であるべきである。換気装置は、化学的な
滅菌により生じたあらゆる煙霧を速やかに除去しなけれ
ばならず、気候条件は以下に詳述するように制御される
べきである。 温度。アイソレーターの温度を２２℃から２６℃の間
（７２から７８°Ｆの間）に保つために、一般に認めら
れている動物の室温、２１−２７℃（７０−８０°Ｆ）
を下方調整する必要があろう。 湿度。相対湿度（ＲＨ）は、ヒトが快適なレベルである
４０−６０パーセントに保つべきである。しかしなが
ら、アイソレーターの換気に室内空気を使用する場合に
は、４０−５０パーセントのＲＨが推奨される。 換気。室内の空気交換は化学滅菌の間に生じたあらゆる
煙霧を速やかに除去するのに十分でなければならない。
１時間当り１０から１５回の空気交換が推奨される。危
険なレベルの化学性煙霧に曝される職員を防護するため
に、新鮮空気換気装置のあるヘッドマスクが利用可能で
あるべきである。 無菌設備 （Ｓａｃｑｕｉｅｔ，Ｅ．１９６８，Ｅｑｕ
ｉｐｍｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍ
ｅｎｔ：Ｇｅｎｅｒａｌ ｔｅｃｈｎｑｕｅｏｆ ｍａ
ｉｎｔａｉｎｉｎｇ ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ ａｎｉｍａ
ｌｓ，ｐ．１−２２ Ｉｎ Ｍ．Ｅ．Ｃｏａｔｅｓ編、
ｔｈｅ ｇｅｒｍｆｒｅｅ ａｎｉｍａｌ ｉｎ ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．Ｌｏｎ
ｄｏｎ：Ｔｒｅｘｌｅｒ，Ｐ．Ｃ．１９６８，Ｅｑｕｉ
ｐｍｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅ
ｎｔ：Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ
ａｎｉｍａｌｓ ａｎｄ ｃｕｒｒｅｎｔ ｄｅｖｅｌ
ｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎｅｑｕｉｐｍｅｎｔ ｄｅｓｉｇ
ｎ，ｐ．２３−３５ Ｉｎ Ｍ．Ｅ．Ｃｏａｔｅｓ編、
Ｔｈｅｇｅｒｍｆｒｅｅ ａｎｉｍａｌ ｉｎ ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄ
ｏｎ参照） 環境中の微生物を完全に排除するには絶対的な障壁が必
要である。アイソレーター操作の成功は、常にそのよう
な障壁を維持することにかかっている。金属とプラスチ
ックの二種類の一般的な種類のアイソレーターがある。
金属性ユニットのなかには、２０ｐｓｉ（１，４０６ｇ
／ｃｍ２）の内部蒸気圧に耐えられるように建造されて
いるものもある。（Ｒｅｙｎｉｅｒｓ，Ｊ．Ａ．１９５
９，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ
ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒｒｅａｒｉｎｇ ｇｅｒ
ｍ−ｆｒｅｅ ａｎｉｍａｌｓ．Ａｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．７８：４７；Ｍｉｙａｋａｗａ，Ｍ．１９
５９．Ｔｈｅ Ｍｉｙａｋａｗａ ｒｅｍｏｔｅ−ｃｏ
ｎｔｒｏ１ ｇｒｅｍｆｒｅｅ ｒｅａｒｉｎｇｕｎｉ
ｔ．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：３７参
照）。また、最初の滅菌のために、大きなオートクレー
ブ内に設置されているものもある（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏ
ｎ，Ｂ．Ｅ．１９５９．Ｌｉｇｈｔｗｅｉｇｈｔ ｓｔ
ａｉｎｌｅｓｓ ｓｔｅｅｌ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ
ｒｅａｒｉｎｇ ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ ａｎｉｍａｌ
ｓ．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：１７参
照）。現在最も広く用いられているユニットはフレキシ
ブルフィルムアイソレーターである（Ｔｒｅｘｌｅｒ，
Ｐ．Ｃ．およびＬ．Ｉ．Ｒｅｙｎｏ１ｄｓ．１９５７．
Ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｆｉｌｍ ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆ
ｏｒ ｔｈｅ ｒｅａｒｉｎｇ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ
ｇｅｒｍｆｒｅｅ ａｎｉｍａｌｓ．Ａｐｐｌ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．５：４０６参照）。このアイソレータ
ーは、通常、伸縮自由の積層のビニルからなり、化学的
に滅菌されなけらばならず、容易に特定の要求に適応で
きる。別の種類はナイロンの大きなチューブからできて
いて、それぞれの末端が縛られており、オートクレーブ
内で滅菌できる。（Ｌｅｖ，Ｍ．１９６２．Ａｎ ａｕ
ｔｏｃｌａｖａｂｌｅｐｌａｓｔｉｃ ｕｎｉｔ ｆｏ
ｒｒｅｒｉｎｇ ａｎｉｍａｌｓ ｕｎｄｅｒ ｇｅｒ
ｍｆｒｅｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．２５：３０参照）。プレキシガラス
アイソレーターおよび使い捨てフレキシブルフィルムユ
ニットも開発されている。これらの多くは十分軽いので
ラック上に２，３個積み重ねることができ、フロアスペ
ースを節約する特徴がある。熱に弱いアイソレーターで
は、一般に食物および供給物を滅菌するための特別なシ
リンダーが用いられる。このシリンダーは高圧オートク
レーブ内で容易に脱気できるよう、大きな濾過部分を有
するよう設計されるべきである（Ｔｒｅｘｌｅｒ，Ｐ．
Ｃ．１９６３．Ａｎ ｉｓｏｌａｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ
ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｃｏｎｔａｍｉｎａ
ｔｉｏｎ．Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．Ｃａｒｅ．１３：５７２
参照）。あるいはまた、減圧によらずに脱気しそして滅
菌中に高圧化するために、シリンダーに大気中に開口し
たドレインチューブを設けることもできる。（Ｊａｗｏ
ｒｓｋｉ，Ｎ．Ｅ．およびＣ．Ｅ．Ｍｉｌｌｅｒ．１９
６３．Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｌｉ
ｎｄｅｒ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｓｕｐｐｌｙ
ｉｎｇｇｅｒｍｆｒｅｅ ｉｓｏｌａｔｏｒｓ．Ｌａ
ｂ．Ａｎｉｍ．Ｃａｒｅ．１３：５９１参照）。 滅 菌 アイソレーター内で使用する設備、食物、下敷、水およ
び空気はすべて完全に無菌でなければならない。用いら
れる方法および条件は個々のアイテムの特性によって決
定される。加圧蒸気は最も良く知られた滅菌法である。
この方法は熱に安定な多孔質アイテムに特に適する。微
生物が潜んでいると考えられ得るあらゆる部分を蒸気に
直接接触させなければならない。蒸気に曝す時間は用い
られる温度に関係する。一度に滅菌する量のうちで最も
到達しにくい部分（パッケージの中心部分）を１２１℃
（２５０°Ｆ）で最低１５分間蒸気に曝すことが推奨さ
れる。無菌性を確保するために注意深く検査した後、よ
り高い温度およびより短い暴露時間を用いてもよい。標
準的なパッケージサイズおよび飼料、下敷、その他の材
料の詰め込み密度は、蒸気の浸透時間が一定で予測可能
であることを保証するためには非常に重要である。乾熱
はアイソレーター用の空気供給の滅菌に用いられている
（Ｍｉｙａｋａｗａ，Ｍ．１９５９．Ｔｈｅ Ｍｉｙａ
ｋａｗａ ｒｅｍｏｔｅ−ｃｏｎｔｒｏｌｇｅｒｍｆｒ
ｅｅ ｒｅａｒｉｎｇ ｕｎｉｔ．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：３７；Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，
Ｂ．Ｅ．１９５９．Ｌｉｇｈｔｗｅｉｇｈｔ ｓｔａｉ
ｎｌｅｓｓ ｓｔｅｅｌ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｒ
ｅａｒｉｎｇ ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ ａｎｉｍａｌｓ．
Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：１７参
照）。過酢酸（ＣＨ３ＣＯＯＯＨ）は、熱に弱く、非多
孔質の、特にフレキシブルフィルムユニットに広く用い
られる。この酸は湿潤剤（界面活性剤）を用いて２％溶
液として使用される（Ｔｒｅｘｌｅｒ，Ｐ．Ｃ．および
Ｌ．Ｉ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ．１９５７．Ｆｌｅｘｉｂｌ
ｅ ｆｉｌｍ ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒｔｈｅ ｒ
ｅａｒｉｎｇ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｇｅｒｍｆｒｅ
ｅ ａｎｉｍａｌｓ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
５：４０６参照）。特別な状況に対しては他の化学物質
例えば、次亜塩素酸塩、ヨードフォア、または第四級ア
ンモニウム化学物を、子宮摘出術により得られた新生仔
を入れる液体トラップに用いることができ、またはＨｇ
Ｃｌ２を解化前に卵を滅菌状態にするために用いること
ができる。湿らすことのできない、熱に弱いアイテムを
滅菌するためには、エチレンオキシド（ＥＴＯ）を用い
ることができる。滅菌時間は温度、湿度、圧力、および
ＥＴＯ濃度によって決まる。ＥＴＯは下敷および飼料成
分と化学的に反応して有毒なまたは望ましくない化合物
を生成する可能性がある。ＥＴＯは引火性で、中毒の危
険があるため、滅菌に日常的にＥＴＯを使用することは
２０パーセント以下のＥＴＯしか含有しない市販のガス
混合物に制限すべきである。空気供給物の滅菌にはファ
イバーガラスフィルターが通常用いられる。このフィル
ターは完壁な濾過装置として機能しなければならない。
メンブランが直径０．２２マイクロメーター以上の粒子
を排除するフィルターのように完壁なフィルターである
ならば、熱に曝すことを避けるために、液体のメンブラ
ン濾過を用いることができる。飼料または他の特別なア
イテムの滅菌にはガンマ線または電子ビーム源による照
射を用いることができる。用いる線量は２．５−６×１
０６ラドまでである。 内部環境 温度。内部のアイソレーター温度は室内環境の関数であ
り、２２から２６℃（７２から７８°Ｆ）の間に維持す
べきである。 湿度。アイソレーターは過剰な負荷、不適切な換気、あ
るいはその両方の場合に、水分の凝縮を受け易い。アイ
ソレーターに入る空気は相対湿度５０パーセント以下そ
して好ましくは４０パーセント以上であるべきである。 空気供給。アイソレーターは時間当り１２から２０回の
換気を行い、３−５インチ（８−１３ｃｍ）水柱の正圧
でなければならない。空気は中央の給源から、あるいは
それぞれのユニット用の個々のブロワーから供給でき
る。中央換気システムとしてはタービン型エアコンプレ
ッサーが推奨されるが、これはオイルピストン型ではオ
イルを空気供給管路中に噴霧する傾向があるためであ
る。空気拡散アイソレーター（Ｔｒｅｘｌｅｒ，Ｐ．
Ｃ．１９６８，Ｂｑｕｉｐｍｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ ａ
ｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ：Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｏｆ
ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ ａｎｉｍａｌｓ ａｎｄ ｃｕ
ｒｒｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｅｑｕ
ｉｐｍｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ，ｐ．２３−３５，Ｉｎ
Ｍ．Ｅ．Ｃｏａｔｅｓ編Ｔｈｅ ｇｅｒｍｆｒｅｅ ａ
ｎｉｍａｌｉｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）は、停電の場合にも換
気中断には陥りにくい。しかしながら、この種類は時間
当りの換気回数が比較的少ないという欠点があり、万一
障壁内に小さな破損部分ができた場合に汚染を防ぐのに
役立つ保護のための正圧に欠ける。緊急時安全装置。停
電や機械的な故障が生じたときにアイソレーター内の空
気圧を維持するための適切な設備が空気供給の遮断から
２，３分以内に供給されなければならない。非固定フィ
ルムアイソレーターの崩壊は、結局動物の窒息に帰着す
るが、より緊急の危険は動物がフィルムや手袋に到達し
これを損なう恐れがあることである。ゴムストッパーを
用いて空気の導管を塞ぐことによってこれを一時的に防
ぐことができる。個々のアイソレーターの空気供給の作
動に必要なのは、唯一、緊急時の電力供給である。中央
換気システムは、非常用空気供給のために、第二のター
ビンコンプレッサーを有すべきである。温度および圧力
の測定記録を取ることが推奨される。電力不足や機械的
な故障が生じた場合にライン圧力の低下によって作動す
るオーディオビジュアル警報システムを中央換気システ
ムに組み込むべきである。同様の警報システムが空気供
給の温度の望ましからざる変動を知らせるべきである。
個々のアイソレーターの換気システムについては、室内
環境について継続的に記録して監視することが推奨され
る。 ケージングおよび内部備品 備品。アイソレーター用の基本的な備品リストには、し
っかりした蓋のついたケージ、水容器および給餌器、ゴ
ム手袋のための布製保護手袋、エキストラドアガスケッ
トまたはキャップをしめるリング、先端にゴムのついた
長いピンセット、止血鉗子、はさみ、タオル、ガーゼス
ポンジ、道具類を入れるための２クオート缶、蓋付き４
クオート食餌缶、スプーン、培養試験管、紙袋、および
汚れた下敷用の耐水バッグが包含される。ケージは、滑
らかな耐腐食性の材質で作るべきである。ケージは液体
を通さず、滅菌が容易でなければならない。許容できる
と考えられる材質にはプラスチック、ステンレス鋼、お
よびガラスが包含される。亜鉛メッキは徐々に腐食し、
微量金属の混入が実験結果に影響を与える可能性がある
ため望ましくない。ケージの大きさは通常、入口部分の
大きさで制限される。雌マウスおよび仔のための最低の
面積は、５０平方インチ（９７０ｃｍ２）である。多く
の状況では、動物当りもっと広いスペースが必要であろ
う。第１表は重量分類によるマウスおよびラットの一匹
当りの推奨される床面積を示す。 その他の注意点 バリアーシステムの完全性を確保するために、微少な漏
れに関するフレオンテストが勧められる。各ユニットを
組み立てて滅菌したときから、そのユニットに関するす
べての操作の時間を追った記録を継続するために、各ユ
ニットはそれ自身の運転記録に備えるべきである。かか
る記録はアイソレーター番号で区別される金属の病院−
チャートホルダーに保管すると便利である。この記録は
例えば手袋の交換といった日常的な保守に関する記録も
含むべきである。飼育記録も同じチャートホルダーに保
管することができる。アイソレーター内部で使用できる
スペースが限られているため、飼料および下敷用に、そ
して無菌通路でつながっているアイソレーター間の動物
の移動のために、紙製で折りたたみ式のコンテナーが望
ましい。静電スパークが生じた場合は爆発するかもしれ
ないのでアイソレーター内ではエーテルを使用すべきで
ない。揮発性で不燃性の麻酔剤としてフルオタン（ブロ
モクロロトリフルオロエタン）が推奨される。 飼料、下敷および水 一般的な注意点 商品として製造された飼料に関する完全な配合が、防腐
剤、抗酸化剤、および他の添加物を含めたすべての成分
およびその濃度を列挙して提供されるべきである。製造
日が明示されるべきである。製造者は飼料が以下の通り
であることを保証すべきである： １．天然に存在するホルモン活性が正常な許容限度内で
ある。 ２．薬物、ホルモン、抗生物質、または異常な生理的状
況をつくり出す可能性があるかあるいは研究操作を妨げ
る可能性のある他のあらゆる物質を含有する添加物を含
まない。 ３．統計学的に選択されたサンプルに基づいてサルモネ
ラ菌を含まない。 ４．齧歯類および害獣の汚染がない。 ５．病原体を含む可能性のある脂肪融出していない肉片
や魚肉をまったく含まない。 飼料の栄養強化 無菌動物の飼料は加熱滅菌によるビタミンの損失 （特にビタミンＢ群の一部とビタミンＡおよびＤ）およ
びタンパク質の栄養価の低下（利用可能なリジン、メチ
オニン、アルギニン、およびトリプトファンの減少）を
補うために、正常な要求量以上にある種の栄養分を含有
しなければならない。また、無菌動物飼料は、 通常の
動物では胃腸管内での微生物合成によって利用可能であ
る要求栄養素も提供しなければならない（Ｒｅｄｄｙ，
Ｂ．Ｓ．，Ｂ．Ｓ．Ｗｏｓｔｍａｎｎ，およびＪ．Ｒ．
Ｐｌｅａｓａｎｔｓ．１９６８ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａ
ｌｌｙ ａｄｅｑｕａｔｅ ｄｉｅｔｓ ｆｏｒ ｇｅ
ｒｍ−ｆｒｅｅ ａｎｉｍａｌｓ，ｐ．８７−１１１，
Ｍ．Ｅ．Ｃｏａｔｅｓ編、Ｔｈｅ ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ
ａｎｉｍａｌ ｉｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ参照）。かかる飼料
の例がＬ−４８５であり、これは大規模に検査され（Ｘ
ｅｌｌｏｇｇ，Ｔ．Ｆ．およびＢ．Ｓ．Ｗｏｓｔｍａｎ
ｎ．１９６９，Ｒａｔ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｓｔｏｃ
ｋ ｄｉｅｔＬ−４８５．Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．Ｃａｒ
ｅ．参照）、商業的に生産できる安価な飼料である（第
２表参照）。タンパク質の質の低下を補うための手段と
して、全タンパク質含量を増加させるよりむしろ特定の
アミノ酸を補うことを考慮すべきである。飼料の全タン
パク質含量を増加させると水の消費および排泄が増加
し、湿った状況を引き起こし、それによって一定の大き
さのアイソレーター内に収容できる動物数が制限され
る。 蒸気滅菌 （Ｒｅｄｄｙ，Ｂ．Ｓ．，Ｂ．Ｓ．Ｗｏｓｔ
ｍａｎｎ，およびＪ．Ｒ．Ｐｌｅａｓａｎｔｓ．１９６
８ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｌｙ ａｄｅｑｕａｔｅ
ｄｉｅｔｓ ｆｏｒ ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ ａｎｉｍａ
ｌｓ，ｐ．８７−１１１ Ｉｎ Ｍ．Ｅ．Ｃｏａｔｅ
［編］．ｔｈｅ ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ ａｎｉｍａｌ
ｉｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｌｏｎｄｏｎ 参照） 実際の方法は利用できる設備によって異なる。三つの要
因が一般に重要である： １．可能な限りいつでも最低２０センチＨｇの滅菌前減
圧を行うことによって、外気に開口したクレーブまたは
シリンダー内の飼料の蒸気浸透が容易になる。用いるシ
リンダーが外気に開口されていない場合には２８インチ
Ｈｇまたはそれ以上の減圧が望ましい。 ２．完全な無菌度を保証する最短の滅菌フェーズを使用
する。設備および技術に応じて安全のための余裕を加え
る。飼料の中心部で測定した温度が最低１２１℃（２５
０゜Ｆ）に達しなければならない。その温度での実際の
滅菌フェーズは最低１５分持続しなければならない。も
っと高い滅菌温度では、滅菌時間は相対的に短くなる。 ３．滅菌後の減圧は飼料温度の低下を速めるであろう。
これは、栄養素の不必要な熱破壊を防ぐであろう。しか
しながら、装置の設計および性能は、この操作段階を行
う間の漏れを防ぐのに適していなければならない。飼料
の蒸気滅菌に於いては、目標は不完全な滅菌、および過
度に長く加熱することによる不必要な栄養の損失の双方
を避けることである。ある程度の栄養素の損失は避けら
れないが、以下をたくみに操作することによってかなり
満足できる結果を得ることができる： （ａ） 温度、時間、滅菌前および滅菌後減圧、および
ペレットの大きさのような技術的手順。 （ｂ） 飼料中の水分含量。水分含量が増加すると滅菌
後のビタミンＢの回収が改善される（Ｚｉｍｍｅｒｍａ
ｎ，Ｄ．Ｒ．，およびＢ．Ｓ．Ｗｏｓｔｍａｎｎ．１９
６３．Ｖｉｔａｍｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｄ
ｉｅｔｓ ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ ｆｏｒ ｇｅｒｍｆ
ｒｅｅ ａｎｉｍａｌｓ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．７９：３１
８）。固形飼料については、２５％までの水分含量、あ
るいは飼料の貯蔵品質と両立すると判明する限り高い水
分含量が望ましい。飼料の水分含量を変化させた後は、
その飼料が滅菌温度に到達する速度をあらためて検査す
べきである。 照射滅菌 （Ｒｅｄｄｙ，Ｂ．Ｓ．，Ｂ．Ｓ．Ｗｏｓｔ
ｍａｎｎおよびＪ．Ｒ．Ｐｌｅａｓａｎｔｓ．１９６８
Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｌｙ ａｄｅｑｕａｔｅ ｄ
ｉｅｔｓ ｆｏｒ ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ ａｎｉｍａｌ
ｓ，ｐ．８７−１１１ Ｍ．Ｅ．Ｃｏａｔｅｓ 編、Ｔ
ｈｅ ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ ａｎｉｍａｌｉｎ ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄ
ｏｎ；Ｌｅｙ，Ｆ．Ｊ．，Ｊ．Ｂｌｅｂｙ，Ｍ．Ｅ．Ｃ
ｏａｔｅｓ，およびＪ．Ｓ．Ｐａｔｅｒｓｏｎ．１９６
９ Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｂｏ−ｒ
ａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌ ｄｉｅｔｓ ｕｓｉｎｇ
ｇａｍｍａ ｒａｄｉａｔｉｏｎ．Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．
３：２２１参照） 技法および線量は照射の設備および種類によって異な
る。一般に、照射滅菌は結果的に栄養素の破壊がより少
ないと考えられるが、現時点では飼料は蒸気で滅菌する
のが望ましい。 無菌度に関する検査。 任意の特定の滅菌方法で達成された無菌度を監視するた
めには、バチルス・ステアロサーモフィルス菌（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）
胞子片の使用が推奨される。この胞子片を飼料の中心部
に埋め込む必要がある。また、アイソレーターおよびそ
の中の動物も定期的に微生物学的に監視すべきである。
かかる監視は、アイソレーターのバリアーの破れに起因
するかあるいはアイソレーターまたはその内容物の不適
切な滅菌に起因する、偶発的な汚染を検出するのに必要
である。これは、Ｗｏｓｔｍａｎｎ，Ｂ．Ｓ．編、Ｇｎ
ｏｔｏｂｉｏｔｅｓ：Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｇ
ｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｒｅｅｄｉｎ
ｇ，Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｍａｎａ−ｇｅｍｅｎｔｏｆ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ，Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ，Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗ
ａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９７０，ｐｐ．２８
−３９の記載にしたがって行うことができる。 滅菌中の栄養価損失の測定 重要な栄養素の損失に関する有用な検査法としては、飼
料添加チアミンの回収の指標として酸で抽出可能なチア
ミンの定量が勧められる（Ｗｏｓｔｍａｎｎ，Ｂ．Ｓ．
およびＰ．Ｌ．Ｋｎｉｇｈｔ．１９６０．Ｔｈｅ ｅｆ
ｆｅｃｔ ｏｆｍｅｔｈｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｏｎ
ｔｈｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆｔｈｉａｍｉｎｅ
ｔｏ ｔｈｉｏｃｈｒｏｍｅ．Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉ
ａ１６：５００ 参照）。２５％以下の回収率は、飼料
の全体的な栄養の質がかなり害われていることを示す。
適当な設備および注意によって、５０％またはそれ以上
の回収率を達成しなければならない。 固形飼料の貯蔵 無菌実験は一般にコストが高いため、栄養価の有意に低
下した飼料を決して使用しないよう特別の注意を払うべ
きである。（ａ）滅菌していない飼料は常に冷蔵で保存
し、決して一ヶ月より長くならないこと、および（ｂ）
滅菌済み飼料のアイソレーター内部での貯蔵期間は一週
間またはそれ以下とし、決して１０日を越えてはならな
いこと、が望ましい。 下 敷 下敷は最低週に一回交換すべきである。下敷の材質は滅
菌が容易で、動物によって容易には食べられないことが
望ましい。滅菌操作の結果として有毒化合物を生じては
ならない。ほこりの立たないストローブマツの破片（の
こぎりくず）およびかんなくずが望ましい。シナノキお
よびポプラのかんなくず、またはつぶしたトウモロコシ
の穂軸は許容できる。珪藻土製品、スギ、樹脂を含む木
材、および堅木は望ましくない。酸化エチレン滅菌は、
有害な化合物が形成される可能性についての疑問が解明
されるまでは用いられるべきでない。 水 飲料水は滅菌されなければならない。角型パック容器、
メイソンジャー、またはユニットに接続したタンク内で
オートクレーブすることができる。各容器の内部に小量
の空気スペースを残す必要がある。 ノトバイオートの帝王切開出産の原理 あらゆる帝王切開の成功の鍵は、一部は妊娠を満期まで
進行させることである。このことは妊娠期間の短い動物
に特に当てはまり、このような動物では胎仔は分娩前の
最後の２４時間にその体重の２０％を獲得することがで
きる。時宣的な交配はほどほどに成功するが、比較的大
きな仔を産む動物（ラットおよびマウス）では、手術を
行う前に、雌が最初の仔を分娩するのを待つことが有用
であろう。モルモットでは、最も満足できる方法は、恥
骨の広がりを測定することによって手術する雌を選択す
ることである（Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｂ．Ｐ．，Ｐ．Ａ．Ｗ
ｏｌｆｅ，およびＨ．Ａ．Ｇｏｒｄｏｎ．１９５９．Ｓ
ｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｒｅａｒｉｎｇ ｔｈｅ ｇｕｉ
ｎｅａ ｐｉｇｇｅｒｍｆｒｅｅ．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：１８３参照）。帝王切開で引き
出された仔が最初の呼吸をする前に、仔は無菌的な環境
中に生み出されなくてはならない。仔は、母体から直
接、子宮切開によって切開した無菌バリアーである膜を
通って無菌のアイソレーターの中へ、または子宮摘出に
よって殺菌トラップを通って無菌のアイソレーターの中
へ、取り出される。帝王切開手術前の雌の通常の手術準
備には腹部の毛の除去および手術部位の清拭および消毒
が包含される。腹部正中線局所麻酔または全身麻酔も危
険なレベルの胎児機能低下や胎児死亡を招くことなく用
いることができるが、ラットおよびマウスでは頸椎の脱
臼によって麻酔を行うのが望ましい。モルモットでは、
手術は一般に予め鎮静後に局所麻酔のもとで行われる。
子宮切開によってバリアー膜を通って仔を出産するため
には特別のアイソレーター設備が必要である。レニアー
ズ ステンレス製外科用ユニット（Ｒｅｙｎｉｅｒｓ，
Ｊ．Ａ．１９６５．Ｇｅｒｍｆｒｅｅ ｌｉｆｅ ｍｅ
ｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（ｇｎｏｔｏｂｉｏ−ｔｉｃｓ）ａ
ｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏ
ｎ．ｐ．４５８−４６６，Ｐｒｏｃ．３ｒｄ Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔ．Ｃｏｎｇｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｂｒｕｘｅ
ｌｌｅｓ参照）には、ユニットの上下のコンパートメン
トを分ける組み込み型の水平金属仕切りがある。この仕
切りには上部コンパートメントの完全な形を維持するた
めにマイラープラスチックフィルムでおおわれた円形の
入口がある。手術の準備をした雌を下部コンパートメン
トに置き、腹部をマイラーに押しつける。すべての手術
道具は上部コンパートメントにあり、この無菌領域で手
術を行う。電気メスまたは小刀を用いて、プラスチック
および皮膚を通して切開を行う。それ自身により滅菌す
る電気メスの刃が皮膚切開には好ましい。皮膚およびマ
イラーの端を一緒にしっかりととめ、反転させる。皮膚
の切断端を覆うために腹部に滅菌した掛け布を掛けそし
て腹腔を開く前にあらわになった筋膜に暖かい消毒液
（ベンザルコニウムクロライド１：１，０００）をかけ
る。腸を切らぬよう細心の注意を払うべきである。一対
の鉗子または止血鉗子を腹膜壁と内臓の間に挿入するこ
とが有用であろう。次に、子宮を開き仔を取り出す。胎
膜を除去し、臍帯を縛って切断する。仔をそっと乾か
し、呼吸を刺激するためにマッサージする。その後仔は
飼育ユニットに移され、養い親の世話を受け、または手
で給餌される。別のマイラーシートを手術用開口部上に
しっかりととめ、以上の手順を５、６匹ほどの雌につい
て、汚染の重大を危険もなく繰り返すことができる。ま
た、手術用ユニットとしてプラスチックアイソレーター
またはグローブバッグを用いて、帝王切開出産を行うこ
ともできる。アイソレーターの床の外側表面を予め滅菌
し、動物の腹部と接触させ、このようにして上記のマイ
ラーシートと同じ目的を果たす。手術後、プラスチック
バリアーのスリットは滅菌テープで閉じることができ、
そして別の妊娠している雌について、手術手順を繰り返
すことができる。プラスチックアイソレーターを用いる
場合には子宮切開による仔の出産がより一般的である
（Ｆｏｓｔｅｒ，Ｈ．１９５９．Ａ．ｐｒｏｃｅｄｕｒ
ｅ ｆｏｒｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｎｕｃｌｅｕｓ ｓｔ
ｏｃｋ ｆｏｒ ａ ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ ａ
ｎｉｍａｌ ｃｏｌｏｎｙ．Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．Ｃａｒ
ｅ９：１３５参照）。子宮を無菌的に露出させ、子宮頸
のすぐ前方で縛る。切り取った子宮を液体の殺菌トラッ
プを通して無菌ユニット内に移す。一たんアイソレータ
ー内に入ると、羊水を吸い込むのを防ぐためにできる限
り速やかに仔を取り出す。臍帯を縛り切断する前に通常
仔を拭い、よく呼吸させる。次に仔を養い親に与えまた
はヒトが飼育する。マウス、ラットおよびブタでは子宮
切開が用いられ成功する。しかしながら、モルモットで
は、もし母親の血液供給遮断とアイソレーター内での出
産の間に２分も経過すると高度の胎児死亡が起こるた
め、子宮切開が好ましい。 ノトバイオート集団の繁殖システム 近交系 従来の繁殖集団で用いられた通常の兄弟姉妹間交配系
を、ノトバイオート集団でも用いることができる。 非近交系 まったくランダムな繁殖には、兄弟姉妹の交配および従
兄弟のある程度の交配が包含される。非近親勾配繁殖集
団では通常かかる交配を避けるが、結果として得られる
交配システムは、可能な限り最大限までは近親交配の割
合を低下させるものではない。近親交配が最低であるよ
うな任意のシステムを利用できる（Ｆａｌｃｏｎｅｒ，
Ｄ．Ｃ．１９６７．Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｓｐｅｃｔｓ
ｏｆ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ．ｐ．７２−
９６ Ｉｎ Ｔｈｅ ＵＦＡＱｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ
ｔｈｅ ｃａｒｅ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔｏ
ｆ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌｓ，第３版、
Ｅ．および Ｓ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，ＬＴｄ．，
Ｌｏｎｄｏｎ；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｃｏｕｎｃｉｌ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ．１
９６９．Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔ
ａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ ａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉ
ｍａｌｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．参
照）。比較可能な従来型集団およびノトバイオート集
団。もし比較目的で従来型集団とノトバイオート集団の
両方を維持することが望ましい場合は、従来型集団の有
効な繁殖集団からノトバイオート集団へ帝王切開で生ま
れた仔を導くことによって、これらの２集団は同様の遺
伝的素質を維持することができる。これが、非ノトバイ
オートラットおよびマウスの生産に最も重点を置く生産
者の選択方法であると思われるが、微生物学的な監視を
簡易化する微生物学的系統の確立を妨げる短所を有す
る。理想的にはこれは、特定の交配からの仔を従来型集
団の繁殖系統として用い、そしてこれら各々の交配から
の次の仔をノトバイオート集団の繁殖系統として用いる
ことによって達成される。もし２、３世代毎にこの方法
にしたがうならば、両方の集団の遺伝的素質は非常に類
似するはずである（もちろん同じ交配システムをそれぞ
れの集団に用いる場合）。あるいはまた、ノトバイオー
ト集団の有効繁殖集団から得られた仔を、従来型集団の
確立または補充に用いることもできる。同じ方法にした
がうならば、遺伝的な結果は同一となるであろう。 記録管理 （Ｗｏｌｆｆ，Ｇ．Ｌ．１９６７．Ｐｒａｃ
ｔｉｃａｌ ｍａｔｉｎｇｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ ｒ
ｅｃｏｒｄ−ｋｅｅｐｉｎｇ ｉｎ ａ ｂｒｅｅｄｉ
ｎｇ ｃｏｌｏｎｙ． ｐ．９７−１１３ Ｉｎ ｔｈ
ｅ ＵＦＡＷｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ ｔｈｅ ｃａｒ
ｅ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆ ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌｓ，第３版、Ｅ．および Ｓ．
Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ参
照）。動物およびアイソレーターの保守に関する適正な
記録を保管すべきである。動物の記録は、手術の有効性
および動物の生物学的な行動を判定するべきである。ア
イソレーターの記録は、時間を追ってアイソレーターに
関する出来事を記録し続けるべきであり、汚染が生じた
場合バリアーのひび割れ箇所を突き止めるのに役立つ。 （３）無抗原動物 本発明の好ましい実施態様に於ては、化学的に定義され
た（ＣＤ）低分子量で水溶性の限外濾過された飼料で無
菌動物を飼育することが好ましい。かかる飼料によっ
て、動物による栄養素および抗原の摂取の完全な制御が
可能になると考えられる。一般に、このような飼料はア
ミノ酸、単糖類、脂質、ビタミンおよびミラルのような
化学的に定義できる成分のみで構成されている。本発明
の目的のためには化学的に定義された飼料はアミノ酸、
単糖類、脂質、ビタミンおよびミネラルを含んでなり、
そして約１０，０００ダルトン以上の分子量を有する他
の成分は含まない。したがって、ＣＤ飼料の全成分は低
分子量であり、動物体内で自然に循環する栄養素であっ
て、それゆえかかる成分は免疫応答を刺激しないと考え
られる。最近の文献はＣＤ飼料で飼育された無菌動物を
「無抗原動物」と呼ぶ。また、濾紙の下敷を用いるのが
好ましい。そうしないと無菌動物が下敷を食べて免疫応
答を引き起こす可能性がある。濾紙の下敷を食べても免
疫応答は生じないと考えられる。特定の種のための特別
なＣＤ飼料は、かかる種について知られている栄養要求
を満たすような割合および量の成分を用いる。無菌マウ
ス用の好ましいＣＤ飼料の組成および調製は以下の通り
である： ＣＤ餌料の詳細な説明についてはＰｌｅａｓａｎｔｓ，
Ｊ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｎｕｔｒ．，１１６，１９４９−１９
６４（１９８６），Ｐｌｅａｓａｎｔｓ，Ｊ．ら、Ｇｅ
ｒｍｆｒｅｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ｍｉｃｒｏｆｌｏｒ
ａ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｉｔｓ Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ，Ｂ．Ｓ．Ｗｏｓｔｍａｎｎ，Ｅｄ．，
ｐ．８７，Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５）；
Ｗｏｓｔ−ｍａｎｎ，Ｂ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｎｕｔｒ．，１
１２，５５２（１９８２）；およびＰｌｅａｓａｎｔ
ｓ，Ｊ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｎｕｔｒ．１００，４９８（１９
７０）を参照されたい。これら開示は参照としてここに
とり込まれる。 （４）モノクローナル抗体の生産 次に、無菌動物をモノクローナル抗体の生産に利用す
る。無菌系を利用して、無菌状態でない動物が生産でき
るあらゆる抗原に対するモノクローナル抗体を生産でき
る。抗原の例示リストは米国特許第３，９３５，０７４
号に明らかである。しかしながら、無菌動物は抗原に対
して非常に増強された免疫応答を示すと考えられる。し
たがって、抗原の特異的なエピトープに結合しうる抗体
を生産するＢ−リンパ球を突き止める確率を高めること
ができる。これが本発明の主要な利点である。さらに、
無菌系は、多数のエピトープを有する抗原に対して高度
に特異的な抗体を生産するのに特に有用であると考えら
れる。無菌動物は標準技法によって免疫することができ
る。しかしながら、無菌動物を各免疫処理の間に最低３
週間おいて最低３回免疫処理し、そのあと融合前追加免
疫することが好ましい。免疫処置のこのような増加は、
通常の２回免疫後に好ましいＩｇＧ分泌性Ｂリンパ球で
はなく、なお主としてＩｇＭ分泌性Ｂリンパ球の存在が
観察されているため、必要であると考えられる。 （５）体細胞 抗体生産能のある無菌動物の体細胞、とりわけＢリンパ
球はＢ細胞ミエローマ系との融合に適する。分裂期の形
質芽球抗体産生細胞が優先的に融合する。体細胞は感作
無菌動物のリンパ節、脾臓および末梢血液から得ること
ができ、そしてリンパ系細胞の選択は、相当程度まで、
特定の融合システムでの経験的な有用性に依存する。し
かしながら、脾臓由来の体細胞が一般に望ましい。ひと
たび感作または高度免疫されると、無菌動物は抗体産生
リンパ球源として使用できる。マウスリンパ球は、高い
割合で以下に記載のマウスミエローマ系との安定な融合
を生ずる。しかしながら、他の無菌動物由来の抗体産生
細胞の使用も可能である。特定の無菌動物の選択は、抗
原の選択によって決まる。これは、その無菌動物が用意
するいくつかのＢリンパ球の中に、かかる抗原に対する
抗体を生産できるＢリンパ球のあることが必須であるた
めである。 （６）不死化細胞 特定の目的に適したミエローマ細胞系が、ハイブリドー
マ産生性融合法で用いるためにリンパ球腫瘍から開発さ
れている（Ｇ．ＫｏｈｌｅｒおよびＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎ，１９７６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１
１−５１９；Ｍ．Ｓｃｈｕｌｍａｎら、１９７８，Ｎａ
ｔｕｒｅ ２７６：２６９−２７０）。この細胞系は少
なくとも三つの理由から開発された。第一の理由は融合
したミエローマ細胞の選択を容易にするためである。通
常、ハイブリドーマの成長を支持する特定の選択培地で
成長できなくするような酵素欠乏を有するミエローマを
用いることによって、これを達成することができる。第
二の理由は、リンパ球腫瘍細胞の、それ自身の抗体を生
産する固有能力から生ずる。モノクローナル技術を使用
する目的は、所望の単一の特異抗体（これはハイブリド
ーマの体細胞成分によって遺伝的に指示される）を生産
する不死の融合ハイブリッド細胞系を得ることである。
ハイブリドーマによる腫瘍細胞抗体の生産を排除するた
めに、免疫グロブリンの軽鎖または重鎖を生産できない
ミエローマ細胞系または抗体分泌機構の欠失した同細胞
系が用いられる。この細胞系を選択した第三の理由はそ
の融合への適性および効率である。融合細胞ハイブリッ
ドの生産にいくつかのミエローマ細胞系が使用でき、こ
れにはマウス由来のＮＳ−１，Ｘ６３−Ａｇ８，ＮＩＳ
−Ａｇ４／１，ＭＰＣ１１−４５．６ＴＧ１．７，Ｘ６
３−Ａｇ８．６５３，Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇｆ１４，ＦＯ，
およびＳ１９４／５ＸＸＯ．Ｂｕ．１．，およびラット
由来の２１０−．ＲＣＹ３．Ａｇ１．２．３が包含され
る。（Ｇ．Ｊ．Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，Ｕ．Ｈａｍｍｅ
ｒｌｉｎｇおよびＪ．Ｆ．Ｋｅａｒｎｌｙ，編、１９８
１，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａ
ｎｄ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ＩｎＪ．Ｌ．Ｔｕｒｋ，
編、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ ｉｎ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ
／Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ
Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ） （７）融 合 抗体産生性脾臓またはリンパ節細胞と不死化細胞とのハ
イブリッドを生成させる方法は一般に細胞膜の融合を促
進する作用剤（類）（化学物質、ウイルスまたは電気）
の存在下において約２０：１〜約１：１まで変動しうる
割合で体細胞と不死化細胞とを混合することから成る。
同種の動物が融合操作に用いられる体細胞および不死化
細胞の供給源として役立てられるのがしばしば好まし
い。融合法はＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１
９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７；１９
７６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１
９），Ｇｅｆｔｅｒら、（１９７７，Ｓｏｍａｔｉｃ
Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．３：２３１−２３６）およびＫ
ｏｚｂｏｒら、１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏ
ｄａｙ，４，７２に記載されている。これらの研究者に
より使用された融合促進剤はそれぞれセンダイウイルス
およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であった。ま
た最近開発されたＥＢＶ形質転換法も利用できる（Ｃｏ
ｌｅら、１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓおよびＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ，Ａｌａ
ｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）。 （８）クローンの単離および抗体検出 融合方法は通常約１×１０−６−１×１０−８の非常に
低い頻度でしか生存能力あるハイブリッドを生成しな
い。生存しうるハイブリッドを得られる頻度が低いの
で、残った未融合細胞、特に未融合ミエローマ細胞から
融合細胞ハイブリッドを選択する手段を有することが必
須要件である。生成した他の融合細胞ハイブリッドの中
から所望の抗体産生ハイブリドーマを検出する方法もま
た必要である。一般に、融合細胞は選択培地、例えばヒ
ポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有す
るＨＡＴ培地中で培養する。ＨＡＴ培地はハイブリッド
細胞の増殖を可能にしそして通常無限に分裂を続ける未
融合ミエローマ細胞の増殖を阻止する。アミノプテリン
はテトラヒドロ葉酸の産生を阻害することにより新たな
プリンおよびピリミジン合成を阻止する。チミジン添加
はピリミジン合成の遮断を迂回し、一方ヒポキサンチン
が培地に包含されているので阻害された細胞はヌクレオ
チドサルベージ経路を用いてプリンを合成できる。使用
されたミエローマ細胞はヒポキサンチンホスホリボシル
トランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を欠く変異種でありし
たがってサルベージ経路を利用できない。生存ハイブリ
ッドにおいては、Ｂリンパ球がこの酵素生産遺伝情報を
供給する。Ｂリンパ球自体は、培養では限定された寿命
しか有しないので（約２週間）、ＨＡＴ培地中で増殖で
きる唯一の細胞がミエローマおよび脾臓細胞から形成さ
れたハイブリッドである。ハイブリッドにより分泌され
た抗体のスクリーニングを促進し、そして個々のハイブ
リッドが他のものより増殖するのをふせぐために、融合
したミエローマおよびＢリンパ球の混合物をＨＡＴ培地
で希釈しそしてマイクロタイタープレートの多重ウェル
で培養した。２−３週間して、ハイブリッドクローンが
顕微鏡で見えるようになったところでハイブリッドクロ
ーンを含有する個々のウェルの上清液を特異的抗体産生
に関してアッセイする。アッセイは感度が良く、簡単で
迅速でなければならない。アッセイ法にはラジオイノム
アッセイ、酵素イムノアッセイ、細胞毒性アッセイおよ
びプラークアッセイが包含される。 （９）細胞増殖および抗体産生 ひとたび所望の融合細胞ハイブリッドが選択され、個々
の抗体産生細胞系にクローン化されると、各細胞系は２
つの標準法のうちいずれかで増殖できる。ハイブリドー
マの試料を最初の融合に体細胞およびミエローマ細胞を
提供するのに用いられた種類の組織適合性動物に注射で
きる。注射された動物は融合細胞ハイブリッドにより産
生された特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を生
ずる。血清または腹水液のような動物の体液を採り、高
濃度のモノクローナル抗体を得る。別の方法としては、
個々の細胞系を実験室培養器でインビトロ増殖させるこ
とができる。単一の特異的モノクローナル抗体を高濃度
に含有する培養培地をデカンテーション、濾過または遠
心により収集できる。 （１０）モノクローナル抗体の使用 本発明の方法により作られたモノクローナル抗体はモノ
クローナル抗体を使用する既知または将来開発されるべ
き任意の方法で使用できる。モノクローナル抗体の主要
な用途は抗原−抗体相互作用の測定であるイムノアッセ
イである。かかるアッセイは一般に不均質または均質で
ある。均質イムノアッセイにおいては、免疫的反応は特
異的抗体、標識した被分析物、および関心のある試料を
通常必要とする。標識から生ずるシグナルは抗体を標識
被分析物に結合させると直接または間接に改変される。
免疫反応およびその程度の検出のいずれも均質溶液中で
行なわれる。使用できる免疫化学的標識にはフリーラジ
カル、蛍光染色、酵素、バクテリオファージ、補酵素そ
の他が包含される。均質イムノアッセイの主な利点は、
特異的抗体が標識被分析物から分離される必要がないこ
とである。不均質イムノアッセイにおいては、試薬は通
常検査試料、特異的抗体、および検出できるシグナルを
生成させる手段である。検査試料は一般にプレートまた
はスライドのような支持体上に載せ、そして液相中の抗
体と接触させる。続いて支持体を液相から分離しそして
支持相かまたは液相をかかるシグナルを生成する手段を
使用して、検出できるシグナルについて検査する。シグ
ナルは検査試料中の被分析物の存在に関連している。検
出できるシグナルを生成させる手段には放射性標識、蛍
光物質、酵素その他の使用が包含される。不均質イムノ
アッセイの例をあげればラジオイノムアッセイ、免疫蛍
光法、エンザイムリンクトイムノアッセイ等である。上
記のイムノアッセイ法のさらに詳しい考案についてはＥ
ｄｗａｒｄ Ｔ．Ｍａｇｇｉｏ，ＣＲＣ Ｐｒｓｅｅ，
Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，１９８０
による“エンザイムイムノアッセイ”を参照。また、例
えば、全てを網羅しているのではないが、米国特許第
３，６９０，８３４；３，７９１，９３２；３，８１
７，８３７；３，８５０，５７８；３，８５３，９８
７；３，８６７，５１７；３，９０１，６５４；３，９
３５，０７４；３，９８４，５３３；３，９９６，３４
５；および４，０９８，８７６号を参照。モノクローナ
ル抗体のもうひとつの主要な用途はインビボ像形成およ
び治療剤である。モノクローナル抗体を放射性化合物、
例えば放射性ヨウ素で標識し、患者に静脈投与できる。
抗体は磁気プローブでも標識できる。続いてＮＭＲを使
用して抗原を正確に探し当てることができる。抗体が抗
原のところに局在化した後、抗原を放射トモグラフィー
および放射性核走査法により検出でき、それにより抗原
の位置を正確に探り当てることができる。説明すると、
精製されたモノクローナル抗体をヒトアルブミンを含有
するかまたは含有しない適切な担体、例えば食塩水中に
適切な用量で懸濁し、そして静脈投与例えばＭｉｌｌｅ
ｒら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｄ
ｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９８２）
（ここに参照としてとり込まれる）に記載されているよ
うに数時間にわたって継続的に静脈注入することにより
投与する。本発明のモノクローナル抗体は治療上使用で
きる。適切な生物学的性質を有する抗体は治療剤として
すぐに役に立つ。あるいはまた、抗体を毒素と結合させ
て免疫毒素を形成させるかまたは放射性物質または薬物
に結合させて放射性薬剤または薬剤を形成させる。抗体
の免疫毒素および放射性薬剤を生成させる方法はよく知
られている（例えばＣａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
Ｒｅｐｏｒｔｓ（１９８４）６８：３１７−３２８参
照）。無菌動物由来のポリクローナル抗体はまたイムノ
アッセイにも使用できそして従来の動物由来のポリクロ
ーナル抗体とべた場合、改善された結果を提供すると考
えられる無菌動物由来のポリクローナル抗体は前記した
無菌動物、前記免疫処理法を用い、続いて従来法、例え
ば動物から血清を分離することにより動物からポリクロ
ーナル抗体を分離することにより作製ができる。 ＩＩ． フィブリン特異性モノクローナル抗体 （１）背 景 止血メカニズムは破損した血管の損傷治癒に係わる複雑
な生理学的応答メカニズムである。止血は損傷した血
管、血小板および凝血系の共同作業的相互作用により達
成される。凝血系の役割は損傷した血管の内皮下の構造
物上に組み立てられている血小板プラグを安定化しつな
ぎとめるための大量のフィブリン網を提供することであ
る。循環フィブリノーゲンからの不溶性フィブリンマト
リックスの形成は必要とされる部位でのトロンビンの爆
発的生産で最高潮に達する複雑な連続反応の結果であ
る。凝血はプロ酵素（凝塊因子）が連続的に活性化され
て活性酵素となるまでの連鎖的酵素反応を伴う増幅過程
である。血栓形成に係わるフィブリン重合過程を制御す
る多数の生理学的メカニズムが存在する。これらにはト
ロンビンインヒビターアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩ
ＩＩ）、プロテインＣ、プロスタサイクリンおよび繊維
素溶解系の種々の成分例えば組織プラスミノーゲンアク
チベーター（ｔ−ＰＡ）およびその即効インヒビターが
包含される。Ａｓｔｒｕｐ １９５６ Ａｓｔｒｕｐ，
Ｔ．，Ｂｌｏｏｄ １１，７８１−８０６（１９５６）
により提案された止血仮説は、フィブリン形成（凝血）
とフィブリン溶解（繊維素溶解）との間にある平衡が存
在すると述べている。正常または健康な状態においては
これらの機能は等しく均衡している。しかしながら、止
血過程がそこなわれると、凝血および繊維素溶解がそれ
ぞれ血栓症および出血として病的に発現される。病的血
栓症または血栓性疾患の臨床的徴候は極度に多様であ
り、そして播種性血管内凝血（ＤＩＣ）、深部静脈血栓
症（ＤＶＴ）、動脈および静脈血栓症が包含される。他
の血管疾患の血栓塞栓症および血栓性合併症（例えばア
テローム性動脈硬化症）は主要 動脈の閉塞を生じて臓
器虚血および、脳血管の発作（卒中）、心筋梗塞、その
他のような付随する生命をおびやかす状態につながりう
る。繊維素溶解過程はプラスミノーゲンアクチベーター
として知られる作用剤の作用により不活性酵素前駆体プ
ラスミノーゲンをタンパク分解酵素プラスミンに変換す
ることを必要とする。生理学的繊維素溶解の分子メカニ
ズムは完全には理解されていないが、フィブリン形成の
間にプラスミノーゲンがフィブリンに結合しそこでそれ
がプラスミノーゲンアクチベーター例えばｔ−ＰＡによ
り活性化されうることが知られている。この様式でプラ
スミン生成が血栓内で進行する。血栓内ではプラスミン
生成はプラスミンの主要な生理学的インヒビター、α２
−抗プラスミンによる不活性化から保護されている。プ
ラスミンにさらされると、フィブリノーゲンおよびフィ
ブリンは分解されてそれらの分解産物を生ずる。フィブ
リノーゲンはフラグメントＸおよびＹに、そしてプラス
ミンにさらにさらされると、フラグメントＤおよびＥに
分解される。フィブリンは非架橋フィブリンからフラグ
メントＸ，Ｙ，ＤおよびＥに、そして架橋フィブリンか
ら架橋Ｄ−ダイマー、Ｄ−Ｄ／Ｅ複合体、Ｙ−ダイマ
ー、Ｙ−Ｄ−ダイマーおよびＸオリゴマーに分解され
る。血栓性障害のマーカーに関するアッセイはラジオイ
ムノアッセイおよびラテックス凝集型のアッセイの両ア
ッセイにおいてポリクローナル抗体を使用してつい最近
まで行なわれている。これらのアッセイはＧａｆｆｎｅ
ｙ（Ｇａｆｆｎｅｙ，Ｐ．Ｊ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．，４０８，４０７−４２３（１９８３）
により、全然信頼できないものであることが示されてい
る。モノクローナル抗体を用いるより特異的でかつ感度
のよいイムノアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）が臨床実験
室において日常行なわれるようになってきている。これ
ら診断アッセイにおける限定的要因は使用される特定の
モノクローナル抗体の特異性およびアフィニティであ
る。損なわれた止血の任意のありうるインジケーターに
対する高度に特異的な抗体の生成は、インジケーターの
レベルの低さおよび血漿中ではるかに高いレベルで通常
存在するその前駆体と特定のマーカーとの抗原関連性の
両方により阻止される。実施例は、酵素およびそのイン
ヒビターとの間の複合体例えばトロンビン−アンチトロ
ンビンＩＩＩ、プラスミン−α２−抗プラスミン、ｔ−
ＰＡ−ＰＡ１−１の形成である。かかる複合体形成によ
り生成される新しい抗原部位の数は極度に少なく、免疫
学的プローブ（例えばモノクローナル抗体）の生産を困
難にしている。同様に、フィブリンに対するモノクロー
ナル抗体を得ることに関連する主要な問題はフィブリン
とその生理学的前駆体フィブリノーゲンとの間の構造的
およびコンホーメーション的相似性である。フィブリノ
ーゲンがフィブリンに変換される場合の共有構造の保存
は ９８％以上と推定されており（Ｐｌｏｗ，Ｅ．
Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａ
ｅｍｏｓｔａｓ，８，３６（１９８２）したがってフィ
ブリン分子のエピトープの少ない割合だけが事実新生抗
原（そしてフィブリンに特有）である。フィブリン抗体
を得るために採用されている多くの方法は可溶性フィブ
リンフラグメントおよび、フィブリン上の露出した新生
抗原部位に似せた合成ペプチドを用いて動物を免疫する
ことに集中している。Ｈｕｉ，Ｋ．Ｙ．，ら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２２，１１２９−３２（１９８３），Ｓｃｈｅ
ｅｆｅｒｓ−Ｂｏｒｃｈｅｌ，Ｖ．，ら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，７０９１−
９５（１９８５），Ｅｌｍｓ，Ｍ．Ｊ．，ら、Ｔｈｒｏ
ｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓ，５０，５９１−９４（１９
８３，およびＫｕｒｄｒｙｋ，Ｂ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍ
ｕｌ．，２１，８９−９４（１９８４）を参照。しかし
ながらかかる抗体の結合部位はフィブリン分解過程中に
も保存されておりしたがってかかる抗体もフィブリン分
解産物に結合することができると考えられている。本発
明はフィブリン特異的モノクローナル抗体を産生するの
に全く異なる方法を取ることを可能にしそして無抗原
（ＡＦ）動物の増強された免疫学的感受性と結合した無
傷のフィブリン抗原を利用するものである。本発明の目
的のためには、フィブリン特異的モノクローナル抗体は
フィブリノーゲン、フィブリノーゲン分解産物またはフ
ィブリン分解産物でなくフィブリンに結合する。 （２）材料および方法 動 物 無菌ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮマウスはｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏ−ｎｓｉｎで維持された無
菌（ＧＦ）群体より得た。この動物をＧＦ条件下で我々
の研究所に輸送した。無抗原（ＡＦ）群体を天然成分食
餌Ｌ−４８５（Ｐｌｅａｓａｎｔｓ，Ｊ．Ｐ．，ら、
Ｊ．Ｎｕｔｒ．１１６，１９４９−１９６４（１９８
６）参照）を与えた妊娠中のＧＦマウスをＡＦアイソレ
イターに移すことから始めた。ＡＦアイソレイターでは
直ちにマウスを化学的に限定された（ＣＤ）ＡＦ食餌に
変えた。天然成分（ＮＩ）食餌に決して直接接触してい
ないそれらの子供を母乳から離乳させてＣＤ飼料にしそ
して第一ＡＦ世代と称した。このＡＦマウスを、雌が妊
娠しているとわかるまで組にしてつがわせた。次に雄を
取り出し雌がそれからは日常の脂質補充物を確実に全部
受取れるようにした。子供は２４日令で離乳させた。 飼育舎 ＡＦ育生種を標準ポリカーボネートマウスケージ２８×
１７．８×１２．７ｃｍの半分に対して飼った。底を切
り取り網目のステンレス鋼の偽底に取り替えた。ステン
レス鋼板の縦方向の仕切りをプラスチックケージの端に
ボルトで止め、ケージをこえて充分上に突き出てステン
レス鋼製網のふたを所定の場所に保持できるようにし
た。通常ケージの内部に収まるこのへこんだふたを逆に
して偽底上に十分な高さの空間を提供できるようにし
た。適切な大きさのステンレス鋼製輪を６０ｍｌ餌料用
ビンを保持するためにふたの上に溶接した。４個のステ
ンレス鋼製カップを偽底および上部との中間で、縦方向
仕切りの両側末端に溶接した（ケージの写真はＰｌｅａ
ｓａｎｔｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｔｈｅ ｇｅｒｍｆｒｅｅ ｓ
ｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ａｇｉｎｇ ａｎｄ ｉｍｍｕｎ
ｉｔｙ Ｉｎ：ＣＲＣＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ａｇｉｎｇ，（Ｋａｙ，Ｍ．
Ｍ．Ｂ．Ｓ．Ｍａｋｉｎｏｄａｎ，Ｔ．，編），ｐｐ．
２５７−２９７，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａ
ｔｏｎ，Ｆｌ．（１９８１）に示されている。餌料用ビ
ンは茶色のガラスであった。餌料および水用のビンの両
方はその中心にドリルであけた穴を有するプラスチック
のふたを有した。ビンを満たし、その輪に倒置した。脂
質補充物をステンレス鋼製カップに毎日測り入れた。プ
ラスチック皿を各ケージの下に置き排泄物を受けるよう
にした。下敷きとしておよび摂収しうる繊維としての両
方の役をする濾紙はクリッピング（Ｓａｒｇｅｎｔ Ｗ
ｅｌｃｈ）として購入したＷｈａｔｍａｎ ａｓｈｌｅ
ｓｓ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ Ｎｏ．４１である。
下敷きにはその紙を細片に切断した。切断していない正
方形の紙をアイソレーターの内部の清掃に使用した。紙
と１２１℃で２５分間オートクレーブするかまたはプラ
スチックバッグ中で照射（４．５Ｍｒａｄ）した。全て
のマウスはケージの片端をおおうのに充分な紙を与えら
れた。それがぬれたり、黄色になるかまたは汚れた場合
は取り替えた。ゲージは標準ノトバイオート法（Ｗｏｓ
ｔｍａｎｎ，Ｂ．Ｓ．，編、Ｇｎｏｔｏｂｉｏｔｅｓ
ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｇｕｉｄｅ Ｌｉｎｅｓ
ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，Ｃａｒｅ ａｎ
ｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ａｎｉｍａｌｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅ
ｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏ
ｎ，Ｄ．Ｃ．）を用いＴｒｅｘｌｅｒ型（Ｔｒｅｘｌｅ
ｒ，Ｐ．Ｃ．，Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．Ｃａｒｅ，１３，５
７２−５８１（１９６３））の１．３７×０．６×０．
６Ｍのフレキシブルアイソレーター内に維持した。アイ
ソレーターは１２時間明暗の時間割で２１℃で室内に維
持した２．５ｃｍ直径の７．５５ｃｍ長さのタイゴン
（Ｔｙｇｏｎ）チューブをアイソレーターの頂部にはめ
こみそして上部および下部両方でビニール栓で閉じた。
これは飼料、水および油の滅菌濾過の入口を提供する。 餌 料 第１表は餌料組成物および限外濾過Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水
（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ）中に成分を溶解させる順
序を示す。アミノ酸およびデキストロースはＳｉｇｍａ
組織培養等級であった。ビタミン類もＨｏｆｆｍａｎ−
Ｌａ Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｃ．（Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）の
善意により供給された純パルミチン酸レチニルを除いて
はＳｉｇｍａからのものであった。他の試薬はＦｉｓｈ
ｅｒ保証または同等品であった。完全に水溶性の食餌を
直径１５０ｍｍの３枚のＰｍ１０膜（Ａｍｉｃｏｎ）を
使用しＡｍｉｃｏｎ Ｄｉａｆｌｏ ＴＣ３限界濾過器
で冷時濾過した。限外濾過膜は分子量カットオフ１０，
０００ダルトンを有した。組立てられた限外濾過装置を
使用に先立ち０．１５％次亜塩素酸ナトリウム溶液を通
過させることにより滅菌にし、続いて充分に洗浄した。
限外濾過餌料は必要時まで無菌貯蔵器中４℃で保存し
た。餌料はＮｏ６ネオプレン栓に挿入された配送用チュ
ーブを有するオートクレーブずみ加圧フィルターホルダ
ー中の０．２μｍナイロン（ＭＳＩ）を使用してＡＦア
イソレーターに導入した。この目的には、アイソレータ
ーの上部にさしこまれたタイゴンチューブから上部のビ
ニール栓を取りはずし、チューブの内部を０．１％アル
キル−アリールスルホネートを含有する２％過酢酸の滅
菌溶液でスプレーした。フィルターホルダー栓を上部栓
の場所に挿入した。２０分後、下部の栓を取りはずし
（アイソレーターの内部）そして餌料または水を２０ｐ
ｓｉの窒素下でアイソレーターに濾過して入れた。脂質
補充物の組成を第２表に示す。大豆のトリグリセリドは
パルミテートからリノレネートまでのエステルを生成す
る温度範囲で真空蒸留したそれらのメチルエステルから
つくられた調製物であった。これらのエステルを続いて
グリセリンとエステル交換して混合トリグリセリドを形
成させた。（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ Ｐｒｅｐ，Ｅｌｙｓｉａ
ｎ，ＭＮ）。この混合物をアイソレーターに濾過して入
れる（その時には混合物は５０℃に加温）に先立ちこの
トリグリセリド混合物に脂溶性ビタミンを加えそして餌
料の水溶性部分について用いたと同じ方法によりアイソ
レーター中に濾過して入れた。脂質の摂取料は０．３７
５ｍｌ／日と測定された。脂質補充物を増大させること
により、新生マウスの死亡率が著しく減少した。平均の
仔寸法も従来通り飼育した動物のそれまで増加した。授
乳中の雌は正常量の２倍の脂質補充物を与えられた。 微生物学的監視 無抗原系を微生物汚染についてＷｏｓｔｍａｎｎ，Ｂ．
Ｓ．編（１９７０）Ｇｎｏｔｏｂｉｏｔｉｃｓ Ｓｔａ
ｎｄａｒｄｓ ａｎｄ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓｆｏｒ
ｔｈｅ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｃａｒｅ ａｎｄ ｍａｎ
ａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉ
ｍａｌｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏ
ｕｎｃｉｌ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．
に記載されたガイドラインに従い検査した。要約する
と、アイソレーター内部からの餌料および水で湿ったス
ワブを用いて、マウスからおよび各ゲージの下の蓄積し
た排泄物から新しく排泄物の塗抹標本を得た。また塗抹
標本はアイソレーターの壁、特に入口周辺からも採取し
た。常に二通り塗抹標本を取った。そのひとセットを、
グラム染色を用いて細菌および真菌について直接顕微鏡
検査により検査した。スワブの第２組は微生物の検出に
用いた。培養物が陰性であると見られるまで三週間経過
させた。微生物学的検査は約２週間ごとにまたはアイソ
レーターに新しい加入がなされた２−３日後に行った。 （３）無抗原マウスを用いるモノクローナル抗体の生産 前記無抗原マウスをモノクローナル抗体生産におけるリ
ンパ球ドナーとして用いた。全抗原の溶液は層流フード
中で無菌条件下に調製した。下記プロトコールをＡＦマ
ウスの免疫化に採用した。抗原（２５−５ｏμｇ）を無
菌食塩水（１００μｌ）に溶解させ、そして同量のフロ
インド完全アジュバント（ＦＣＡ）で乳化した。インタ
ーフェロン（１０００単位）を乳濁液調製に先立ち抗原
の溶液に添加した。無菌注射器および針を全ての免疫処
置に使用した。注射器を入口を通してＡＦアイソレータ
ーに搬入し、そこで過酢酸（２％）の溶液でスプレーす
ることにより滅菌した。ブースター注射は同量の抗原を
用い、ＦＣＡをフロインド不完全アジュバントで置き換
えて行った。全部で３回のブースター免疫を各３週間間
隔で行った。最後のブースター（アジュバントなし）は
融合の４−７日前に行った。全ての免疫処置は腹腔内に
行った。マウスを融合の当日にアイソレーターから取り
出しそしてＣＯ２窒息によりすぐに殺した。脾臓を取り
出して脾細胞を標準ハイブリドーマ法を用いてマウスミ
エローマ細胞（ＮＳｌ）と融合させた。 （４）フィブリン特異的モノクローナル抗体生産のため
の無抗原動物系の使用無抗原系を用いてフィブリン特異
的モノクローナル抗体を生成させた。抗体は特異性が高
く、そしてフィブリノーゲン、フィブリン分解産物また
はフィブリノーゲン分解産物を認識しない。ハイプリド
ーマ細胞系はヒトフィブリンで免疫化した無抗原ＢＡＬ
Ｂ／ｃマウスの脾細胞およびＮＳｌミエローマ細胞の融
合により生成させた。 免疫処置日程 ８週令の３匹の雌の無抗原マウスをヒトフィブリン調製
物３３μｇで免疫処置した。この調製物は、下記のよう
に調製されたフィブリンのフリーズフラクチャー試料で
あった：ヒトフィブリノーゲンをトロンビンおよび第Ｘ
ＩＩＩａ因子によりフィブリンに変換した。次にフィブ
リン凝塊を液体窒素中で凍結させそして機械的破壊によ
り非常に微細な粉末となした。フリーズフラクチャーし
たフィブリンの分散液を食塩水中に生成させて最終濃度
１ｍｇ／ｍｌを有する架橋フィブリンＸＬ−Ｆｎの透明
溶液を得た。このフィブリン抗原の３３μｌを動物の免
疫化に使用した。抗原溶液の量を無菌食塩水で１００μ
ｌに調整し、次に前項記載のようにしてＦＣＡで乳化し
た。２回のブースター免疫処置をフロインド不完全アジ
ュバント中の同レベルの抗原を用い、３週間間隔で投与
した。最後のブースターは融合４日前に行った。同レベ
ルの抗原を用いそしてアジュバントを食塩水で置き換え
た。 抗体の検出および測定 モノクローナル抗体の定性的および定量的測定はエンザ
イムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）
を用いて行った。ＥＬＩＳＡは９６ウェルＰＶＣプレー
ト（Ｃｏｓｔａｒ）上に固定化したヒトフィブリンを用
いて実施した。フィブリン被覆したアッセイプレートは
フィブリノーゲン溶液（Ｋａｂｉ、等級Ｌ）（５０μｇ
／ｍｌボレート／食塩緩衝液）の１００μｌを４℃にて
一夜インキュベートすることにより調製した。未結合フ
ィブリノーゲンは０．０５％ツィーン８０を含有するＰ
ＢＳ（ＰＢＳ−ツィーン）で洗浄することにより除去し
た。各プラスチックウェル上に被覆したフィブリノーゲ
ンを２ｍＭ ＣａＣｌ２を含有するトロンビン溶液（１
０ＮＩＨ 単位／ｍｌ）１００μｌと３７℃で１時間イ
ンキュベートすることによりフィブリンに変換した。抗
体の標準検量曲線はＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば均質であ
る抗体調製物を用いて作成した。非特異的結合を阻止す
るために、フィブリンを被覆したプレートをＰＢＳ ｐ
Ｈ７．４中のＢＳＡの１％溶液とインキュベートした。
次に抗体含有溶液（１００μｌ）を添加し、３７℃で９
０分間インキュベートした。手順の各工程後、ウェルを
ＰＢＳ−ツィーンで充分に洗浄した。結合された抗体は
１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ８．０、中で希釈し
たアルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）接合ウサギ抗
−マウス抗体の１０００倍希釈物を添加することにより
検出した。 ハイブリドーマの産生−融合 マウスをＣＯ２窒息により殺しそして直ちに脾臓摘出を
行った。免疫化マウスの脾臓細胞を融合剤ポリエチレン
グリコール４０００（３，０００−３，７００）を用い
て融合した。細胞をＴフラスコ中のＨＡＴ選択培地で１
週間インキュベートした。この期間の後、細胞を５個の
９６ウェルプレートに塗布すると、そのうち９３ウェル
が増殖を示した。これらのうち、１９ウェルはフィブリ
ン抗原に関して陽性であった。これらのクローンのうち
のひとつＦ４９２Ｄ８（後にＭＨ１と改称）は、フィブ
リン抗原は認識するがフィブリノーゲンと交差反応しな
い抗体を産生した。この特別のクローン、ＭＨ １を限
界希釈法で３回再クローンし、第三のクローニング期は
１ウェル１細胞で行った。細胞系が、いったん安定化さ
れると、無血清培地に移した。この細胞系は約７．５ｍ
ｇ／ｌレベルで抗体を産生する。 モノクローナル抗体の精製 精製に先立ち（４ｌバッチの）組織培養上清を遠心して
細胞屑を除去し、そして０．８μＭナイロン膜で濾過し
てすべての残留微粒子物質を除去した。ハイブリドーマ
上清は分子量カットオフ３０，０００を有するＹＭ型の
膜（Ａｍｉｃｏｎ）を用いてらせん巻き限外濾過装置を
使用して４℃にて５００ｍｌ量まで濃縮した。２０ｍＭ
２（Ｎ−モルホリン）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、
ｐＨ６（緩衝液Ａ）への緩衝液交換は製造業者の説明書
に従いダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａ
ｔｉｏｎ）により達成した。最終容量１００ｍｌとなる
までさらに濃縮した後、抗体溶液をさらに精製する前に
０．４５１ミクロンナイロン膜で濾過した。濃縮した抗
体溶液を７．７５ｍｍ×１０ｃｍ ＡＢｘカラム（Ｊ．
Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）を
用いるＷａｔｅｒｓＨＰＬＣクロマトグラフィーでの液
体クロマトグラフィーにより精製した。カラムを緩衝液
Ａで平衡化し、試料（１００ｍｌ）を１．０ｍｌ／分の
流速で注いだ。緩衝液Ａで充分に洗浄した後、抗体を緩
衝液Ａから１００％緩衝液Ｂ（１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ
７）のグラジィエントを用いてカラムから１ｍｌ／分で
溶出させた。フラクション（２ｍｌ）を収集し、ＭＡｂ
（ＥＬＩＳＡにより測定）を含有するものをプールして
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（２０ｍＭリン酸ナトリウ
ム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）で透析
し、１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で−２０℃にて保存した。
ＡＢｘカラムは１００％緩衝液Ｂで５分間洗浄し続いて
１５カラム量の緩衝液Ａで再度平衡化することにより再
生した。 （５）フィブリン特異性の測定 フィブリン特異性の最初の測定はハイブリドーマ上清を
フィブリンおよびフィブリノーゲン被覆マイクロタイタ
ープレートで別々にスクリーニングすることにより行っ
た。フィブリノーゲンと交差反応しない抗体を産生する
細胞系のみが受容された。フィブリン特異性のそれ以上
の確認は溶液中のフィブリノーゲンとの競合アッセイを
用いて測定され、それによりこの抗体が溶液中のフィブ
リノーゲンを認識しないことが確認された。抗体のフィ
ブリン特異性を確認するのに用いられる競合アッセイは
前記ＥＬＩＳＡアッセイで記載されるようにして行わ
れ、抗体を溶液中のフィブリノーゲンとプレインキュベ
ーションした。要約すると、ハイブリドーマ上清を、抗
体のフィブリノーゲンへの非特異的結合を阻止するため
にＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を含有する生理学的濃度の
フィブリノーゲン溶液（４ｍｇ／ｍｌ）と３７℃で３０
分間インキュベートした。次にフィブリノーゲン／抗体
溶液を、フィブリンを被覆したマイクロタイタープレー
トのウェルに移した。ＧｌｙＰｒｏＡｒｇＰｒｏ（ＧＰ
ＲＰ）を、フィブリンウェル中に残留するトロンビンに
よるフィブリノーゲンのありうる重合防止するためにフ
ィブリノーゲンインヒビターに添加した。次にアッセイ
を固定化抗原に結合された抗体に関する慣用のＥＬＩＳ
Ａアッセイと同様にして実施した。ＭＨ １抗体のフィ
ブリン特異性を検査する全ての実験において、第２の抗
体４５Ｊを対照として用いた。４５Ｊはフィブリンおよ
びフィブリノーゲンと交差反応する。 フィブリノーゲンとの交差反応の測定 ｉ）固定化されたフィブリンおよびフィブリノーゲン 細胞系ＭＨ１は、フィブリンがＰＶＣマイクロタイター
アッセイプレートの表面に固定化された場合、それと交
差反応するマウスモノクローナル抗体を産生する（第５
表）。同じアッセイにおいて、この抗体はプレートに固
定化されたフィブリノーゲンを認識しない。第５表のデ
ータが示すように、フィブリノーゲンがいったんトロン
ビンによりフィブリンに変換されると免疫反応は劇的に
増大し、このことはフィブリン分子上の新しいエピトー
プの露出または形成を明らかに示している。しかしなが
ら対照抗体である４５Ｊはフィブリノーゲンがフィブリ
ンに変換された場合に保存されているエピトープを明ら
かに認識する。 ｉｉ）フィブリンおよびフィブリノーゲンとの競合アッ
セイ 抗体、ＭＨ１抗体のフィブリン特異性は、ハイブリドー
マ上清をフィブリン被覆ウェル上でのＥＬＩＳＡに先立
ちフィブリノーゲン溶液（最終濃度４ｍｇ／ｍｌ）とプ
レインキュベートする競合アッセイでさらに示された。
かかる高レベルのフィブリノーゲンをこの競合アッセイ
に用いたので（抗体濃度の×５００）、ＢＳＡ（最終濃
度１０ｍｇ／ｍｌ）を混合物に添加した。フィブリン被
覆ウェル上の残留トロンビンによるフィブリン重合を阻
止するためにペプチドＧＰＲＰを添加した。このアッセ
イの結果は、ＭＨ１抗体が溶液中のフィブリノーゲンを
認識しないことを示している（第６図）。フィブリン４
００ｎｇがマイクロタイターアッセイプレートの各ウェ
ルに結合すると仮定すると、この特別の競合アッセイに
使用されたフィブリノーゲンレベルは結合フィブリン抗
原よりも１，０００倍過剰である。さらに、これは組織
上清中の抗体レベルの４００倍過剰である。 フィブリン（ブィブリノーゲン）分解産物との交差
反応性の測定 フィブリノーゲン分解産物（ＦＤＰ）はフィブリノーゲ
ンをプラスミンと３７℃で１０分〜３時間インキュベー
トすることにより調製した。所望の時間にトラシロール
（Ｔｒａｓｙｌｏｌ）（１００カリクレイン インヒビ
ター単位／ｍｌ）および２０ｍＭイプシロンアミノカプ
ロン酸（ＥＡＣＡ）の添加によりフィブリノーゲン分解
を停止させた。架橋フィブリン分解産物（ＸＬＦＤＰ）
は、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、プラスミノーゲン（０．２
５ｍｇ／ｍｌ）およびウロキナーゼ（５０ＩＵ／ｍｌ）
を含有するトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ，ｐＨ７．４、５
０ｍＭ トリスＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中のフ
ィブリノーゲン溶液（５ｍｇ／ｍｌ）にトロンビン（４
ＮＩＨ 単位／ｍｌ）を添加することにより調製した。
この混合物を３７℃でインキュベートしそしてプラスミ
ン消化を前記ＦＤＰで記載したようにして種々の時間間
隔で終了させた。抗体とフィブリン分解産物およびフィ
ブリノーゲン分解産物との交差反応性を測定するために
は、適当な分解産物をマイクロタイタープレートに被覆
しそして常法によりＥＬＩＳＡを行った。第７表の結果
が示すように、ＭＨ１抗体はプラスミンにより生成され
たフィブリノーゲン分解産物のいずれとも交差反応しな
い。第８表が示すとおり、この抗体はＸＬ−フィブリン
分解産物と反応しない。また、抗体をウェスタンブロッ
ティング分析により交差反応性について検査した場合に
もこの観察がなされた。抗体は、前駆体分子フィブリノ
ーゲンの表面上に存在しないか露出されていない無傷の
フィブリン分子のエピトープを認識するという結論が導
き出されうる。このエピトープは第８表のデータが示唆
するとおり、架橋フィブリンのプラスミン消化により明
らかに破壊される。従って、ＭＨ１抗体は以下のように
定義されうるフィブリン特異的モノクローナル抗体であ
る。すなわち本発明の目的にとって、フィブリン特異的
モノクローナル抗体は次のようなモノクローナル抗体で
ある： １．前記した、フィブリンおよびフィブリノーゲンとの
交差反応性を測定するための競合アッセイにおいて、こ
のモノクローナル抗体はフィブリノーゲンがフィブリン
と比較して１０００倍過剰量で用いられた場合にフィブ
リノーゲンと約７５％以下、そして好ましくは約１０％
以下の交差反応性しか有しない、 ２．前記した、架橋フィブリンおよびフィブリン分解産
物との交差反応性を測定するためのアッセイにおいて、
このモノクローナル抗体と、プラスミンで約３時間消化
したフィブリンとの反応性はモノクローナル抗体とフィ
ブリンとのゼロ時間における反応性の約５０％以下、そ
して好ましくは約４０％以下である、および ３．前記した、フィブリノーゲンおよびフィブリノーゲ
ン分解産物との交差反応性を測定するためのアッセイに
おいて、このモノクローナル抗体と、プラスミンで約４
時間消化したフィブリノーゲンとの反応性はゼロ時間で
のこのモノクローナル抗体とフィブリノーゲンとの反応
性より決して大きくない。ＭＨ１抗体は、そのフィブリ
ンに対するアフィニティを測定することによりさらに特
性決定されている。アフィニティは１２５Ｉ標識ＭＨ１
抗体を用いスカッチャード分析（Ｆｒａｎｋｅｌら、Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６，１０
１−１０６（１９７９））により測定した。解離定数Ｋ
Ｄについて得られた値は６．７×１０−１０Ｍであっ
た。かかるアフィニティはフィブリンに対するｔ−ＰＡ
のアフィニティのそれの約５，０００倍である。ＭＨ１
抗体がフィブリノーゲンのＡα、Ｂβまたはガンマ鎖と
交差反応しないこともウェスタンブロッティング分析に
より測定されている。また、ＭＨ１抗体がフィブリノー
ゲンのトロンビン処理ＡαまたはＢβ鎖と交差反応しな
いことも同じ分析法により測定されている。（フィブリ
ノーゲンのトロンビン処理は、Ａα鎖およびＢβ鎖から
それぞれフィブリノペプチドＡおよびフィブリノペプチ
ドＢの放出を生じ、それゆえフィブリンのα鎖およびβ
鎖が形成される。） 加えて、第７表の結果が示すとおり、対照抗体４５Ｊ抗
体はフィブリノーゲンに結合しそしてフィブリノーゲン
分解産物とは交差反応しない。従って、かかるモノクロ
ーナル抗体はフィブリノーゲン特異的モノクローナル抗
体であって本発明のもう一つの観点を表わすものであ
る。フィブリノーゲン特異的モノクローナル抗体は、イ
ンビトロで血漿フィブリノーゲンレベルを測定するのに
利用できる任意のイムノアッセイに使用できる。４５Ｊ
抗体は、４５ＪエピトープがフィブリノーゲンのＡα鎖
のアミノ酸およそ２０６からおよそ４２４までの領域に
あり、そしておよそ２０７からおよそ２３１までの領域
にある可能性が最も高いことが測定されているという点
でさらに特性決定されている。本発明の目的にとって、
フィブリノーゲン特異的モノクローナル抗体は前記した
ように、フィブリノーゲンおよびフィブリノーゲン分解
産物との交差反応性を測定するアッセイにおいて、プラ
スミンで約４０分間消化したフィブリノーゲンとそのモ
ノクローナル抗体との反応性がモノクローナル抗体とフ
ィブリノーゲンとのゼロ時間での反応性の約５０％以下
である抗体である。４５Ｊハイブリドーマはフィブリン
で免疫した慣用のＢａｌｂ／ｃマウスを用いる常法によ
り作られた。しかしながら、フィブリノーゲンも抗原と
して利用できる。 非架橋フィブリンおよび非架橋フィブリン凝血塊と
の交差反応性の測定 抗体ＭＨ１は架橋フィブリン（ＸＬＦｎ）とのみならず
非架橋フィブリン（ＮＯＮＸＬＦｎ）とも交差反応する
ことがＥＬＩＳＡにより示されている。ＥＬＩＳＡは以
下のようにして行われた。 １．９６ウェルマイクロタイターアッセイプレートを１
００μｌのフィブリノーゲン溶液（ボレート（ｐＨ８．
５）食塩水緩衝液中５０μｇ／ｍｌ）で４℃で一夜被覆
した。 ２．架橋フィブリンは、２ｍＭ ＣａＣｌ２および１０
ｍＭシステインを含有するトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ、
ｐＨ７．４、５０ｍＭ トリスＨＣｌ、１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ）中のトロンビン溶液（１０ＮＩＨ 単位／ｍ
ｌ）と３７℃で１時間インキュベーションすることによ
りフィブリノーゲン被覆ウェル中で形成された。 ３．非架橋フィブリンはＥＤＴＡを最終濃度０．０１２
５Ｍまで含有するりん酸塩緩衝液（ｐＨ６．１）中のト
ロンビン溶液（１０ＮＩＨ 単位／ｍｌ）と３７℃で１
時間インキュベーションすることにより、フィブリノー
ゲン被覆ウェル中で形成された。 ４．結合された抗体は抗マウスアルカリホスファターゼ
接合体とインキュベーションすることにより測定した。
結合された接合体はアルカリホスファターゼ基質を添加
することにより測定しそして生ずる比色反応を自動式プ
レート読みとり器中４０５ｎＭで監視した。 アッセイの結果を第９表に示し、そして架橋フィブリン
との抗体の交差反応性はそれと非架橋フィブリンとのそ
れより大きいと結論できる。最も簡単な説明は架橋重合
体状構造中に存在する共有架橋が抗体が認識するコンホ
ーメーションを固定または凍結させる役目をするという
ことである。非架橋種ではコンホーメーションは形成さ
れはするが重合体の共有結合によって安定化されていな
い。この抗体がインビトロで形成された架橋および非架
橋凝血塊の両方と交差反応することも示されている。架
橋フィブリンは、フィブリノーゲン溶液（ＣａＣｌ
２（２ｍＭ）およびシステイン（１０ｍＭ）を含有する
トリス（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）食塩水中）をトロンビ
ン（１０ＮＩＨ 単位／ｍｌ）と３７℃で３時間インキ
ュベートすることにより調製した。非架橋フィブリン
は、ＥＤＴＡを最終濃度０．０１２５Ｍまで含有するり
ん酸塩緩衝液（ｐＨ６．１）中のフィブリノーゲン溶液
（３ｍｇ／ｍｌ）をトロンビン溶液（１０ＮＩＨ 単位
／ｍｌ）と３７℃で３時間インキュベートすることによ
り形成された。凝血塊の形成後、これらを洗浄しそして
１２５Ｉ−標識ＭＨ１抗体を含有する１％ＢＳＡ溶液４
００μｌと３７℃でインキュベートした。種々の時点で
少量の溶液をとり出しそして抗体とり込みの量をガンマ
カウンター中で血漿を計測することにより測定した。第
１０表は非架橋および架橋凝血塊の両方による抗体のと
り込みを示す。 （６）ハイブリドーマの寄託 ＭＨ１および４５Ｊは１９８８年６月９日にアメリカン
タイプ カルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託
されておりそしてそれぞれ受託番号ＨＢ ９７３９およ
び ＨＢ ９７４０を与えられた。ＡＴＣＣは１２３０
１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ，ＭＤ．２０８５２にある。ＭＨ１抗体はカッパ軽鎖
を有するＩｇＧ１抗体でありそしてＭＨ１抗体はヒトフ
ィブリンのみならずウサギフィブリンとも交差反応する
ことが観察されている。本発明は寄託されたハイブリド
ーマにその範囲が限定れることを意図するものではな
く、これらはここに定義されるようにフィブリン特異的
モノクローナル抗体およびフィブリノーゲン特異的モノ
クローナル抗体を生成したハイブリドーマの単一の説明
例であることが意図される。機能的に同等なすべての細
胞系が本発明の範囲内にある。“機能的に同等”なる用
語は、ＭＨ１抗体が結合するフィブリンのエピトープへ
の結合または４５Ｊ抗体が結合するフィブリノーゲンの
エピトープへの結合においてそれぞれＭＨ１抗体または
４５Ｊ抗体とその抗体が競合しうることを意味する。さ
らに、かかる用語にはここに記載されるように、ＭＨ１
抗体が結合しそして４５Ｊ抗体が結合するエピトープと
は異なるエピトープに結合するフィブリン特異的モノク
ローナル抗体およびフィブリノーゲン特異的モノクロー
ナル抗体がそれぞれ包含される。 （７）フィブリン特異的モノクローナル抗体のインビボ
診断用途および治療用途 凝血塊／血管病所在確認 本発明のフィブリン特異的モノクローナル抗体はインビ
ボでフィブリン凝血塊またはフィブリン集塊を標的ねら
いしうる。それゆえこれらはヒトのありうる組織または
血管損傷の局在判定および血管疾患の監視に用いること
ができる。フィブリン特異的モノクローナル抗体は、か
かるモノクローナル抗体がフィブリノーゲン、フィブリ
ン分解産物およびフィブリノーゲン分解産物に結合せ
ず、それによりバックグラウンドを低下させ、このこと
によりフィブリン凝血塊またはフィブリンの集塊物をよ
り正確に所在確認できるので、この用途に特に好まし
い。この応用にとっては、精製モノクローナル抗体の使
用が好ましい。精製はＨＰＬＣ法でなされるのが好まし
い。ヒトへの投与用のモノクローナル抗体の精製はまた
硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウム沈澱に続く食塩
水での透析および濾過滅菌によっても達成できる。ある
いはまた、イムノアフィニティクロマトグラフィー法を
モノクローナル抗体の精製に用いることもできる。精製
モノクローナル抗体は放射性化合物例えば、１２３Ｉ、
１２５Ｉ、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎで標識し
そして患者に静脈投与することができる。抗体は磁気プ
ローブで標識することもできる。次に凝血塊の位置を正
確に指摘するのにＮＭＲを利用できる。凝血塊またはフ
ィブリン集塊物での抗体の局在確認後、それらを放射形
トモグラフィー法および放射性核走査法により検出し、
それにより例えば血栓またはフィブリンによりカプセル
化された腫瘍の位置を正確に指摘できる。例示するに
は、精製モノクローナル抗体を適当な担体例えばヒトア
ルブミンを含有または含有しない食塩水中に適当な用量
で懸濁させ、そして患者に投与する。このモノクローナ
ル抗体は好ましくは静脈投与、例えば数時間にわたり連
続して静脈注入することにより投与される。 血管疾患のモノクローナル抗体接合体を用いる治療 本発明のモノクローナル抗体は広範囲の薬剤例えば細胞
毒剤および血栓溶解剤例えばｔ−ＰＡ、ウロキナーゼ、
ストレプトキナーゼ、およびフィブリンを溶解させうる
他のプロテアーゼと一緒に使用できる。かかる使用は特
に好ましい、何故なら本発明のフィブリン特異的モノク
ローナル抗体は、かかる試薬のどれもフィブリノーゲ
ン、フィブリン分解産物またはフィブリノーゲン分解産
物への結合によって失われないであろうからかかる試薬
の非常に効率的な使用ができようからである。この点に
関する種々の概説はＢａｌｅら、１９８０，Ｃａｎｃｅ
ｒＲｅｓｅａｒｃｈ，４ｏ：２９６５−２９７；Ｇｈｏ
ｓｅおよびＢｌａｉｒ，１９７８，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，６１（３）：６５７−６７６；
Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，１９７７，Ｎａｔｕｒｅ，２
６５：４０７−４１１；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，１９
８０，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．，１０：１０３−１
０８；およびＴｒｏｕｅｔら、１９８０，Ｒｅｃｅｎｔ
Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７５：２
２９−２３５を参照されたい。これら薬剤をモノクロー
ナル抗体分子に結合させるのに用いられる方法は非共有
または共有結合を包含しうる。非共有結合は抗体複合体
が標的部位に到達する以前に破壊される可能性がより高
そうなので、共有結合が好ましい。例えば、カルボジイ
ミド結合は薬剤のカルボキシ基と抗体分子のアミノ基と
の間で形成されうる。ジアルデヒドまたはイミドエステ
ルのような二官能剤を薬物のアミノ基を抗体分子のアミ
ノ基に結合させるのに使用できる。シッフ塩基反応は薬
物を抗体分子に結合させるのに使用できる。この方法は
グリコールまたはヒドロキシ基を含有する薬物または細
胞毒剤の過ヨウ素酸塩酸化、従ってアルデヒドの形成を
包含し、次にこれが抗体分子と反応する。結合は抗体分
子のアミノ基とのシッフ塩基形成を介して起る。さら
に、反応性スルフヒドリル基を有する薬物も抗体分子に
結合されている。 微生物 アメリカン タイプ カルチャー コレクション １２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ ２０８５２ ＵＳＡ １９８８年６月９日寄託、受託番号ＨＢ ９７４０
なるイムノアッセイを提供する：抗原を抗体と接触させ
ることからなる該抗原の存在を判定するためのイムノア
ッセイにおいて、改良点が該抗体として無抗原動物由来
の抗体を用いることからなるイムノアッセイ。本発明は
無菌動物由来のモノクローナル抗体またはポリクローナ
ル抗体を利用する方法をも提供するものである。本発明
はまた、フィブリン特異的モノクローナル抗体およびか
かるモノクローナル抗体の利用方法をも提供する。以
下、本発明を詳細に説明する。 Ｉ． 抗原を抗体と接触させることからなる該抗原の存
在を判定するためのイムノアッセイにおいて、改良点が
該抗体として無抗原動物由来の抗体を用いることからな
るイムノアッセイ：無菌動物由来のモノクローナル抗体
またはポリクローナル抗体を利用する方法 （１）無菌動物 本発明は、モノクローナル抗体生産のための無菌動物の
使用に関する。無菌動物は１９世紀後期に最初に開発さ
れ、それ以来広範に利用されてきている。無菌動物は、
細菌、ウイルス、真菌、原生動物、および他の非病原性
または寄生性形態物を包含するあらゆる論証可能な生命
の関連形を含有しないノトバイオートである。ノトバイ
オートは無菌的帝王切開または卵の無菌孵化により得ら
れた動物または系統であり、アイソレーター条件下で無
菌技法により飼育され連続的に維持される。このような
動物に於いては、関連するあらゆる動物相および植物相
の組成は、もし存在するとしても、一般に認められてい
る現行の方法論によって完全に限定されている。（以下
の点を銘記すべきである。すなわち、すべてのマウスは
潜伏性白血病誘発ウイルスを担持しており、従ってこの
ような白血病誘発ウイルスについて以外は無菌的である
マウスは本発明の目的に関して無菌的であると見なされ
るべきである。） 無菌系の核心は、欲せざる微生物の侵入に対する障壁を
用意することである。動物を囲うプラスチック、金属、
ゴムおよびガラスの物理的障壁に加えて、無菌系は空気
の濾過、食物及び水の滅菌、手袋による操作といった操
作上の障壁を必要とし、このような障壁が障壁系の不可
欠の部分をなす。また、アイソレーターへの物資の搬入
は無菌条件下で行うべきである。あらゆる無菌動物が本
発明に利用できると考えられる。最も一般的な無菌動物
はマウス、ブタ、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ、
ヒツジ、霊長類、および家禽であり、マウス、特にＢａ
ｌｂ／ｃマウスが好ましい。 （２）無菌動物の生産、ケアおよび維持 無菌動物の生産、ケアおよび維持に関しては移しい刊行
物がある。例えば、Ｗｏｓｔｍａｎｎ，Ｂ．Ｓ．編、Ｇ
ｎｏｔｏ−ｂｉｏｔｅｓ：Ｓｔａｎｄａｒｄｓａｎｄ
Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｒｅｅｄｉ
ｎｇ，Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ．Ｎａｉｉｏ
ｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ，Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，
Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９７０；Ｃｏａｔ
ｅｓ，Ｍ．Ｅ．ら、Ｔｈｅ Ｇｅｒｍｆｒｅｅ Ａｎｉ
ｍａｌ ｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９６８；およびＰｌｅａ
ｓａｎｔｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｇｎｏｔｏｂｉｏ−ｔｉｃｓ，
ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｉａｂｏｒａｔｏｒｙ
ＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，第１巻，Ｍｅｌｂｙ，
Ｅ．Ｃ．ほか編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａ
ｔｏｎ，Ｆｌａ．，１１７，（１９７４）、以上の刊行
物は参照としてここにとり込まれる。以下は、Ｗｏｓｔ
ｍａｎｎ，Ｂ．Ｓ．編、Ｇｎｏｔｏｂｉｏｔｅｓ：Ｓｔ
ａｎｄａｒｄｓａｎｄ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｍａ
ｎａ−ｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎ
ｉｍａｌｓ，Ｎａｈｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏ
ｕｎｃｉ１，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．
の無菌ラットおよびマウスの生産、ケアおよび維持を記
述する論文の要約である。かかる生産、ケアおよび維持
は他の動物についても同様である点に留意すべきであ
る。 室内環境 施設、設備、および管理方法は、最大の環境制御と最適
の快適さおよび福利を動物に供与するよう設計され、運
営されるべきである。ケージ、給餌器および給水器は、
動物に最大の快適さを供与し、食物及び水が容易に摂取
できるようにし、そして清掃および滅菌が実行可能で効
率的であるように設計および組み立てられるべきであ
る。大規模な無菌作業のための望ましいフロアプランは
以下からなるべきである： １．アイソレーターを組み立てそして滅菌するための作
業領域、２．動物の入っているアイソレーターを維持す
る領域、および３．ノトバイオートの環境を日常的に監
視するための実験室領域。事務室および飼料調製領域を
フロアプランに組み込んでもよい。ノトバイオートのア
イソレーターを維持するための室内環境は従来の実験用
齧歯類の収容に関して確立された基準に合致しなければ
ならない。その構造は昆虫を通さず、壁および床は防水
性であるべきである。光線は年間を通じて同一の明暗周
期で一定不変であるべきである。換気装置は、化学的な
滅菌により生じたあらゆる煙霧を速やかに除去しなけれ
ばならず、気候条件は以下に詳述するように制御される
べきである。 温度。アイソレーターの温度を２２℃から２６℃の間
（７２から７８°Ｆの間）に保つために、一般に認めら
れている動物の室温、２１−２７℃（７０−８０°Ｆ）
を下方調整する必要があろう。 湿度。相対湿度（ＲＨ）は、ヒトが快適なレベルである
４０−６０パーセントに保つべきである。しかしなが
ら、アイソレーターの換気に室内空気を使用する場合に
は、４０−５０パーセントのＲＨが推奨される。 換気。室内の空気交換は化学滅菌の間に生じたあらゆる
煙霧を速やかに除去するのに十分でなければならない。
１時間当り１０から１５回の空気交換が推奨される。危
険なレベルの化学性煙霧に曝される職員を防護するため
に、新鮮空気換気装置のあるヘッドマスクが利用可能で
あるべきである。 無菌設備 （Ｓａｃｑｕｉｅｔ，Ｅ．１９６８，Ｅｑｕ
ｉｐｍｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍ
ｅｎｔ：Ｇｅｎｅｒａｌ ｔｅｃｈｎｑｕｅｏｆ ｍａ
ｉｎｔａｉｎｉｎｇ ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ ａｎｉｍａ
ｌｓ，ｐ．１−２２ Ｉｎ Ｍ．Ｅ．Ｃｏａｔｅｓ編、
ｔｈｅ ｇｅｒｍｆｒｅｅ ａｎｉｍａｌ ｉｎ ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．Ｌｏｎ
ｄｏｎ：Ｔｒｅｘｌｅｒ，Ｐ．Ｃ．１９６８，Ｅｑｕｉ
ｐｍｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅ
ｎｔ：Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ
ａｎｉｍａｌｓ ａｎｄ ｃｕｒｒｅｎｔ ｄｅｖｅｌ
ｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎｅｑｕｉｐｍｅｎｔ ｄｅｓｉｇ
ｎ，ｐ．２３−３５ Ｉｎ Ｍ．Ｅ．Ｃｏａｔｅｓ編、
Ｔｈｅｇｅｒｍｆｒｅｅ ａｎｉｍａｌ ｉｎ ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄ
ｏｎ参照） 環境中の微生物を完全に排除するには絶対的な障壁が必
要である。アイソレーター操作の成功は、常にそのよう
な障壁を維持することにかかっている。金属とプラスチ
ックの二種類の一般的な種類のアイソレーターがある。
金属性ユニットのなかには、２０ｐｓｉ（１，４０６ｇ
／ｃｍ２）の内部蒸気圧に耐えられるように建造されて
いるものもある。（Ｒｅｙｎｉｅｒｓ，Ｊ．Ａ．１９５
９，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ
ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒｒｅａｒｉｎｇ ｇｅｒ
ｍ−ｆｒｅｅ ａｎｉｍａｌｓ．Ａｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．７８：４７；Ｍｉｙａｋａｗａ，Ｍ．１９
５９．Ｔｈｅ Ｍｉｙａｋａｗａ ｒｅｍｏｔｅ−ｃｏ
ｎｔｒｏ１ ｇｒｅｍｆｒｅｅ ｒｅａｒｉｎｇｕｎｉ
ｔ．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：３７参
照）。また、最初の滅菌のために、大きなオートクレー
ブ内に設置されているものもある（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏ
ｎ，Ｂ．Ｅ．１９５９．Ｌｉｇｈｔｗｅｉｇｈｔ ｓｔ
ａｉｎｌｅｓｓ ｓｔｅｅｌ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ
ｒｅａｒｉｎｇ ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ ａｎｉｍａｌ
ｓ．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：１７参
照）。現在最も広く用いられているユニットはフレキシ
ブルフィルムアイソレーターである（Ｔｒｅｘｌｅｒ，
Ｐ．Ｃ．およびＬ．Ｉ．Ｒｅｙｎｏ１ｄｓ．１９５７．
Ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｆｉｌｍ ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆ
ｏｒ ｔｈｅ ｒｅａｒｉｎｇ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ
ｇｅｒｍｆｒｅｅ ａｎｉｍａｌｓ．Ａｐｐｌ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．５：４０６参照）。このアイソレータ
ーは、通常、伸縮自由の積層のビニルからなり、化学的
に滅菌されなけらばならず、容易に特定の要求に適応で
きる。別の種類はナイロンの大きなチューブからできて
いて、それぞれの末端が縛られており、オートクレーブ
内で滅菌できる。（Ｌｅｖ，Ｍ．１９６２．Ａｎ ａｕ
ｔｏｃｌａｖａｂｌｅｐｌａｓｔｉｃ ｕｎｉｔ ｆｏ
ｒｒｅｒｉｎｇ ａｎｉｍａｌｓ ｕｎｄｅｒ ｇｅｒ
ｍｆｒｅｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．２５：３０参照）。プレキシガラス
アイソレーターおよび使い捨てフレキシブルフィルムユ
ニットも開発されている。これらの多くは十分軽いので
ラック上に２，３個積み重ねることができ、フロアスペ
ースを節約する特徴がある。熱に弱いアイソレーターで
は、一般に食物および供給物を滅菌するための特別なシ
リンダーが用いられる。このシリンダーは高圧オートク
レーブ内で容易に脱気できるよう、大きな濾過部分を有
するよう設計されるべきである（Ｔｒｅｘｌｅｒ，Ｐ．
Ｃ．１９６３．Ａｎ ｉｓｏｌａｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ
ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｃｏｎｔａｍｉｎａ
ｔｉｏｎ．Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．Ｃａｒｅ．１３：５７２
参照）。あるいはまた、減圧によらずに脱気しそして滅
菌中に高圧化するために、シリンダーに大気中に開口し
たドレインチューブを設けることもできる。（Ｊａｗｏ
ｒｓｋｉ，Ｎ．Ｅ．およびＣ．Ｅ．Ｍｉｌｌｅｒ．１９
６３．Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｌｉ
ｎｄｅｒ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｓｕｐｐｌｙ
ｉｎｇｇｅｒｍｆｒｅｅ ｉｓｏｌａｔｏｒｓ．Ｌａ
ｂ．Ａｎｉｍ．Ｃａｒｅ．１３：５９１参照）。 滅 菌 アイソレーター内で使用する設備、食物、下敷、水およ
び空気はすべて完全に無菌でなければならない。用いら
れる方法および条件は個々のアイテムの特性によって決
定される。加圧蒸気は最も良く知られた滅菌法である。
この方法は熱に安定な多孔質アイテムに特に適する。微
生物が潜んでいると考えられ得るあらゆる部分を蒸気に
直接接触させなければならない。蒸気に曝す時間は用い
られる温度に関係する。一度に滅菌する量のうちで最も
到達しにくい部分（パッケージの中心部分）を１２１℃
（２５０°Ｆ）で最低１５分間蒸気に曝すことが推奨さ
れる。無菌性を確保するために注意深く検査した後、よ
り高い温度およびより短い暴露時間を用いてもよい。標
準的なパッケージサイズおよび飼料、下敷、その他の材
料の詰め込み密度は、蒸気の浸透時間が一定で予測可能
であることを保証するためには非常に重要である。乾熱
はアイソレーター用の空気供給の滅菌に用いられている
（Ｍｉｙａｋａｗａ，Ｍ．１９５９．Ｔｈｅ Ｍｉｙａ
ｋａｗａ ｒｅｍｏｔｅ−ｃｏｎｔｒｏｌｇｅｒｍｆｒ
ｅｅ ｒｅａｒｉｎｇ ｕｎｉｔ．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：３７；Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，
Ｂ．Ｅ．１９５９．Ｌｉｇｈｔｗｅｉｇｈｔ ｓｔａｉ
ｎｌｅｓｓ ｓｔｅｅｌ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｒ
ｅａｒｉｎｇ ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ ａｎｉｍａｌｓ．
Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：１７参
照）。過酢酸（ＣＨ３ＣＯＯＯＨ）は、熱に弱く、非多
孔質の、特にフレキシブルフィルムユニットに広く用い
られる。この酸は湿潤剤（界面活性剤）を用いて２％溶
液として使用される（Ｔｒｅｘｌｅｒ，Ｐ．Ｃ．および
Ｌ．Ｉ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ．１９５７．Ｆｌｅｘｉｂｌ
ｅ ｆｉｌｍ ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒｔｈｅ ｒ
ｅａｒｉｎｇ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｇｅｒｍｆｒｅ
ｅ ａｎｉｍａｌｓ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
５：４０６参照）。特別な状況に対しては他の化学物質
例えば、次亜塩素酸塩、ヨードフォア、または第四級ア
ンモニウム化学物を、子宮摘出術により得られた新生仔
を入れる液体トラップに用いることができ、またはＨｇ
Ｃｌ２を解化前に卵を滅菌状態にするために用いること
ができる。湿らすことのできない、熱に弱いアイテムを
滅菌するためには、エチレンオキシド（ＥＴＯ）を用い
ることができる。滅菌時間は温度、湿度、圧力、および
ＥＴＯ濃度によって決まる。ＥＴＯは下敷および飼料成
分と化学的に反応して有毒なまたは望ましくない化合物
を生成する可能性がある。ＥＴＯは引火性で、中毒の危
険があるため、滅菌に日常的にＥＴＯを使用することは
２０パーセント以下のＥＴＯしか含有しない市販のガス
混合物に制限すべきである。空気供給物の滅菌にはファ
イバーガラスフィルターが通常用いられる。このフィル
ターは完壁な濾過装置として機能しなければならない。
メンブランが直径０．２２マイクロメーター以上の粒子
を排除するフィルターのように完壁なフィルターである
ならば、熱に曝すことを避けるために、液体のメンブラ
ン濾過を用いることができる。飼料または他の特別なア
イテムの滅菌にはガンマ線または電子ビーム源による照
射を用いることができる。用いる線量は２．５−６×１
０６ラドまでである。 内部環境 温度。内部のアイソレーター温度は室内環境の関数であ
り、２２から２６℃（７２から７８°Ｆ）の間に維持す
べきである。 湿度。アイソレーターは過剰な負荷、不適切な換気、あ
るいはその両方の場合に、水分の凝縮を受け易い。アイ
ソレーターに入る空気は相対湿度５０パーセント以下そ
して好ましくは４０パーセント以上であるべきである。 空気供給。アイソレーターは時間当り１２から２０回の
換気を行い、３−５インチ（８−１３ｃｍ）水柱の正圧
でなければならない。空気は中央の給源から、あるいは
それぞれのユニット用の個々のブロワーから供給でき
る。中央換気システムとしてはタービン型エアコンプレ
ッサーが推奨されるが、これはオイルピストン型ではオ
イルを空気供給管路中に噴霧する傾向があるためであ
る。空気拡散アイソレーター（Ｔｒｅｘｌｅｒ，Ｐ．
Ｃ．１９６８，Ｂｑｕｉｐｍｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ ａ
ｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ：Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｏｆ
ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ ａｎｉｍａｌｓ ａｎｄ ｃｕ
ｒｒｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｅｑｕ
ｉｐｍｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ，ｐ．２３−３５，Ｉｎ
Ｍ．Ｅ．Ｃｏａｔｅｓ編Ｔｈｅ ｇｅｒｍｆｒｅｅ ａ
ｎｉｍａｌｉｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）は、停電の場合にも換
気中断には陥りにくい。しかしながら、この種類は時間
当りの換気回数が比較的少ないという欠点があり、万一
障壁内に小さな破損部分ができた場合に汚染を防ぐのに
役立つ保護のための正圧に欠ける。緊急時安全装置。停
電や機械的な故障が生じたときにアイソレーター内の空
気圧を維持するための適切な設備が空気供給の遮断から
２，３分以内に供給されなければならない。非固定フィ
ルムアイソレーターの崩壊は、結局動物の窒息に帰着す
るが、より緊急の危険は動物がフィルムや手袋に到達し
これを損なう恐れがあることである。ゴムストッパーを
用いて空気の導管を塞ぐことによってこれを一時的に防
ぐことができる。個々のアイソレーターの空気供給の作
動に必要なのは、唯一、緊急時の電力供給である。中央
換気システムは、非常用空気供給のために、第二のター
ビンコンプレッサーを有すべきである。温度および圧力
の測定記録を取ることが推奨される。電力不足や機械的
な故障が生じた場合にライン圧力の低下によって作動す
るオーディオビジュアル警報システムを中央換気システ
ムに組み込むべきである。同様の警報システムが空気供
給の温度の望ましからざる変動を知らせるべきである。
個々のアイソレーターの換気システムについては、室内
環境について継続的に記録して監視することが推奨され
る。 ケージングおよび内部備品 備品。アイソレーター用の基本的な備品リストには、し
っかりした蓋のついたケージ、水容器および給餌器、ゴ
ム手袋のための布製保護手袋、エキストラドアガスケッ
トまたはキャップをしめるリング、先端にゴムのついた
長いピンセット、止血鉗子、はさみ、タオル、ガーゼス
ポンジ、道具類を入れるための２クオート缶、蓋付き４
クオート食餌缶、スプーン、培養試験管、紙袋、および
汚れた下敷用の耐水バッグが包含される。ケージは、滑
らかな耐腐食性の材質で作るべきである。ケージは液体
を通さず、滅菌が容易でなければならない。許容できる
と考えられる材質にはプラスチック、ステンレス鋼、お
よびガラスが包含される。亜鉛メッキは徐々に腐食し、
微量金属の混入が実験結果に影響を与える可能性がある
ため望ましくない。ケージの大きさは通常、入口部分の
大きさで制限される。雌マウスおよび仔のための最低の
面積は、５０平方インチ（９７０ｃｍ２）である。多く
の状況では、動物当りもっと広いスペースが必要であろ
う。第１表は重量分類によるマウスおよびラットの一匹
当りの推奨される床面積を示す。 その他の注意点 バリアーシステムの完全性を確保するために、微少な漏
れに関するフレオンテストが勧められる。各ユニットを
組み立てて滅菌したときから、そのユニットに関するす
べての操作の時間を追った記録を継続するために、各ユ
ニットはそれ自身の運転記録に備えるべきである。かか
る記録はアイソレーター番号で区別される金属の病院−
チャートホルダーに保管すると便利である。この記録は
例えば手袋の交換といった日常的な保守に関する記録も
含むべきである。飼育記録も同じチャートホルダーに保
管することができる。アイソレーター内部で使用できる
スペースが限られているため、飼料および下敷用に、そ
して無菌通路でつながっているアイソレーター間の動物
の移動のために、紙製で折りたたみ式のコンテナーが望
ましい。静電スパークが生じた場合は爆発するかもしれ
ないのでアイソレーター内ではエーテルを使用すべきで
ない。揮発性で不燃性の麻酔剤としてフルオタン（ブロ
モクロロトリフルオロエタン）が推奨される。 飼料、下敷および水 一般的な注意点 商品として製造された飼料に関する完全な配合が、防腐
剤、抗酸化剤、および他の添加物を含めたすべての成分
およびその濃度を列挙して提供されるべきである。製造
日が明示されるべきである。製造者は飼料が以下の通り
であることを保証すべきである： １．天然に存在するホルモン活性が正常な許容限度内で
ある。 ２．薬物、ホルモン、抗生物質、または異常な生理的状
況をつくり出す可能性があるかあるいは研究操作を妨げ
る可能性のある他のあらゆる物質を含有する添加物を含
まない。 ３．統計学的に選択されたサンプルに基づいてサルモネ
ラ菌を含まない。 ４．齧歯類および害獣の汚染がない。 ５．病原体を含む可能性のある脂肪融出していない肉片
や魚肉をまったく含まない。 飼料の栄養強化 無菌動物の飼料は加熱滅菌によるビタミンの損失 （特にビタミンＢ群の一部とビタミンＡおよびＤ）およ
びタンパク質の栄養価の低下（利用可能なリジン、メチ
オニン、アルギニン、およびトリプトファンの減少）を
補うために、正常な要求量以上にある種の栄養分を含有
しなければならない。また、無菌動物飼料は、 通常の
動物では胃腸管内での微生物合成によって利用可能であ
る要求栄養素も提供しなければならない（Ｒｅｄｄｙ，
Ｂ．Ｓ．，Ｂ．Ｓ．Ｗｏｓｔｍａｎｎ，およびＪ．Ｒ．
Ｐｌｅａｓａｎｔｓ．１９６８ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａ
ｌｌｙ ａｄｅｑｕａｔｅ ｄｉｅｔｓ ｆｏｒ ｇｅ
ｒｍ−ｆｒｅｅ ａｎｉｍａｌｓ，ｐ．８７−１１１，
Ｍ．Ｅ．Ｃｏａｔｅｓ編、Ｔｈｅ ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ
ａｎｉｍａｌ ｉｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ参照）。かかる飼料
の例がＬ−４８５であり、これは大規模に検査され（Ｘ
ｅｌｌｏｇｇ，Ｔ．Ｆ．およびＢ．Ｓ．Ｗｏｓｔｍａｎ
ｎ．１９６９，Ｒａｔ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｓｔｏｃ
ｋ ｄｉｅｔＬ−４８５．Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．Ｃａｒ
ｅ．参照）、商業的に生産できる安価な飼料である（第
２表参照）。タンパク質の質の低下を補うための手段と
して、全タンパク質含量を増加させるよりむしろ特定の
アミノ酸を補うことを考慮すべきである。飼料の全タン
パク質含量を増加させると水の消費および排泄が増加
し、湿った状況を引き起こし、それによって一定の大き
さのアイソレーター内に収容できる動物数が制限され
る。 蒸気滅菌 （Ｒｅｄｄｙ，Ｂ．Ｓ．，Ｂ．Ｓ．Ｗｏｓｔ
ｍａｎｎ，およびＪ．Ｒ．Ｐｌｅａｓａｎｔｓ．１９６
８ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｌｙ ａｄｅｑｕａｔｅ
ｄｉｅｔｓ ｆｏｒ ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ ａｎｉｍａ
ｌｓ，ｐ．８７−１１１ Ｉｎ Ｍ．Ｅ．Ｃｏａｔｅ
［編］．ｔｈｅ ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ ａｎｉｍａｌ
ｉｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｌｏｎｄｏｎ 参照） 実際の方法は利用できる設備によって異なる。三つの要
因が一般に重要である： １．可能な限りいつでも最低２０センチＨｇの滅菌前減
圧を行うことによって、外気に開口したクレーブまたは
シリンダー内の飼料の蒸気浸透が容易になる。用いるシ
リンダーが外気に開口されていない場合には２８インチ
Ｈｇまたはそれ以上の減圧が望ましい。 ２．完全な無菌度を保証する最短の滅菌フェーズを使用
する。設備および技術に応じて安全のための余裕を加え
る。飼料の中心部で測定した温度が最低１２１℃（２５
０゜Ｆ）に達しなければならない。その温度での実際の
滅菌フェーズは最低１５分持続しなければならない。も
っと高い滅菌温度では、滅菌時間は相対的に短くなる。 ３．滅菌後の減圧は飼料温度の低下を速めるであろう。
これは、栄養素の不必要な熱破壊を防ぐであろう。しか
しながら、装置の設計および性能は、この操作段階を行
う間の漏れを防ぐのに適していなければならない。飼料
の蒸気滅菌に於いては、目標は不完全な滅菌、および過
度に長く加熱することによる不必要な栄養の損失の双方
を避けることである。ある程度の栄養素の損失は避けら
れないが、以下をたくみに操作することによってかなり
満足できる結果を得ることができる： （ａ） 温度、時間、滅菌前および滅菌後減圧、および
ペレットの大きさのような技術的手順。 （ｂ） 飼料中の水分含量。水分含量が増加すると滅菌
後のビタミンＢの回収が改善される（Ｚｉｍｍｅｒｍａ
ｎ，Ｄ．Ｒ．，およびＢ．Ｓ．Ｗｏｓｔｍａｎｎ．１９
６３．Ｖｉｔａｍｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｄ
ｉｅｔｓ ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ ｆｏｒ ｇｅｒｍｆ
ｒｅｅ ａｎｉｍａｌｓ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．７９：３１
８）。固形飼料については、２５％までの水分含量、あ
るいは飼料の貯蔵品質と両立すると判明する限り高い水
分含量が望ましい。飼料の水分含量を変化させた後は、
その飼料が滅菌温度に到達する速度をあらためて検査す
べきである。 照射滅菌 （Ｒｅｄｄｙ，Ｂ．Ｓ．，Ｂ．Ｓ．Ｗｏｓｔ
ｍａｎｎおよびＪ．Ｒ．Ｐｌｅａｓａｎｔｓ．１９６８
Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｌｙ ａｄｅｑｕａｔｅ ｄ
ｉｅｔｓ ｆｏｒ ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ ａｎｉｍａｌ
ｓ，ｐ．８７−１１１ Ｍ．Ｅ．Ｃｏａｔｅｓ 編、Ｔ
ｈｅ ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ ａｎｉｍａｌｉｎ ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄ
ｏｎ；Ｌｅｙ，Ｆ．Ｊ．，Ｊ．Ｂｌｅｂｙ，Ｍ．Ｅ．Ｃ
ｏａｔｅｓ，およびＪ．Ｓ．Ｐａｔｅｒｓｏｎ．１９６
９ Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｂｏ−ｒ
ａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌ ｄｉｅｔｓ ｕｓｉｎｇ
ｇａｍｍａ ｒａｄｉａｔｉｏｎ．Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．
３：２２１参照） 技法および線量は照射の設備および種類によって異な
る。一般に、照射滅菌は結果的に栄養素の破壊がより少
ないと考えられるが、現時点では飼料は蒸気で滅菌する
のが望ましい。 無菌度に関する検査。 任意の特定の滅菌方法で達成された無菌度を監視するた
めには、バチルス・ステアロサーモフィルス菌（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）
胞子片の使用が推奨される。この胞子片を飼料の中心部
に埋め込む必要がある。また、アイソレーターおよびそ
の中の動物も定期的に微生物学的に監視すべきである。
かかる監視は、アイソレーターのバリアーの破れに起因
するかあるいはアイソレーターまたはその内容物の不適
切な滅菌に起因する、偶発的な汚染を検出するのに必要
である。これは、Ｗｏｓｔｍａｎｎ，Ｂ．Ｓ．編、Ｇｎ
ｏｔｏｂｉｏｔｅｓ：Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｇ
ｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｒｅｅｄｉｎ
ｇ，Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｍａｎａ−ｇｅｍｅｎｔｏｆ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ，Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ，Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗ
ａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９７０，ｐｐ．２８
−３９の記載にしたがって行うことができる。 滅菌中の栄養価損失の測定 重要な栄養素の損失に関する有用な検査法としては、飼
料添加チアミンの回収の指標として酸で抽出可能なチア
ミンの定量が勧められる（Ｗｏｓｔｍａｎｎ，Ｂ．Ｓ．
およびＰ．Ｌ．Ｋｎｉｇｈｔ．１９６０．Ｔｈｅ ｅｆ
ｆｅｃｔ ｏｆｍｅｔｈｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｏｎ
ｔｈｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆｔｈｉａｍｉｎｅ
ｔｏ ｔｈｉｏｃｈｒｏｍｅ．Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉ
ａ１６：５００ 参照）。２５％以下の回収率は、飼料
の全体的な栄養の質がかなり害われていることを示す。
適当な設備および注意によって、５０％またはそれ以上
の回収率を達成しなければならない。 固形飼料の貯蔵 無菌実験は一般にコストが高いため、栄養価の有意に低
下した飼料を決して使用しないよう特別の注意を払うべ
きである。（ａ）滅菌していない飼料は常に冷蔵で保存
し、決して一ヶ月より長くならないこと、および（ｂ）
滅菌済み飼料のアイソレーター内部での貯蔵期間は一週
間またはそれ以下とし、決して１０日を越えてはならな
いこと、が望ましい。 下 敷 下敷は最低週に一回交換すべきである。下敷の材質は滅
菌が容易で、動物によって容易には食べられないことが
望ましい。滅菌操作の結果として有毒化合物を生じては
ならない。ほこりの立たないストローブマツの破片（の
こぎりくず）およびかんなくずが望ましい。シナノキお
よびポプラのかんなくず、またはつぶしたトウモロコシ
の穂軸は許容できる。珪藻土製品、スギ、樹脂を含む木
材、および堅木は望ましくない。酸化エチレン滅菌は、
有害な化合物が形成される可能性についての疑問が解明
されるまでは用いられるべきでない。 水 飲料水は滅菌されなければならない。角型パック容器、
メイソンジャー、またはユニットに接続したタンク内で
オートクレーブすることができる。各容器の内部に小量
の空気スペースを残す必要がある。 ノトバイオートの帝王切開出産の原理 あらゆる帝王切開の成功の鍵は、一部は妊娠を満期まで
進行させることである。このことは妊娠期間の短い動物
に特に当てはまり、このような動物では胎仔は分娩前の
最後の２４時間にその体重の２０％を獲得することがで
きる。時宣的な交配はほどほどに成功するが、比較的大
きな仔を産む動物（ラットおよびマウス）では、手術を
行う前に、雌が最初の仔を分娩するのを待つことが有用
であろう。モルモットでは、最も満足できる方法は、恥
骨の広がりを測定することによって手術する雌を選択す
ることである（Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｂ．Ｐ．，Ｐ．Ａ．Ｗ
ｏｌｆｅ，およびＨ．Ａ．Ｇｏｒｄｏｎ．１９５９．Ｓ
ｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｒｅａｒｉｎｇ ｔｈｅ ｇｕｉ
ｎｅａ ｐｉｇｇｅｒｍｆｒｅｅ．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：１８３参照）。帝王切開で引き
出された仔が最初の呼吸をする前に、仔は無菌的な環境
中に生み出されなくてはならない。仔は、母体から直
接、子宮切開によって切開した無菌バリアーである膜を
通って無菌のアイソレーターの中へ、または子宮摘出に
よって殺菌トラップを通って無菌のアイソレーターの中
へ、取り出される。帝王切開手術前の雌の通常の手術準
備には腹部の毛の除去および手術部位の清拭および消毒
が包含される。腹部正中線局所麻酔または全身麻酔も危
険なレベルの胎児機能低下や胎児死亡を招くことなく用
いることができるが、ラットおよびマウスでは頸椎の脱
臼によって麻酔を行うのが望ましい。モルモットでは、
手術は一般に予め鎮静後に局所麻酔のもとで行われる。
子宮切開によってバリアー膜を通って仔を出産するため
には特別のアイソレーター設備が必要である。レニアー
ズ ステンレス製外科用ユニット（Ｒｅｙｎｉｅｒｓ，
Ｊ．Ａ．１９６５．Ｇｅｒｍｆｒｅｅ ｌｉｆｅ ｍｅ
ｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（ｇｎｏｔｏｂｉｏ−ｔｉｃｓ）ａ
ｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏ
ｎ．ｐ．４５８−４６６，Ｐｒｏｃ．３ｒｄ Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔ．Ｃｏｎｇｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｂｒｕｘｅ
ｌｌｅｓ参照）には、ユニットの上下のコンパートメン
トを分ける組み込み型の水平金属仕切りがある。この仕
切りには上部コンパートメントの完全な形を維持するた
めにマイラープラスチックフィルムでおおわれた円形の
入口がある。手術の準備をした雌を下部コンパートメン
トに置き、腹部をマイラーに押しつける。すべての手術
道具は上部コンパートメントにあり、この無菌領域で手
術を行う。電気メスまたは小刀を用いて、プラスチック
および皮膚を通して切開を行う。それ自身により滅菌す
る電気メスの刃が皮膚切開には好ましい。皮膚およびマ
イラーの端を一緒にしっかりととめ、反転させる。皮膚
の切断端を覆うために腹部に滅菌した掛け布を掛けそし
て腹腔を開く前にあらわになった筋膜に暖かい消毒液
（ベンザルコニウムクロライド１：１，０００）をかけ
る。腸を切らぬよう細心の注意を払うべきである。一対
の鉗子または止血鉗子を腹膜壁と内臓の間に挿入するこ
とが有用であろう。次に、子宮を開き仔を取り出す。胎
膜を除去し、臍帯を縛って切断する。仔をそっと乾か
し、呼吸を刺激するためにマッサージする。その後仔は
飼育ユニットに移され、養い親の世話を受け、または手
で給餌される。別のマイラーシートを手術用開口部上に
しっかりととめ、以上の手順を５、６匹ほどの雌につい
て、汚染の重大を危険もなく繰り返すことができる。ま
た、手術用ユニットとしてプラスチックアイソレーター
またはグローブバッグを用いて、帝王切開出産を行うこ
ともできる。アイソレーターの床の外側表面を予め滅菌
し、動物の腹部と接触させ、このようにして上記のマイ
ラーシートと同じ目的を果たす。手術後、プラスチック
バリアーのスリットは滅菌テープで閉じることができ、
そして別の妊娠している雌について、手術手順を繰り返
すことができる。プラスチックアイソレーターを用いる
場合には子宮切開による仔の出産がより一般的である
（Ｆｏｓｔｅｒ，Ｈ．１９５９．Ａ．ｐｒｏｃｅｄｕｒ
ｅ ｆｏｒｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｎｕｃｌｅｕｓ ｓｔ
ｏｃｋ ｆｏｒ ａ ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ ａ
ｎｉｍａｌ ｃｏｌｏｎｙ．Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．Ｃａｒ
ｅ９：１３５参照）。子宮を無菌的に露出させ、子宮頸
のすぐ前方で縛る。切り取った子宮を液体の殺菌トラッ
プを通して無菌ユニット内に移す。一たんアイソレータ
ー内に入ると、羊水を吸い込むのを防ぐためにできる限
り速やかに仔を取り出す。臍帯を縛り切断する前に通常
仔を拭い、よく呼吸させる。次に仔を養い親に与えまた
はヒトが飼育する。マウス、ラットおよびブタでは子宮
切開が用いられ成功する。しかしながら、モルモットで
は、もし母親の血液供給遮断とアイソレーター内での出
産の間に２分も経過すると高度の胎児死亡が起こるた
め、子宮切開が好ましい。 ノトバイオート集団の繁殖システム 近交系 従来の繁殖集団で用いられた通常の兄弟姉妹間交配系
を、ノトバイオート集団でも用いることができる。 非近交系 まったくランダムな繁殖には、兄弟姉妹の交配および従
兄弟のある程度の交配が包含される。非近親勾配繁殖集
団では通常かかる交配を避けるが、結果として得られる
交配システムは、可能な限り最大限までは近親交配の割
合を低下させるものではない。近親交配が最低であるよ
うな任意のシステムを利用できる（Ｆａｌｃｏｎｅｒ，
Ｄ．Ｃ．１９６７．Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｓｐｅｃｔｓ
ｏｆ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ．ｐ．７２−
９６ Ｉｎ Ｔｈｅ ＵＦＡＱｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ
ｔｈｅ ｃａｒｅ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔｏ
ｆ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌｓ，第３版、
Ｅ．および Ｓ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，ＬＴｄ．，
Ｌｏｎｄｏｎ；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｃｏｕｎｃｉｌ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ．１
９６９．Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔ
ａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ ａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉ
ｍａｌｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．参
照）。比較可能な従来型集団およびノトバイオート集
団。もし比較目的で従来型集団とノトバイオート集団の
両方を維持することが望ましい場合は、従来型集団の有
効な繁殖集団からノトバイオート集団へ帝王切開で生ま
れた仔を導くことによって、これらの２集団は同様の遺
伝的素質を維持することができる。これが、非ノトバイ
オートラットおよびマウスの生産に最も重点を置く生産
者の選択方法であると思われるが、微生物学的な監視を
簡易化する微生物学的系統の確立を妨げる短所を有す
る。理想的にはこれは、特定の交配からの仔を従来型集
団の繁殖系統として用い、そしてこれら各々の交配から
の次の仔をノトバイオート集団の繁殖系統として用いる
ことによって達成される。もし２、３世代毎にこの方法
にしたがうならば、両方の集団の遺伝的素質は非常に類
似するはずである（もちろん同じ交配システムをそれぞ
れの集団に用いる場合）。あるいはまた、ノトバイオー
ト集団の有効繁殖集団から得られた仔を、従来型集団の
確立または補充に用いることもできる。同じ方法にした
がうならば、遺伝的な結果は同一となるであろう。 記録管理 （Ｗｏｌｆｆ，Ｇ．Ｌ．１９６７．Ｐｒａｃ
ｔｉｃａｌ ｍａｔｉｎｇｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ ｒ
ｅｃｏｒｄ−ｋｅｅｐｉｎｇ ｉｎ ａ ｂｒｅｅｄｉ
ｎｇ ｃｏｌｏｎｙ． ｐ．９７−１１３ Ｉｎ ｔｈ
ｅ ＵＦＡＷｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ ｔｈｅ ｃａｒ
ｅ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆ ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌｓ，第３版、Ｅ．および Ｓ．
Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ参
照）。動物およびアイソレーターの保守に関する適正な
記録を保管すべきである。動物の記録は、手術の有効性
および動物の生物学的な行動を判定するべきである。ア
イソレーターの記録は、時間を追ってアイソレーターに
関する出来事を記録し続けるべきであり、汚染が生じた
場合バリアーのひび割れ箇所を突き止めるのに役立つ。 （３）無抗原動物 本発明の好ましい実施態様に於ては、化学的に定義され
た（ＣＤ）低分子量で水溶性の限外濾過された飼料で無
菌動物を飼育することが好ましい。かかる飼料によっ
て、動物による栄養素および抗原の摂取の完全な制御が
可能になると考えられる。一般に、このような飼料はア
ミノ酸、単糖類、脂質、ビタミンおよびミラルのような
化学的に定義できる成分のみで構成されている。本発明
の目的のためには化学的に定義された飼料はアミノ酸、
単糖類、脂質、ビタミンおよびミネラルを含んでなり、
そして約１０，０００ダルトン以上の分子量を有する他
の成分は含まない。したがって、ＣＤ飼料の全成分は低
分子量であり、動物体内で自然に循環する栄養素であっ
て、それゆえかかる成分は免疫応答を刺激しないと考え
られる。最近の文献はＣＤ飼料で飼育された無菌動物を
「無抗原動物」と呼ぶ。また、濾紙の下敷を用いるのが
好ましい。そうしないと無菌動物が下敷を食べて免疫応
答を引き起こす可能性がある。濾紙の下敷を食べても免
疫応答は生じないと考えられる。特定の種のための特別
なＣＤ飼料は、かかる種について知られている栄養要求
を満たすような割合および量の成分を用いる。無菌マウ
ス用の好ましいＣＤ飼料の組成および調製は以下の通り
である： ＣＤ餌料の詳細な説明についてはＰｌｅａｓａｎｔｓ，
Ｊ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｎｕｔｒ．，１１６，１９４９−１９
６４（１９８６），Ｐｌｅａｓａｎｔｓ，Ｊ．ら、Ｇｅ
ｒｍｆｒｅｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ｍｉｃｒｏｆｌｏｒ
ａ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｉｔｓ Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ，Ｂ．Ｓ．Ｗｏｓｔｍａｎｎ，Ｅｄ．，
ｐ．８７，Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５）；
Ｗｏｓｔ−ｍａｎｎ，Ｂ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｎｕｔｒ．，１
１２，５５２（１９８２）；およびＰｌｅａｓａｎｔ
ｓ，Ｊ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｎｕｔｒ．１００，４９８（１９
７０）を参照されたい。これら開示は参照としてここに
とり込まれる。 （４）モノクローナル抗体の生産 次に、無菌動物をモノクローナル抗体の生産に利用す
る。無菌系を利用して、無菌状態でない動物が生産でき
るあらゆる抗原に対するモノクローナル抗体を生産でき
る。抗原の例示リストは米国特許第３，９３５，０７４
号に明らかである。しかしながら、無菌動物は抗原に対
して非常に増強された免疫応答を示すと考えられる。し
たがって、抗原の特異的なエピトープに結合しうる抗体
を生産するＢ−リンパ球を突き止める確率を高めること
ができる。これが本発明の主要な利点である。さらに、
無菌系は、多数のエピトープを有する抗原に対して高度
に特異的な抗体を生産するのに特に有用であると考えら
れる。無菌動物は標準技法によって免疫することができ
る。しかしながら、無菌動物を各免疫処理の間に最低３
週間おいて最低３回免疫処理し、そのあと融合前追加免
疫することが好ましい。免疫処置のこのような増加は、
通常の２回免疫後に好ましいＩｇＧ分泌性Ｂリンパ球で
はなく、なお主としてＩｇＭ分泌性Ｂリンパ球の存在が
観察されているため、必要であると考えられる。 （５）体細胞 抗体生産能のある無菌動物の体細胞、とりわけＢリンパ
球はＢ細胞ミエローマ系との融合に適する。分裂期の形
質芽球抗体産生細胞が優先的に融合する。体細胞は感作
無菌動物のリンパ節、脾臓および末梢血液から得ること
ができ、そしてリンパ系細胞の選択は、相当程度まで、
特定の融合システムでの経験的な有用性に依存する。し
かしながら、脾臓由来の体細胞が一般に望ましい。ひと
たび感作または高度免疫されると、無菌動物は抗体産生
リンパ球源として使用できる。マウスリンパ球は、高い
割合で以下に記載のマウスミエローマ系との安定な融合
を生ずる。しかしながら、他の無菌動物由来の抗体産生
細胞の使用も可能である。特定の無菌動物の選択は、抗
原の選択によって決まる。これは、その無菌動物が用意
するいくつかのＢリンパ球の中に、かかる抗原に対する
抗体を生産できるＢリンパ球のあることが必須であるた
めである。 （６）不死化細胞 特定の目的に適したミエローマ細胞系が、ハイブリドー
マ産生性融合法で用いるためにリンパ球腫瘍から開発さ
れている（Ｇ．ＫｏｈｌｅｒおよびＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎ，１９７６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１
１−５１９；Ｍ．Ｓｃｈｕｌｍａｎら、１９７８，Ｎａ
ｔｕｒｅ ２７６：２６９−２７０）。この細胞系は少
なくとも三つの理由から開発された。第一の理由は融合
したミエローマ細胞の選択を容易にするためである。通
常、ハイブリドーマの成長を支持する特定の選択培地で
成長できなくするような酵素欠乏を有するミエローマを
用いることによって、これを達成することができる。第
二の理由は、リンパ球腫瘍細胞の、それ自身の抗体を生
産する固有能力から生ずる。モノクローナル技術を使用
する目的は、所望の単一の特異抗体（これはハイブリド
ーマの体細胞成分によって遺伝的に指示される）を生産
する不死の融合ハイブリッド細胞系を得ることである。
ハイブリドーマによる腫瘍細胞抗体の生産を排除するた
めに、免疫グロブリンの軽鎖または重鎖を生産できない
ミエローマ細胞系または抗体分泌機構の欠失した同細胞
系が用いられる。この細胞系を選択した第三の理由はそ
の融合への適性および効率である。融合細胞ハイブリッ
ドの生産にいくつかのミエローマ細胞系が使用でき、こ
れにはマウス由来のＮＳ−１，Ｘ６３−Ａｇ８，ＮＩＳ
−Ａｇ４／１，ＭＰＣ１１−４５．６ＴＧ１．７，Ｘ６
３−Ａｇ８．６５３，Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇｆ１４，ＦＯ，
およびＳ１９４／５ＸＸＯ．Ｂｕ．１．，およびラット
由来の２１０−．ＲＣＹ３．Ａｇ１．２．３が包含され
る。（Ｇ．Ｊ．Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，Ｕ．Ｈａｍｍｅ
ｒｌｉｎｇおよびＪ．Ｆ．Ｋｅａｒｎｌｙ，編、１９８
１，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａ
ｎｄ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ＩｎＪ．Ｌ．Ｔｕｒｋ，
編、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ ｉｎ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ
／Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ
Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ） （７）融 合 抗体産生性脾臓またはリンパ節細胞と不死化細胞とのハ
イブリッドを生成させる方法は一般に細胞膜の融合を促
進する作用剤（類）（化学物質、ウイルスまたは電気）
の存在下において約２０：１〜約１：１まで変動しうる
割合で体細胞と不死化細胞とを混合することから成る。
同種の動物が融合操作に用いられる体細胞および不死化
細胞の供給源として役立てられるのがしばしば好まし
い。融合法はＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１
９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７；１９
７６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１
９），Ｇｅｆｔｅｒら、（１９７７，Ｓｏｍａｔｉｃ
Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．３：２３１−２３６）およびＫ
ｏｚｂｏｒら、１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏ
ｄａｙ，４，７２に記載されている。これらの研究者に
より使用された融合促進剤はそれぞれセンダイウイルス
およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であった。ま
た最近開発されたＥＢＶ形質転換法も利用できる（Ｃｏ
ｌｅら、１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓおよびＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ，Ａｌａ
ｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）。 （８）クローンの単離および抗体検出 融合方法は通常約１×１０−６−１×１０−８の非常に
低い頻度でしか生存能力あるハイブリッドを生成しな
い。生存しうるハイブリッドを得られる頻度が低いの
で、残った未融合細胞、特に未融合ミエローマ細胞から
融合細胞ハイブリッドを選択する手段を有することが必
須要件である。生成した他の融合細胞ハイブリッドの中
から所望の抗体産生ハイブリドーマを検出する方法もま
た必要である。一般に、融合細胞は選択培地、例えばヒ
ポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有す
るＨＡＴ培地中で培養する。ＨＡＴ培地はハイブリッド
細胞の増殖を可能にしそして通常無限に分裂を続ける未
融合ミエローマ細胞の増殖を阻止する。アミノプテリン
はテトラヒドロ葉酸の産生を阻害することにより新たな
プリンおよびピリミジン合成を阻止する。チミジン添加
はピリミジン合成の遮断を迂回し、一方ヒポキサンチン
が培地に包含されているので阻害された細胞はヌクレオ
チドサルベージ経路を用いてプリンを合成できる。使用
されたミエローマ細胞はヒポキサンチンホスホリボシル
トランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を欠く変異種でありし
たがってサルベージ経路を利用できない。生存ハイブリ
ッドにおいては、Ｂリンパ球がこの酵素生産遺伝情報を
供給する。Ｂリンパ球自体は、培養では限定された寿命
しか有しないので（約２週間）、ＨＡＴ培地中で増殖で
きる唯一の細胞がミエローマおよび脾臓細胞から形成さ
れたハイブリッドである。ハイブリッドにより分泌され
た抗体のスクリーニングを促進し、そして個々のハイブ
リッドが他のものより増殖するのをふせぐために、融合
したミエローマおよびＢリンパ球の混合物をＨＡＴ培地
で希釈しそしてマイクロタイタープレートの多重ウェル
で培養した。２−３週間して、ハイブリッドクローンが
顕微鏡で見えるようになったところでハイブリッドクロ
ーンを含有する個々のウェルの上清液を特異的抗体産生
に関してアッセイする。アッセイは感度が良く、簡単で
迅速でなければならない。アッセイ法にはラジオイノム
アッセイ、酵素イムノアッセイ、細胞毒性アッセイおよ
びプラークアッセイが包含される。 （９）細胞増殖および抗体産生 ひとたび所望の融合細胞ハイブリッドが選択され、個々
の抗体産生細胞系にクローン化されると、各細胞系は２
つの標準法のうちいずれかで増殖できる。ハイブリドー
マの試料を最初の融合に体細胞およびミエローマ細胞を
提供するのに用いられた種類の組織適合性動物に注射で
きる。注射された動物は融合細胞ハイブリッドにより産
生された特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を生
ずる。血清または腹水液のような動物の体液を採り、高
濃度のモノクローナル抗体を得る。別の方法としては、
個々の細胞系を実験室培養器でインビトロ増殖させるこ
とができる。単一の特異的モノクローナル抗体を高濃度
に含有する培養培地をデカンテーション、濾過または遠
心により収集できる。 （１０）モノクローナル抗体の使用 本発明の方法により作られたモノクローナル抗体はモノ
クローナル抗体を使用する既知または将来開発されるべ
き任意の方法で使用できる。モノクローナル抗体の主要
な用途は抗原−抗体相互作用の測定であるイムノアッセ
イである。かかるアッセイは一般に不均質または均質で
ある。均質イムノアッセイにおいては、免疫的反応は特
異的抗体、標識した被分析物、および関心のある試料を
通常必要とする。標識から生ずるシグナルは抗体を標識
被分析物に結合させると直接または間接に改変される。
免疫反応およびその程度の検出のいずれも均質溶液中で
行なわれる。使用できる免疫化学的標識にはフリーラジ
カル、蛍光染色、酵素、バクテリオファージ、補酵素そ
の他が包含される。均質イムノアッセイの主な利点は、
特異的抗体が標識被分析物から分離される必要がないこ
とである。不均質イムノアッセイにおいては、試薬は通
常検査試料、特異的抗体、および検出できるシグナルを
生成させる手段である。検査試料は一般にプレートまた
はスライドのような支持体上に載せ、そして液相中の抗
体と接触させる。続いて支持体を液相から分離しそして
支持相かまたは液相をかかるシグナルを生成する手段を
使用して、検出できるシグナルについて検査する。シグ
ナルは検査試料中の被分析物の存在に関連している。検
出できるシグナルを生成させる手段には放射性標識、蛍
光物質、酵素その他の使用が包含される。不均質イムノ
アッセイの例をあげればラジオイノムアッセイ、免疫蛍
光法、エンザイムリンクトイムノアッセイ等である。上
記のイムノアッセイ法のさらに詳しい考案についてはＥ
ｄｗａｒｄ Ｔ．Ｍａｇｇｉｏ，ＣＲＣ Ｐｒｓｅｅ，
Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，１９８０
による“エンザイムイムノアッセイ”を参照。また、例
えば、全てを網羅しているのではないが、米国特許第
３，６９０，８３４；３，７９１，９３２；３，８１
７，８３７；３，８５０，５７８；３，８５３，９８
７；３，８６７，５１７；３，９０１，６５４；３，９
３５，０７４；３，９８４，５３３；３，９９６，３４
５；および４，０９８，８７６号を参照。モノクローナ
ル抗体のもうひとつの主要な用途はインビボ像形成およ
び治療剤である。モノクローナル抗体を放射性化合物、
例えば放射性ヨウ素で標識し、患者に静脈投与できる。
抗体は磁気プローブでも標識できる。続いてＮＭＲを使
用して抗原を正確に探し当てることができる。抗体が抗
原のところに局在化した後、抗原を放射トモグラフィー
および放射性核走査法により検出でき、それにより抗原
の位置を正確に探り当てることができる。説明すると、
精製されたモノクローナル抗体をヒトアルブミンを含有
するかまたは含有しない適切な担体、例えば食塩水中に
適切な用量で懸濁し、そして静脈投与例えばＭｉｌｌｅ
ｒら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｄ
ｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９８２）
（ここに参照としてとり込まれる）に記載されているよ
うに数時間にわたって継続的に静脈注入することにより
投与する。本発明のモノクローナル抗体は治療上使用で
きる。適切な生物学的性質を有する抗体は治療剤として
すぐに役に立つ。あるいはまた、抗体を毒素と結合させ
て免疫毒素を形成させるかまたは放射性物質または薬物
に結合させて放射性薬剤または薬剤を形成させる。抗体
の免疫毒素および放射性薬剤を生成させる方法はよく知
られている（例えばＣａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
Ｒｅｐｏｒｔｓ（１９８４）６８：３１７−３２８参
照）。無菌動物由来のポリクローナル抗体はまたイムノ
アッセイにも使用できそして従来の動物由来のポリクロ
ーナル抗体とべた場合、改善された結果を提供すると考
えられる無菌動物由来のポリクローナル抗体は前記した
無菌動物、前記免疫処理法を用い、続いて従来法、例え
ば動物から血清を分離することにより動物からポリクロ
ーナル抗体を分離することにより作製ができる。 ＩＩ． フィブリン特異性モノクローナル抗体 （１）背 景 止血メカニズムは破損した血管の損傷治癒に係わる複雑
な生理学的応答メカニズムである。止血は損傷した血
管、血小板および凝血系の共同作業的相互作用により達
成される。凝血系の役割は損傷した血管の内皮下の構造
物上に組み立てられている血小板プラグを安定化しつな
ぎとめるための大量のフィブリン網を提供することであ
る。循環フィブリノーゲンからの不溶性フィブリンマト
リックスの形成は必要とされる部位でのトロンビンの爆
発的生産で最高潮に達する複雑な連続反応の結果であ
る。凝血はプロ酵素（凝塊因子）が連続的に活性化され
て活性酵素となるまでの連鎖的酵素反応を伴う増幅過程
である。血栓形成に係わるフィブリン重合過程を制御す
る多数の生理学的メカニズムが存在する。これらにはト
ロンビンインヒビターアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩ
ＩＩ）、プロテインＣ、プロスタサイクリンおよび繊維
素溶解系の種々の成分例えば組織プラスミノーゲンアク
チベーター（ｔ−ＰＡ）およびその即効インヒビターが
包含される。Ａｓｔｒｕｐ １９５６ Ａｓｔｒｕｐ，
Ｔ．，Ｂｌｏｏｄ １１，７８１−８０６（１９５６）
により提案された止血仮説は、フィブリン形成（凝血）
とフィブリン溶解（繊維素溶解）との間にある平衡が存
在すると述べている。正常または健康な状態においては
これらの機能は等しく均衡している。しかしながら、止
血過程がそこなわれると、凝血および繊維素溶解がそれ
ぞれ血栓症および出血として病的に発現される。病的血
栓症または血栓性疾患の臨床的徴候は極度に多様であ
り、そして播種性血管内凝血（ＤＩＣ）、深部静脈血栓
症（ＤＶＴ）、動脈および静脈血栓症が包含される。他
の血管疾患の血栓塞栓症および血栓性合併症（例えばア
テローム性動脈硬化症）は主要 動脈の閉塞を生じて臓
器虚血および、脳血管の発作（卒中）、心筋梗塞、その
他のような付随する生命をおびやかす状態につながりう
る。繊維素溶解過程はプラスミノーゲンアクチベーター
として知られる作用剤の作用により不活性酵素前駆体プ
ラスミノーゲンをタンパク分解酵素プラスミンに変換す
ることを必要とする。生理学的繊維素溶解の分子メカニ
ズムは完全には理解されていないが、フィブリン形成の
間にプラスミノーゲンがフィブリンに結合しそこでそれ
がプラスミノーゲンアクチベーター例えばｔ−ＰＡによ
り活性化されうることが知られている。この様式でプラ
スミン生成が血栓内で進行する。血栓内ではプラスミン
生成はプラスミンの主要な生理学的インヒビター、α２
−抗プラスミンによる不活性化から保護されている。プ
ラスミンにさらされると、フィブリノーゲンおよびフィ
ブリンは分解されてそれらの分解産物を生ずる。フィブ
リノーゲンはフラグメントＸおよびＹに、そしてプラス
ミンにさらにさらされると、フラグメントＤおよびＥに
分解される。フィブリンは非架橋フィブリンからフラグ
メントＸ，Ｙ，ＤおよびＥに、そして架橋フィブリンか
ら架橋Ｄ−ダイマー、Ｄ−Ｄ／Ｅ複合体、Ｙ−ダイマ
ー、Ｙ−Ｄ−ダイマーおよびＸオリゴマーに分解され
る。血栓性障害のマーカーに関するアッセイはラジオイ
ムノアッセイおよびラテックス凝集型のアッセイの両ア
ッセイにおいてポリクローナル抗体を使用してつい最近
まで行なわれている。これらのアッセイはＧａｆｆｎｅ
ｙ（Ｇａｆｆｎｅｙ，Ｐ．Ｊ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．，４０８，４０７−４２３（１９８３）
により、全然信頼できないものであることが示されてい
る。モノクローナル抗体を用いるより特異的でかつ感度
のよいイムノアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）が臨床実験
室において日常行なわれるようになってきている。これ
ら診断アッセイにおける限定的要因は使用される特定の
モノクローナル抗体の特異性およびアフィニティであ
る。損なわれた止血の任意のありうるインジケーターに
対する高度に特異的な抗体の生成は、インジケーターの
レベルの低さおよび血漿中ではるかに高いレベルで通常
存在するその前駆体と特定のマーカーとの抗原関連性の
両方により阻止される。実施例は、酵素およびそのイン
ヒビターとの間の複合体例えばトロンビン−アンチトロ
ンビンＩＩＩ、プラスミン−α２−抗プラスミン、ｔ−
ＰＡ−ＰＡ１−１の形成である。かかる複合体形成によ
り生成される新しい抗原部位の数は極度に少なく、免疫
学的プローブ（例えばモノクローナル抗体）の生産を困
難にしている。同様に、フィブリンに対するモノクロー
ナル抗体を得ることに関連する主要な問題はフィブリン
とその生理学的前駆体フィブリノーゲンとの間の構造的
およびコンホーメーション的相似性である。フィブリノ
ーゲンがフィブリンに変換される場合の共有構造の保存
は ９８％以上と推定されており（Ｐｌｏｗ，Ｅ．
Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａ
ｅｍｏｓｔａｓ，８，３６（１９８２）したがってフィ
ブリン分子のエピトープの少ない割合だけが事実新生抗
原（そしてフィブリンに特有）である。フィブリン抗体
を得るために採用されている多くの方法は可溶性フィブ
リンフラグメントおよび、フィブリン上の露出した新生
抗原部位に似せた合成ペプチドを用いて動物を免疫する
ことに集中している。Ｈｕｉ，Ｋ．Ｙ．，ら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２２，１１２９−３２（１９８３），Ｓｃｈｅ
ｅｆｅｒｓ−Ｂｏｒｃｈｅｌ，Ｖ．，ら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，７０９１−
９５（１９８５），Ｅｌｍｓ，Ｍ．Ｊ．，ら、Ｔｈｒｏ
ｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓ，５０，５９１−９４（１９
８３，およびＫｕｒｄｒｙｋ，Ｂ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍ
ｕｌ．，２１，８９−９４（１９８４）を参照。しかし
ながらかかる抗体の結合部位はフィブリン分解過程中に
も保存されておりしたがってかかる抗体もフィブリン分
解産物に結合することができると考えられている。本発
明はフィブリン特異的モノクローナル抗体を産生するの
に全く異なる方法を取ることを可能にしそして無抗原
（ＡＦ）動物の増強された免疫学的感受性と結合した無
傷のフィブリン抗原を利用するものである。本発明の目
的のためには、フィブリン特異的モノクローナル抗体は
フィブリノーゲン、フィブリノーゲン分解産物またはフ
ィブリン分解産物でなくフィブリンに結合する。 （２）材料および方法 動 物 無菌ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮマウスはｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏ−ｎｓｉｎで維持された無
菌（ＧＦ）群体より得た。この動物をＧＦ条件下で我々
の研究所に輸送した。無抗原（ＡＦ）群体を天然成分食
餌Ｌ−４８５（Ｐｌｅａｓａｎｔｓ，Ｊ．Ｐ．，ら、
Ｊ．Ｎｕｔｒ．１１６，１９４９−１９６４（１９８
６）参照）を与えた妊娠中のＧＦマウスをＡＦアイソレ
イターに移すことから始めた。ＡＦアイソレイターでは
直ちにマウスを化学的に限定された（ＣＤ）ＡＦ食餌に
変えた。天然成分（ＮＩ）食餌に決して直接接触してい
ないそれらの子供を母乳から離乳させてＣＤ飼料にしそ
して第一ＡＦ世代と称した。このＡＦマウスを、雌が妊
娠しているとわかるまで組にしてつがわせた。次に雄を
取り出し雌がそれからは日常の脂質補充物を確実に全部
受取れるようにした。子供は２４日令で離乳させた。 飼育舎 ＡＦ育生種を標準ポリカーボネートマウスケージ２８×
１７．８×１２．７ｃｍの半分に対して飼った。底を切
り取り網目のステンレス鋼の偽底に取り替えた。ステン
レス鋼板の縦方向の仕切りをプラスチックケージの端に
ボルトで止め、ケージをこえて充分上に突き出てステン
レス鋼製網のふたを所定の場所に保持できるようにし
た。通常ケージの内部に収まるこのへこんだふたを逆に
して偽底上に十分な高さの空間を提供できるようにし
た。適切な大きさのステンレス鋼製輪を６０ｍｌ餌料用
ビンを保持するためにふたの上に溶接した。４個のステ
ンレス鋼製カップを偽底および上部との中間で、縦方向
仕切りの両側末端に溶接した（ケージの写真はＰｌｅａ
ｓａｎｔｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｔｈｅ ｇｅｒｍｆｒｅｅ ｓ
ｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ａｇｉｎｇ ａｎｄ ｉｍｍｕｎ
ｉｔｙ Ｉｎ：ＣＲＣＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ａｇｉｎｇ，（Ｋａｙ，Ｍ．
Ｍ．Ｂ．Ｓ．Ｍａｋｉｎｏｄａｎ，Ｔ．，編），ｐｐ．
２５７−２９７，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａ
ｔｏｎ，Ｆｌ．（１９８１）に示されている。餌料用ビ
ンは茶色のガラスであった。餌料および水用のビンの両
方はその中心にドリルであけた穴を有するプラスチック
のふたを有した。ビンを満たし、その輪に倒置した。脂
質補充物をステンレス鋼製カップに毎日測り入れた。プ
ラスチック皿を各ケージの下に置き排泄物を受けるよう
にした。下敷きとしておよび摂収しうる繊維としての両
方の役をする濾紙はクリッピング（Ｓａｒｇｅｎｔ Ｗ
ｅｌｃｈ）として購入したＷｈａｔｍａｎ ａｓｈｌｅ
ｓｓ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ Ｎｏ．４１である。
下敷きにはその紙を細片に切断した。切断していない正
方形の紙をアイソレーターの内部の清掃に使用した。紙
と１２１℃で２５分間オートクレーブするかまたはプラ
スチックバッグ中で照射（４．５Ｍｒａｄ）した。全て
のマウスはケージの片端をおおうのに充分な紙を与えら
れた。それがぬれたり、黄色になるかまたは汚れた場合
は取り替えた。ゲージは標準ノトバイオート法（Ｗｏｓ
ｔｍａｎｎ，Ｂ．Ｓ．，編、Ｇｎｏｔｏｂｉｏｔｅｓ
ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｇｕｉｄｅ Ｌｉｎｅｓ
ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，Ｃａｒｅ ａｎ
ｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ａｎｉｍａｌｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅ
ｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏ
ｎ，Ｄ．Ｃ．）を用いＴｒｅｘｌｅｒ型（Ｔｒｅｘｌｅ
ｒ，Ｐ．Ｃ．，Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．Ｃａｒｅ，１３，５
７２−５８１（１９６３））の１．３７×０．６×０．
６Ｍのフレキシブルアイソレーター内に維持した。アイ
ソレーターは１２時間明暗の時間割で２１℃で室内に維
持した２．５ｃｍ直径の７．５５ｃｍ長さのタイゴン
（Ｔｙｇｏｎ）チューブをアイソレーターの頂部にはめ
こみそして上部および下部両方でビニール栓で閉じた。
これは飼料、水および油の滅菌濾過の入口を提供する。 餌 料 第１表は餌料組成物および限外濾過Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水
（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ）中に成分を溶解させる順
序を示す。アミノ酸およびデキストロースはＳｉｇｍａ
組織培養等級であった。ビタミン類もＨｏｆｆｍａｎ−
Ｌａ Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｃ．（Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）の
善意により供給された純パルミチン酸レチニルを除いて
はＳｉｇｍａからのものであった。他の試薬はＦｉｓｈ
ｅｒ保証または同等品であった。完全に水溶性の食餌を
直径１５０ｍｍの３枚のＰｍ１０膜（Ａｍｉｃｏｎ）を
使用しＡｍｉｃｏｎ Ｄｉａｆｌｏ ＴＣ３限界濾過器
で冷時濾過した。限外濾過膜は分子量カットオフ１０，
０００ダルトンを有した。組立てられた限外濾過装置を
使用に先立ち０．１５％次亜塩素酸ナトリウム溶液を通
過させることにより滅菌にし、続いて充分に洗浄した。
限外濾過餌料は必要時まで無菌貯蔵器中４℃で保存し
た。餌料はＮｏ６ネオプレン栓に挿入された配送用チュ
ーブを有するオートクレーブずみ加圧フィルターホルダ
ー中の０．２μｍナイロン（ＭＳＩ）を使用してＡＦア
イソレーターに導入した。この目的には、アイソレータ
ーの上部にさしこまれたタイゴンチューブから上部のビ
ニール栓を取りはずし、チューブの内部を０．１％アル
キル−アリールスルホネートを含有する２％過酢酸の滅
菌溶液でスプレーした。フィルターホルダー栓を上部栓
の場所に挿入した。２０分後、下部の栓を取りはずし
（アイソレーターの内部）そして餌料または水を２０ｐ
ｓｉの窒素下でアイソレーターに濾過して入れた。脂質
補充物の組成を第２表に示す。大豆のトリグリセリドは
パルミテートからリノレネートまでのエステルを生成す
る温度範囲で真空蒸留したそれらのメチルエステルから
つくられた調製物であった。これらのエステルを続いて
グリセリンとエステル交換して混合トリグリセリドを形
成させた。（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ Ｐｒｅｐ，Ｅｌｙｓｉａ
ｎ，ＭＮ）。この混合物をアイソレーターに濾過して入
れる（その時には混合物は５０℃に加温）に先立ちこの
トリグリセリド混合物に脂溶性ビタミンを加えそして餌
料の水溶性部分について用いたと同じ方法によりアイソ
レーター中に濾過して入れた。脂質の摂取料は０．３７
５ｍｌ／日と測定された。脂質補充物を増大させること
により、新生マウスの死亡率が著しく減少した。平均の
仔寸法も従来通り飼育した動物のそれまで増加した。授
乳中の雌は正常量の２倍の脂質補充物を与えられた。 微生物学的監視 無抗原系を微生物汚染についてＷｏｓｔｍａｎｎ，Ｂ．
Ｓ．編（１９７０）Ｇｎｏｔｏｂｉｏｔｉｃｓ Ｓｔａ
ｎｄａｒｄｓ ａｎｄ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓｆｏｒ
ｔｈｅ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｃａｒｅ ａｎｄ ｍａｎ
ａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉ
ｍａｌｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏ
ｕｎｃｉｌ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．
に記載されたガイドラインに従い検査した。要約する
と、アイソレーター内部からの餌料および水で湿ったス
ワブを用いて、マウスからおよび各ゲージの下の蓄積し
た排泄物から新しく排泄物の塗抹標本を得た。また塗抹
標本はアイソレーターの壁、特に入口周辺からも採取し
た。常に二通り塗抹標本を取った。そのひとセットを、
グラム染色を用いて細菌および真菌について直接顕微鏡
検査により検査した。スワブの第２組は微生物の検出に
用いた。培養物が陰性であると見られるまで三週間経過
させた。微生物学的検査は約２週間ごとにまたはアイソ
レーターに新しい加入がなされた２−３日後に行った。 （３）無抗原マウスを用いるモノクローナル抗体の生産 前記無抗原マウスをモノクローナル抗体生産におけるリ
ンパ球ドナーとして用いた。全抗原の溶液は層流フード
中で無菌条件下に調製した。下記プロトコールをＡＦマ
ウスの免疫化に採用した。抗原（２５−５ｏμｇ）を無
菌食塩水（１００μｌ）に溶解させ、そして同量のフロ
インド完全アジュバント（ＦＣＡ）で乳化した。インタ
ーフェロン（１０００単位）を乳濁液調製に先立ち抗原
の溶液に添加した。無菌注射器および針を全ての免疫処
置に使用した。注射器を入口を通してＡＦアイソレータ
ーに搬入し、そこで過酢酸（２％）の溶液でスプレーす
ることにより滅菌した。ブースター注射は同量の抗原を
用い、ＦＣＡをフロインド不完全アジュバントで置き換
えて行った。全部で３回のブースター免疫を各３週間間
隔で行った。最後のブースター（アジュバントなし）は
融合の４−７日前に行った。全ての免疫処置は腹腔内に
行った。マウスを融合の当日にアイソレーターから取り
出しそしてＣＯ２窒息によりすぐに殺した。脾臓を取り
出して脾細胞を標準ハイブリドーマ法を用いてマウスミ
エローマ細胞（ＮＳｌ）と融合させた。 （４）フィブリン特異的モノクローナル抗体生産のため
の無抗原動物系の使用無抗原系を用いてフィブリン特異
的モノクローナル抗体を生成させた。抗体は特異性が高
く、そしてフィブリノーゲン、フィブリン分解産物また
はフィブリノーゲン分解産物を認識しない。ハイプリド
ーマ細胞系はヒトフィブリンで免疫化した無抗原ＢＡＬ
Ｂ／ｃマウスの脾細胞およびＮＳｌミエローマ細胞の融
合により生成させた。 免疫処置日程 ８週令の３匹の雌の無抗原マウスをヒトフィブリン調製
物３３μｇで免疫処置した。この調製物は、下記のよう
に調製されたフィブリンのフリーズフラクチャー試料で
あった：ヒトフィブリノーゲンをトロンビンおよび第Ｘ
ＩＩＩａ因子によりフィブリンに変換した。次にフィブ
リン凝塊を液体窒素中で凍結させそして機械的破壊によ
り非常に微細な粉末となした。フリーズフラクチャーし
たフィブリンの分散液を食塩水中に生成させて最終濃度
１ｍｇ／ｍｌを有する架橋フィブリンＸＬ−Ｆｎの透明
溶液を得た。このフィブリン抗原の３３μｌを動物の免
疫化に使用した。抗原溶液の量を無菌食塩水で１００μ
ｌに調整し、次に前項記載のようにしてＦＣＡで乳化し
た。２回のブースター免疫処置をフロインド不完全アジ
ュバント中の同レベルの抗原を用い、３週間間隔で投与
した。最後のブースターは融合４日前に行った。同レベ
ルの抗原を用いそしてアジュバントを食塩水で置き換え
た。 抗体の検出および測定 モノクローナル抗体の定性的および定量的測定はエンザ
イムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）
を用いて行った。ＥＬＩＳＡは９６ウェルＰＶＣプレー
ト（Ｃｏｓｔａｒ）上に固定化したヒトフィブリンを用
いて実施した。フィブリン被覆したアッセイプレートは
フィブリノーゲン溶液（Ｋａｂｉ、等級Ｌ）（５０μｇ
／ｍｌボレート／食塩緩衝液）の１００μｌを４℃にて
一夜インキュベートすることにより調製した。未結合フ
ィブリノーゲンは０．０５％ツィーン８０を含有するＰ
ＢＳ（ＰＢＳ−ツィーン）で洗浄することにより除去し
た。各プラスチックウェル上に被覆したフィブリノーゲ
ンを２ｍＭ ＣａＣｌ２を含有するトロンビン溶液（１
０ＮＩＨ 単位／ｍｌ）１００μｌと３７℃で１時間イ
ンキュベートすることによりフィブリンに変換した。抗
体の標準検量曲線はＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば均質であ
る抗体調製物を用いて作成した。非特異的結合を阻止す
るために、フィブリンを被覆したプレートをＰＢＳ ｐ
Ｈ７．４中のＢＳＡの１％溶液とインキュベートした。
次に抗体含有溶液（１００μｌ）を添加し、３７℃で９
０分間インキュベートした。手順の各工程後、ウェルを
ＰＢＳ−ツィーンで充分に洗浄した。結合された抗体は
１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ８．０、中で希釈し
たアルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）接合ウサギ抗
−マウス抗体の１０００倍希釈物を添加することにより
検出した。 ハイブリドーマの産生−融合 マウスをＣＯ２窒息により殺しそして直ちに脾臓摘出を
行った。免疫化マウスの脾臓細胞を融合剤ポリエチレン
グリコール４０００（３，０００−３，７００）を用い
て融合した。細胞をＴフラスコ中のＨＡＴ選択培地で１
週間インキュベートした。この期間の後、細胞を５個の
９６ウェルプレートに塗布すると、そのうち９３ウェル
が増殖を示した。これらのうち、１９ウェルはフィブリ
ン抗原に関して陽性であった。これらのクローンのうち
のひとつＦ４９２Ｄ８（後にＭＨ１と改称）は、フィブ
リン抗原は認識するがフィブリノーゲンと交差反応しな
い抗体を産生した。この特別のクローン、ＭＨ １を限
界希釈法で３回再クローンし、第三のクローニング期は
１ウェル１細胞で行った。細胞系が、いったん安定化さ
れると、無血清培地に移した。この細胞系は約７．５ｍ
ｇ／ｌレベルで抗体を産生する。 モノクローナル抗体の精製 精製に先立ち（４ｌバッチの）組織培養上清を遠心して
細胞屑を除去し、そして０．８μＭナイロン膜で濾過し
てすべての残留微粒子物質を除去した。ハイブリドーマ
上清は分子量カットオフ３０，０００を有するＹＭ型の
膜（Ａｍｉｃｏｎ）を用いてらせん巻き限外濾過装置を
使用して４℃にて５００ｍｌ量まで濃縮した。２０ｍＭ
２（Ｎ−モルホリン）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、
ｐＨ６（緩衝液Ａ）への緩衝液交換は製造業者の説明書
に従いダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａ
ｔｉｏｎ）により達成した。最終容量１００ｍｌとなる
までさらに濃縮した後、抗体溶液をさらに精製する前に
０．４５１ミクロンナイロン膜で濾過した。濃縮した抗
体溶液を７．７５ｍｍ×１０ｃｍ ＡＢｘカラム（Ｊ．
Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）を
用いるＷａｔｅｒｓＨＰＬＣクロマトグラフィーでの液
体クロマトグラフィーにより精製した。カラムを緩衝液
Ａで平衡化し、試料（１００ｍｌ）を１．０ｍｌ／分の
流速で注いだ。緩衝液Ａで充分に洗浄した後、抗体を緩
衝液Ａから１００％緩衝液Ｂ（１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ
７）のグラジィエントを用いてカラムから１ｍｌ／分で
溶出させた。フラクション（２ｍｌ）を収集し、ＭＡｂ
（ＥＬＩＳＡにより測定）を含有するものをプールして
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（２０ｍＭリン酸ナトリウ
ム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）で透析
し、１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で−２０℃にて保存した。
ＡＢｘカラムは１００％緩衝液Ｂで５分間洗浄し続いて
１５カラム量の緩衝液Ａで再度平衡化することにより再
生した。 （５）フィブリン特異性の測定 フィブリン特異性の最初の測定はハイブリドーマ上清を
フィブリンおよびフィブリノーゲン被覆マイクロタイタ
ープレートで別々にスクリーニングすることにより行っ
た。フィブリノーゲンと交差反応しない抗体を産生する
細胞系のみが受容された。フィブリン特異性のそれ以上
の確認は溶液中のフィブリノーゲンとの競合アッセイを
用いて測定され、それによりこの抗体が溶液中のフィブ
リノーゲンを認識しないことが確認された。抗体のフィ
ブリン特異性を確認するのに用いられる競合アッセイは
前記ＥＬＩＳＡアッセイで記載されるようにして行わ
れ、抗体を溶液中のフィブリノーゲンとプレインキュベ
ーションした。要約すると、ハイブリドーマ上清を、抗
体のフィブリノーゲンへの非特異的結合を阻止するため
にＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を含有する生理学的濃度の
フィブリノーゲン溶液（４ｍｇ／ｍｌ）と３７℃で３０
分間インキュベートした。次にフィブリノーゲン／抗体
溶液を、フィブリンを被覆したマイクロタイタープレー
トのウェルに移した。ＧｌｙＰｒｏＡｒｇＰｒｏ（ＧＰ
ＲＰ）を、フィブリンウェル中に残留するトロンビンに
よるフィブリノーゲンのありうる重合防止するためにフ
ィブリノーゲンインヒビターに添加した。次にアッセイ
を固定化抗原に結合された抗体に関する慣用のＥＬＩＳ
Ａアッセイと同様にして実施した。ＭＨ １抗体のフィ
ブリン特異性を検査する全ての実験において、第２の抗
体４５Ｊを対照として用いた。４５Ｊはフィブリンおよ
びフィブリノーゲンと交差反応する。 フィブリノーゲンとの交差反応の測定 ｉ）固定化されたフィブリンおよびフィブリノーゲン 細胞系ＭＨ１は、フィブリンがＰＶＣマイクロタイター
アッセイプレートの表面に固定化された場合、それと交
差反応するマウスモノクローナル抗体を産生する（第５
表）。同じアッセイにおいて、この抗体はプレートに固
定化されたフィブリノーゲンを認識しない。第５表のデ
ータが示すように、フィブリノーゲンがいったんトロン
ビンによりフィブリンに変換されると免疫反応は劇的に
増大し、このことはフィブリン分子上の新しいエピトー
プの露出または形成を明らかに示している。しかしなが
ら対照抗体である４５Ｊはフィブリノーゲンがフィブリ
ンに変換された場合に保存されているエピトープを明ら
かに認識する。 ｉｉ）フィブリンおよびフィブリノーゲンとの競合アッ
セイ 抗体、ＭＨ１抗体のフィブリン特異性は、ハイブリドー
マ上清をフィブリン被覆ウェル上でのＥＬＩＳＡに先立
ちフィブリノーゲン溶液（最終濃度４ｍｇ／ｍｌ）とプ
レインキュベートする競合アッセイでさらに示された。
かかる高レベルのフィブリノーゲンをこの競合アッセイ
に用いたので（抗体濃度の×５００）、ＢＳＡ（最終濃
度１０ｍｇ／ｍｌ）を混合物に添加した。フィブリン被
覆ウェル上の残留トロンビンによるフィブリン重合を阻
止するためにペプチドＧＰＲＰを添加した。このアッセ
イの結果は、ＭＨ１抗体が溶液中のフィブリノーゲンを
認識しないことを示している（第６図）。フィブリン４
００ｎｇがマイクロタイターアッセイプレートの各ウェ
ルに結合すると仮定すると、この特別の競合アッセイに
使用されたフィブリノーゲンレベルは結合フィブリン抗
原よりも１，０００倍過剰である。さらに、これは組織
上清中の抗体レベルの４００倍過剰である。 フィブリン（ブィブリノーゲン）分解産物との交差
反応性の測定 フィブリノーゲン分解産物（ＦＤＰ）はフィブリノーゲ
ンをプラスミンと３７℃で１０分〜３時間インキュベー
トすることにより調製した。所望の時間にトラシロール
（Ｔｒａｓｙｌｏｌ）（１００カリクレイン インヒビ
ター単位／ｍｌ）および２０ｍＭイプシロンアミノカプ
ロン酸（ＥＡＣＡ）の添加によりフィブリノーゲン分解
を停止させた。架橋フィブリン分解産物（ＸＬＦＤＰ）
は、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、プラスミノーゲン（０．２
５ｍｇ／ｍｌ）およびウロキナーゼ（５０ＩＵ／ｍｌ）
を含有するトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ，ｐＨ７．４、５
０ｍＭ トリスＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中のフ
ィブリノーゲン溶液（５ｍｇ／ｍｌ）にトロンビン（４
ＮＩＨ 単位／ｍｌ）を添加することにより調製した。
この混合物を３７℃でインキュベートしそしてプラスミ
ン消化を前記ＦＤＰで記載したようにして種々の時間間
隔で終了させた。抗体とフィブリン分解産物およびフィ
ブリノーゲン分解産物との交差反応性を測定するために
は、適当な分解産物をマイクロタイタープレートに被覆
しそして常法によりＥＬＩＳＡを行った。第７表の結果
が示すように、ＭＨ１抗体はプラスミンにより生成され
たフィブリノーゲン分解産物のいずれとも交差反応しな
い。第８表が示すとおり、この抗体はＸＬ−フィブリン
分解産物と反応しない。また、抗体をウェスタンブロッ
ティング分析により交差反応性について検査した場合に
もこの観察がなされた。抗体は、前駆体分子フィブリノ
ーゲンの表面上に存在しないか露出されていない無傷の
フィブリン分子のエピトープを認識するという結論が導
き出されうる。このエピトープは第８表のデータが示唆
するとおり、架橋フィブリンのプラスミン消化により明
らかに破壊される。従って、ＭＨ１抗体は以下のように
定義されうるフィブリン特異的モノクローナル抗体であ
る。すなわち本発明の目的にとって、フィブリン特異的
モノクローナル抗体は次のようなモノクローナル抗体で
ある： １．前記した、フィブリンおよびフィブリノーゲンとの
交差反応性を測定するための競合アッセイにおいて、こ
のモノクローナル抗体はフィブリノーゲンがフィブリン
と比較して１０００倍過剰量で用いられた場合にフィブ
リノーゲンと約７５％以下、そして好ましくは約１０％
以下の交差反応性しか有しない、 ２．前記した、架橋フィブリンおよびフィブリン分解産
物との交差反応性を測定するためのアッセイにおいて、
このモノクローナル抗体と、プラスミンで約３時間消化
したフィブリンとの反応性はモノクローナル抗体とフィ
ブリンとのゼロ時間における反応性の約５０％以下、そ
して好ましくは約４０％以下である、および ３．前記した、フィブリノーゲンおよびフィブリノーゲ
ン分解産物との交差反応性を測定するためのアッセイに
おいて、このモノクローナル抗体と、プラスミンで約４
時間消化したフィブリノーゲンとの反応性はゼロ時間で
のこのモノクローナル抗体とフィブリノーゲンとの反応
性より決して大きくない。ＭＨ１抗体は、そのフィブリ
ンに対するアフィニティを測定することによりさらに特
性決定されている。アフィニティは１２５Ｉ標識ＭＨ１
抗体を用いスカッチャード分析（Ｆｒａｎｋｅｌら、Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６，１０
１−１０６（１９７９））により測定した。解離定数Ｋ
Ｄについて得られた値は６．７×１０−１０Ｍであっ
た。かかるアフィニティはフィブリンに対するｔ−ＰＡ
のアフィニティのそれの約５，０００倍である。ＭＨ１
抗体がフィブリノーゲンのＡα、Ｂβまたはガンマ鎖と
交差反応しないこともウェスタンブロッティング分析に
より測定されている。また、ＭＨ１抗体がフィブリノー
ゲンのトロンビン処理ＡαまたはＢβ鎖と交差反応しな
いことも同じ分析法により測定されている。（フィブリ
ノーゲンのトロンビン処理は、Ａα鎖およびＢβ鎖から
それぞれフィブリノペプチドＡおよびフィブリノペプチ
ドＢの放出を生じ、それゆえフィブリンのα鎖およびβ
鎖が形成される。） 加えて、第７表の結果が示すとおり、対照抗体４５Ｊ抗
体はフィブリノーゲンに結合しそしてフィブリノーゲン
分解産物とは交差反応しない。従って、かかるモノクロ
ーナル抗体はフィブリノーゲン特異的モノクローナル抗
体であって本発明のもう一つの観点を表わすものであ
る。フィブリノーゲン特異的モノクローナル抗体は、イ
ンビトロで血漿フィブリノーゲンレベルを測定するのに
利用できる任意のイムノアッセイに使用できる。４５Ｊ
抗体は、４５ＪエピトープがフィブリノーゲンのＡα鎖
のアミノ酸およそ２０６からおよそ４２４までの領域に
あり、そしておよそ２０７からおよそ２３１までの領域
にある可能性が最も高いことが測定されているという点
でさらに特性決定されている。本発明の目的にとって、
フィブリノーゲン特異的モノクローナル抗体は前記した
ように、フィブリノーゲンおよびフィブリノーゲン分解
産物との交差反応性を測定するアッセイにおいて、プラ
スミンで約４０分間消化したフィブリノーゲンとそのモ
ノクローナル抗体との反応性がモノクローナル抗体とフ
ィブリノーゲンとのゼロ時間での反応性の約５０％以下
である抗体である。４５Ｊハイブリドーマはフィブリン
で免疫した慣用のＢａｌｂ／ｃマウスを用いる常法によ
り作られた。しかしながら、フィブリノーゲンも抗原と
して利用できる。 非架橋フィブリンおよび非架橋フィブリン凝血塊と
の交差反応性の測定 抗体ＭＨ１は架橋フィブリン（ＸＬＦｎ）とのみならず
非架橋フィブリン（ＮＯＮＸＬＦｎ）とも交差反応する
ことがＥＬＩＳＡにより示されている。ＥＬＩＳＡは以
下のようにして行われた。 １．９６ウェルマイクロタイターアッセイプレートを１
００μｌのフィブリノーゲン溶液（ボレート（ｐＨ８．
５）食塩水緩衝液中５０μｇ／ｍｌ）で４℃で一夜被覆
した。 ２．架橋フィブリンは、２ｍＭ ＣａＣｌ２および１０
ｍＭシステインを含有するトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ、
ｐＨ７．４、５０ｍＭ トリスＨＣｌ、１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ）中のトロンビン溶液（１０ＮＩＨ 単位／ｍ
ｌ）と３７℃で１時間インキュベーションすることによ
りフィブリノーゲン被覆ウェル中で形成された。 ３．非架橋フィブリンはＥＤＴＡを最終濃度０．０１２
５Ｍまで含有するりん酸塩緩衝液（ｐＨ６．１）中のト
ロンビン溶液（１０ＮＩＨ 単位／ｍｌ）と３７℃で１
時間インキュベーションすることにより、フィブリノー
ゲン被覆ウェル中で形成された。 ４．結合された抗体は抗マウスアルカリホスファターゼ
接合体とインキュベーションすることにより測定した。
結合された接合体はアルカリホスファターゼ基質を添加
することにより測定しそして生ずる比色反応を自動式プ
レート読みとり器中４０５ｎＭで監視した。 アッセイの結果を第９表に示し、そして架橋フィブリン
との抗体の交差反応性はそれと非架橋フィブリンとのそ
れより大きいと結論できる。最も簡単な説明は架橋重合
体状構造中に存在する共有架橋が抗体が認識するコンホ
ーメーションを固定または凍結させる役目をするという
ことである。非架橋種ではコンホーメーションは形成さ
れはするが重合体の共有結合によって安定化されていな
い。この抗体がインビトロで形成された架橋および非架
橋凝血塊の両方と交差反応することも示されている。架
橋フィブリンは、フィブリノーゲン溶液（ＣａＣｌ
２（２ｍＭ）およびシステイン（１０ｍＭ）を含有する
トリス（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）食塩水中）をトロンビ
ン（１０ＮＩＨ 単位／ｍｌ）と３７℃で３時間インキ
ュベートすることにより調製した。非架橋フィブリン
は、ＥＤＴＡを最終濃度０．０１２５Ｍまで含有するり
ん酸塩緩衝液（ｐＨ６．１）中のフィブリノーゲン溶液
（３ｍｇ／ｍｌ）をトロンビン溶液（１０ＮＩＨ 単位
／ｍｌ）と３７℃で３時間インキュベートすることによ
り形成された。凝血塊の形成後、これらを洗浄しそして
１２５Ｉ−標識ＭＨ１抗体を含有する１％ＢＳＡ溶液４
００μｌと３７℃でインキュベートした。種々の時点で
少量の溶液をとり出しそして抗体とり込みの量をガンマ
カウンター中で血漿を計測することにより測定した。第
１０表は非架橋および架橋凝血塊の両方による抗体のと
り込みを示す。 （６）ハイブリドーマの寄託 ＭＨ１および４５Ｊは１９８８年６月９日にアメリカン
タイプ カルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託
されておりそしてそれぞれ受託番号ＨＢ ９７３９およ
び ＨＢ ９７４０を与えられた。ＡＴＣＣは１２３０
１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ，ＭＤ．２０８５２にある。ＭＨ１抗体はカッパ軽鎖
を有するＩｇＧ１抗体でありそしてＭＨ１抗体はヒトフ
ィブリンのみならずウサギフィブリンとも交差反応する
ことが観察されている。本発明は寄託されたハイブリド
ーマにその範囲が限定れることを意図するものではな
く、これらはここに定義されるようにフィブリン特異的
モノクローナル抗体およびフィブリノーゲン特異的モノ
クローナル抗体を生成したハイブリドーマの単一の説明
例であることが意図される。機能的に同等なすべての細
胞系が本発明の範囲内にある。“機能的に同等”なる用
語は、ＭＨ１抗体が結合するフィブリンのエピトープへ
の結合または４５Ｊ抗体が結合するフィブリノーゲンの
エピトープへの結合においてそれぞれＭＨ１抗体または
４５Ｊ抗体とその抗体が競合しうることを意味する。さ
らに、かかる用語にはここに記載されるように、ＭＨ１
抗体が結合しそして４５Ｊ抗体が結合するエピトープと
は異なるエピトープに結合するフィブリン特異的モノク
ローナル抗体およびフィブリノーゲン特異的モノクロー
ナル抗体がそれぞれ包含される。 （７）フィブリン特異的モノクローナル抗体のインビボ
診断用途および治療用途 凝血塊／血管病所在確認 本発明のフィブリン特異的モノクローナル抗体はインビ
ボでフィブリン凝血塊またはフィブリン集塊を標的ねら
いしうる。それゆえこれらはヒトのありうる組織または
血管損傷の局在判定および血管疾患の監視に用いること
ができる。フィブリン特異的モノクローナル抗体は、か
かるモノクローナル抗体がフィブリノーゲン、フィブリ
ン分解産物およびフィブリノーゲン分解産物に結合せ
ず、それによりバックグラウンドを低下させ、このこと
によりフィブリン凝血塊またはフィブリンの集塊物をよ
り正確に所在確認できるので、この用途に特に好まし
い。この応用にとっては、精製モノクローナル抗体の使
用が好ましい。精製はＨＰＬＣ法でなされるのが好まし
い。ヒトへの投与用のモノクローナル抗体の精製はまた
硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウム沈澱に続く食塩
水での透析および濾過滅菌によっても達成できる。ある
いはまた、イムノアフィニティクロマトグラフィー法を
モノクローナル抗体の精製に用いることもできる。精製
モノクローナル抗体は放射性化合物例えば、１２３Ｉ、
１２５Ｉ、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎで標識し
そして患者に静脈投与することができる。抗体は磁気プ
ローブで標識することもできる。次に凝血塊の位置を正
確に指摘するのにＮＭＲを利用できる。凝血塊またはフ
ィブリン集塊物での抗体の局在確認後、それらを放射形
トモグラフィー法および放射性核走査法により検出し、
それにより例えば血栓またはフィブリンによりカプセル
化された腫瘍の位置を正確に指摘できる。例示するに
は、精製モノクローナル抗体を適当な担体例えばヒトア
ルブミンを含有または含有しない食塩水中に適当な用量
で懸濁させ、そして患者に投与する。このモノクローナ
ル抗体は好ましくは静脈投与、例えば数時間にわたり連
続して静脈注入することにより投与される。 血管疾患のモノクローナル抗体接合体を用いる治療 本発明のモノクローナル抗体は広範囲の薬剤例えば細胞
毒剤および血栓溶解剤例えばｔ−ＰＡ、ウロキナーゼ、
ストレプトキナーゼ、およびフィブリンを溶解させうる
他のプロテアーゼと一緒に使用できる。かかる使用は特
に好ましい、何故なら本発明のフィブリン特異的モノク
ローナル抗体は、かかる試薬のどれもフィブリノーゲ
ン、フィブリン分解産物またはフィブリノーゲン分解産
物への結合によって失われないであろうからかかる試薬
の非常に効率的な使用ができようからである。この点に
関する種々の概説はＢａｌｅら、１９８０，Ｃａｎｃｅ
ｒＲｅｓｅａｒｃｈ，４ｏ：２９６５−２９７；Ｇｈｏ
ｓｅおよびＢｌａｉｒ，１９７８，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，６１（３）：６５７−６７６；
Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，１９７７，Ｎａｔｕｒｅ，２
６５：４０７−４１１；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，１９
８０，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．，１０：１０３−１
０８；およびＴｒｏｕｅｔら、１９８０，Ｒｅｃｅｎｔ
Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７５：２
２９−２３５を参照されたい。これら薬剤をモノクロー
ナル抗体分子に結合させるのに用いられる方法は非共有
または共有結合を包含しうる。非共有結合は抗体複合体
が標的部位に到達する以前に破壊される可能性がより高
そうなので、共有結合が好ましい。例えば、カルボジイ
ミド結合は薬剤のカルボキシ基と抗体分子のアミノ基と
の間で形成されうる。ジアルデヒドまたはイミドエステ
ルのような二官能剤を薬物のアミノ基を抗体分子のアミ
ノ基に結合させるのに使用できる。シッフ塩基反応は薬
物を抗体分子に結合させるのに使用できる。この方法は
グリコールまたはヒドロキシ基を含有する薬物または細
胞毒剤の過ヨウ素酸塩酸化、従ってアルデヒドの形成を
包含し、次にこれが抗体分子と反応する。結合は抗体分
子のアミノ基とのシッフ塩基形成を介して起る。さら
に、反応性スルフヒドリル基を有する薬物も抗体分子に
結合されている。 微生物 アメリカン タイプ カルチャー コレクション １２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ ２０８５２ ＵＳＡ １９８８年６月９日寄託、受託番号ＨＢ ９７４０
【発明の効果】本発明により、抗原を抗体と接触させる
ことからなる該抗原の存在を判定するためのイムノアッ
セイ、モノクローナル抗体および免疫した無菌動物から
得られたポリクローナル抗体をインビボおよびインビト
ロで臨床的診断および治療に利用するための方法が提供
される。また本発明により、フィブリン特異的モノクロ
ーナル抗体をも提供される。
ことからなる該抗原の存在を判定するためのイムノアッ
セイ、モノクローナル抗体および免疫した無菌動物から
得られたポリクローナル抗体をインビボおよびインビト
ロで臨床的診断および治療に利用するための方法が提供
される。また本発明により、フィブリン特異的モノクロ
ーナル抗体をも提供される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 16/36 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/10 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｌ 33/577 Ｂ Ａ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 プロプリス，ヴィクトリア，エー. アメリカ合衆国 インディアナ州 46615, サウスベンド，ジェファーソン スクウ ェア 3317 (72)発明者 プリーザンツ，ジュリアン，アール. アメリカ合衆国 インディアナ州 46530, グレンジャー，ガムウッド ロード 52631
Claims (29)
- 【請求項１】抗原を抗体と接触させることからなる該抗
原の存在を判定するためのイムノアッセイにおいて、改
良点が該抗体として無抗原動物由来の抗体を用いること
からなるイムノアッセイ。 - 【請求項２】前記抗体がモノクローナル抗体である、請
求項１のイムノアッセイ。 - 【請求項３】前記抗体が血清中のポリクローナル抗体で
ある、請求項１のイムノアッセイ。 - 【請求項４】前記無抗原動物がマウス、ラット、ブタ、
モルモット、家禽、ヤギ、ヒツジ、霊長類およびウサギ
より成る群から選択される、請求項２または３の方法。 - 【請求項５】前記無抗原動物がマウスである、請求項４
の方法。 - 【請求項６】前記マウスがＢａｌｂ／Ｃマウスである、
請求項５の方法。 - 【請求項７】有効量のモノクローナル抗体を診断学的に
許容しうる担体と共に含有して成るインビボで抗原を局
在判定するための診断用組成物であって、該モノクロー
ナル抗体が無抗原動物由来のモノクローナル抗体である
ことから成る組成物。 - 【請求項８】前記無抗原動物がマウス、ラット、ブタ、
モルモット、家禽、ヤギ、ヒツジ、霊長類およびウサギ
より成る群から選択される、請求項７の組成物。 - 【請求項９】前記無抗原動物がマウスである、請求項８
の組成物。 - 【請求項１０】前記マウスがＢａｌｂ／Ｃマウスであ
る、請求項９の組成物。 - 【請求項１１】有効量のモノクローナル抗体を製剤学的
に許容しうる担体と共に含有して成る該モノクローナル
抗体を治療上利用するための医薬組成物であって、該モ
ノクローナル抗体が無抗原動物由来のモノクローナル抗
体であることから成る組成物。 - 【請求項１２】前記無抗原動物がマウス、ラット、ブ
タ、モルモット、家禽、ヤギ、ヒツジ、霊長類およびウ
サギから成る群から選択される、請求項１１の組成物。 - 【請求項１３】前記無抗原動物がマウスである、請求項
１２の組成物。 - 【請求項１４】前記マウスがＢａｌｂ／Ｃマウスであ
る、請求項１３の組成物。 - 【請求項１５】（ａ）フィブリノーゲン、（ｂ）プラス
ミン誘導フィブリノーゲン分解産物、および（ｃ）プラ
スミン誘導フィブリン分解産物と交差反応しない、ハイ
ブリドーマＡＴＣＣ ＨＢ ９７３９により生産された
フィブリン特異的モノクローナル抗体。 - 【請求項１６】像形成剤または治療剤に結合された、請
求項１５のモノクローナル抗体。 - 【請求項１７】（ａ）フィブリノーゲン、（ｂ）プラス
ミン誘導フィブリノーゲン分解産物、および（ｃ）プラ
スミン誘導フィブリン分解産物と交差反応しない、フィ
ブリン特異的 モノクローナル抗体を産生する連続細胞
系列ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ ９７３９。 - 【請求項１８】ハイブリドーマＡＴＣＣ ＨＢ ９７３
９により産生されたＭＨ−１抗体のＭＨ−１標的抗原へ
の免疫特異的結合を競合的に阻害し、かつ（ａ）フィブ
リノーゲン、 （ｂ）プラスミン誘導フィブリノーゲン分解産物、およ
び（ｃ）プラスミン誘導フィブリン分解産物、 と交差反応しない、モノクローナル抗体。 - 【請求項１９】像形成剤または治療剤に結合された、請
求項１８のモノクローナル抗体。 - 【請求項２０】有効量のモノクローナル抗体を診断学的
に許容しうる担体と共に含有して成るインビボでフィブ
リン凝血塊またはフィブリンの凝集を局在判定するため
の診断用組成物であって、該モノクローナル抗体が請求
項１５または１８のフィブリン特異的モノクローナル抗
体である組成物。 - 【請求項２１】有効量のモノクローナル抗体と血栓溶解
剤を製剤学的に許容しうる担体と共に含有して成る血栓
を治療するための医薬組成物であって、該モノクローナ
ル抗体が請求項１５または１８のフィブリン特異的モノ
クローナル抗体である組成物。 - 【請求項２２】有効量のモノクローナル抗体と細胞毒剤
を製剤学的に許容しうる担体と共に含有して成るフィブ
リンカプセル化腫瘍を治療するための医薬組成物であっ
て、該モノクローナル抗体が請求項２０または２３のフ
ィブリン特異的モノクローナル抗体である組成物。 - 【請求項２３】血漿フィブリンをモノクローナル抗体と
接触させることから成るインビトロで血漿フィブリンレ
ベルを測定するためのイムノアッセイにおいて、改良点
が該モノクローナル抗体として請求項１５または１８の
フィブリン特異的モノクローナル抗体を用いることから
成る方法。 - 【請求項２４】請求項１５または１８のフィブリン特異
的モノクローナル抗体を含むキット。 - 【請求項２５】（ａ）フィブリノーゲンの単離したＡα
鎖に結合し、（ｂ）トロンビンによるフィブリノーゲン
のフィブリンへの変換時間を延長せず、（ｃ）フィブリ
ンに結合し、そして（ｄ）プラスミン誘導フィブリノー
ゲン分解産物と交差反応しない、ハイブリドーマＡＴＣ
Ｃ ＨＢ ９７４０により産生されたフィブリノーゲン
特異的モノクローナル抗体。 - 【請求項２６】（ａ）フィブリノーゲンの単離したＡα
鎖に結合し、（ｂ）トロンビンによるフィブリノーゲン
のフィブリンへの変換時間を延長せず、（ｃ）フィブリ
ンに結合し、そして（ｄ）プラスミン誘導フィブリノー
ゲン分解産物と交差反応しない、フィブリノーゲン特異
的モノクローナル抗体を産生する連続細胞系列ハイブリ
ドーマＡＴＣＣ ＨＢ ９７４０。 - 【請求項２７】ハイブリドーマＡＴＣＣ ＨＢ ９７４
０により産生された４５Ｊ抗体の４５Ｊ標的抗原への免
疫特異的結合を競合的に阻害し、かつ（ａ）フィブリノ
ーゲンの単離したＡα鎖に結合し、（ｂ）トロンビンに
よるフィブリノーゲンのフィブリンへの変換時間を延長
せず、（ｃ）フィブリンに結合し、そして（ｄ）プラス
ミン誘導フィブリノーゲン分解産物と交差反応しない、
ことを特徴とするモノクローナル抗体。 - 【請求項２８】血漿フィブリノーゲンをモノクローナル
抗体と接触させることから成るインビトロで血漿フィブ
リノーゲンレベルを測定するためのイムノアッセイにお
いて、改良点が該モノクローナル抗体として請求項２５
または２７のフィブリノーゲン特異的モノクローナル抗
体を用いることから成る方法。 - 【請求項２９】請求項２５または２７のモノクローナル
抗体を含むキット。
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