CN101100662A - 热稳定可逆失活酶类的再激活的增强 - Google Patents
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Abstract
公开了增强热稳定可逆失活酶再激活的方法，包括在一种或多种含氮化合物的存在下再激活至少一种热稳定可逆失活酶。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求以2006年6月28日提交的美国临时申请NO.60/817,043和2006年10月19日提交的美国临时申请No.60/852,804作为优先权基础，这两份申请均通过援引全文纳入本申请。
背景技术
一些分子生物学方法需要已存在于反应中的、可受控激活的酶。这使得可在预定的时间点在同一反应容器中起动相继的酶解过程，或者避免由于过早开始酶反应而产生不良副产物。就使用经化学修饰的热稳定酶类而言，对热稳定DNA聚合酶的这两类修饰已被描述(参见美国专利No.5,677,152、5,773,258和6,183,998，通过援引将其全文纳入本文)。这种修饰还可应用于其它热稳定酶，原因在于所有酶中所含的氨基酸例如具有游离NH2-基团的氨基酸可由这些化学物质所修饰，并且这些氨基酸通常涉及酶的催化中心。另外，美国专利No.6,183,998教导了用醛类交联酶分子，该交联一般适于修饰任何热稳定酶。这种经化学修饰的酶类的活性可通过热孵育步骤恢复，所述热孵育步骤可断裂连接到氨基酸残基上的共价键，由此恢复酶的催化活性。但是，由于所选择的修饰物浓度或失活方法，酶活性仅以缓慢速率恢复。
发明人发现含氮化合物可显著提高经化学修饰的酶类的酶活性，并且它们不影响未修饰的酶。因此，本发明首次描述了使经化学修饰的酶的再激活增强的机制，该机制适于多种应用例如用于提高酶反应速度。
发明内容
依照本文所具体充分描述的公开的材料、化合物、组合物、物品和方法的目的，所公开主题一方面涉及化合物和组合物以及制备和使用所述化合物和组合物的方法。另一方面，所公开主题涉及使用一种或多种含氮化合物来增强可逆失活热稳定酶类的再激活。
其它优点一部分将在随后的说明书中进行阐述，另一部分可显而易见于说明书或者可通过实施下述各方面获知。下述优点可通过在所附权利要求书中具体指出的要素和组合实现和获得。应理解的是，上文的概述和随后的详述均是示例性的，仅仅用于解释而无意于限定。
附图说明
纳入本文并构成本说明书的一部分的附图对下述几方面进行了图示。
图1为来自加入不同浓度三唑的快速PCR反应的琼脂糖凝胶。
图2为一组表格和相应组图，每个表格示出获自加入不同浓度具体氨化合物的反应的平均CT值。
图3为一组获自加入不同浓度氯化铵的三个快速PCR反应的三个琼脂糖凝胶。
图4为获自存在氯化铵和不同浓度三唑时的快速PCR反应的琼脂糖凝胶。
具体实施方式
通过参考下文的对所公开主题具体方面和其中包括的实施例的详细描述并参考附图，可更容易理解本文所述材料、化合物、组合物、物品和方法。
公开和描述本发明材料、化合物、组合物、物品和方法之前，应理解的是下述各方面并不限于具体的合成方法或具体的试剂，因为它们理所当然可有所变化。还应理解的是，本文所使用的术语仅仅是为了描述具体方面，而无意于限定。
还在通篇说明书中引用了多篇出版物。这些出版物的公开内容通过援引全文纳入本申请，目的在于充分描述与所公开主题相关的现有技术的状况。基于倚赖参考文献的句子中所论述的包含在所述参考文献中的素材，公开的参考文献也通过引用的方式单独地并特别地纳入本说明书。
总的定义
在本说明书及随后的权利要求书中，会提及一些术语，这些术语应被定义为具有下述含义：
整篇本说明书的描述和权利要求中，词语“包含”和该词的其它形式例如“包括”和“含有”意味着包括但不限于，而且无意于排除例如其它添加剂、组分、整数或步骤。
除非上下文中另外明确指出，在本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式的“一”、“一种”和“该”包括复数指代对象。因此，例如，提及“一种化合物”包括两种或多种这类化合物的混合物，提及“一种酶”包括两种或多种这类酶的混合物，提及“该引物”包括两种或多种这类引物的混合物等等。
本文所使用术语“取代的”，考虑包括有机化合物的所有容许的取代基。在一个大方面，容许的取代基包括有机化合物的无环与有环、支链与无支链、碳环与杂环以及芳香族与非芳香族取代基。示例性取代基包括例如下述的取代基。恰当有机化合物的容许取代基可有一个或多个，并且可相同或不同。就本发明公开内容的目的而言，杂原子例如氮可具有氢取代基和/或满足杂原子化合价的本文所述有机化合物的任何容许取代基。该公开内容无意于以任何方式被有机化合物容许的取代基限定。同样，术语“取代”或“被……取代”包含这样一种隐含前提：这种取代与所取代原子和取代基容许的化合价相一致，并且这种取代可得到稳定的化合物，例如不会通过例如重排、环化、消除等发生自发转化的化合物。
本文所使用的术语“烷基”为1至24个碳原子的支链或无支链饱和烃基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等等。烷基基团还可以是取代的或未取代的。烷基基团可被一个或多个基团所取代，所述一个或多个基团包括但不限于本文所述的取代的或未取代的烷基、环烷基、烷氧基、链烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、硼酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、叠氮化物、硝基、氧肟酸盐、甲硅烷基、硫代-氧代(sulfo-oxo)或巯基。“低级烷基”基团是含有一至六个碳原子的烷基基团。
本文所使用的“烷氧基”为通过醚键键合的烷基或环烷基；也就是说，“烷氧基”基团可定义为-OA1，其中A1为上文定义的烷基或环烷基。
本文所使用的术语“链烯基”为其结构式含有至少一个碳碳双键的2至24个碳原子烃基。不对称结构例如(A1A2)C＝C(A3A4)旨在包括E和Z异构体。这可从存在不对称烯的本发明结构式推定，或者可由键合符号C＝C明示。链烯基可被一个或多个基团所取代，所述一个或多个基团包括但不限于本文所述取代的或未取代的烷基、环烷基、烷氧基、链烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、硼酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、叠氮化物、硝基、氧肟酸盐、甲硅烷基、硫代氧代或巯基。
本文所使用术语“炔基”为其结构式含有至少一个碳碳三键的2至24碳原子烃基。炔基可未被取代，或者被一个或多个基团所取代，所述一个或多个基团包括但不限于本文所述取代的或未取代的烷基、环烷基、烷氧基、链烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、硼酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、叠氮化物、硝基、氧肟酸盐、甲硅烷基、硫代氧代或巯基。
术语“酰基”表示含10个或少于10个连续C原子的相应酸的衍生物。这些酸部分可具有其它烷基基团或官能团例如羟基、氨基、羧基、磺酸、酯或醚基团。
本文所使用术语“芳基”是包含任意基于碳的芳香族基团的基团，包括但不限于苯、萘、苯基、联苯基、苯氧基苯(phenoxybenzene)等。术语“芳基”还包括“杂芳基”，它被定义为含有芳香族基团、且所述芳香族基团的环内掺入了至少一个杂原子的基团。杂原子的实例包括但不限于氮、氧、硫和磷。同样，也包含在术语“芳基”中的术语“非杂芳基”定义为含有不含杂原子的芳香族基团的基团。芳基基团可为取代的或未取代的。芳基基团可被一个或多个基团所取代，所述一个或多个基团包括但不限于本文所述取代的或未取代的烷基、环烷基、烷氧基、链烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、硼酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、叠氮化物、硝基、氧肟酸盐、甲硅烷基、硫代氧代或巯基。术语“联芳基”为特定类型的芳基基团，它包含在“芳基”的定义之中。联芳基指的是通过例如萘中的稠环结构键合在一起、或者通过例如联苯中的一个或多个碳碳键连接的两个芳基基团。术语“苯基”包含在芳基的含义之中，并指苄基部分，它可具有连接到环上的其它烷基链(含4个或少于4个连续C原子)或官能团例如羟基、氨基、硝基、羰基、磺酸、酯、醚或卤素基团。
本文所使用的术语“胺”或“氨基”由式NA1A2A3表示，其中A1、A2和A3可独立地为氢或本文所述取代的或未取代的烷基、环烷基、链烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基或杂芳基基团。术语“氨基烷基”指具有烷基部分的氨基基团。术语“烷基”定义如上。同样，氨基烷基的衍生物与烷基基团的衍生物相对应。
本文所使用的术语“氮杂五元环(azole)”为在环上含有至少一个氮原子的取代的或未取代的或者稠合的五元环。
本文所使用术语“羧酸”由式-C(O)OH表示。
本文所使用术语“酯”由式-OC(O)A1或-C(O)OA1表示，其中A1为本文所述取代的或未取代的烷基、环烷基、链烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基或杂芳基基团。
本文所使用术语“醚”由式A1OA2表示，其中A1和A2可独立地为本文所述取代的或未取代的烷基、环烷基、链烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基或杂芳基。
本文所使用术语“卤化物”或“卤素”指卤素氟、氯、溴和碘。
本文所使用术语“羟基”由式-OH表示。
本文所使用术语“酮”由式A1C(O)A2表示，其中A1和A2可独立地为本文所述取代的或未取代的烷基、环烷基、链烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基或杂芳基。
本文所使用术语“叠氮化物”由式-N3表示。
本文所使用术语“硝基”由式-NO2表示。
本文所使用术语“腈”由式-CN表示。
本文所使用术语“甲硅烷基”由式-SiA1A2A3表示，其中A1、A2和A3可独立地为氢或本文所述取代的或未取代的烷基、环烷基、烷氧基、链烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基或杂芳基。
本文所使用的术语“硫代-氧代”由式-S(O)A1、-S(O)2A1、-OS(O)2A1或-OS(O)2OA1表示，其中A1可为氢或本文所述取代的或未取代的烷基、环烷基、链烯基、环烯基，炔基、环炔基、芳基或杂芳基基团。整个说明书中，“S(O)”是S＝O的缩写符号。本文所使用术语“磺酰基”指的是由式-S(O)2A1表示的硫代-氧代基团，其中A1可为氢或本文所述取代的或未取代的烷基、环烷基、链烯基、环烯基，炔基、环炔基、芳基或杂芳基基团。本文所使用术语“砜”可由式A1S(O)2A1表示，其中A1和A1可独立地为本文所述取代的或未取代的烷基、环烷基、链烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基或杂芳基基团。本文所使用术语“亚砜”由式A1S(O)A1表示，其中A1和A1可独立地为本文所述取代的或未取代的烷基、环烷基、链烯基、环烯基，炔基、环炔基、芳基或杂芳基基团。
本文所使用术语“巯基”由式-SH表示。
本文所使用“R1”、“R2”和“X”可独立地具有上述一个或多个基团。例如，若R1为烷基基团，则所述烷基的氢原子之一任选可被羟基基团、烷氧基基团、烷基基团、卤化物等所取代。根据所选择的基团，第一个基团可掺入第二个基团之中，或者第一个基团可悬吊于(即连接)第二个基团之上。例如短语“含氨基的烷基”为氨基掺入烷基的骨架之中。或者，氨基可与烷基的骨架相连。所选基团的性质可确定第一个基团是嵌于第二个基团之中还是与之相连。
现将以所公开材料、化合物、组合物、物品和方法的具体方面为详细参考，它们的实例将在所附实施例和附图中阐述。
方法和组合物
本发明提供了一种增强可逆失活热稳定酶类的再激活的方法。具体而言，所公开的方法涉及使用其特征在于下式1-6的含氮化合物，
其中每个X各自独立地为CH、CR、N、O或S；并且每个R各自独立地为H，取代的或未取代的烷基、链烯基、炔基、烷氧基或芳基，羟基，氨基，硝基，羧酸，酯，磺酸，醚或卤素基团。如本文所公开的那样，可使用这些化合物(包括其混合物在内)来增强热稳定可逆失活酶的再激活。
在多个实例中，本文公开了用于增强热稳定可逆失活酶的再激活的方法，所述方法包括在含氮化合物的存在下再激活至少一种热稳定可逆失活酶。适用于本文的含氮化合物的具体实施例包括但不限于氮杂五元环。合适的氮杂五元环可包括具有式1的含氮五元环化合物，
其中每个X各自独立地为CH、CR或N，并且R可为H，取代的或未取代的烷基、链烯基、炔基、烷氧基或芳基基团，羟基，氨基，硝基，羧酸，酯，磺酸，醚或卤素基团。
在另一实例中，合适的氮杂五元环可包括具有式2的含氮五元环化合物，
其中每个X各自独立地为CH、CR、N、O或S，并且每个R可各自独立地为H，取代的或未取代的烷基、链烯基、炔基、烷氧基或芳基基团，羟基，氨基，硝基，羧酸，酯，磺酸，醚或卤素基团。在另一实例中，每个X可各自独立地为任意组合的CH或N。
在又一实例中，合适的氮杂五元环可包括具有式3的含氮二环化合物，
其中每个X可各自独立地为CH、CR、N、O或S，并且每个R可各自独立地为H，取代的或未取代的烷基、链烯基、炔基、烷氧基或芳基基团，羟基，氨基，硝基，羧酸，酯，磺酸，醚或卤素基团。
本文还公开了增强热稳定可逆失活酶的再激活的方法，所述方法包括，在包括具有式4的吡啶的化合物的存在下再激活至少一种热稳定可逆失活酶，
其中每个X可各自独立地为CH、CR或N，并且R可为羟基、氨基、巯基或氨基烷基基团，或其衍生物。
另外，本文公开了增强热稳定可逆失活酶的再激活的方法，所述方法包括，在包括具有式5的N-氢氧化物的化合物的存在下再激活至少一种热稳定可逆失活酶，
其中每个R可各自独立地为H，取代的或未取代的烷基、链烯基、炔基、烷氧基或芳基基团，或酰基基团或其衍生物。
在又一实施例中，本文公开了增强热稳定可逆失活酶的再激活的方法，所述方法包括，在包括具有式6的肼的化合物的存在下激活至少一种热稳定可逆失活酶，
其中每个R可各自独立地为H，取代的或未取代的烷基、链烯基、炔基、烷氧基或芳基基团，或酰基基团或其衍生物。
在又一实例中，本文公开了增强热稳定可逆失活酶的再激活的方法，所述方法包括在铵盐的存在下再激活至少一种热稳定可逆失活酶。铵盐可为包含式+NR4的带正电荷氮类和带负电荷的无机反荷离子、有机反荷离子、金属氧化物反荷离子或金属络合物反荷离子反荷离子的任何化合物，所述式+NR4的带正电荷氮类中每个R各自独立地为H，取代的或未取代的烷基、链烯基、炔基、烷氧基或芳基，羟基，氨基，硝基，羧酸，酯，磺酸，醚或卤素基团。
铵盐的合适带正电荷氮类为NH4和四烷基铵。铵盐中合适的反荷离子可带一个或多个负电荷。合适的反荷离子的实例包括但不限于无机反荷离子如卤素(如F-、 Cl-、Br-和I-)、拟卤素(如SCN-和OCN-)、高氯酸根(ClO4 -)、氯酸根(ClO3 -)、亚氯酸根(ClO2 -)、次氯酸根(ClO-)、溴酸根(BrO3 -)、 高碘酸根(IO4 -)、硫离子(S2-)、硫酸根(SO4 2-)、亚硫酸根(SO3 2-)、硫酸氢根(HSO4 -)、磷离子(P3-)、磷酸根(PO4 3-)、磷酸氢根(HPO4 2-)、磷酸二氢根(H2PO4 -)、亚磷酸根(PO3 2-)、氮离子(N3-)、硝酸根(NO3 -)、亚硝酸根(NO2-)、氢氧根(OH-)、过氧根(O2 2-)、 六氟磷酸根(PF6 -)和高锰酸根(MnO4 -)。
合适的反荷离子的其它实例包括但不限于有机反荷离子例如碳酸根(CO3 2-)、碳酸氢根(HCO3 -)、甲酸根(CHO2 -)、乙酸根(CH3CO2 -)和其它烷基羧酸根(RCO2 -，其中R为烷基，如丙酸根、丁酸根等)、草酸根(C2O4 2-)、酒石酸根和苹果酸根(C4H4O6 2-)、柠檬酸根(C6H5O7 3-)和苯甲酸根(C6H5CO2 -)。
其它适合的反荷离子包括但不限于金属氧化物和金属络合物。金属氧化物和金属络合物的实例包括原钒酸根、钼酸根(Mo7O24)、六氰亚铁酸根(FeCN6)4-和硝酸铈。
本文公开的任何反荷离子可与本文公开的任何铵类联合形成铵盐。合适的铵盐的一些具体实例包括但不限于氯化铵(NH4Cl)、磷酸二氢铵(NH4H2PO4)、磷酸氢二铵((NH4)2HPO4)、(NH4)3PO4、(NH4)4(Fe(CN)6)、醋酸铵(NH4CH3CO2)、碳酸铵((NH4)2CO3)、钼酸铵(NH4Mo7O24)、高氯酸铵(NH4ClO4)、柠檬酸铵((NH4)3C6H5O7)、苯甲酸铵(NH4C6H5CO2)和磷酸铵((NH4)3PO4)。
应该理解的是，可对本文所公开的方法作一些调整。例如，若铵盐的反荷离子可与反应中的Mg(其作为辅因子是酶所必需的)螯合，则该盐对再激活也具有相同作用。但是，必须提高反应中的Mg浓度以补偿反荷离子的螯合作用。同样，若反荷离子对酶有抑制作用，则可优化浓度，使其既有效又没有抑制作用。
在一个具体方面，铵盐可与本文所公开的任何氮杂五元环、嘧啶、N-羟胺或肼一起使用。正如下文更充分描述的那样，本文所公开的铵盐与本文所公开的任何其它含氮化合物一起使用可产生协同效应。
本文所公开的方法中，本文所公开的氮杂五元环、嘧啶、N-羟胺和肼存在的浓度可为从约0.5mM至约1M，例如约0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、505、510、515、520、525、530、535、540、545、550、555、560、565、570、575、580、585、590、595、600、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995、1000mM，其中任何指明的数值可形成某个范围的上限或下限端点。对于铵盐而言，铵类可为所列出的任何浓度。
在某些实施例中，铵化合物并非柠檬酸铵、磷酸氢二铵、苯甲酸铵、碳酸铵或硫酸铵。
所公开方法可应用到涉及核酸操作如扩增、连接、核酸外切或核酸内切反应，或核酸拓扑学发生改变的酶促反应的所有应用中，其中通过在升高的温度下、在本文所述含氮化合物的存在下，在预定酶促反应之前孵育反应混合物或将此孵育作为预定酶促反应的一部分，从而使所述失活酶得以再激活。
实施例
下面给出以下实施例以阐述所公开主题的方法和结果。这些实施例无意于囊括本文所公开主题的所有方面，而意在阐述代表性的方法和结果。这些实施例无意于排除对于本领域的技术人员而言显而易见的本发明的等价方案和变化方案。
对于数字(例如数量、温度等)，已经努力确保其准确性，但应该考虑到会存在一些误差和偏差。除非另有说明，份数为重量份数，温度以℃为单位或者为环境温度，压力等于或接近大气压。反应条件例如组分浓度、所需溶剂、溶剂混合物、温度、压力和可用于使自所述方法获得的产品纯度和产量最优化的反应范围和条件等可有很多变化和组合。优化这些过程条件仅需要合理且常规的实验。
作为对本发明进行举例说明的模型体系，选择了热启动PCR和两种可商购的酶。由于两种聚合酶由不同的化学修饰物所失活，因此这表现出本发明的属间适应性。AmpliTaq Gold(Applied Biosystems)可通过使用二羧酸酐以化学方式失活，而HotStarTaq(QIAGEN)可通过使用甲醛以化学方式失活。选择热启动PCR作为模型体系是基于如下理由：(i)聚合酶链反应是广泛使用的分子生物学手段，因此可阐述本发明的经济价值；(ii)基于反应所固有的高效率，PCR是一个很好的模型体系，该模型可表明本发明所使用的物质并不会影响含有未修饰酶的反应，并且在反应中含有经化学修饰的酶时还能更进一步增强这类反应的效率。
为容易地说明酶反应效率的提高，选择了实时PCR。在实时PCR中，酶促反应可通过测量整个反应中的荧光信号而被连续监测。PCR反应期间可形成双链DNA分子。通过使用仅选择性结合dsDNA的SYBR Green I荧光染料可检测这些PCR产物。因此，荧光的增强表明PCR产物量的提高，由此表明包含在反应中的DNA聚合酶的活性提高。一旦总的荧光相对于背景荧光信号显著增强，则达到了所谓的CT值。因此，CT值是在反应中所含的酶活性的一个量度：低CT值表明反应中存在的酶活性较高，高CT值表明反应中存在的酶活性较低。
另外，另一个实施例示出通过产生的浓度依赖PCR产物产量对一种所选择物质(三唑)进行的滴定测定及其对提高PCR中酶活性的作用。
实施例1
使用HotStarTaq DNA聚合酶(QIAGEN)或AmpliTaq Gold(AppliedBiosystems)进行基于SYBR Green I的PCR反应，同时使用未修饰的TaqDNA聚合酶(QIAGEN)作为对照反应。每个反应含有0.625单位的各DNA聚合酶、各DNA聚合酶的1×PCR反应缓冲系、每种dNTP各200μM、0.5μM引物A：5’-GTC ACC TTC ACC GTT CCA GT-3’(SEQ ID NO：1)、0.5μM引物B：5’-CTC TTC CAG CCT TCC TTC CT-3’(SEQ ID NO：2)、PCR级水，在测试含氮化合物的实例中，加入终浓度为100mM的三唑。每个反应包含作为扩增底物的10ng人基因组DNA。以在95℃进行5分钟酶激活步骤来开始PCR反应，随后进行50个如下循环：94℃，15秒；60℃，60秒。通过比较未添加三唑和添加100mM三唑的反应，可从三个重复反应中测定平均CT值。
| 酶 | 不含三唑的平均CT值 | 含100mM三唑的平均CT值 |
| Taq(未修饰) | 21.0 | 21.3 |
| HotStarTaq | 42.3 | 35.9 |
| AmpliTaq Gold | 27.6 | 25.6 |
结果：在使用Taq DNA聚合酶时，加入三唑对酶活性没有影响，但是在使用经化学修饰的酶HotStarTaq DNA聚合酶和AmpliTaq Gold时，含有三唑的反应表现出明显较高的酶活性。
实施例2
在不存在三唑以及存在浓度递增的三唑的情况下，进行了含有经化学修饰的HotStarTaq DNA聚合酶的、循环时间显著缩短的快速PCR反应。每个PCR反应含有1.5单位HotStarTaq DNA聚合酶、10ng模板人基因组DNA、每种dNTP各200μM、0.5μM引物A：5’-CAC ACA GCG ATG GCA GCTATG C-3’(SEQ ID NO：3)、0.5μM引物B：5’-CCC AGT GAT GGG CCA GCTC-3’(SEQ ID NO：4)、PCR级水，并且在测试含氮化合物的实例中，加入终浓度为100mM、200mM、300mM、400mM和500mM的三唑。以在95℃进行5分钟酶激活步骤来开始PCR反应，随后进行35个如下循环：96℃，5秒；60℃，5秒和68℃，30秒。在1％TAE琼脂糖凝胶上分析PCR产物(图1)。
结果：不存在三唑的快速PCR显示仅形成非特异性副产物，而即便是在快速循环PCR条件下，加入其中任一浓度的三唑均会显著提高形成所需PCR产物的酶活性。
实施例3
使用HotStarTaq DNA聚合酶(QIAGEN)进行基于SYBR Green I的PCR反应，同时使用未修饰的Taq DNA聚合酶(QIAGEN)作为对照反应。每个反应(反应体积20μL)含有不含HotStarTAQ DNA聚合酶和(NH4)2SO4的Quant iTect SYBR Green PCR Mas ter Mix、1.0单位的各DNA聚合酶和0.5μM引物A：5’-GTC ACC TTC ACC GTT CCA GT-3’(SEQ ID NO：5)、0.5μM引物B：5’-CTC TTC CAG CCT TCC TTC CT-3’(SEQ ID NO：6)、PCR级水，并且在测试含氨化合物的实例中，加入不同的氨化合物(氨化合物和浓度参见表)。每个反应含有作为扩增底物的10ng人基因组DNA。以在95℃进行10分钟(该时间较QIAGEN QuantiTect SYBR Green实验规程中所述的时间短5分钟)酶激活步骤来开始PCR反应，随后进行40个如下循环：94℃，15秒；55℃，39秒和72℃，40秒。通过比较未添加氨化合物和添加了不同浓度的氨化合物的反应，可从三个重复反应中测定平均CT值(氨化合物和浓度参见图2)。
结果：在使用未修饰Taq DNA聚合酶时，添加氨化合物对酶活性没有影响(或者在较高浓度时起抑制作用)，但是在使用经化学修饰的酶如HotStarTaq DNA聚合酶时，含有氨化合物的反应表现出明显较高的酶活性。
实施例4
在不存在氯化铵(对照反应，0mM氯化铵)以及存在浓度递增的氯化铵(最终反应混合物中的浓度为10、20和30mM)的情况下，进行了含有经化学修饰的HotStarTaq DNA聚合酶的、循环时间显著缩短的快速PCR反应。每个PCR反应含有1.5单位HotStarTaq DNA聚合酶、10ng模板人或小鼠基因组DNA、每种dNTP各200μM、每个不同PCR分析的各个引物各0.5μM(分析A，引物A1：5’-GCT TGA GCA ACC TGG CTA AGA TAGAGG-3’(SEQ ID NO：7)，引物A2：5’-GAG TTA GCA GGA GGC TGG ATG CAGATG-3’(SEQ ID NO：8)；分析B，引物B1：5’-CCA CAA TGG ACA TCA CAC AAGTGA G-3’(SEQ ID NO：9)、引物B2：5’-GAT CTT TCT GCC CAG ATA CCA TTCG-3’(SEQ ID NO：10)；分析C，引物C1：5’-CCT TGC CTT AGA TGT GTC GGCA-3’(SEQ ID NO：11)、引物C2：5’-CCC AAA CCC AAC CCA TAC ACA C-3’(SEQID NO：12))以及PCR级水。以在95℃进行5分钟酶激活步骤来开始PCR反应，随后进行35个如下循环：96℃，5秒；60℃，5秒和68℃，30秒/kbPCR产物大小。在1％TAE琼脂糖凝胶上分析PCR产物。M：DNA分子大小标记(ladder)(图3)。
结果：与不含任何氨化合物的反应相比较，加入含量逐渐增加的氯化铵会引起经化学失活的酶的总体酶活性增加。
实施例5
为了证明氨化合物和氮杂五元环的组合物的协同累积效应，在存在20mM氯化铵、不存在三唑(对照反应0)和存在浓度递增的三唑(最终反应混合物浓度为100、200、300、400和500mM)的情况下，进行了含有经化学修饰的HotStarTaq DNA聚合酶、循环时间显著缩短的快速PCR反应。将实施例4所示的体系C选作模型体系。每个PCR反应含有1.5单位HotStarTaq DNA聚合酶、10 ng模板人基因组DNA、每种dNTP各200μM、每种引物各0.5μM，引物A：5’-CCT TGC CTT AGA TGT GTC GGC A-3’(SEQID NO：11)、引物B：5’-CCC AAA CCC AAC CCA TAC ACA C-3’(SEQ ID NO：12)和PCR级水。以在95℃进行5分钟酶激活步骤达来开始PCR反应，随后进行35个如下循环：96℃，5秒；60℃，5秒和68℃，45秒。在1％TAE琼脂糖凝胶上对来自两个重复反应的PCR产物进行分析。M：DNA分子大小标记。由于在PCR设置期间的操作错误，在200mM三唑存在下指示分析的反应未给出结果(图4)。
结果：与仅含20mM氯化铵、不含三唑的反应相比较，三唑的加入表现出对经化学修饰酶的酶活性具有明显益处。尽管在500mM的极高浓度时，三唑的作用开始变得不太显著，但是该活性依然高于未加入三唑的反应中的酶活性。该实施例表明氨化合物和氮杂五元环的组合物可协同增强经化学修饰酶的酶活性。
其它经测试但为表现出改进的化合物为C6H17N3O7(柠檬酸铵)、H9N2O4P(磷酸氢二铵)、C7H9NO2(苯甲酸铵)、(NH4)2CO3(碳酸铵)、(NH4)2SO4(硫酸铵)。
对于本领域技术人员显而易见的是，只要不背离本发明的范围和精神，可对本发明进行各种修改和变动。通过考虑本文所公开发明的说明书和实施本文公开的发明，本发明的其他实施方案对本领域技术人员来说是显而易见的。本说明书和实施例应仅看作示例性的，本发明真正的范围和精神在所附的权利要求书中说明。
序列表
<110>QIAGEN GmbH
DIRK LFFERT
RALF PEIST
PATRICK BAUMHOF
<120>热稳定可逆失活酶类再激活的增强
<130>17140.0010CN1
<140>Unassigned
<141>2007-05-22
<150>60/817,043
<151>2006-06-28
<150>60/852,804
<151>2006-10-19
<160>12
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述；注＝
合成构建体
<400>1
gtcaccttca ccgttccagt 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述；注＝
合成构建体
<400>2
ctcttccagc cttccttcct 20
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述；注＝
合成构建体
<400>3
cacacagcga tggcagctat gc 22
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述；注＝
合成构建体
<400>4
cccagtgatg ggccagctc 19
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述；注＝
合成构建体
<400>5
gtcaccttca ccgttccagt 20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述；注＝
合成构建体
<400>6
ctcttccagc cttccttcct 20
<210>7
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述；注＝
合成构建体
<400>7
gcttgagcaa cctggctaag atagagg 27
<210>8
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述；注＝
合成构建体
<400>8
gagttagcag gaggctggat gcagatg 27
<210>9
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述；注＝
合成构建体
<400>9
ccacaatgga catcacacaa gtgag 25
<210>10
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述；注＝
合成构建体
<400>10
gatctttctg cccagatacc attcg 25
<210>11
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述；注＝
合成构建体
<400>11
ccttgcctta gatgtgtcgg ca 22
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述；注＝
合成构建体
<400>12
cccaaaccca acccatacac ac 22
Claims (25)
1.一种使热稳定可逆失活酶的再激活增强的方法，包括：在氮杂五元环的存在下再激活至少一种热稳定可逆失活酶。
2.权利要求1的方法，其中所述氮杂五元环包括具有式1的含氮五元环化合物，
式1
其中每个X各自独立地为CH、CR或N；并且R为H，取代的或未取代的烷基、链烯基、炔基、烷氧基或芳基，羟基，氨基，硝基，羧酸，酯，磺酸，醚或卤素基团。
3.权利要求1的方法，其中所述氮杂五元环包括具有式2的含氮五元环化合物，
式2
其中每个X各自独立地为CH、CR、N、O或S；并且每个R各自独立地为H，取代的或未取代的烷基、链烯基、炔基、烷氧基或芳基，羟基，氨基，硝基，羧酸，酯，磺酸，醚或卤素基团。
4.权利要求3的方法，其中每个X各自独立地为任意组合的CH或N。
5.权利要求1的方法，其中所述氮杂五元环包括具有式3的含氮二环化合物，
式3
其中每个X各自独立地为CH、CR、N、O或S；并且每个R各自独立地为H，取代的或未取代的烷基、链烯基、炔基、烷氧基或芳基，羟基，氨基，硝基，羧酸，酯，磺酸，醚或卤素基团。
6.权利要求1的方法，其中还在铵盐的存在下进行再激活。
7.权利要求1的方法，其中所述氮杂五元环的浓度约2mM至约1M。
8.权利要求1的方法，其中所述氮杂五元环的浓度为0.5mM至约0.5M。
9.一种增强热稳定可逆失活酶再激活的方法，包括在具有式4的吡啶化合物的存在下再激活至少一种热稳定可逆失活酶，
式4
其中每个X各自独立地为CH、CR或N；并且R为羟基、氨基、巯基或氨基烷基基团。
10.权利要求9的方法，其中还在铵盐的存在下进行再激活。
11.权利要求9的方法，其中所述吡啶化合物的浓度为约2mM至约1M。
12.权利要求9的方法，其中所述吡啶化合物的浓度为约0.5mM至约0.5M。
13.一种增强热稳定可逆失活酶再激活的方法，包括：在包括具有式5的N-氢氧化物的化合物的存在下再激活至少一种热稳定可逆失活酶，
式5
其中每个R各自独立地为H，取代的或未取代的烷基、链烯基、炔基、烷氧基或芳基，或酰基或其衍生物。
14.权利要求13的方法，其中还在铵盐的存在下进行再激活。
15.权利要求13的方法，其中所述N-氢氧化物化合物的浓度为约2mM至约1M。
16.权利要求13的方法，其中所述N-氢氧化物化合物的浓度为约0.5mM至约0.5M。
17.一种增强热稳定可逆失活酶再激活的方法，包括：在包括具有式6的肼的化合物的存在下再激活至少一种热稳定可逆失活酶，
式6
其中每个R各自独立地为H，取代的或未取代的烷基、链烯基、炔基、烷氧基或芳基，或酰基或其衍生物。
18.权利要求17的方法，其中还在铵盐的存在下进行再激活。
19.权利要求17的方法，其中所述肼化合物的浓度为约2mM至约1M。
20.权利要求17的方法，其中所述肼化合物的浓度为约0.5mM至约0.5M。
21.一种增强热稳定可逆失活酶再激活的方法，包括：在包括铵盐的化合物的存在下再激活至少一种热稳定可逆失活酶。
22.权利要求21的方法，其中所述铵盐包括无机反荷离子、有机反荷离子、金属氧化物反荷离子或金属复合物反荷离子。
23.权利要求21的方法，其中所述铵盐的浓度为约2mM至约1M。
24.权利要求21的方法，其中所述铵盐的浓度为约0.5mM至约0.5M。
25.一种试剂盒，含有至少一种热稳定可逆失活酶和至少一种选自下列的化合物：具有式1、式2或式3的氮杂五元环、具有式4的吡啶、具有式5的N-氢氧化物或具有式6的肼，
其中每个X各自独立地为CH、CR、N、O或S；并且每个R各自独立地为H，取代的或未取代的烷基、链烯基、炔基、烷氧基或芳基，羟基，氨基，硝基，羧酸，酯，磺酸，醚或卤素基团。
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