CN101115831A - 纯化脂肪酶的制造方法 - Google Patents

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CN101115831A CNA2006800044516A CN200680004451A CN101115831A CN 101115831 A CN101115831 A CN 101115831A CN A2006800044516 A CNA2006800044516 A CN A2006800044516A CN 200680004451 A CN200680004451 A CN 200680004451A CN 101115831 A CN101115831 A CN 101115831A
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广瀬忠城
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新井有里
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Abstract

本发明提供一种纯化脂肪酶的制造方法，包括(a)使长链甘油三脂肪酸酯和中链甘油三脂肪酸酯与脂肪酶相接触来纯化该脂肪酶的工序；以及(b)收集纯化脂肪酶的工序。通过该制造方法，可以得到降低了有机硅等杂质含量的纯化脂肪酶。

Description

纯化脂肪酶的制造方法
技术领域
本发明涉及可适用于各种酯化反应、酯交换反应等的纯化脂肪酶的制造方法，可适用于酯交换反应的酯交换用脂肪酶的制造方法，使用由这些方法得到的脂肪酶的油脂的酯交换方法以及含有该脂肪酶的脂肪酶组合物。
背景技术
脂肪酶广泛应用于脂肪酸等各种羧酸和一元醇或多元醇等醇类的酯化反应、多个羧酸酯间的酯交换反应等中。其中，酯交换反应是作为动植物油脂类的改性，各种脂肪酸的酯、糖酯或甾类化合物的制造方法的重要技术。作为这些反应的催化剂，使用作为油脂水解酶的脂肪酶时，在室温至约70℃左右的温和条件下即可进行酯交换反应，与以往的化学反应相比，不仅可抑制副反应、降低能源成本，而且作为催化剂的脂肪酶是天然物质，因此安全性也很高。另外，利用其基质特异性和位置特异性，可以高效地生产目的物。
另一方面，培养脂肪酶的生产菌时，为了消泡通常在培养基中添加有机硅，添加的有机硅会混入收集的脂肪酶中。用这种脂肪酶进行油脂的酯交换时，所得酯交换油脂中往往混有有机硅，用含有有机硅的油炸食品时有起泡性增高的问题。另一方面，培养脂肪酶的生产菌时，脂肪酶往往会产生色素等，使用这种脂肪酶进行油脂的酯交换时得到的酯交换油脂往往着色、风味变差。
因此，寻求高度除去认为来自有机硅或脂肪酶的各种杂质的纯化脂肪酶。
进而寻求脂肪酶活性提高的酯交换用脂肪酶。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供(纯化)脂肪酶的制造方法。
本发明的目的还在于提供(酯交换用)脂肪酶的制造方法。
本发明的目的还在于提供使用上述制造方法得到的脂肪酶的油脂组合物的制造方法。
本发明的目的还在于提供含有上述制造方法得到的脂肪酶的脂肪酶组合物。
本发明正是基于将脂肪酶与长链甘油三脂肪酸酯和中链甘油三脂肪酸酯混合时，脂肪酶中的各种杂质高效地转移到甘油三酯中，可纯化脂肪酶这一知识而达成的。
即，本发明提供(纯化)脂肪酶的制造方法(本发明的第1实施方式)，包括(a)使长链甘油三脂肪酸酯和中链甘油三脂肪酸酯与脂肪酶相接触来纯化该脂肪酶的工序；以及
(b)收集纯化脂肪酶的工序。
本发明提供(酯交换用)脂肪酶的制造方法(本发明的第2实施方式)，包括(a)使甘油的脂肪酸偏酯和/或甘油缩合物的脂肪酸偏酯与脂肪酶相接触的工序；以及
(b)接触后，收集脂肪酶的工序。
本发明还提供油脂组合物的制造方法，其特征在于，在通过上述制造方法制造的脂肪酶存在下，进行油脂的酯交换。
本发明还提供一种脂肪酶组合物，其含有由上述方法制造的脂肪酶和相当于该脂肪酶0.5～5倍质量的甘油三酯。
具体实施方式
首先，对本发明的第1实施方式进行说明。
[长链甘油三脂肪酸酯]
本发明中使用的长链甘油三脂肪酸酯优选为构成脂肪酸的碳数为14～24，优选为16～18的甘油三酯。构成的脂肪酸可以是饱和脂肪酸也可以是不饱和脂肪酸，可以是直链也可以是支链。构成甘油三酯的3个脂肪酸可以是3个完全相同，也可以是2个构成的脂肪酸相同而另1个不同，还可以是3个都互不相同。其中，优选碳数16～22的不饱和脂肪酸，特别优选碳数16～18的直链不饱和脂肪酸。特别优选选自菜籽油、大豆油、葵花籽油、红花油、玉米油中的脂肪酸。这些长链甘油三脂肪酸酯可以单独使用，也可以2种以上并用。
本发明中可用的长链甘油三脂肪酸酯可以用公知的方法制造，也可以使用市售品。市售品例如为日清奥利友集团株式会社出售的商品名为Canola油的产品。
[中链甘油三脂肪酸酯]
本发明中使用的中链甘油三脂肪酸酯优选构成脂肪酸的碳数为6～12，优选为8～10的甘油三酯。构成的脂肪酸可以是饱和脂肪酸也可以是不饱和脂肪酸，可以是直链也可以是支链。构成甘油三酯的3个脂肪酸可以是3个完全相同，也可以是2个构成的脂肪酸相同，还可以是3个都互不相同。其中，优选碳数8～10的饱和脂肪酸。这些中链甘油三脂肪酸酯可以单独使用，也可以2种以上并用。
本发明中可用的中链甘油三脂肪酸酯可以用公知的方法制造，也可以使用市售品。市售品例如为日清奥利友集团株式会社出售的商品名为ODO的产品。
本发明的纯化脂肪酶作为油脂的酯交换用酶使用时，优选本发明中使用的长链甘油三脂肪酸酯和/或中链甘油三脂肪酸酯与进行酯交换的油脂相同。
本发明中，长链甘油三脂肪酸酯和中链甘油三脂肪酸酯优选以质量比为99∶1～1∶99的比率使用，更优选为以95∶5～50∶50的比率使用。进一步优选为以90∶10～80∶20的比率使用。因为以这种比率使用时操作性提高而优选。
本发明中，优选使相当于脂肪酶总质量2倍～100倍，优选5～10倍质量的甘油三酯与脂肪酶相接触。因为以这样的用量使用时酶的洗涤效果提高而优选。
[脂肪酶]
作为本发明中可用的脂肪酶，可举出脂蛋白脂酶、单酰甘油脂肪酶、二酰甘油脂肪酶、三酰甘油脂肪酶、半乳糖酯酶、磷脂酶等。其中，优选三酰甘油脂肪酶。
作为产生这些脂肪酶的微生物，并不特别限定于细菌、酵母、线状菌、放线菌等，可举出假单胞杆菌属(Pseudomonas sp.)、产碱杆菌属(Alcaligenes sp.)、节杆菌属(Arthrobacter sp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)、球拟酵母属(Torulopsis sp.)、埃希氏杆菌属(Escherichia sp.)、芽生圆酵母属(Mycotorula sp.)、丙酸杆菌属(Propionibacterium sp.)、色杆菌属(Chromobacterium sp.)、黄单胞菌属(Xanthomonas sp.)、乳芽孢杆菌属(Lactobacillus sp.)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium sp.)、假丝酵母菌属(Candida sp.)、地霉属(Geotrichum sp.)、荚复膜孢糖酵母属(Saccharomycopsis sp.)、诺卡氏菌属(Nocardia sp.)、镰孢菌属(Fusarium sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)、青霉属(Penicillium sp.)、根毛霉属(Rhizomucorsp.)、毛霉菌属(Mucor sp.)、根霉属(Rhizopus sp.)、须霉属(Phycomyces sp.)、柄锈菌属(Puccinia sp.)、芽孢杆菌属(Bacillussp.)、链霉菌属(Streptomyces sp.)等。
本发明优选其中来自产碱杆菌属、假单胞杆菌属、根毛霉属、毛霉菌属、嗜热真菌属(Thermomyces sp.)、根霉属或青霉属的脂肪酶，更优选来自米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)和产碱杆菌属(Alcaligenes sp.)的脂肪酶。
本发明中使用的脂肪酶，可以有位置特异性，也可以没有。有位置特异性时，优选为1，3-特异性。
本发明中使用的脂肪酶，可以是固定于阴离子交换树脂、苯酚吸附树脂、疏水性载体、阳离子交换树脂、螯合树脂等载体上的形态，也可以是不固定于载体上的粉末状形态，但优选为不固定于载体上的粉末状形态。使用这种粉末状的脂肪酶(以下简称为粉末脂肪酶)时，通过本发明的制造方法得到的纯化脂肪酶的酶活性更高，因此是优选的。
上述脂肪酶为粉末脂肪酶时，其粒径可为任意大小，但优选其90质量％以上的粒径为1～100μm，优选为10～70μm。因为在该范围内操作性良好而优选。在此，粉末脂肪酶的粒径例如可以用HORIBA公司的粒度分布测定装置(LA-500)进行测定。
另外，反应前后脂肪酶的含水量优选调整为0.1～10％。因为在该范围内操作性良好而优选。
本发明中使用的脂肪酶可以使用可商购的产品。这些脂肪酶例如为名糖产业(株)销售的商品名lipase QLM、lipase PL，NOVOZYMES销售的lipase RM、lipase TL。
本发明中使用的脂肪酶为粉末状时，例如可通过对含有脂肪酶的水溶液进行喷雾干燥或冷冻干燥得到。
在此，作为含有脂肪酶的水溶液，可举出除去菌体的脂肪酶培养液、纯化培养液、将由此制得的脂肪酶粉末再次溶解·分散在水中的溶液、将市售的脂肪酶粉末再次溶解·分散在水中的溶液、市售的液状脂肪酶等。进而，优选为了更提高脂肪酶活性而除去了盐类等低分子成分的溶液，另外，更优选为了更提高粉末性状而除去了糖等低分子成分的溶液。
作为脂肪酶培养液，例如可举出含有大豆粉、蛋白胨、玉米浆、K2HPO4、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O等的水溶液。其浓度为大豆粉0.1～20质量％、优选1.0～10质量％，蛋白胨0.1～30质量％、优选0.5～10质量％，玉米浆0.1～30质量％、优选0.5～10质量％，K2HPO4 0.01～20质量％、优选0.1～5质量％。另外，(NH4)2SO4 0.01～20质量％、优选0.05～5质量％，MgSO4·7H2O 0.01～20质量％、优选0.05～5质量％。培养条件调控为培养温度10～40℃、优选20～35℃，通气量0.1～2.0VVM、优选0.1～1.5VVM，搅拌转数100～800rpm、优选200～400rpm，pH 3.0～10.0、优选4.0～9.5为宜。
菌体分离优选通过离心分离、膜过滤等进行。另外，盐类或糖等低分子成分的去除可以通过UF(超滤)膜处理进行。具体地，进行UF膜处理，将含有脂肪酶的水溶液浓缩至1/2量的体积后，加入与浓缩液等量的磷酸缓冲液，重复上述操作1～5次，由此得到除去了低分子成分的含有脂肪酶的水溶液。
优选离心分离控制在200～20000×g，膜过滤采用MF膜(微孔滤膜)，用MF膜、压滤器等将压力控制在3.0kg/m2以下。菌体内的酶优选用均质器、韦林捣切机、超声粉碎、弗氏压碎机、球磨机等进行细胞粉碎，通过离心分离、膜过滤等除去细胞残留。均质器的搅拌转数为500～30000rpm、优选为1000～15000rpm，韦林捣切机的转数为500～10000rpm、优选为1000～5000rpm。搅拌时间为0.5～10分钟，优选为1～5分钟。超声波粉碎在1～50KHz、优选在10～20KHz的条件下进行为宜。球磨机使用直径0.1～0.5mm左右的玻璃制小球为宜。
本发明中，含有脂肪酶的水溶液优选为含有固体成分5～30质量％。
优选在即将进行喷雾干燥等干燥工序前将含有脂肪酶的水溶液的pH调整至6～7.5。特别优选调整至pH 7.0以下，更优选调整到pH 6.5～7.0的范围内。pH调整也可以在喷雾干燥等干燥工序前的任一工序中进行，为了使即将进行干燥工序前的pH在上述范围内，也可以预先调整含有脂肪酶的水溶液的pH。pH调整可采用各种碱性物质或酸，但优选使用氢氧化钠等碱金属氢氧化物。
另外，也可以在干燥工序前的中间工序中对含有脂肪酶的水溶液进行浓缩。浓缩方法没有特别限定，例如可举出蒸发器、闪蒸器、UF膜浓缩、MF膜浓缩、采用无机盐类的盐析、溶剂沉淀法、采用离子交换纤维素等的吸附法、采用吸水性凝胶的吸水法等。优选为UF膜浓缩、蒸发器。UF膜浓缩用膜优选截留分子量为3000～100000、更优选为6000～50000的平膜或中空纤维膜，材质优选为聚丙烯腈类、聚砜类等。
喷雾干燥例如使用喷管逆流式、盘式逆流式、喷管并流式、盘式并流式等的喷雾干燥机进行为宜。优选为盘式并流式，优选喷雾器转数为4000～20000rpm，加热控制为入口温度100～200℃、出口温度40～100℃的喷雾干燥。
另外，也优选冷冻干燥，例如优选通过实验室型的少用量冷冻干燥机、层板式冷冻干燥来进行。进而，也可以通过减压干燥制备。
本发明的(a)工序中，通过使长链甘油三脂肪酸酯和中链甘油三脂肪酸酯与脂肪酶相接触来纯化该脂肪酶。接触例如可以通过向脂肪酶中添加长链甘油三脂肪酸酯和中链甘油三脂肪酸酯的混和物，在环境温度下搅拌0.5～100小时来进行。通过搅拌可得到纯度更高的纯化脂肪酶。
(a)工序后，通过过滤等从甘油三酯中收集脂肪酶，但优选在(a)工序中进一步与助滤剂接触。因为通过与助滤剂接触操作性良好而优选。本发明中可用的助滤剂可举出日本制纸化学株式会社销售的商品名为KC Flock的产品。
在(a)工序中，除了甘油三酯以外，还可以与甘油的脂肪酸偏酯和/或甘油缩合物的脂肪酸偏酯相接触。通过与甘油的脂肪酸偏酯和/或甘油缩合物的脂肪酸偏酯相接触，所得油脂组合物的色泽和气味均良好，因此是优选的。
[甘油的脂肪酸偏酯和甘油缩合物的脂肪酸偏酯]
甘油的脂肪酸偏酯可举出甘油单酯和甘油二酯等。在此，可用的甘油单酯可举出碳数8～22的脂肪酸和甘油的酯。具体可举出甘油单油酸酯、甘油单亚油酸酯、甘油单硬脂酸酯、甘油单棕榈酸酯等。其中，优选甘油单油酸酯。也可以并用2种以上的甘油单酯。甘油二酯可举出碳数8～18的脂肪酸和甘油的酯。具体可举出甘油二油酸酯、甘油二亚油酸酯、甘油二硬脂酸酯、甘油二棕榈酸酯等。其中优选甘油二油酸酯。也可以并用2种以上的甘油二酯。
优选甘油的脂肪酸偏酯和/或甘油缩合物的脂肪酸偏酯(g1)与甘油三酯(g2)以质量比(g1)/(g2)为1∶99～99∶1的比率使用，更优选以1∶99～60∶40的比率使用。优选甘油单酯和/或甘油二酯(g1)与甘油三酯(g2)以质量比(g1)/(g2)为0.1∶99.9～99∶1的比率使用，更优选以0.1∶99.1～90∶10的比率使用。以这样的比率混合使用时可以得到色泽良好的酯交换油，因而优选。
并用甘油的脂肪酸偏酯与甘油缩合物的脂肪酸偏酯时，优选甘油的脂肪酸偏酯与甘油缩合物的脂肪酸偏酯以质量比为99∶1～1∶99的比率使用，更优选以99∶1～50∶50的比率使用。并用甘油单酯与甘油二酯时，更优选以1∶99～90∶10的比率使用。以这样的比率使用时操作性提高，因而优选。
甘油缩合物的脂肪酸偏酯可举出与碳数8～18的脂肪酸形成的酯。具体可举出多甘油油酸酯等。其中，优选十甘油油酸酯。也可以并用2种以上的甘油缩合物的脂肪酸偏酯。
甘油的脂肪酸偏酯和/或甘油缩合物的脂肪酸偏酯，可以通过对菜籽油等液状油脂进行水解、分子蒸馏等本领域技术人员公知的方法制得，也可以使用市售品，例如甘油单酯可用太阳化学(株)销售的商品名为Sunsoft 8090的产品。
(a)工序中，并用助滤剂与甘油的脂肪酸偏酯和/或甘油缩合物的脂肪酸偏酯，从反复反应方面出发是优选的。
这样制得的纯化脂肪酶可以直接使用，但是从操作性的观点来看优选使其浸渍或润湿在甘油三酯中而作为脂肪酶组合物使用。在此，脂肪酶组合物中甘油三酯的质量优选为相当于该脂肪酶的0.5～5倍，更优选为1～3倍。
接下来，对本发明的第2实施方式进行说明。
在此，甘油的脂肪酸偏酯是碳数8～22、优选14～18的脂肪酸与甘油形成的甘油单酯，或碳数8～18、优选14～18的脂肪酸与甘油形成的甘油二酯。
在(a)工序中，也可以加入甘油三酯。甘油的脂肪酸偏酯可举出甘油单酯和甘油二酯等。这里，可使用的甘油单酯或甘油二酯可以采用本发明的第1实施方式中所述的物质。可以使用甘油的脂肪酸偏酯和/或甘油缩合物的脂肪酸偏酯(g 1)和甘油三酯(g2)，它们可以采用本发明的第1实施方式中所述的物质。另外，甘油缩合物的脂肪酸偏酯和脂肪酶也可以使用本发明的第1实施方式中所述的物质。即，本发明的第1实施方式中的[甘油的脂肪酸偏酯和甘油缩合物的脂肪酸偏酯]中所述的内容和[脂肪酶]中所述的内容也适用于本发明的第2实施方式。
本发明的第2实施方式的(a)工序中，通过使甘油的脂肪酸偏酯和/或甘油缩合物的脂肪酸偏酯与脂肪酶相接触，可得到脂肪酶活性高的酯交换用脂肪酶。接触例如可以通过向脂肪酶中添加甘油的脂肪酸偏酯和/或甘油缩合物的脂肪酸偏酯，在环境温度下搅拌0.5～100小时来进行。通过搅拌可得到脂肪酶活性更高的酯交换用脂肪酶。
(a)工序后，通过过滤等从甘油的脂肪酸偏酯和/或甘油缩合物的脂肪酸偏酯中收集脂肪酶，但优选在(a)工序中进一步与助滤剂接触。助滤剂可使用本发明的第1实施方式中所述的物质。优选在(a)工序中进一步与甘油三酯接触。此处使用的甘油三酯优选为长链甘油三脂肪酸酯和/或中链甘油三脂肪酸酯。
本发明中可用的长链甘油三脂肪酸酯和中链甘油三脂肪酸酯可以采用本发明的第1实施方式中所述的物质。即，本发明的第1实施方式中的[长链甘油三脂肪酸酯]和[中链甘油三脂肪酸酯]中所述的内容也适用于本发明的第2实施方式。
根据本发明的第2实施方式，可以制造与原料脂肪酶相比其酯交换活性至少提高2～10倍，期望提高2～5倍以上的酯交换用脂肪酶。在此，酯交换酶活性可根据S.Negishi，S.Shirasawa，Y.Arai，J.Suzuki，S.Mukataka，Enzyme Microb.Technol，32，66-70(2003)公开的内容进行测定。即，用甘油三油酸酯和甘油三辛酸酯各5g进行酯交换，用气相色谱法测定酯交换的程度，算出酯交换活性。
这样制得的酯交换用脂肪酶可以直接使用，但是从操作性的观点来看优选使其在甘油的脂肪酸偏酯和/或甘油缩合物的脂肪酸偏酯中浸渍或润湿而作为脂肪酶组合物使用。在此，脂肪酶组合物中的甘油的脂肪酸偏酯和/或甘油缩合物的脂肪酸偏酯的质量优选为相当于该脂肪酶的0.5～5倍，更优选为1～3倍。
根据本发明的第1和第2实施方式得到的脂肪酶，可适用作酯交换用脂肪酶。使用这种脂肪酶可以有效地通过常规方法进行甘油三酯等的酯交换反应。详细而言除了可用于酯和酯的反应还可用于酯和醇或羧酸的反应。进而，本发明的脂肪酶还可用于由醇和羧酸合成酯的反应。
更具体地，酯交换是通过使酯与分子内至少具有1个醇性羟基的化合物、羧酸或酯作用而进行的，作为酯交换对象的酯，可举出碳数4～22的甘油三酯。具体可举出菜籽油、大豆油、葵花籽油、玉米油、米油、红花油、芝麻油、亚麻籽油、棕榈油及其分选不饱和油、椰子油、橄榄油、低芥酸菜籽油、山茶油、可可脂、牛油树脂、婆罗双树籽油脂、东印度山榄科植物油等植物油，鱼油、牛油、猪油等动物油脂等。其中优选菜籽油、中链甘油三酯。
分子内至少含有1个醇性羟基的化合物，可举出各种一元醇、植物甾醇、多元醇、氨基醇等各种化合物。具体可举出短链、中链、长链的饱和、不饱和、直链、支链醇、二醇类、甘油、赤藓醇类等多元醇。其中优选甘油。
羧酸可举出短链、中链、长链的饱和、不饱和、直链、支链羧酸。其中，碳数6～30的脂肪酸例如可举出辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等。可以使用他们中的1种或并用2种以上。其中，优选使用不饱和脂肪酸，更优选使用共轭亚油酸。
酯交换条件，例如可以按照特开平13-169795号公报等所述的条件进行。现举一例，用本发明的酯交换用脂肪酶对中链甘油三酯ODO(日清奥利友集团株式会社)和菜籽油进行酯交换，可以得到中链甘油三脂肪酸酯。
应予说明，使用(a)的来自青霉属(Penicillium sp.)的粉末状脂肪酶时，最好预先添加相对于基质总质量为0.1～5质量％的水使反应开始来进行反应。
根据本发明的制造方法得到的脂肪酶，经过滤、再生可重复使用。使用再生的脂肪酶时，可以单独使用再生的脂肪酶，也可以与本发明所得的未使用的脂肪酶并用。
根据本发明的第1实施方式，可以得到降低了有机硅等杂质含量的纯化脂肪酶。特别是可以得到有机硅的含量降至100ppm以下的脂肪酶。另外，可以得到风味、色泽良好的油脂组合物。另外，可以得到抑制油炸食品时的起泡而烹饪操作性良好的油脂组合物。
根据本发明的第2实施方式，可以得到酯交换活性提高的脂肪酶。另外，可以得到色香味俱佳的油脂组合物。
实施例
实施例1
向名糖产业社制的脂肪酶QLM 20g中添加菜籽油90g、ODO(日清奥利友集团株式会社)10g、助滤剂KC flock(日本制纸化学株式会社)20g，在25℃下搅拌5小时后过滤。将菜籽油90g、ODO(日清奥利友集团株式会社)10g换成其他的油、溶剂进行同样的试验，用HPLC(岛津制作所)测定处理后的脂肪酶的有机硅含量。
然后，向ODO(日清奥利友集团株式会社)150g、菜籽油(日清奥利友集团株式会社)850g中添加制得的脂肪酶0.5％，搅拌15小时，进行酯交换反应。反应结束后，过滤脂肪酶。之后，按常规方法对所得的油进行脱酸、脱色及除臭，制备酯交换油。
用Lobbybond测定所得酯交换油的色泽，由经过培训的研究小组成员来比较油的风味。
结果
如下表所示，通过混合长链甘油三脂肪酸酯和中链甘油三脂肪酸酯进行预处理，可以减少有机硅。
另外可知，使用通过本发明的制造方法所得的纯化脂肪酶进行酯交换反应，可以获得色泽风味俱佳的油脂。
[表1]
有机硅(ppm)   酯交换油的色泽   酯交换油的风味
 处理前菜籽油/ODO＝9/1*仅用ODO仅用菜籽油己烷THF辛酸     5000100以下18002300300018004000     11Y5R5Y2R8Y3R9Y4R7Y3R10Y5R10Y4R     ×○△△×××
*：实施例
实施例2
向各种脂肪酶20g中添加菜籽油90g、ODO(日清奥利友集团株式会社)10g、甘油单酯(Sunsoft 8090，太阳化学)100g、助滤剂KC flock(日本制纸化学株式会社)20g，在25℃下搅拌5小时后过滤。粉末脂肪酶RM和TL通过将市售的酶溶液(Palatase(奶酪香精脂肪酶)、LipozymeTL100L)超滤后用喷雾干燥机粉末化而制成。所得脂肪酶与实施例1同样地，制造酯交换油，测定其色泽，评价油的风味。
[表2]
    脂肪酶 有机硅(ppm) 酯交换油的色泽 酯交换油的风味
脂肪酶QLM(名糖产业)脂肪酶PL(名糖产业)脂肪酶RM(NOVOZYMES)脂肪酶TL(NOVOZYMES)脂肪酶D(天野ENZYME)   100以下80以下50以下50以下50以下     7Y3R6Y3R8Y2R8Y3R7Y2R     ○○○○○
实施例3
向脂肪酶QLM20g中添加菜籽油和ODO(日清奥利友集团株式会社)以9/1混合的甘油三酯、甘油单酯(Sunsoft 8090，太阳化学)共100g、助滤剂KC flock(日本制纸化学株式会社)20g，在60℃下搅拌3小时后过滤。改变此时甘油三酯与甘油单酯的比率。所得脂肪酶与实施例1同样地，制造酯交换油，测定其色泽，评价油的风味。
[表3]
甘油三酯/单甘油酯的比率 有机硅(ppm)   酯交换油的色泽   酯交换油的风味
    1/05/12/11/11/21/5     100以下100以下100以下100以下100以下100以下     5Y2R5Y2R4Y2R6Y2R6Y4R5Y3R     ○○○○○○
实施例4
向名糖产业社制的脂肪酶PL20g中添加菜籽油90g、ODO(日清奥利友集团株式会社)10g、助滤剂KC flock(日本制纸化学株式会社)20g，在25℃下搅拌5小时后过滤。所得脂肪酶与实施例1同样地，制造酯交换油，测定其色泽，评价油的风味。
[表4]
结果
有机硅(ppm) 酯交换油的色泽 酯交换油的风味
    80以下     5Y3R     ○
有机硅(ppm)   酯交换油的色泽 酯交换油的风味
处理前菜籽油/ODO＝9/1     3000100以下     12Y6R6Y3R     ×○
实施例5
向脂肪酶QLM20g中添加菜籽油90g、ODO(日清奥利友集团株式会社)10g、菜籽油水解后经分子蒸馏得到的甘油二酯200g、助滤剂KC flock(日本制纸化学株式会社)20g，在25℃下搅拌5小时后过滤。得到的脂肪酶和实施例1同样地，制造酯交换油，测定其色泽，评价油的风味。
[表5]
有机硅(ppm) 酯交换油的色泽 酯交换油的风味
    100以下     5Y3R     ○
实施例6
向各种脂肪酶20g中添加菜籽油90g、ODO(日清奥利友集团株式会社)10g、甘油单酯(Sunsoft 8090，太阳化学)100g、助滤剂KC flock(日本制纸化学株式会社)20g，在25℃下搅拌5小时后过滤。粉末脂肪酶RM和TL通过将市售的酶溶液(Palatase、Lipozyme TL100L)超滤后用喷雾干燥机粉末化而制成。
然后，向ODO(日清奥利友集团株式会社)150g、菜籽油(日清奥利友集团株式会社)850g中添加制得的脂肪酶0.5％，搅拌15小时，进行酯交换反应。反应结束后，过滤脂肪酶。之后，用常规方法对得到的油进行脱酸、脱色及除臭，制备酯交换油。
根据Negishi，S.Shirasawa，Y.Arai，J.Suzuki，S.Mukataka，Enzyme Microb.Technol，32，66-70(2003)公开的内容测定所得脂肪酶的酯交换活性，用相对值表示。
[表6]
    脂肪酶 处理前活性   处理后活性
脂肪酶QLM(名糖产业)脂肪酶PL(名糖产业)脂肪酶RM(NOVOZYMES公司)脂肪酶TL(NOVOZYMES公司)     1111     3.12.84.12.6
实施例7
向脂肪酶QLM20g中添加菜籽油和ODO(日清奥利友集团株式会社)以9/1混合的甘油三酯、甘油单酯(Sunsoft 8090，太阳化学)共100g、助滤剂KC flock(日本制纸化学株式会社)20g，在60℃下搅拌3小时后过滤，改变此时甘油三酯与甘油单酯的比率。得到的脂肪酶和实施例6同样地，制造酯交换油，测定其酯交换活性。
[表7]
    甘油三酯/甘油单酯的比率     处理前活性 处理后活性
    1/0*2/11/11/21/51/10     111111     1.82.12.53.74.03.6
*比较例
实施例8
向脂肪酶QLM20g中添加菜籽油90g、ODO(日清奥利友集团株式会社)10g、菜籽油水解后经分子蒸馏得到的甘油二酯200g、助滤剂KC flock(日本制纸化学株式会社)20g，在25℃下搅拌5小时后过滤。所得脂肪酶与实施例6同样地，制造酯交换油，测定其酯交换油的活性。
[表8]
  处理前活性   处理后活性
  菜籽油/ODO/DGA＝9/1/20     1     5.2

Claims (19)

1.纯化脂肪酶的制造方法，包括(a)使长链甘油三脂肪酸酯和中链甘油三脂肪酸酯与脂肪酶相接触来纯化该脂肪酶的工序；以及
(b)收集纯化脂肪酶的工序。
2.权利要求1所述的脂肪酶的制造方法，其中，长链甘油三脂肪酸酯为构成脂肪酸的碳数为14～24的甘油三酯，中链甘油三脂肪酸酯为构成脂肪酸的碳数为6～12的甘油三酯。
3.权利要求2所述的脂肪酶的制造方法，其中，长链甘油三脂肪酸酯选自菜籽油、大豆油、葵花籽油、红花油、玉米油。
4.权利要求1～3中任一项所述的脂肪酶的制造方法，其中，长链甘油三脂肪酸酯与中链甘油三脂肪酸酯以质量比为95∶5～50∶50的比率使用。
5.权利要求1～4中任一项所述的脂肪酶的制造方法，其中，相当于脂肪酶总质量的2倍～100倍质量的甘油三酯与脂肪酶相接触。
6.酯交换用脂肪酶的制造方法，包括(a)使甘油的脂肪酸偏酯和/或甘油缩合物的脂肪酸偏酯与脂肪酶相接触的工序；以及
(b)接触后收集脂肪酶的工序。
7.权利要求6所述的脂肪酶的制造方法，其中，甘油的脂肪酸偏酯是碳数8～22的脂肪酸与甘油的甘油单酯，或碳数8～18的脂肪酸与甘油的甘油二酯。
8.权利要求7所述的脂肪酶的制造方法，其中，甘油单酯选自甘油单油酸酯、甘油单亚油酸酯、甘油单硬脂酸酯、甘油单棕榈酸酯，甘油二酯选自甘油二油酸酯、甘油二亚油酸酯、甘油二硬脂酸酯、甘油二棕榈酸酯。
9.权利要求6～8中任一项所述的脂肪酶的制造方法，其中，甘油单酯和甘油二酯以质量比为1∶99～90∶10的比率使用。
10.权利要求6～9中任一项所述的脂肪酶的制造方法，其中，在(a)工序中进一步与甘油三酯接触。
11.权利要求10所述的脂肪酶的制造方法，其中，(g1)甘油单酯和/或甘油二酯与(g2)甘油三酯以质量比(g1)/(g2)为0.1∶99.1～90∶10的比率使用。
12.权利要求10或11所述的脂肪酶的制造方法，其中，甘油三酯为长链甘油三脂肪酸酯和/或中链甘油三脂肪酸酯。
13.权利要求1～12中任一项所述的脂肪酶的制造方法，其中，在(a)工序中进一步与助滤剂接触。
14.权利要求1～13中任一项所述的脂肪酶的制造方法，其中，上述脂肪酶是来自产碱杆菌属(Alcaligenes sp.)、假单胞杆菌属(Pseudomonas sp.)、根毛霉属(Rhizomucor sp.)、毛霉菌属(Mucorsp.)、嗜热真菌属(Thermomyces sp.)、根霉属(Rhizopus sp.)或青霉属(Penicillium sp.)的脂肪酶。
15.权利要求1～14中任一项所述的脂肪酶的制造方法，其中，上述脂肪酶为粉末脂肪酶，其90质量％以上的粒径为1～100μm。
16.权利要求1～15中任一项所述的脂肪酶的制造方法，其中，反应前后脂肪酶的含水量调整为0.1～10％。
17.油脂组合物的制造方法，其特征在于，在通过权利要求1～16中任一项所述制造方法制造的脂肪酶的存在下，进行油脂的酯交换。
18.脂肪酶组合物，含有通过权利要求1～16中任一项所述方法制造的脂肪酶和相当于该脂肪酶0.5～5倍质量的甘油三酯。
19.脂肪酶组合物，含有通过权利要求1～16中任一项所述方法制造的脂肪酶和相当于该脂肪酶0.5～5倍质量的甘油的脂肪酸偏酯和/或甘油缩合物的脂肪酸偏酯。
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