CN101115727A - 用于抑制chk1的化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示用于治疗与DNA损伤或DNA复制损害有关的疾病和病症的芳基和杂芳基取代的脲化合物。本发明也揭示制备该等化合物的方法，和该等化合物作为治疗剂用于治疗例如癌症和特征为DNA复制、染色体分离或细胞分裂缺陷的其他疾病的用途。

Description

用于抑制CHK1的化合物
发明领域
本发明涉及用于抑制保持和修复遗传物质完整性的酶的化合物。更具体地说，本发明涉及一系列芳基和杂芳基取代的脲化合物，涉及制造该等化合物的方法，和其作为治疗剂在治疗例如癌症和特征为脱氧核糖核酸(DNA)复制、染色体分离或细胞分裂缺陷的其他疾病中的用途。
发明背景
大量疾病、病症和病况(下文称为“适应症”)特征为涉及异常增生细胞。本文所用术语“异常增生细胞”(或“异常细胞增生”)意即偏离正常、适当或预期进程的细胞增生。举例而言，异常细胞增生包括不适当的细胞增殖，其中DNA或其他细胞成分受到损伤或有缺陷。异常细胞增生也包括由下列情况引起或介导或者导致以下情况的适应症：不适当的高水平细胞分裂、不适当的低水平细胞死亡(例如细胞凋亡)或二者都有。举例而言，此等适应症特征为细胞、细胞群或组织的单个或多个局部异常增殖，包括癌性(良性或恶性)和非癌性适应症。
就定义而言，所有癌症(良性和恶性)都涉及某些异常细胞增生形式。非限制性实例包括癌和肉瘤。其他的在下面讨论。某些非癌性适应症也涉及异常细胞增生。涉及异常细胞增生的非癌性适应症的非限制性实例包括风湿性关节炎、牛皮癣、白癜风、Wegener肉芽肿病和系统性红斑狼疮。其他的在下面讨论。
治疗涉及异常增生细胞的适应症的一种方法涉及使用DNA损伤剂。这些损伤剂设计为通过干扰重要的细胞过程(例如DNA代谢、DNA合成、DNA转录和微管纺锤体形成)来杀伤异常增生细胞。举例而言，他们也可通过将损伤引入到扰乱染色体结构完整性的DNA来起作用。DNA损伤剂以多种方式来设计和给予，以尝试在异常增生细胞中诱导最大损伤并随后使细胞死亡，而对正常健康细胞产生最小的损伤。
迄今业已开发了大量DNA损伤剂。其他的也正在开发中。DNA损伤剂包括化疗剂和辐射。很不幸，DNA损伤剂治疗涉及异常细胞增生的病症的效力一直比所期需的低，尤其是在治疗癌症方面。相对于健康细胞而言，此等损伤剂针对异常增生细胞的选择性(有时称为治疗指数)通常勉强够格。
此外，所有细胞都具有感觉机制和修复机制，其对DNA损伤剂的处理可能是相互矛盾的。此等感觉机制称作细胞周期检查点，帮助维持各个细胞复制阶段的次序，确保每一步以高度保真度来执行(Hartwell等，Science，246：629-634(1989)；Weinert等，Genes Dev.，8：652(1994))。当细胞探测到DNA损伤、包括由DNA损伤剂有目的地诱导的损伤时，某些信号途径激活细胞周期检查点，则细胞复制周期暂时停止(“停滞”)。这种停滞使得异常增生细胞有时间修复其DNA，通常修复到足以使受影响的细胞继续存活和增殖的程度。这种不想要的修复往往暗中破坏将DNA损伤诱导到足以杀伤异常增生细胞的努力。
举例而言，称为GemzarTM(吉西他滨或2′，2′二氟-2′-脱氧胞苷)的化疗剂通过在DNA合成期间将其自身掺入到DNA中来损伤DNA。未经修复的损伤DNA通常变得不能维持生命。然而，在很多靶细胞中，细胞周期检查点探测到这种不恰当地制造的(或相反为损伤的)DNA。激活的细胞周期检查点引发细胞周期停滞一段足以使损伤的DNA得到修复的时间。这是一种其中异常增生细胞理论上能抵抗DNA损伤剂(例如化疗剂、辐射和其他治疗)的细胞杀伤作用的方式。
其他DNA损伤剂引起肿瘤细胞停滞在S期。业已观察到当给予某些化疗剂时，肿瘤细胞简单地通过停滞在S期来抵抗这些化疗剂。那么，一旦除去药物，马上修复DNA损伤，细胞周期停滞终止，细胞继续进行余下的细胞周期(Shi等，Cancer Res.61：1065-1072，2001)。其他治疗剂引起细胞周期停滞在包括G1和G2在内的其他检查点(在下面更详细地阐述)。本文通常将激活细胞周期检查点的DNA损伤剂称为“检查点激活剂”。本文将激活叫做“Chk1”(读作“检查点-1”)的检查点的DNA损伤剂称作“Chk1激活剂”。本文将此等检查点抑制剂分别概括地和具体地称为“检查点抑制剂”和“Chk1抑制剂”。
因此，预期抑制各个DNA损伤检查点有助于防止细胞修复治疗性诱导的DNA损伤，并且使靶细胞对DNA损伤剂敏感。进而预期此等敏化作用提高这些治疗的治疗指数。
为了更好地理解本发明，下面更详细地讨论细胞周期各期和Chk1的作用。
对于所有真核物种，细胞周期在其基本过程和调节模式方面在结构和功能上是相同的。有丝分裂(体细胞)细胞周期由四期组成：G1(间隙)期、S(合成)期、G2(间隙)期和M(有丝分裂)期。G1、S和G2期统称为细胞周期的间期。在G1期期间，细胞的生物合成活动高速进行。当DNA合成开始时，S期开始；当细胞核的DNA内容物业已复制并形成了2套相同的染色体时，S期结束。
然后细胞进入G2期，该期持续到有丝分裂开始。在有丝分裂中，染色体配对、分离，形成2个新细胞核，出现胞质分裂，其中细胞分裂为2个子细胞，每一个得到一个含有2套染色体中的1套的细胞核。胞质分裂结束了M期，标志下一细胞周期的间期开始。细胞周期事件发生的次序受到严格调控，如此一个细胞周期事件的开始由前面细胞周期事件的完成来决定。这使得遗传物质可从一代体细胞到下一代体细胞忠实地复制并分离。
业已报道，细胞周期检查点包含至少3类不同的多肽，其对细胞周期信号或染色体机制缺陷反应而依次发挥作用(Carr，A.M.，Science，271：314-315(1996))。第一类为探测或感觉DNA损伤或细胞周期异常的蛋白质家族。这些探测器包括共济失调-毛细血管扩张突变蛋白(Atm)和共济失调-毛细血管扩张Rad相关蛋白(Atr)。第二类多肽放大并传导由探测器探测的信号，以Rad53(Alen等，Genes Dev.8：2416-2488(1994))和Chk1为例。第三类多肽包括细胞周期效应器，例如p53，其介导细胞反应，例如有丝分裂停滞和细胞凋亡。
当前对细胞周期检查点功能的理解大多来自对肿瘤来源的细胞系的研究。在很多情况下，肿瘤细胞丧失了关键的细胞周期检查点(Hartwell等，Science 266：1821-28，1994)。据报道，细胞发展为瘤状态的关键步骤是获得使细胞周期检查点途径失活的突变，例如涉及p53的突变(Weinberg，R.A.，Cell 81：323 330，1995；Levine，A.J.，Cell 88：3234 331，1997)。丧失这些细胞周期检查点，导致尽管有DNA损伤但肿瘤细胞仍复制。
具有完整细胞周期检查点的非癌性组织通常因单个检查点途径暂时中断而绝缘。然而，肿瘤细胞在控制细胞周期进展的途径中具有缺陷，由此对另外检查点的干扰使得他们对DNA损伤剂特别敏感。举例而言，含有p53突变体的肿瘤细胞在G1 DNA损伤检查点和维持G2 DNA损伤检查点能力两方面都有缺陷(Bunz等，Science，282：1497-1501，1998)。预期靶向启动G2检查点或S期检查点的检查点抑制剂可进一步削弱这些肿瘤细胞修复DNA损伤的能力，因此，它们是提高辐射和全身化疗二者之治疗指数的候选者(Gesner，T.，SRIConference摘要：Protein Phosphorylation and Drug Discovery WorldSummit，March 2003)。
当有DNA损伤或对DNA复制的任何妨碍存在时，检查点蛋白Atm和Atr启动信号转导途径，导致细胞周期停滞。业已表明Atm在对电离辐射应答的DNA损伤检查点中起作用。Atr受到引起双链DNA断裂、单链DNA断裂的作用剂和封阻DNA辐射的作用剂所刺激。
Chk1是在DNA损伤检查点信号转导途径中位于Atm和/或Atr下游的蛋白激酶(Sanchez等，Science，277：1497-1501，1997；美国专利第6,218,109号)。在哺乳动物细胞中，Chk1对引起DNA损伤的作用剂，包括电离辐射、紫外(UV)线和羟基脲(Sanchez等，见上述；Lui等，Genes Dev.，14：1448-1459，2000)应答而被磷酸化。这种激活哺乳动物细胞的Chk1的磷酸化作用依赖于Atm(Chen等，Oncogene，18：249-256，1999)和Atr(Lui等，见上述)。另外，业已表明Chk1使weel(O′Connell等，EMBO J.，16：545-554，1997)和Pds1(Sanchez等，Science，286：1166-1171，1999)两者磷酸化，后两者是已知在细胞周期控制中很重要的基因产物。
这些研究证明，哺乳动物Chk1在导致停滞于S期的Atm依赖性DNA损伤检查点中起作用。最近已阐明Chk1在S期哺乳动物细胞中的作用(Feijoo等，J.Cell.Biol.，154：913-923，2001；Zhao等，PNASUSA，99：14795-800，2002；Xiao等，J Biol Chem.，278(24)：21767-21773，2003；Sorensen等，Cancer Cell，3(3)：247-58，2003)，强调Chk1在监测DNA合成完整性中的作用。Chk1通过使Cdc25A磷酸化来引起S期停滞，Cdc25A调控细胞周期蛋白A/cdk2活性(Xiao等，见上述；和Sorensen等，见上述)。Chk1也通过使Cdc25C磷酸化并使其失活来引起G2停滞，Cdc25C是一种双特异性磷酸酶，通常当细胞从G2进展到有丝分裂时使细胞周期蛋白B/cdc2(也称为Cdk1)脱磷酸化(Fernery等，Science，277：1495-7，1997；Sanchez等，见上述；Matsuoka等，Science，282：1893-1897，1998；和Blasina等，Curr.Biol.，9：1-10，1999)。在这两种情况下，当存在DNA损伤或未经复制的DNA时，对Cdk活性的调控诱导细胞周期停滞，以防止细胞进入有丝分裂。
其他种类的细胞周期检查点抑制剂在G1或G2/M期发挥作用。UCN-01或7-羟基星形孢菌素最初作为主要作用于蛋白激酶C的非特异性激酶抑制剂被分离出来，但近来已发现其能抑制Chk1活性并取消G2细胞周期检查点(Shi等，见上述)。因此，UCN-01为非特异性Chk1抑制剂，并且在高剂量时对细胞有毒。在低剂量时，其非特异性地抑制很多细胞激酶，也抑制G1检查点(Tenzer和Pruschy，Curr.Med.Chem.Anti-Cancer Agents，3：35-46，2003)。
业已将UCN-01与癌症疗法联合应用，例如与辐射、抗癌药喜树碱(Tenzer和Pruschy，见上述)和吉西他滨(Shi等，见上述)联合，取得有限的成功。另外，也已将UCN-01用于成胶质细胞瘤细胞中加强替莫唑胺(TMZ)诱导的DNA错配修复(MMR)的作用(Hirose等，CancerRes.，61：5843-5849，2001)。在临床上，UCN-01并非如预期的那样为有效化疗剂，可能是由于不能制作治疗方案和无法鉴别具体的关键分子靶(Grant和Roberts，Drug Resistance Updates，6：15-26，2003)。因此，Mack等报道，UCN-01在培养的非小细胞肺癌细胞系中细胞周期依赖性地增强顺铂的作用，但未鉴别出UCN-01所靶向的关键细胞周期检查点的特异性(Mack等，Cancer Chemother.Pharmacol.，51(4)：337-348，2003)。
有几种使肿瘤细胞对影响细胞周期的化疗剂的治疗敏感的策略。举例而言，给予2-氨基-嘌呤可取消多种细胞周期检查点机制，例如含羞草氨酸诱导的G1停滞或羟基脲诱导的S期停滞，使得细胞继续进入并通过有丝分裂(Andreassen等，Proc Natl Acad Sci USA，86：2272-2276，1992)。也已将咖啡因即甲基黄嘌呤用于通过介导穿越G2检查点的进程并由此诱导细胞死亡(Bracey等，Clin.Cancer Res.，3：1371-1381，1997)，增强DNA损伤剂(例如顺铂和电离辐射)的细胞毒性。然而，用于实现取消细胞周期的咖啡因剂量超过临床上可接受水平，因而不能作为可使用的治疗选择。另外，已将Chk1激酶的反义核苷酸用于增加对拓扑异构酶抑制剂BNP1350的敏感性(Yin等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，295：435-44，2002)，但证明存在有通常与反义治疗和基因治疗相关的问题。
Chk1抑制剂也已揭示于WO 02/070494、WO 04/014876和WO03/101444中。另外的Chk1抑制剂包括二芳基脲化合物，例如：揭示于美国专利公开号2003-0069284 A1中的芳基和杂芳基取代的脲化合物；甲基黄嘌呤和相关的化合物(Fan等，Cancer Res.，55：1649-54(1995)；脲基噻吩(WO 03/029241)；N-吡咯并吡啶甲酰胺(WO03/28724)；反义Chk1核苷酸(WO 01/57206)；Chk1受体拮抗剂(WO00/16781)；芳杂基羧酰胺衍生物(WO 03/037886)；氨基噻吩(WO03/029242)；(吲唑基)苯并咪唑(WO 03/004488)；杂环-羟基亚氨基-芴(WO 02/16326)；含scytoneman主链的衍生物(scytonemin)(美国专利第6,495,586号)；杂芳基苯甲酰胺(WO 01/53274)；吲唑化合物(WO01/53268)；吲哚并咔唑(参见Tenzer等，见上述)；苯并二氢吡喃衍生物(WO 02/070515)；paullones(Schultz等，J.Med.Chem.，42：2909-2919(1999))；茚并吡唑(WO 99/17769)；黄酮(Sedlacek等，Int.J.Oncol.，9：1143-1168(1996)；丝氨酸苏氨酸激酶肽环的肽衍生物(WO98/53050)；和羟吲哚(WO 03/051838)。
然而，本领域仍需要有效和具有选择性的Chk1抑制剂。本发明致力解决这一问题和满足其他需要。
发明简述
本发明涉及检查点激酶Chk1的有效并具有选择性的抑制剂。本发明Chk1抑制剂用于治疗涉及异常细胞增生的适应症，并且在治疗与DNA损伤或DNA复制中的损害有关的适应症中用作化疗敏化剂和放射敏化剂。
因此，本发明一方面提供结构式(I)化合物。该等化合物用于抑制Chk1的方法，该方法包括将有效量的结构式(I)化合物给予个体这一步骤。
式(I)化合物具有下面的结构式：
Figure A20058003538200201
其中X1为不存在、-O-、-S-、-CH2-或-N(R1)-；
X2为-O-、-S-或-N(R1)-；
Y为O或S；或＝Y代表2个连接到共用碳原子的氢原子；
W选自杂芳基、芳基和被杂芳基或芳基取代的C1-6烷基，其中(a)所述W的芳基或杂芳基用CF3和杂芳基中的至少一个取代；(b)所述基团W的芳基任选被由R2代表的1-3个取代基取代；和(c)所述基团W的杂芳基任选被由R5代表的1-3个取代基取代；
R1选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基和芳基；
R2选自杂芳基、卤素、任选取代的C1-6烷基、C2-6烯基、OCF3、NO2、CN、NC、N(R3)2、OR3、CO2R3、C(O)N(R3)2、C(O)R3、N(R1)COR3、N(R1)C(O)OR3、N(R1)C(O)C1-6亚烷基C(O)R3、N(R1)C(O)C1-6亚烷基C(O)OR3、N(R1)C(O)C1-6亚烷基OR3、N(R1)C(O)C1-6亚烷基NHC(O)OR3、N(R1)C(O)C1-6亚烷基SO2NR3、C1-6亚烷基OR3和SR3；
R3选自氢、卤素、C1-6烷基、C2-6烯基、环烷基、芳基、杂芳基、CO2R4、SO2R4；被卤素、羟基、芳基、杂芳基、杂环烷基、N(R4)2和SO2R4中的一个或多个取代的C1-6烷基；C1-6亚烷基芳基、C1-6亚烷基杂芳基、C1-6亚烷基C3-8杂环烷基、C1-6亚烷基SO2芳基、任选取代的C1-6亚烷基(R4)2、OCF3、C1-6亚烷基N(R4)3 +、C3-8杂环烷基和CH(C1-6亚烷基N(R4)2)2，或2个R3基共同形成任选取代的3-6元脂肪族环；
R4选自氢、C1-6烷基、环烷基、芳基、杂芳基、C1-6亚烷基芳基和SO2C1-6烷基，或2个R4基共同形成任选取代的3-6元环；
R5选自C1-6烷基、芳基、杂芳基、杂环烷基、N(R3)2、OR3、卤素、N3、CN、C1-6亚烷基芳基、C1-6亚烷基N(R3)2、C(O)R3、C(O)OR3、C(O)N(R3)2、N(R1)C(O)R3、N(R1)C(O)OR3、CF3和
Figure A20058003538200211
R6选自OR11、-C≡C-R7和杂芳基；
R7选自氢、C1-6烷基、芳基、C1-6亚烷基芳基、杂芳基、C1-6亚烷基杂芳基、烷氧基；
R8、R9和R10独立选自氢、卤素、任选取代的C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、OCF3、CF3、NO2、CN、NC、N(R3)2、OR3、CO2R3、C(O)N(R3)2、C(O)R3、N(R1)COR3、N(R1)C(O)OR3、N(R8)C(O)OR3、N(R1)C(O)C1-6亚烷基C(O)R3、N(R1)C(O)C1-6亚烷基C(O)OR3、N(R1)C(O)C1-6亚烷基OR3、N(R1)C(O)C1-6亚烷基NHC(O)OR3、N(R1)C(O)C1-6亚烷基SO2NR3、C1-6亚烷基OR3和SR3；
R11选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、SO2R4；被卤素、羟基、芳基、杂芳基、N(R4)2和SO2R4中的一个或多个取代的C1-6烷基；C1-6亚烷基芳基、C1-6亚烷基杂芳基、C1-6亚烷基C3-8杂环烷基、C1-6亚烷基SO2芳基、任选取代的C1-6亚烷基N(R4)2、OCF3、C1-6亚烷基N(R4)3 +、C3-8杂环烷基和CH(C1-6亚烷基-N(R4)2)2；
或其药物上可接受盐或前药或溶剂化物。
本发明另一方面提供包含一种或多种结构式(I)化合物的药物组合物和该组合物在治疗性治疗疾病或病况中的用途，其中体内或离体抑制Chk1提供治疗益处，或具有研究或诊断利益。
本发明再一方面提供使正经受化疗或放疗治疗医学病症的个体的细胞敏化的方法，包括将结构式(I)化合物与化疗剂、放疗剂或这二者联合给予该个体。由该方法治疗的非限制性适应症为癌症。
本发明另一方面提供抑制或预防异常细胞增生的方法。在一实施方案中，方法包括使包含异常增生细胞的细胞群与至少一种Chk1激活剂接触，激活剂的量和作用时间足以使异常增生细胞的细胞周期停滞基本上同步。一旦在细胞群中达到细胞周期停滞基本同步，则使该细胞群与至少一种Chk1抑制剂接触，抑制剂的量和作用时间足以基本上取消该细胞周期停滞。
本发明这些和其他方面将从下面详述的优选实施方案中明显可见。
优选实施方案详述
本发明化合物具有结构式(I)：
Figure A20058003538200221
其中X1为不存在、-O-、-S-、-CH2-或-N(R1)-；
X2为-O-、-S-或-N(R1)-；
Y为O或S；或＝Y代表2个连接到共用碳原子的氢原子；
W选自杂芳基、芳基和被杂芳基或芳基取代的C1-6烷基，其中(a)所述基团W的芳基或杂芳基被CF3和杂芳基中的至少一个取代；(b)所述基团W的芳基任选被由R2代表的1-3个取代基取代；和(c)所述基团W的杂芳基任选被由R5代表的1-3个取代基取代；
R1选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基和芳基；
R2选自杂芳基、卤素、任选取代的C1-6烷基、C2-6烯基、OCF3、NO2、CN、NC、N(R3)2、OR3、CO2R3、C(O)N(R3)2、C(O)R3、N(R1)COR3、N(R1)C(O)OR3、N(R1)C(O)C1-6亚烷基C(O)R3、N(R1)C(O)C1-6亚烷基C(O)OR3、N(R1)C(O)C1-6亚烷基OR3、N(R1)C(O)C1-6亚烷基NHC(O)OR3、N(R1)C(O)C1-6亚烷基SO2NR3、C1-6亚烷基OR3和SR3；
R3选自氢、卤素、C1-6烷基、C2-6烯基、环烷基、芳基、杂芳基、CO2R4、SO2R4；被卤素、羟基、芳基、杂芳基、杂环烷基、N(R4)2和SO2R4中的一个或多个取代的C1-6烷基；C1-6亚烷基芳基、C1-6亚烷基杂芳基、C1-6亚烷基C3-8杂环烷基、C1-6亚烷基SO2芳基、任选取代的C1-6亚烷基(R4)2、OCF3、C1-6亚烷基N(R4)3 +、C3-8杂环烷基和CH(C1-6亚烷基N(R4)2)2，或2个R3基共同形成任选取代的3-6元脂肪族环；
R4选自氢、C1-6烷基、环烷基、芳基、杂芳基、C1-6亚烷基芳基和SO2C1-6烷基，或2个R4基共同形成任选取代的3-6元环；
R5选自C1-6烷基、芳基、杂芳基、杂环烷基、N(R3)2、OR3、卤素、N3、CN、C1-6亚烷基芳基、C1-6亚烷基N(R3)2、C(O)R3、C(O)OR3、C(O)N(R3)2、N(R1)C(O)R3、N(R1)C(O)OR3、CF3和
Figure A20058003538200231
R6选自OR11、-C≡C-R7和杂芳基；
R7选自氢、C1-6烷基、芳基、C1-6亚烷基芳基、杂芳基、C1-6亚烷基杂芳基、烷氧基；
R8、R9和R10独立选自氢、卤素、任选取代的C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、OCF3、CF3、NO2、CN、NC、N(R3)2、OR3、CO2R3、C(O)N(R3)2、C(O)R3、N(R1)COR3、N(R1)C(O)OR3、N(R8)C(O)OR3、N(R1)C(O)C1-6亚烷基C(O)R3、N(R1)C(O)C1-6亚烷基C(O)OR3、N(R1)C(O)C1-6亚烷基OR3、N(R1)C(O)C1-6亚烷基NHC(O)OR3、N(R1)C(O)C1-6亚烷基SO2NR3、C1-6亚烷基OR3和SR3；
R11选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、SO2R4；被卤素、羟基、芳基、杂芳基、N(R4)2和SO2R4中的一个或多个取代的C1-6烷基；C1-6亚烷基芳基、C1-6亚烷基杂芳基、C1-6亚烷基C3-8杂环烷基、C1-6亚烷基SO2芳基、任选取代的C1-6亚烷基N(R4)2、OCF3、C1-6亚烷基N(R4)3 +、C3-8杂环烷基和CH(C1-6亚烷基-N(R4)2)2；
和其药物上可接受盐或前药或溶剂化物。
本发明优选化合物为下述化合物，其中X1和X2为-N(H)-；
Y为O或S；和
优选W为杂芳基。在一实施方案中，W为含有至少2个选自N、O和S的杂原子的杂芳基，所述杂芳基环任选被一或两个选自任选取代的C1-6烷基、芳基、杂芳基、N(R3)2、OR3、C(O)N(R3)2、CO2R3、CN和卤素的取代基取代，其中R3如前所定义。
其他优选结构式(I)化合物为下述化合物，其中W选自哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基和三嗪基，其任选被一或两个选自C1-6烷基、芳基、杂芳基、N(R3)2、C(O)N(R3)2、CO2R3、OR3和卤素的取代基取代。
在某些优选实施方案中，W选自下列结构式：
Figure A20058003538200241
和
Figure A20058003538200251
其任选被1-4个选自C1-6烷基、C2-6炔基、芳基、杂芳基、CN、CO2R3、N(R3)2、OR3和卤素的取代基取代。
在更优选实施方案中，W为
Figure A20058003538200252
或
Figure A20058003538200253
在最优选实施方案中，W为吡嗪基，而X1和X2各自为N(H)。
在其他优选实施方案中，W上的杂芳基取代基和R6的杂芳基独立选自
Figure A20058003538200254
Figure A20058003538200261
Figure A20058003538200271
Figure A20058003538200282
和
Figure A20058003538200283
本文所用术语“烷基”包括含有指定碳原子数目的直链和支链烃基，通常为甲基、乙基和直连与支链丙基和丁基。除非另外指出，否则该烃基可含有高达20个碳原子。术语“烷基”包括“桥联烷基”，即C6-C16二环或多环烃基，例如降冰片烷基、金刚烷基、二环[2.2.2]辛基、二环[2.2.1]庚基、二环[3.2.1]辛基或十氢萘基。烷基任选可被例如羟基(OH)、卤素、芳基、杂芳基、环烷基、杂环烷基、氨基(N(R3)2)和磺酰基(SO2R3)取代，其中R3如前所定义。
术语“环烷基”定义为环状C3-8烃基，例如环丙基、环丁基、环己基或环戊基。除了该环含有1-3个独立选自氧、氮和硫的杂原子外，“杂环烷基”定义与环烷基相似。环烷基和杂环烷基可为任选被1-3个独立选自C1-4烷基、C1-3亚烷基OH、C(O)NH2、NH2、氧代(＝O)、芳基、三氟乙酰基和OH取代的饱和或部分不饱和环系统。杂环烷基可任选进一步被C1-6烷基、羟基C1-6烷基、C1-3亚烷基芳基或C1-3亚烷基杂芳基进行N-取代。
除了含有碳-碳双键外，术语“烯基”的定义同“烷基”。
除了含有碳-碳三键外，术语“炔基”的定义同“烷基”。
术语“亚烷基”是指含有取代基的烷基。举例而言，术语“C1-6亚烷基C(O)OR”是指被-C(O)OR基取代的含有1-6个碳原子的烷基。亚烷基任选被一个或多个前面列作任选为烷基取代基的取代基取代。
本文术语“卤素”(“halo”或“halogen”)定义为氟、溴、氯和碘。
单独或联合的本文术语“芳基”定义为单环或多环芳香基，优选单环或二环芳香基，例如苯基或萘基。除非另外指出，否则芳基可以是未被取代的，或例如被一个或多个(尤其是1-4个)独立选自以下的基团取代：卤素、C1-6烷基、C2-6烯基、OCF3、NO2、CN、NC、N(R3)2、OR3、CO2R3、C(O)N(R3)2、C(O)R3、N(R1)COR3、N(R1)C(O)OR3、N(R1)C(O)OR3、N(R1)C(O)C1-3亚烷基C(O)R3、N(R1)C(O)C1-3亚烷基C(O)OR3、N(R1)C(O)C1-3亚烷基OR3、N(R1)C(O)C1-3亚烷基NHC(O)OR3、N(R1)C(O)C1-3亚烷基SO2NR3、C1-3亚烷基OR1和SR3，其中R1和R3如前所定义。例示性芳基包括但不限于苯基、萘基、四氢萘基、氯苯基、甲基苯基、甲氧基苯基、三氟甲基苯基、硝苯基基、2，4-甲氧基氯苯基等等。术语“芳基C1-3烷基”和“杂芳基C1-3烷基”定义为含C1-3烷基取代基的芳基或杂芳基。
术语“杂芳基”定义为含有1或2个芳香环且在芳香环中含有至少1个氮、氧或硫原子的单环或二环环系统。除非另外指出，否则杂芳基可以是未被取代的，或例如被一个或多个(尤其是1-4个)选自C1-6烷基、芳基、杂芳基、CF3、CN、C(O)N(R3)2、CO2R2、N(R3)2、OR3和卤素的取代基取代，其中R3如前所定义。杂芳基实例包括但不限于噻吩基、呋喃基、吡啶基、唑基、喹啉基、异喹啉基、吲哚基、三嗪基、三唑基、噻唑基、异唑基、咪唑基(imidizolyl)、苯并噻唑基、吡嗪基、嘧啶基、噻唑基和噻二唑基。
术语“氢”定义为-H。
术语“羟基”定义为-OH。
术语“硝基”定义为-NO2。
术语“氰基”定义为-CN。
术语“异氰基”定义为-NC。
术语“三氟甲氧基”定义为-OCF3。
术语“叠氮基”定义为-N3。
本文所用术语“3-8元环”是指碳环和杂环脂肪族基团或芳香基团，包括但不限于吗啉基、吡啶基、苯基、噻吩基(thiophenyl)、呋喃基、吡咯基、咪唑基、嘧啶基和吡啶基，任选被一个或多个(尤其是1-3个)上面芳基的例示性基团取代。
含烃部分的碳原子数量由该部分碳原子下方标定的最小和最大数目来表示，例如“C1-6烷基”是指具有1-6个碳原子的烷基，包括1和6个碳原子。
在本文结构式中，对于未标出取代基的键来说，该取代基为甲基，例如
Figure A20058003538200301
为
当未指出连接到环上碳原子的取代基时，应该理解该碳原子含有适当数目的氢原子。另外，例如当未指出连接到羰基或氮原子的取代基时，应该理解该取代基为氢，例如
为
Figure A20058003538200304
R-N为R-NH2。
缩写“Me”为甲基。缩写CO和C(O)为羰基(C＝O)。
符号N(Rx)(其中x代表字母或数字，例如Ra、Rb、R3、R4等等)用于表示两个连接到共用氮原子的Rx基。当使用此符号时，Rx基可相同或不同，选自由Rx基所定义的基团。
“Chk1抑制剂”意即已知的或以后发现的能够至少部分取消Chk1蛋白的细胞周期检查点活性的任何化合物，不管其是天然存在或是人工合成的。当战胜细胞的检查点机制，足以使细胞通过本来中断的细胞周期的某期进入下一期时，或使细胞直接进行到细胞死亡时，就达到了取消细胞周期检查点。取消细胞周期检查点使得细胞可携带损伤或缺陷进入后来的细胞周期各期，由此诱导或促进细胞死亡。细胞死亡可通过任何联合机制发生，包括细胞凋亡和有丝分裂灾难。
“Chk1激活剂”意即已知或以后发现的能够激活DNA修复和细胞周期检查点稳态中的Chk1激酶活性，其由此诱导至少部分细胞周期停滞的任何作用剂。Chk1激活剂包括能够在细胞周期的任一期停滞细胞周期的作用剂，本文可称该期为该激活剂的“靶期”。靶期包括除有丝分裂期外的任一细胞周期的期，即G1期、S期和G2期。用于本发明的Chk1激活剂包括DNA损伤剂，例如化疗剂和/或辐射(或“放疗剂”)，例如电离辐射或紫外辐射。Chk1辐射激活剂包括但不限于γ辐射、X-射线辐射、紫外线、可见光、红外辐射、微波辐射和其混合。
“抑制异常细胞增生”意即减慢或消除异常增生细胞增殖的速度。这种抑制可来自复制速率降低、细胞死亡率增加或这二者。细胞死亡可通过任何机制发生，包括细胞凋亡和有丝分裂灾难。
“预防异常细胞增生”意即在发生之前抑制异常细胞增生，或抑制其复发。
“体内”意即在有生命的受治疗者体内，如在动物或人类体内。在该方面，作用剂可治疗性用于受治疗者以延迟或消除异常复制细胞的增殖。该等作用剂也可用作预防以防止异常细胞增生发生或复发，或防止与其有关的症状表现。
“离体”意即在活有生命的受治疗者外。离体细胞群实例包括体外细胞培养物和来自人类或动物的生物样品，例如流液样品或组织样品。可通过本技术熟知的方法获得此等样品。例示性生物学流液样品包括血液、脑脊髓液、尿液、唾液。例示性组织样品包括肿瘤和其活组织切片。在该方面，本发明化合物可在治疗和实验两方面有多种应用。
本文所用术语“放射敏化剂”定义为以治疗有效量给予人类或其他动物，以增加细胞对电磁辐射的敏感性和/或促进可用电磁辐射治疗的疾病的治疗的化合物。
本文所用术语“电磁辐射”和“辐射”包括但不限于10-20到100纳米波长的辐射。
本发明包括结构式(I)化合物所有可能的立体异构体和几何异构体。本发明不仅包括外消旋化合物，而且也包括旋光异构体。当期望结构式(I)化合物为单对映异构体时，可通过拆分终产物获得，或通过从异构纯的原材料或使用手性辅助试剂立体定向合成，例如参见Ma等，Tetrahedron.：Asymmetry，8(6)，第883-888页(1997)。通过本领域已知的任何合适的方法可完成终产物、中间体或原材料拆分。另外，可能有结构式(I)化合物互变异构体的情况下，本发明意欲包括该等化合物的所有互变异构体形式。如下文所证明，定向立体异构体与化疗或放疗联合可表现出异常的抑制Chk1的能力。
结构式(I)化合物的前药也可作为本发明方法中的化合物。已完全确定，，将化合物衍生为适于配制和/或给予的形式然后作为药物在体内释放的前药途径，已成功地用于暂时(例如生物可逆地)改变该化合物的物理化学特性(参见H.Bundgaard编者″Design of Prodrugs，″Elsevier，Amsterdam，(1985)；Silverman，″The Organic Chemistry of DrugDesign and Drug Action，″Academic Press，San Diego，chapter 8，(1992)；Hillgren等，Med.Res.Rev.，15，83(1995))。
本发明化合物可含有一种或多种官能团。需要或必要时，可修饰该官能团以提供前药。举例而言，合适的前药包括酸衍生物，例如酰胺和酯类。本领域技术人员也会认识到，N-氧化物可用作前药。
本文所用术语“药物上可接受盐”是指含有酸性部分并形成具有合适阳离子盐的结构式(I)化合物。合适的药物上可接受阳离子包括碱金属离子(例如钠或钾)和碱土金属(例如钙或镁)阳离子。另外，含有碱性中心的结构式(I)化合物的药物上可接受盐为与药物上可接受酸形成的酸加成盐。非限制性实例包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、乙酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐葡糖酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐。根据前述，只要提及本文出现的本发明化合物，意欲包括结构式(I)化合物以及其药物上可接受盐或溶剂化物。
本发明化合物可作为纯化学药品治疗性给予，但也可作为药物组合物或制剂来给予结构式(I)化合物。因此，本发明提供药物组合物，其包含式(I)化合物与药物上可接受稀释剂或载体。也提供制备药物组合物的方法，包括将式(I)化合物与药物上可接受稀释剂或载体混合。
因此，本发明进一步提供药物制剂，其包含结构式(I)化合物或其药物上可接受盐、前药或溶剂化物与一种或多种药物上可接受载体和任选其他治疗组分和/或预防组分。该等载体在与该制剂的其他组分相容并对其接受者无毒的意义上为“可接受”。举例而言，此等载体可在Remington′s Pharmaceutical Sciences，17th Ed.，MackPublishing Co.，Easton，PA.(1985)中找到。
通常用剂量反应测定测量检查点激酶的抑制，其中让敏感的测定系统与一定浓度范围的目的化合物接触，所述浓度范围包括未观查到效果的浓度或观察到最小效果的浓度，经由观察到部份效果的较高浓度，到观察到最大效果的饱和浓度。理论上，抑制剂化合物的剂量反应效果的此等测定可描述为S形曲线，其表示作为浓度函数的抑制程度。该曲线理论上也通过浓度足以降低检查点酶活性到测定的最小和最大酶活性差额的50％的水平的点。该浓度定义为“抑制浓度(50％)”或“IC50”值。可用常规生化(非细胞)测定技术或基于细胞的测定技术来完成IC50值的测定。
抑制剂功效的比较通常参考对比IC50值来提供，其中较高IC50表明该试验化合物比参比化合物物的功效小，而较低IC50表明该化合物比参比化合物物的功效大。当用剂量反应测定测量时，本发明化合物表现出IC50值小于5μM，低至0.1nM。优选化合物表现出500nM的IC50值或更小。更优选本发明化合物表现出IC50值小于250nM或更小，100nM或更小，50nM或更小，20nM或更小。
优选的本发明Chk1抑制剂具有选择性，即在抑制Chk1方面表现出至少为下列蛋白激酶20倍的选择性：蛋白激酶A、蛋白激酶C、cdc2和pp60v-src。更优选的本发明Chk1抑制剂在抑制Chk1方面优选表现出至少为下列蛋白激酶75倍的选择性：蛋白激酶A、蛋白激酶C、cdc2和pp60v-src。最优选的本发明Chk1抑制剂表现出至少为蛋白激酶A、蛋白激酶C、cdc2、pp60v-src、蛋白激酶B/Akt-1、p38MapK、ERK1、p70S6K、cdc2、cdk2、Chk2和ab1酪氨酸激酶的100倍的选择性。“倍选择性”定义为用于比较的激酶的Chk1抑制剂的IC50除以作用于Chk1的Chk1抑制剂的IC50。
适用于本发明的化合物和药物组合物包括其中给予有效量的活性组分以达到其计划目的的化合物和药物组合物。更具体地讲，“治疗有效量”，意即足以治疗患有适应症的个体或减轻该适应症现有症状的量。测定治疗有效量完全在本领域技术人员能力范围内，尤其是在根据本文提供的详细说明情况下。
除了Chk1抑制剂外，本发明药物组合物可与包括细胞因子、淋巴因子、生长因子、其他造血因子或其混合物调配，以降低单独给予该药物组合物所产生或与其有关的不利副作用。在本发明药物组合物中尤其有用的细胞因子、淋巴因子、生长因子或其他造血因子包括但不限于M-CSF、GM-CSF、TNF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-1 1、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IFN、TNF、G-CSF、Meg-CSF、GM-CSF、血小板生成素、干细胞因子、红细胞生成素、血管生成素(包括Aug-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y和/或人血管生成素样多肽)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生长素、骨形态发生蛋白-1(BMP-1)、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-14、BMP-15、BMP受体IA、BMP受体IB、脑源性神经营养因子、睫状神经营养因子、睫状神经营养因子受体细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子1、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2、内皮细胞生长因子、内皮素1、表皮生长因子、上皮细胞来源的嗜中性粒细胞引诱剂、成纤维细胞生长因子(FGF)4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF8b、FGF8c、FGF9、FGF10、酸性FGF、碱性FGF、胶质细胞系源性神经营养因子受体1、胶质细胞系源性神经营养因子受体2、生长相关蛋白、生长相关蛋白、生长相关蛋白、生长相关蛋白、肝素结合性表皮生长因子、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子受体、胰岛素样生长因子II、胰岛素样生长因子结合蛋白、角质细胞生长因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受体、神经生长因子、神经生长因子受体、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、胎盘生长因子、胎盘生长因子2、血小板衍生内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、血小板衍生生长因子A链、血小板衍生生长因子AA、血小板衍生生长因子AB、血小板衍生生长因子B链、血小板衍生生长因子BB、血小板衍生生长因子受体、血小板衍生生长因子受体、前B细胞生长刺激因子、干细胞因子、干细胞因子受体、转化生长因子(TGF)、TGF、TGF1、TGF 1.2、TGF2、TGF3、TGF5、潜在TGF1、TGF、结合蛋白I、TGF结合蛋白II、TGF结合蛋白III、肿瘤坏死因子受体I型、肿瘤坏死因子受体II型、尿激酶型纤溶酶原激活剂受体、血管内皮生长因子和嵌合蛋白和其生物学或其免疫活性片段。
结构式(I)化合物也可与在治疗应用方法中促进该化合物的有益性质的辅助部份缀合或连接。此等缀合物可增进将该等化合物递送到特定解剖学位点或目的区域(例如肿瘤)，使得在靶细胞中有持续的治疗浓度化合物，改变该等化合物的药代学和药动学性质，和/或改进该等化合物的治疗指数或安全性模式。举例而言，合适的辅助部分包括氨基酸、寡肽或多肽，例如抗体，例如单克隆抗体和其他工程抗体；和靶细胞或组织受体的天然或人工配体。其他合适的辅助部分包括促进该化合物生物分布和/或靶细胞吸收该化合物的脂肪酸或脂类部分(例如参见Bradley等，Clin.Cancer Res.(2001)7：3229)。
本发明制剂可以标准方式给予用于治疗指出的疾病，例如通过口服、胃肠外、透过粘膜(例如舌下或通过口腔含化给予)、局部、透皮、直肠或吸入(例如鼻腔或肺部深处吸入)给予。胃肠外给予包括但不限于以静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌内、鞘内和关节内方式给予。胃肠外给予也可用高压技术如POWDERJECTTM来完成。
对于口服给药和口腔含化给药，组合物可为用常规方式调配的片剂形式或锭剂形式。举例而言，用于口服给药的片剂和胶囊剂可含有常规赋形剂，例如粘合剂(例如糖浆、阿拉伯树胶、明胶、山梨醇、黄蓍胶、淀粉浆或聚乙烯吡咯烷酮)、填充剂(例如乳糖、蔗糖、糖、微晶纤维素、玉米淀粉、磷酸钙或山梨醇)、润滑剂(例如硬脂酸镁、硬脂酸、滑石粉、聚乙二醇或硅石)、崩解剂(例如马铃薯淀粉或乙醇酸淀粉钠)或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠)。片剂可按照本技术熟知方法包衣。
或者，举例而言，本发明化合物可加入到为口服液体制剂(例如水性或油性混悬剂、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂)中。此外，含有这些化合物的制剂可呈现为干制品，用于在使用前用水或其他合适的溶媒重建。此等液体制剂可含有常规添加剂，例如悬浮剂，例如山梨醇糖浆、甲基纤维素、葡萄糖/糖浆、明胶、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶和氢化食用脂肪；乳化剂，例如卵磷脂、山梨坦单油酸酯或阿拉伯树胶；非水性溶媒(可包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、油性酯、丙二醇和乙醇；和防腐剂，例如对羟基苯甲酸甲酯或乙酯和山梨酸。
此等制剂也可配制为栓剂，例如含有常规栓剂基质，例如可可油或其他甘油酯。用于吸入的组合物通常可以溶液、混悬剂或乳状液的形式来提供，其可作为干粉或以用常规抛射剂例如二氯二氟甲烷或三氯氟甲烷的气雾剂形式来给予。典型的局部和透皮制剂，例如滴眼剂、霜剂、膏剂、洗剂和糊剂，包含常规水性或非水性溶媒或为加有药物的膏药、贴剂或膜剂形式。
另外，本发明组合物可配制用于通过注射或连续输注胃肠外给予。于注射用制剂可为存于油性或水性溶媒的混悬剂、溶液或乳状液的形式，可含有调配剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性组分可以干粉形式用于在使用前与合适的溶媒(例如无菌、无热原水)重建。
也可将本发明组合物配制为缓释制剂。可通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌肉注射给予此等长效制剂。因此，本发明化合物可用合适的聚合材料或疏水材料(例如存于可接受油中的乳状液)、离子交换树脂或微溶性衍生物(例如微溶性盐)调配。
对于兽医应用，式(I)化合物或其药物上可接受盐、前药或溶剂化物，可作为与标准兽医实践一致的合适的可接受制剂来给予。兽医可易于确定最适于特定动物的给药方案和给药途径。可用本发明的化合物和方法治疗的动物包括但不限于宠物、家畜、观赏动物和动物园样本。
合成方法
通过下面的合成流程可制备本发明化合物。原材料可从商业来源得到，或通过本领域一般技术人员所知的已确立的文献方法来制备。除非下面另外注明，否则X、R1、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10和R11基团如上所定义。R2如上所定义，也包括下面合成流程中的CF3和杂芳基。
流程1
Figure A20058003538200381
如流程1所示，可通过用碱例如DIEA和二苯基磷酰叠氮处理从式6化合物制备式4化合物。该反应的典型溶剂为THF，反应在防爆屏蔽后于室温下进行1-12小时。
流程2
Figure A20058003538200382
流程2展示式5化合物的可供选择的合成。用式7化合物处理式3化合物，式7化合物按流程3来制备。有用的非限制性溶剂为DMF，反应温度保持在室温和60℃之间约1-12小时。
流程3
Figure A20058003538200391
如流程3所示，可在碱例如吡啶存在下，通过用氯甲酸芳基酯(例如氯甲酸苯酯或氯甲酸对硝基苯酯)处理，从式8化合物制备式7化合物。用于该反应的非限制性溶剂包括CH2Cl2或吡啶，温度从0℃到室温。
流程4
Figure A20058003538200392
Figure A20058003538200401
流程4展示得到式3化合物的方法。在碱性水溶液例如碳酸氢钠、碳酸钾或磷酸钾存在下，通过用芳基硼酸和钯(0)源(例如四(三苯基膦)合钯)处理，将式1化合物转化为式2化合物。用于该反应的非限制性溶剂实例包括THF、二烷或乙二醇二甲醚。该反应通常在0℃和90℃之间温度下进行约1-12小时。举例而言，在披钯碳、披铂碳或锌存在下，将式2化合物转化为式3化合物。用于该反应的溶剂实例包括但不限于甲醇、乙醇或乙酸。或者，用催化剂例如二氯双三(苯基膦)合钯或任何其他钯(0)源，可将式1化合物用于使末端炔11芳基化。反应通常在存在碱例如三甲胺时于室温到90℃之间的不同温度下进行。
此外，可从式9化合物得到的，其中X为三氟甲磺酸(即tf)式1化合物。典型的试剂包括三氟甲磺酸酐或N-苯基triflimide。该反应通常在-10℃和室温之间的温度下进行。非限制性溶剂实例为二氯甲烷。非限制性碱实例为三乙胺或二异丙基乙胺。
流程5
Figure A20058003538200411
流程5阐明式5化合物的可供选择的合成。根据流程2所示程序，可将式3化合物转化为式10化合物。然后根据流程4所示程序，可将式10化合物转化为式5化合物。
流程6
Figure A20058003538200412
Figure A20058003538200421
如流程6所示，可通过用碱(例如碳酸钾、三乙胺或氢氧化钠)处理，接着加入R11X(其中X为卤化物、甲磺酸基或甲苯磺酸基)，将式11化合物转化为式12化合物。用于该反应的溶剂实例包括DMF、THF、CH2Cl2和其混合物。该反应在0℃和100℃之间的温度下进行约15分钟到12小时。
或者，可将式11化合物与式R11X化合物混合，其中X为羟基，用存于溶剂例如THF中的三苯基膦和偶氮二甲酸二异丙酯处理所得到的混合物，得到式12化合物。
可在催化剂(例如氧化铂物、披钯碳或阮内镍)存在下用氢气处理式12化合物，或在金属锌存在下用酸源(例如饱和氯化铵水溶液或盐酸水溶液)处理式12化合物，得到式13化合物。用于该反应的溶剂实例包括甲醇、乙醇、乙酸乙酯或其混合物。该反应通常在室温或室温以下的温度进行1-12小时。
可通过让式13化合物与式4化合物(如流程1所述制备)化合来制备式15化合物。用于该反应的溶剂实例包括甲苯、苯和二甲苯。该反应在60℃-100℃温度下进行5-12小时。
流程7
Figure A20058003538200431
流程7展示了式15化合物的可供选择的合成。用式7化合物处理式3化合物，式7化合物按流程3制备。可使用的一种溶剂为DMF，反应温度保持在室温和60℃之间，反应时间为1-12小时。
流程8
Figure A20058003538200432
Figure A20058003538200441
流程8展示了式15化合物的可供选择的合成方法。在碱例如氢化钠、双(三甲基硅烷基)氨基钾或正丁锂存在下用醇处理，可将式19化合物转化为式12化合物。用于该反应的溶剂实例包括THF或二乙醚。该反应通常在-15℃和室温之间的温度下进行约1-6小时。按流程6所示程序将式12化合物转化为式15化合物.
流程9展示化合物21和23的可供选择的合成。可用流程5或流程6所示程序合成化合物20，其中R2＝Br。在碱性水溶液例如碳酸氢钠、碳酸钾或磷酸钾存在下，用杂芳基硼酸(HetB(OH)2)和钯(0)源(例如四(三苯基膦)合钯)处理，可将化合物20转化为化合物21。用于该反应的非限制性溶剂实例包括THF、二烷或乙二醇二甲醚。该反应通常在0℃和90℃之间的温度下进行约1-12小时。或者，可用杂芳基锡酸盐例如(HetSn(Bu)3)代替杂芳基硼酸。
举例而言，在碱例如三乙胺或Hunig氏碱存在下，用氰化锌和钯(0)源(例如四(三苯基膦)合钯)处理，也可将化合物21转化为22。用于该反应的非限制性溶剂实例为DMF和DME，在80℃反应1-12小时。或者，可在Pd(0)源(例如四(三苯基膦)合钯)和铜源(例如碘化铜)存在下，用氰化钾从化合物21得到化合物22。该反应通常在室温和200℃之间的温度下进行约30分钟到5小时。用于该反应的非限制性溶剂实例包括DMF。
最后，在碱例如三乙胺存在下，用例如叠氮钠，可将化合物22转化为化合物23。用于该反应的非限制性溶剂实例包括DMF或硝基苯。该反应通常在80℃和100℃之间的温度进行约1-5小时。
以下提供结构式(I)化合物具体的非限制性实例，其合成按照下面提出的和共同待审的美国专利申请公开号2003-0069284 A1(在此引作参考)中所述的方法来实施。
本文所述合成中所用的缩写为：小时(h)、水(H2O)、硫酸镁(MgSO4)、盐酸(HCl)、二甲亚砜(DMSO)、偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD)、二氯甲烷(CH2Cl2)、氯仿(CHCl3)、甲醇(MeOH)、氢氧化铵(NH4OH)、氘代氯仿(CDCl3)、四氢呋喃(THF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、乙酸(AcOH)、氢氧化钠(NaOH)、乙酸乙酯(EtOAc)、乙醇(EtOH)、二甲亚砜(DMSO)、二乙醚(Et2O)、碳酸钠(Na2CO3)、碳酸氢钠(NaHCO3)、硝酸(HNO3)、氯化钠(NaCl)、硫酸钠(Na2SO4)、二甲基甲酰胺(DMF)、1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)和N，N-二异-丙基乙胺(DIEA)。
中间体1：
Figure A20058003538200451
5-甲基-吡嗪-2-羰基叠氮
在室温下于氮气中将DIEA(31.7mL，181mmol)加入到存于540mL THF的搅拌的5-甲基-吡嗪-2-甲酸(25g，181mmol)悬浮液中，得到棕色溶液。然后在防爆屏蔽后经1小时逐滴加入存于50mL THF的二苯基磷酰基叠氮(39.2mL，181mmol)溶液。将该反应物搅拌过夜。然后在室温下将该反应物旋转蒸发到小体积，在Et2O(1L)和H2O(1L)之间分配。用2×250mL Et2O反萃取H2O层，用2×1L饱和碳酸氢钠洗涤合并的有机物。干燥(MgSO4)该有机物，过滤，浓缩为固体块，用Et2O研磨，得到产物，为黄色固体(15g，50％)。可通过将xg粗产物溶于20×mL Et2O中并用1-2xg脱色炭在室温处理几分钟，分离得到较纯的化合物。过滤和浓缩后，将该物质在EtOAc中用TLC表明为均质，为纯白色。回收率通常为65％。
化合物1：
Figure A20058003538200461
1-[2-(哌啶-3-基甲氧基)-5-三氟甲基-苯基]-3-(5-三氟甲基-吡嗪-2-基)-脲盐酸盐
步骤1：3-[2-(4-硝基-苯氧基羰基氨基)-4-三氟甲基-苯氧基甲基]-哌啶-1-甲酸叔丁酯。在氮气中于0℃将吡啶(57uL，0.71mmol)加入到存于2mL CH2Cl2的搅拌的3-(2-氨基-4-三氟甲基-苯氧基甲基)-哌啶-1-甲酸叔丁酯(240mg，0.64mmol)溶液中，接着加入对氯甲酸对硝基苯酯(130mg，0.64mmol)。在0℃ 1小时后，用CH2Cl2将该反应混合物稀释到30mL，然后用2×30mL 2N HCl洗涤，用1×30mL水洗涤，用1×30mL盐水洗涤。干燥(MgSO4)该有机物，过滤，浓缩为灰白色泡沫状物。
步骤2：3-{4-三氟甲基-2-[3-(5-三氟甲基-吡嗪-2-基)-脲基]-苯氧基甲基}-哌啶-1-甲酸叔丁酯。将3-[2-(4-硝基-苯氧基羰基氨基)-4-三氟甲基-苯氧基甲基]-哌啶-1-甲酸叔丁酯(217mg，0.4mmol)和5-三氟甲基-吡嗪-2-基胺(66mg，0.4mmol)(按美国专利第4,293,552号的方法制备)在5mL反应瓶中作为固体混合，用400uL NMP稀释，盖上盖子，作为暗黄色溶液搅拌，然后浸入85℃油浴中搅拌6小时。将该反应混合物冷却到室温，搅拌过夜。然后于80℃在0.5mm压力下通过Kugekohr蒸馏除去NMP。用CH2Cl2将棕色残留物稀释到30mL，然后用3×30mL 1M Na2CO3洗涤以除去对硝基酚。干燥(MgSO4)有机物，过滤，浓缩为粗制固体，用EtOAc研磨，过滤，得到所期需的产物，为白色固体。
步骤3：于室温将存于二烷(2mL)的2N HCl加入到有盖烧瓶中存于2mL二烷的搅拌的3-[2-(4-硝基-苯氧基羰基氨基)-4-三氟甲基-苯氧基甲基]-哌啶-1-甲酸叔丁酯(60mg，0.11mmol)溶液中，将该反应混合物搅拌过夜。通过旋转蒸发和高真空浓缩所得到的悬浮液，得到对应于终产物的黄色固体(57mg，99％)。1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ：11.18(brs，1H)，9.91(s，1H)，9.13(s，1H)，8.79(s，1H)，8.62(brs，1H)，8.57(s，1H)，7.43(d，1H)，7.25(d，1H)，4.18(m，2H)，3.44(m，1H)，3.23(m，1H)，2.86(m，2H)，2.36(m，1H)，1.96(m，1H)，1.83(m，1H)，1.67(m，1H)，1.42(m，1H)。LRMS(apci，阳离子模式)m/e 464.3(M+1)。
化合物2：
Figure A20058003538200481
1-[5-甲基-2-(哌啶-3-基甲氧基)-苯基]-3-(5-三氟甲基-吡嗪-2-基)-脲盐酸盐
步骤1：按化合物1的步骤2程序，从3-[4-甲基-2-(4-硝基-苯氧基羰基氨基)-苯氧基甲基]-哌啶-1-甲酸叔丁酯(WO 02/070494)制备3-{4-甲基-2-[3-(5-三氟甲基-吡嗪-2-基)-脲基]-苯氧基甲基}-哌啶-1-甲酸叔丁酯。分离该产物，为白色固体。
步骤2：按化合物1的步骤3程序，从3-{4-甲基-2-[3-(5-三氟甲基-吡嗪-2-基)-脲基]-苯氧基甲基}-哌啶-1-甲酸叔丁酯制备化合物2。分离该终产物，为黄色固体(30mg，99％)。1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ：10.86(s，1H)，9.61(s，1H)，9.05(s，1H)，8.77(s，1H)，8.58(br s，1H)，7.98(s，1H)，6.98(d，1H)，6.83(d，1H)，3.99(m，2H)，3.40(m，1H)，3.23(m，1H)，2.81(m，2H)，2.23(m，1H)，2.22(s，3H)，1.91(m，1H)，1.80(m，1H)，1.62(m，1H)，1.39(m，1H)。LRMS(apci，阳离子模式)m/e410.4(M+1)。
化合物3：
Figure A20058003538200482
1-[5-甲基-2-(1-甲基-哌啶-3-基甲氧基)-苯基]-3-(5-三氟甲基-吡嗪-2-基)-脲
按化合物1的步骤2程序，从[5-甲基-2-(1-甲基-哌啶-3-基甲氧基)-苯基]-氨基甲酸4-硝基-苯酯(WO 02/070494)制备化合物3，为白色固体。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：11.01(br s，1H)，8.87(brs，1H)，8.82(s，1H)，8.44(s，1H)，8.17(s，1H)，6.84(d，1H)，6.76(d，1H)，3.84(m，2H)，3.16(m，1H)，2.81(m，1H)，2.37(s，3H)，2.29(m，1H)，2.20(s，3H)，1.99(m，1H)，1.87-1.62(m，4H)，1.11(m，1H)。LRMS(apci，阳离子模式)m/e 424.3(M+1)。
另外的本发明非限制性化合物阐明如下。
化合物4
Figure A20058003538200491
化合物5
Figure A20058003538200492
化合物6
Figure A20058003538200493
化合物7
化合物8
Figure A20058003538200502
治疗方法
可将本发明化合物用于加强辐射和/或化疗剂的治疗效果，这些辐射和/或化疗剂用于治疗癌症和其他涉及真核细胞的细胞增生适应症，包括人类和其他动物中的适应症。举例而言，可将本发明化合物用于增强通常用抗代谢物例如甲氨蝶呤或5-氟尿嘧啶(5-FU)治疗的肿瘤的治疗。一般而言，本发明化合物抑制癌性和非癌性两种情况的异常增生细胞。
使用本发明化合物可导致异常增生细胞部分或完全消退，即此等细胞从细胞群部分或完全消失。因此，举例而言，当异常增生细胞为肿瘤细胞时，可将本发明方法用于减慢肿瘤生长速度，缩小肿瘤大小或减少其数量，或诱导肿瘤部分或完全消退。
在所有实施方案中，本发明可在没有识别出异常细胞增生或没有正在发生异常细胞增生、分别怀疑或预期有异常细胞增生时在体内或离体使用。此外，本发明也可在从前已治疗过的异常细胞增生的任何地方使用，以防止或抑制异常细胞增生复发。在这些和有关的实施方案中，“包含异常增生细胞的细胞群”是指其中尚未鉴定出或正在发生异常细胞增生，但分别怀疑或预期其有异常细胞增生的任一细胞群，和/或从前治疗过异常细胞增生以防止或抑制异常细胞增生复发的任一细胞群。
本发明的一种方法包括联合给予治疗有效量的本发明Chk1抑制剂化合物与化疗剂，该化疗剂可实现单链或双链DNA断裂，或可阻止DNA复制或细胞增生。或者，本发明方法包括联合给予治疗有效量的至少一种本发明Chk1抑制剂化合物与包括使用具有抑制癌症细胞增殖活性的抗体例如曲妥单抗的疗法。因此，癌症(例如结肠直肠癌、头颈癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、外阴癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、肾细胞癌、卵巢癌、脑瘤、骨肉瘤和肺癌)对通过联合给予本发明Chk1抑制剂与化疗剂或抗体的增强治疗敏感。
癌症包括肿瘤或赘生物，它们是其中细胞繁殖不受控制和连续不断的组织细胞的生长。某些此等生长为良性，但其他的被称为“恶性”，可引起有机体死亡。恶性肿瘤或“癌症”不同于良性生长，因为除表现出进攻性的细胞增殖外，还可侵入周围组织并转移。此外，恶性肿瘤特征为表现出丢失较多的细胞分化(更多“去分化”)和彼此相关的结构和周围组织。这种性质被称为“退行发育。”
本发明可治疗的癌症也包括实体瘤，即癌和肉瘤。癌包括源自上皮细胞的恶性肿瘤，其浸润(即侵入)周围组织，并产生转移。腺癌为源自腺组织或形成可识别的腺结构之组织的癌。另一种大类的癌症包括肉瘤，这是其细胞埋入纤维状物质或同种物质(例如胚胎结缔组织)的肿瘤。本发明也能治疗骨髓或淋巴同种物质系统的癌症，包括白血病、淋巴瘤和通常不以肿瘤实块存在而是分布在脉管系统或淋巴网状系统的其他癌症。
Chk1活性例如在以下方面与各种癌症形式有关：成人和儿童肿瘤学、实体瘤/恶性肿瘤的生长、粘液样圆细胞癌症、局部晚期肿瘤、转移性癌症、人软组织肉瘤(包括Ewing氏肉瘤)、癌症转移(包括淋巴细胞性转移)、鳞状上皮细胞癌(尤其是头颈癌、食管鳞状细胞癌、口腔癌)、血细胞恶性病变(包括多发性骨髓瘤、白血病(包括急性淋巴细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病和毛细胞白血病))、渗出性淋巴瘤(以体腔为主的淋巴瘤)、胸腺淋巴肺癌(包括小细胞癌、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肾上腺皮质癌、产生ACTH的肿瘤、非小细胞癌、乳腺癌、包括小细胞癌和导管癌)、胃肠癌(包括胃癌、结肠癌、结肠直肠癌和与结直肠瘤形成相关的息肉)、胰腺癌、肝癌、泌尿系统癌(包括膀胱癌，例如原发性浅表性膀胱瘤、侵袭性膀胱移行细胞癌和肌侵袭性膀胱癌)、前列腺癌、女性生殖道恶性肿瘤(包括卵巢癌、原发性腹膜上皮瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、子宫癌和卵泡实体瘤)、男性生殖道恶性病变(包括睾丸癌和阴茎癌)、肾癌(包括肾细胞癌)、脑癌(包括内部脑瘤(intrisic brain tumor)、成神经细胞瘤、星形细胞脑瘤、神经胶质瘤和侵袭到中枢神经系统的转移性肿瘤细胞)、骨癌(包括骨瘤和骨肉瘤)、皮肤癌(包括恶性黑素瘤、人类皮肤角质细胞的肿瘤进展和鳞状上皮细胞癌)、甲状腺癌、成视网膜细胞瘤、成神经细胞瘤、腹水、恶性胸腹水、间皮瘤、Wilms氏肿瘤、胆囊癌、滋养细胞肿瘤、血管外皮细胞瘤和卡波西肉瘤。因此，预期给予本发明Chk1抑制剂可提高治疗计划的效果。
本发明化合物也可加强药物治疗炎性疾病的功效。可从与适于本发明方法的化合物联合治疗得到益处的疾病实例为类风湿性关节炎、牛皮癣、白癜风、Wegener肉芽肿病和系统性红斑狼疮(SLE)。关节炎、Wegener肉芽肿病和SLE的治疗通常涉及使用免疫抑制疗法，例如电离辐射、甲氨蝶呤和环磷酰胺。此等治疗通常直接或间接诱导DNA损伤。对损坏了的免疫细胞中Chk1活性的抑制使得该等细胞对这些标准治疗的控制更敏感。通常用紫外辐射(UV)与补骨脂素联合治疗牛皮癣和白癜风。本发明DNA损伤剂诱导UV和补骨脂素的杀伤作用，提高该治疗方案的治疗指数。一般而言，当用于本发明方法的化合物与目前使用的免疫抑制药物联合时，可加强对炎性疾病细胞的控制。
除了上面揭示的癌症外，本发明也可用于治疗非癌性增生细胞的方法中。此等病症包括但不限于动脉粥样硬化症、再狭窄、脉管炎、肾炎、视网膜病、肾病、增生性皮肤病、牛皮癣、瘢痕形成、光化性角化病、Stevens-Johnson综合征、类风湿性关节炎(RA)、系统发作型青少年慢性关节炎(JCA)、骨质疏松症、系统性红斑狼疮、眼过度增生病(包括上皮向根端迁徙、增生性玻璃体视网膜病(PVR))、糖尿病性视网膜病(diabetic retropathy)、Hemangio增生病、鱼鳞病或乳头状瘤。
一种给予本发明Chk1抑制剂的优选方法阐述于Keegan等，美国临时申请第60/503,925号(于2003年9月17日提出申请，其整体内容在此引作参考)中。用于抑制异常细胞增生的此等方法涉及给予Chk1激活剂(例如化疗剂)和本发明Chk1抑制剂的方案。在该方法中，至少一种Chk1激活剂以在增生细胞中足以诱导细胞周期停滞基本同步的剂量和时间来给予。一旦达到细胞周期基本同步，则给予至少一种Chk1抑制剂以消除细胞周期停滞，诱导治疗性细胞死亡。该方法可与任何Chk1激活剂同用，可应用于治疗或预防癌性和非癌性异常细胞增生。
可使异常增生细胞群与一种Chk1抑制剂接触，或与超过一种Chk1抑制剂接触。若使用超过一种Chk1抑制剂，则该等Chk1抑制剂可由主治医生或实验技术人员决定同时给予或在不同的时间给予。
也可让异常增生细胞群与一种Chk1激活剂接触，或与超过一种的Chk1激活剂接触。若使用超过一种Chk1激活剂，则该等Chk1激活剂可由主治医生或实验技术人员决定同时给予或在不同的时间给予。
可将本发明Chk1抑制剂用于研究或改进离体细胞群的行为。举例而言，可将本发明化合物离体用于确定最佳给药方案，和/或确定将Chk1抑制剂给予特定适应症、细胞类型、患者的剂量，以及确定其他参数。从此等应用中收集的信息可用于实验目的，或用于在临床上设计体外治疗方案。本发明合适的其他离体的应用对本领域技术人员是显而易见。
本发明的Chk1抑制剂化合物也可使细胞对放射变得敏感。可用电磁辐射治疗的疾病包括肿瘤性疾病、良性和恶性肿瘤与癌细胞。
本文未列举的电磁辐射治疗也涵盖于本发明。本发明优选实施方案采用的电磁辐射有：γ辐射(10-20-10-13m)、X-射线辐射(10-12-10-19m)，紫外线(10nm-400nm)、可见光(400nm-700nm)、红外辐射(700nm-1.0mm)和微波辐射(1mm-30cm)。
目前很多癌症治疗方案采用电磁辐射例如X-射线激活的放射敏化剂。X射线激活的放射敏化剂实例包括但不限于下列：甲硝唑、米索硝唑、去甲米索硝唑、哌莫硝唑、依他硝唑、尼莫唑、丝裂霉素C、RSU 1069、SR 4233、EO9、RB 6145、烟酰胺、5-溴脱氧尿苷(BUdR)、5-碘脱氧尿苷(IUdR)、溴脱氧胞苷、氟脱氧尿苷(FUdR)、羟基脲、顺铂和以上物质治疗上有效的类似物和衍生物。
癌症的光动力学治疗(PDT)采用可见光作为敏化剂的辐射激活剂。光动力学放射敏化剂实例包括但不限于下列：血卟啉衍生物、PHOTOFRIN、苯并卟啉衍生物、NPe6、初卟啉锡(SnET2)、pheoborbide-a、细菌叶绿素-a、naphthalocyanines、酞菁、酞菁锌和以上物质治疗上有效的类似物和衍生物。
除Chk1抑制剂以外，放射敏化剂还可与一种或多种治疗有效量的化合物联合给予，此等化合物包括但不限于，促进放射敏化剂掺入到靶细胞的化合物，控制治疗剂、营养物质和/或氧流入到靶细胞的化合物，在有或无另外辐射或对治疗癌症或他疾病治疗有效的其他化合物时对肿瘤起作用的化疗剂。可用于与放射敏化剂组合的另外治疗剂实例包括但不限于5-氟尿嘧啶(5-FU)、亚叶酸、氧、卡波金(carbogen)、红细胞输入、全氟化碳(例如FLUOSOL-DA)、2，3-DPG、BW12C、钙通道阻滞剂、己酮可可碱、抗血管生成化合物、肼屈嗪和L-BSO。
可使用的化疗剂包括但不限于烷化剂、抗代谢物、激素和其拮抗剂、放射线同位素、抗体以及天然产物和其组合。举例而言，本发明抑制剂化合物可与以下物质联合给予：抗生素，例如多柔比星和其他蒽环霉素类似物；氮芥，例如环磷酰胺；嘧啶类似物，例如5-氟尿嘧啶；顺铂；羟基脲；泰素和其天然和合成衍生物等等。作为另一实例，在混合肿瘤(例如乳腺癌，其中肿瘤包括依赖促性腺激素和不依赖促性腺激素的细胞)情况下，所述化合物可与亮丙立德或戈舍瑞林(人工合成的LH-RH肽类似物)联合给予。其他抗肿瘤方案包括抑制剂化合物与其他治疗形式联合应用，例如外科手术或辐射，本文也称为“辅助抗肿瘤形式”。用于本发明的其他化疗剂包括激素和其拮抗剂、放射性同位素、抗体、天然产物和其组合。用于本发明方法的化疗剂实例列入下表中。
烷化剂 氮芥 氮芥
环磷酰胺 异环磷酰胺 美法仑
苯丁酸氮芥 亚硝基脲 卡莫司汀(BCNU)
洛莫司汀(CCNU) 司莫司汀(甲基-CCNU) 乙烯亚胺/甲基蜜胺
曲他胺(TEM) 撑硫代磷酰胺 (塞替派)
六甲蜜胺 (HMM，六甲蜜胺) 磺酸烷基酯
白消安 三嗪 达卡巴嗪(DTIC)
抗代谢物 叶酸类似物 甲氨蝶呤
三甲曲沙 嘧啶类似物 5-氟尿嘧啶
氟脱氧尿苷 吉西他滨 阿糖胞苷
(AraC，阿糖胞苷) 5-氮杂胞苷 2，2′-双氟去氧胞苷
嘌呤类似物 6-巯嘌呤 6-硫鸟嘌呤
硫唑嘌呤 2′-脱氧考福霉素 (喷司他丁)
erythrohydroxynonyladenine 磷酸氟达拉滨 2-氯脱氧腺苷
(EHNA)
(克拉屈滨，2-CdA) 多靶向抗叶酸药 I型拓扑异构酶抑制剂
喜树碱 托泊替康 伊立替康
天然产物 抗有丝分裂药物 紫杉醇
长春碱类 长春碱(VLB) 长春新碱
长春瑞滨 Taxotere(多西他赛) 雌莫司汀
磷酸雌莫司汀表鬼臼毒素 依托泊苷 替尼泊苷
抗生素 放线菌素D 道诺霉素(红比霉素)
多柔比星(阿霉素) 米托蒽醌伊达比星 博来霉素普卡霉素(bleomycinsplicamycin)(普卡霉素)
丝裂霉素C 更生霉素 酶类
L-天冬酰胺酶 生物反应调节剂 干扰素-α
IL-2 G-CSF GM-CSF
分化剂 视黄酸衍生物 放射敏化剂
甲硝唑 米索硝唑 去甲米索硝唑
哌莫硝唑 依他硝唑 尼莫唑
RSU 1069 EO9 RB 6145
SR4233 烟酰胺 5-溴去氧尿苷
5-碘去氧尿苷 溴去氧胞苷 其他类药剂
铂配位络合物 顺铂 卡铂
奥沙利铂 蒽二酮 米托蒽醌
取代脲 羟基脲 甲基肼衍生物
N-甲基肼(MIH) 丙卡巴肼 肾上腺皮质抑制剂
米托坦(o，p′-DDD) ainoglutethimide 细胞因子
干扰素(α、β、γ) 白介素-2激素和拮抗剂 肾上腺皮质类固醇/拮抗剂
泼尼松和等同物 地塞米松 ainoglutethimide
孕酮 己酸羟孕酮 醋酸甲羟孕酮
醋酸甲地孕酮 雌激素 己烯雌酚
炔雌醇/等同物 抗雌激素 他莫西芬
雄激素 丙酸睾酮 氟甲睾酮/等同物
抗性激素 氟他胺 促性腺激素释放素
激素类似物 亮丙立德 非类固醇抗雄性激素
氟他胺 光敏剂 血卟啉衍生物
Photofrin 苯并卟啉衍生物 Npe6
初卟啉锡(SnET2) pheoboride-a 细菌叶绿素-a
naphthalocyanines 酞菁 酞菁锌
生长因子受体拮抗剂 EGFR拮抗剂 HER-2拮抗剂
尤其可用于与放射敏化剂联合的化疗剂实例包括例如喜树碱、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、干扰素(α、β、γ)、伊立替康、羟基脲、苯丁酸氮芥、5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲氨蝶呤、2-氯腺苷、氟达拉滨、氮杂胞苷、吉西他滨、培美曲塞、白介素-2、伊立替康、多西他赛、紫杉醇、托泊替康和以上物质治疗上有效的类似物和衍生物。
根据本发明，本发明化合物可用于与吉西他滨联合，或与吉西他滨和紫杉醇联合。本发明化合物也可用于与培美曲塞联合，或与培美曲塞和顺铂、卡铂或其他铂类联合。本发明Chk1抑制剂也可与吉西他滨和培美曲塞联合给予。
与吉西他滨联合给予的本发明Chk1抑制剂，可用于治疗例如胰腺癌、子宫平滑肌肉瘤、骨肉瘤、转移性非小细胞肺癌、四肢和躯干软组织肉瘤、肾细胞癌、腺癌和霍奇金病。可将与培美曲塞联合给予的本发明Chk1抑制剂可用于治疗间皮瘤。
如本领域技术人员所了解，本文提及治疗时延伸到预防以及治疗已确定的疾病或综合症。提及治疗时也指降低增生速率或减少已治疗的适应症的复发。应进一步了解，用于治疗所需要的本发明化合物的量，随待治疗的病症的特性和患者的年龄和病症而变化，其最终由主治医生或兽医决定。
然而，一般而言，成人治疗用的给药剂量通常在每天0.001mg/kg到约100mg/kg范围内。可以单剂量或以合适的间隔多剂量方便地给予所期需的量，举例而言，每天给予2次、3次、4次或更多亚剂量。实践中由医生来决定最适于个体患者的实际给药方案，该剂量随特定患者的年龄、体重和反应来确定。上述剂量为一般病例的例示性剂量，但个别情况可存在应给较高或较低剂量，此等均在本发明范围内。
可以用本发明Chk1抑制剂以足以达到基本取消细胞周期检查点的任意剂量和时间接触该等细胞群。尽管不必要但通常此等时间包括长达约72到约96小时，其视各种因素而定。在某些实施方案中，如主治医生或技术人员所决定，长达约几周或更长时间给予Chk1抑制剂是理想的或必要的。因此，本发明Chk1抑制剂通常可以以下时间来给予：达到约1小时，达到约2小时，达到约3小时，达到约4小时，达到约6小时，达到约12小时，达到约18小时，达到约24小时，达到约48小时，或达到约72小时。本领域技术人员了解，本文所示时间范围仅为例示性，在该等所示以内或以外的范围或子范围也在本发明范围内。
可以多种剂量给予本发明Chk1抑制剂。举例而言，可以以下频率来给予Chk1抑制剂：以4天间隔每天将1剂量分4次递送(q4dx4)；以3天间隔每天将1剂量分4次递送(q3dx4)；以5天间隔每天递送1剂量(qdx5)；3周间每周递送1剂量(qwk3)；5天每天给药，2天休息，又另外每天给药5天(5/2/5)；或所定的对情况适合的任何其他给药方案。
实施例
实施例1
测定Chk1抑制剂的IC50值
如先前国际申请公告第WO 99/11795号(1998年9月4日提出申请)中所述来鉴别和克隆人Chk1 cDNA。将FLAG标记按照全长Chk1的氨基末段的读框插入。5′引物含有EcoRI位点、Kozak序列，也编码用于用M2抗体(Sigma，Saint Louis，IL)亲和纯化的FLAG标记。3′引物含有SalI位点。将PCR扩增的片段作为EcoRI-SalI片段克隆到pCI-Neo(Invitrogen，Carlsbad，CA)，然后以EcoRI-NotI片段亚克隆到pFastBacI(Gibco-BRL，Bethesda，MD)。如Gibco-BRL Bac-to-Bac手册所述制备重组杆状病毒，用于感染生长在CCM3培养基(HyClone Laboratories，Logan，UT)中的Sf-9细胞，以表达FLAG-标记的Chk1蛋白。
从杆状病毒感染的SF9细胞的冷冻沉淀中纯化FLAG-标记的Chk1。用等体积的2X裂解缓冲液(含有100mM Tris-HCl pH 7.5、200mM NaCl、50mM B-甘油磷酸、25mM NaF、4mM MgCl2、0.5mMEGTA、0.2％TWEEN-20、2mM钒酸钠、2mM DTT)和蛋白酶抑制剂混合物(Complete mini，Boehringer Mannheim 2000 catalog#1836170)混合冷冻的细胞沉淀。然后用杜恩斯匀浆器的松散杵将细胞匀浆20次，以48,400xg离心1小时。用10柱体积的50mM甘氨酸pH 3.5接着用20mM Tris pH 7.5、150mM NaCl预洗涤M2亲和基质，交替洗3次，用Tris NaCl结束洗涤。然后用25柱体积的20mM Tris pH 7.5、150mM NaCl、0.1％TWEEN-20、1mM EGTA、1mM EDTA和1X complete mini protease tablet(蛋白酶片剂)洗涤该柱。然后让清澈的裂解液经4小时在4℃分批结合到M2亲合树脂。然后将树脂和裂解物的混合物倒入柱中，收集流通液。用10柱体积的20mM Tris pH 7.5、150mM NaCl和3mM N-辛基葡糖苷洗涤树脂。然后用6柱体积的含有0.5mg/mL FLAG肽(Sigma，2000 Catalog#F-3290)的冷20mM Tris pH 7.5、150mM NaCl、3mM N-辛基葡糖苷从该柱洗脱FLAG-标记的Chk1。收集3个流分，分析FLAG-标记的Chk1的存在情况。
将蛋白激酶用于Chk1激酶活性测定，该测定包括100ng纯化的FLAG-Chk1(150pmol的ATP/分钟)、20μm Cdc25C肽(H-leu-tyr-arg-ser-pro-ser-met-pro-glu-asn-leu-asn-arg-arg-arg-arg-OH)(SEQ ID NO：1)、4μm ATP、2μCi[32P]γ-ATP、20mM Hepes pH 7.2、5mM MgCl2、0.1％NP40和1mM DTT。该测定用于测定本发明化合物的IC50。通过加入含有ATP的反应混合物来启动反应，在室温下进行10分钟。通过加入磷酸(150mM终浓度)来终止反应，并转移到磷酸纤维素圆盘。用150mM磷酸洗涤该等磷酸纤维素圆盘5次，风干。加入闪烁液，用Wallac闪烁计数器计数这些圆盘。所测定的本发明Chk1抑制剂的IC50值测量为约8到约500nM。
实施例2
选择性
测试本发明Chk1抑制剂对一种或多种其他蛋白激酶的选择性，即针对DNA-PK、Cdc2、酪蛋白激酶I(CKI)、Chk2、p38 MAP激酶、ERK激酶、蛋白激酶A(PKA)和/或钙-钙调蛋白蛋白激酶II(CaM KII)的选择性。除Chk2外，所有这些激酶的测定程序从前在下列文献中已有阐述，包括美国专利公开第2002-016521 A1号和美国专利申请第08/184,605号(于1994年1月21日提出申请)，这二者都在此引作参考。
所述化合物针对Chk2的活性如下测定：在4mM ATP、1mCi[32P]γ-ATP、20mM Hepes pH 7.5、5mM MgCl2和0.25％NP40存在，下于室温中让128ng纯化的His-标记的Chk2与高达100mM的Chk1抑制剂温育20分钟。用终浓度为150mM的磷酸终止反应，将反应混合物的5/8转移到磷酸纤维素圆盘。用150mM磷酸洗涤该等圆盘5次，风干。加入闪烁剂，用Wallacβ计数仪计数放射性。
p38 MAP激酶、ERK激酶、PKA、CaM KII和Cdc2购自NewEngland Biolabs，按制造商说明书用4-50μM ATP实施测定，测试的Chk1抑制剂浓度高达100μM。所测的所有抑制剂皆表现出对Chk1的选择性是其他酶的至少100倍。
实施例3
本发明的Chk1抑制剂在细胞中抑制Chk1的功能
为确定本发明Chk1抑制剂在细胞中抑制Chk1的功能，抑制剂可在基于细胞的分子测定中试验。因为业已证明哺乳动物Chk1在体外使Cdc25C磷酸化，表明其在对DNA损伤应答而负调控细胞周期蛋白B/cdc2，所以可分析Chk1抑制剂提高细胞周期蛋白B/cdc2活性的能力。该实验可设计如下：用800拉德的光照射HeLa细胞，在37℃孵育7小时。因为这些细胞功能上为p53阴性，所以它们专有地在G2期停滞。然后，加入0.5μg/mL浓度的诺考达唑，让细胞在37℃孵育15小时。加入诺考达唑以捕获任何通过G2停滞到M的细胞。最后将Chk1抑制剂加入8小时，收获细胞，裂解，按照制造商的提议用细胞周期蛋白B1抗体(New England Biolabs)免疫沉淀等量蛋白质。然后通过测定组蛋白H1激酶活性来分析免疫沉淀物中的与细胞周期蛋白B有关的cdc2激酶活性(Yu等，J Biol Chem.，Dec.11，1998；273(50)：33455-64)。
另外，所述Chk1抑制剂取消电离辐射诱导的G2 DNA损伤检查点的能力，可用有丝分裂指数测定实验来确定。如上所述处理HeLa细胞(大约1×106)。通过离心收获细胞，用PBS洗涤一次，然后重悬于2.5mL的75mM KCl中，再次离心。然后将细胞于3mL新鲜制备的冷乙酸∶甲醇(1∶3)中固定，在冰上孵育20分钟。沉淀细胞，吸出固定液，将细胞重悬于0.5mL PBS中。通过移取100μL固定的细胞到显微镜载玻片上并用1mL固定液盖住样品来制备有丝分裂涂片。然后风干玻片，用Wright氏染色液(Sigma)染色1分钟，接着用水洗涤一次，用50％甲醇洗涤一次。存在浓缩染色体并缺乏核膜则确定为有丝分裂细胞。
实施例4
本发明Chk1抑制剂提高通过癌症治疗杀伤细胞的能力
为证明本发明化合物对Chk1的抑制使靶细胞变得对DNA损伤剂的杀伤作用更加敏感，可在本发明Chk1抑制剂存在下孵育该等细胞，并与辐射或化学DNA损伤剂接触。细胞以每孔1000-2000个的密度在96孔微滴板中铺板，于37℃潮湿含5％CO2的培养箱中在含有10％FBS、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RMPI 1640中生长18小时。所测试细胞可包括任何目的细胞或细胞系，例如HeLa、ACHN、786-0、HCT116、SW620、HT29、Colo205、SK-MEL-5、SK-MEL-28、A549、H322、OVCAR-3、SK-OV-3、MDA-MB-231、MCF-7、PC-3、HL-60、K562和MOLT4。所有细胞系代称是指下面的人类细胞系：
HeLa 宫颈腺癌
ACHN 肾腺癌
786-0 肾腺癌
HCT116 结 肠癌
SW620 结肠癌，淋巴结转移
HT-29 结肠肠直肠腺癌
Colo205 结肠腺癌
SK-MEL-5 黑素瘤
SK-MEL-28 恶性黑素瘤
A549 肺癌
H322 细支气管肺泡癌
OVCAR-3 卵巢腺癌
SK-OV-3 卵巢腺癌
MDA-MB-231 乳腺癌
MCF-7 乳腺癌
PC-3 来自转移到骨的前列腺癌
HL-60 急性早幼粒细胞白血病
K562 慢性骨髓性白血病
MOLT4 急性成淋巴细胞性白血病；T成淋巴细胞
用单含化疗药或含化疗药和Chk1抑制剂的培养基处理细胞。在通过测定3H-胸苷摄入水平来测量生长之前，将细胞孵育大约5天。化疗药包括依托泊苷、多柔比星、顺铂、苯丁酸氮芥、5-氟尿嘧啶(5-FU)。将细胞生长抑制到未处理对照细胞的90％所需的药物浓度定义为GI90。
可用另外的抗代谢物，包括甲氨蝶呤、羟基脲、2-氯腺苷、氟达拉滨、氮杂胞苷和吉西他滨，来试验本发明化合物，以评估所述化合物增强上述抗代谢物杀伤作用的能力。可通过评估与吉西他滨联合增强对HT29结肠直肠癌杀伤作用来彼此比较本发明化合物。
另外，可测定本发明Chk1抑制剂增强辐射杀伤作用的能力。
实施例5
动物肿瘤模型
为试验本发明Chk1抑制剂在小鼠中增强DNA损伤剂杀伤的肿瘤的能力，用结肠肿瘤细胞系建立异种移植肿瘤模型。可将5-氟尿嘧啶(5-FU)或吉西他滨用作DNA损伤剂。可用HT29和Colo205(人类结肠癌)和H460和Calu-6(非小细胞癌)细胞在6-8周龄的雌性胸腺Balb/c(nu/nu)小鼠中繁殖异种移植肿瘤。将小鼠饲养在无病原条件的层流橱内，随意喂食无菌食物和水。让细胞系在补充有10％FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和1.5mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中于5％CO2的潮湿环境中生长到亚融合。用CMF-PBS制备单细胞悬浮液，将细胞浓度调整为1×108细胞/mL。在小鼠右侧腹部或右腿皮下(s.c.)接种总量为1×107的细胞(100μL)。
将小鼠随机分为(5-15只小鼠/组)4个治疗组，当肿瘤达到75-100cm3体积(通常在接种后7-11天)时使用。用游标卡尺测量肿瘤，用源自经验的公式估量肿瘤体积：肿瘤体积(cm3)＝肿瘤长度(cm)×肿瘤宽度(cm)×肿瘤厚度(cm)/3.3。治疗由腹膜内(i.p)注射100μL的160mg/kg吉西他滨组成。在用吉西他滨治疗的小鼠中观察到肿瘤生长迟滞。用160mg/kg吉西他滨与口服给予Chk1抑制剂二者联合治疗小鼠，预期可缩小肿瘤体积和延长生命。在实验期间每隔一天监测一次肿瘤大小。
很显然，可如上文所述对本发明进行很多不偏离其精神和范围的修正和改变，因此，如附加权利要求所指出的，仅此等限制应包括在内。
序列表
<110>ICOS Corporation
<120>用于抑制CHK1的化合物
<130>27866/40321A
<150>US 60/602,968
<151>2004-08-19
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>1
Leu Tyr Arg Ser Pro Ser Met Pro Glu Asn Leu Asn Arg Arg Arg Arg
1               5                 10                  15

Claims (28)

1.一种具有下式的化合物和其药物上可接受盐或前药或溶剂化物：
Figure A2005800353820002C1
其中X1为不存在、-O-、-S-、-CH2-或-N(R1)-；
X2为-O-、-S-或-N(R1)-；
Y为O或S；或＝Y代表2个连接到共用碳原子的氢原子；
W选自杂芳基、芳基、杂环烷基、环烷基和被杂芳基或芳基取代的C1-6烷基，其中(a)所述W基团的芳基或杂芳基被CF3和杂芳基中的至少一个取代；(b)所述W基团的芳基任选被1-3个由R2代表的取代基取代；和(c)所述W基团的杂芳基任选被1-3个由R5代表的取代基取代；
R1选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基和芳基；
R2选自杂芳基、卤素、任选取代的C1-6烷基、C2-6烯基、OCF3、NO2、CN、NC、N(R3)2、OR3、CO2R3、C(O)N(R3)2、C(O)R3、N(R1)COR3、N(R1)C(O)OR3、N(R1)C(O)C1-6亚烷基C(O)R3、N(R1)C(O)C1-6亚烷基C(O)OR3、N(R1)C(O)C1-6亚烷基OR3、N(R1)C(O)C1-6亚烷基NHC(O)OR3、N(R1)C(O)C1-6亚烷基SO2NR3、C1-6亚烷基OR3和SR3；
R3选自氢、卤素、C1-6烷基、C2-6烯基、环烷基、芳基、杂芳基、CO2R4、SO2R4；被卤素、羟基、芳基、杂芳基、杂环烷基、N(R4)2和SO2R4中的一个或多个取代的C1-6烷基；C1-6亚烷基芳基、C1-6亚烷基杂芳基、C1-6亚烷基C3-8杂环烷基、C1-6亚烷基SO2芳基、任选取代的C1-6亚烷基N(R4)2、OCF3、C1-6亚烷基N(R4)3 +、C3-8杂环烷基和CH(C1-6亚烷基N(R4)2)2，或2个R3基共同形成任选取代的3-6元脂肪族环；
R4选自氢、C1-6烷基、环烷基、芳基、杂芳基、C1-6亚烷基芳基和SO2C1-6烷基，或2个R4基共同形成任选取代的3-6元环；
R5选自C1-6烷基、芳基、杂芳基、杂环烷基、N(R3)2、OR3、卤素、N3、CN、C1-6亚烷基芳基、C1-6亚烷基N(R3)2、C(O)R3、C(O)OR3、C(O)N(R3)2、N(R1)C(O)R3、N(R1)C(O)OR3、CF3和
Figure A2005800353820003C1
R6选自OR11、-C≡C-R7和杂芳基；
R7选自氢、C1-6烷基、芳基、C1-6亚烷基芳基、杂芳基、C1-6亚烷基杂芳基和烷氧基；
R8、R9和R10独立选自氢、卤素、任选取代的C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、OCF3、CF3、NO2、CN、NC、N(R3)2、OR3、CO2R3、C(O)N(R3)2、C(O)R3、N(R1)COR3、N(R1)C(O)OR3、N(R8)C(O)OR3、N(R1)C(O)C1-6亚烷基C(O)R3、N(R1)C(O)C1-6亚烷基C(O)OR3、N(R1)C(O)C1-3亚烷基OR3、N(R1)C(O)C1-6亚烷基NHC(O)OR3、N(R1)C(O)C1-6亚烷基SO2NR3、C1-6亚烷基OR3和SR3；
R11选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、SO2R4；被卤素、羟基、芳基、杂芳基、N(R4)2和SO2R4中的一个或多个取代的C1-6烷基；C1-6亚烷基芳基、C1-6亚烷基杂芳基、C1-6亚烷基C3-8杂环烷基、C1-6亚烷基SO2芳基、任选取代的C1-6亚烷基N(R4)2、OCF3、C1-6亚烷基N(R4)3 +、C3-8杂环烷基和CH(C1-6亚烷基-N(R4)2)2。
2.权利要求1的化合物，其中
X1和X2为-N(H)-；
Y为O或S；
W为含有至少2个选自N、O和S的杂原子的杂芳基，所述环任选被一或两个选自C1-6烷基、芳基、杂芳基、N(R3)2、OR3、C(O)N(R3)2、CO2R3、CN、CF3和卤素的取代基取代。
3.权利要求2的化合物，其中W选自哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基和三嗪基，其任选被一或两个选自任选取代的C1-6烷基、芳基、杂芳基、N(R3)2、OR3、C(O)OR3、C(O)N(R3)2和卤素的取代基取代。
4.权利要求2的化合物，其中W选自
Figure A2005800353820004C1
5.权利要求2的化合物，其中W选自
6.权利要求2的化合物，其中W为吡嗪基。
7.权利要求1的化合物，其中R6为OR11。
8.权利要求1的化合物，其中R7为杂芳基。
9.权利要求1的化合物，其中W上的杂芳基取代基和R6的杂芳基独立选自
Figure A2005800353820005C2
Figure A2005800353820006C1
Figure A2005800353820007C1
Figure A2005800353820008C1
10.选自下列的化合物：
Figure A2005800353820008C2
Figure A2005800353820009C1
Figure A2005800353820010C1
11.组合物，其包含权利要求1的化合物和药物上可接受载体。
12.抑制细胞中检查点激酶1的方法，该方法包括使所述细胞与有效量的权利要求1的化合物接触的步骤。
13.使正经历医学病症化疗或放疗的个体的细胞敏化的方法，该方法包括将有效量的权利要求1的化合物与化疗剂、放疗剂或其混合物联合给予所述个体。
14.权利要求13的方法，该方法进一步包括给予一种或多种细胞因子、淋巴因子、生长因子或其他造血因子。
15.权利要求12的方法，其中所述化疗剂选自烷化剂、抗代谢物、激素或其拮抗物、放射性同位素、抗体和其混合物。
16.权利要求13的方法，其中所述放疗剂选自γ-辐射、X-射线辐射、紫外线、可见光、红外辐射和微波辐射。
17.权利要求13的方法，其中所述病症为选自结肠直肠癌、头颈癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、外阴癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、肾细胞癌、卵巢癌、脑瘤、骨肉瘤和肺癌的癌症。
18.权利要求13的方法，其中所述病症为选自下列的癌症：粘液样圆细胞癌、局部晚期肿瘤、转移性癌、Ewing氏肉瘤、癌症转移、淋巴细胞性转移、鳞状上皮细胞癌、食管鳞状细胞癌、口腔癌、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、毛细胞白血病、渗出性淋巴瘤(以体腔为主的淋巴瘤)、胸腺淋巴肺癌、小细胞癌、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肾上腺皮质癌、产生ACTH的肿瘤、非小细胞癌、乳腺癌、小细胞癌、导管癌、胃癌、结肠癌、结肠直肠癌、与结直肠瘤形成相关的息肉、胰腺癌、肝癌、膀胱癌、原发性浅表性膀胱瘤、侵袭性膀胱移行细胞癌、肌侵袭性膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、原发性腹膜上皮瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、子宫癌和卵泡实体瘤、睾丸癌、阴茎癌、肾细胞癌、内部脑瘤、成神经细胞瘤、星形细胞脑瘤、神经胶质瘤、侵袭到中枢神经系统的转移性肿瘤细胞、骨瘤和骨肉瘤、恶性黑素瘤、人皮肤角质细胞的肿瘤进展、鳞状上皮细胞癌、甲状腺癌、成视网膜细胞癌、成神经细胞瘤、腹水、恶性胸膜积液、间皮瘤、Wilms氏肿瘤、胆囊癌、滋养层细胞肿瘤、血管外皮细胞瘤和卡波西肉瘤。
19.权利要求12的方法，其中所述治疗给予选自类风湿性关节炎、牛皮癣、白癜风、Wegener肉芽肿病和系统性红斑狼疮的炎性病症。
20.权利要求13的方法，其中所述权利要求1的化合物在抑制Chk1方面的选择性是蛋白激酶A、蛋白激酶C、cdc2和pp60v-src的至少20倍。
21.权利要求13的方法，其中所述权利要求1的化合物在抑制Chk1方面的选择性是蛋白激酶A、蛋白激酶C、cdc2和pp60v-src 75的至少倍。
22.权利要求13的方法，其中所述权利要求1的化合物在抑制Chk1方面的选择性是蛋白激酶A、蛋白激酶C、cdc2、pp60v-src 100的至少倍。
23.权利要求13的方法，其中所述化疗剂包括吉西他滨、培美曲塞、顺铂、卡铂、紫杉醇或其混合物。
24.抑制异常细胞增生的方法，该方法包括用Chk1激活剂与包含异常增生细胞的细胞群接触，以使所述异常增生细胞的细胞周期停滞基本上同步，随后用权利要求1的化合物与所述细胞群接触，以基本上取消所述细胞周期停滞。
25.权利要求24的方法，其中所述Chk1激活剂包括至少一种化疗剂。
26.权利要求24的方法，其中所述Chk1激活剂包括电离辐射或紫外辐射。
27.权利要求24的方法，其中所述电离辐射与放射敏化剂、光敏剂或其混合物联合给予。
28.权利要求24的方法，其中所述异常增生细胞为非癌性细胞。
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