JP3968606B2 - 超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＯＤ１株由来ＤＮＡポリメラーゼに特異的なモノクローナル抗体を利用した核酸増幅法 - Google Patents
超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＯＤ１株由来ＤＮＡポリメラーゼに特異的なモノクローナル抗体を利用した核酸増幅法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＯＤ１株由来ＤＮＡポリメラーゼに特異的なモノクローナル抗体、該抗体を利用したホットスタートＰＣＲ法ならびにその試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
１９８６年に開発されたＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法は、極めて微量の核酸を迅速かつ特異的に検出、定量できることから、現在、生命科学分野の研究や検査において必要不可欠な技術のひとつとなっている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このＰＣＲ法に問題点がないわけではない。特に、標的ではない核酸の非特異的な増幅がみられることがある。この非特異的な増幅の多くは、反応液を調製し、サーマル・サイクラーにセットした後、反応温度がアニーリング温度に達するまでにプライマーの３’末端の一部が、鋳型ＤＮＡにアニーリングし、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅がスタートしてしまうこと（ミスプライミング）が原因であると考えられている。
【０００４】
この非特異的な増幅の問題点を解決する方法として、ホットスタートＰＣＲ法が開発された。ホットスタートＰＣＲ法としては、ワックス（Ａｍｐｌｉ−ＷａｘTM ＰＣＲ Ｇｅｍ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）を用いる方法、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのモノクローナル抗体（ＴａｑＳｔａｒｔTM、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いる方法などが知られている (特開平6-209775号公報) 。
【０００５】
ワックスを用いる方法では、ワックスは室温では固形であるが、ＰＣＲ反応条件下では溶解して液状となるという性質を利用する。そこで、このワックスで固形の層を作り、下層にプライマーを含んだ液、上層に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含んだ液を入れることにより、両者を分離し、これにより、前述のミスプライミングを防止する。該方法では、１回目のＰＣＲサイクルに入り、温度が７０℃以上になると、ワックスは溶解するので、上層と下層が混ざりＤＮＡ増幅が始まる。
【０００６】
また、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのモノクローナル抗体を用いる場合は、モノクローナル抗体をＰＣＲ反応液に加えることにより、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの働きは抑えられ、前述のミスプライミングは防止される。１回目のＰＣＲサイクルに入り、温度が７０℃以上になった時点で、モノクローナル抗体は、不可逆的に変性し、ＤＮＡ増幅が始まる。
【０００７】
一方、ＰＣＲに用いられる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼについても、これまでに数多くの改良が行われている。ＰＣＲ法が開発された当初は、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼといったＰｏｌＩ型の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが多く用いられていた。
【０００８】
しかしながら、これらの酵素では、増幅の忠実性が悪い、長い標的核酸の増幅が難しいなどの問題点があり、最近では、ＤＮＡポリメラーゼ活性以外に、３’→５’エキソヌクレアーゼを有するα型の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＯＤ１株由来のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績社）やＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）などが、高い忠実性が必要な増幅に用いられている。また、ＰｏｌＩ型の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとα型の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを適当な割合で混合させた混合型の酵素が、長い標的核酸の増幅に用いられている。特にＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼは、高い正確性と伸長能力を合わせもつことにより、優れたＰＣＲ特性を示すことが実証されている。
しかしながら、これまでに、α型の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに対するモノクローナル抗体や、そのモノクローナル抗体を用いたＰＣＲ法に関しての報告は全くみられない。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼでマウスを免疫し、ハイブリドーマを得て、ＫＯＤ ＤＮＡポリラーゼに特異的なモノクローナル抗体を取得し、その中からＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを阻害するモノクローナル抗体を選択することができた。また、優れたＰＣＲ特性を示す酵素であるＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼに対してモノクローナル抗体を用いたホットスタートＰＣＲを行い、短い反応時間で目的断片の増幅効率を上昇させることができた。さらに、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの改変型であるＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼに対してもモノクローナル抗体を用いたホットスタートＰＣＲが可能であり、従来のＤＮＡポリメラーゼを用いたホットスタートＰＣＲより増幅効率が優れていることも見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は下記性質を有する超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＯＤ１株由来ＤＮＡポリメラーゼに特異的なモノクローナル抗体である。
ａ）６０℃より低い温度でＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害する能力を有し、かつ、６０℃よりも高い温度で不可逆的に不活性化されることによって、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ活性を回復させる。
ｂ）ＩｇＧ１クラスである抗体。
【００１１】
また、本発明は超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＯＤ１株由来ＤＮＡポリメラーゼおよび上記モノクローナル抗体を含む核酸増幅用試薬である。
【００１２】
また、本発明は少なくとも２種のプライマー、デオキシリボヌクレオシド−５’−リン酸、超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＯＤ１株由来ＤＮＡポリメラーゼおよび上記モノクローナル抗体を含む核酸増幅用試薬である。
【００１３】
さらに、本発明は標的核酸を含む試料に、少なくとも２種のプライマー、デオキシリボヌクレオシド−５’−リン酸、超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＯＤ１株由来ＤＮＡポリメラーゼおよび上記モノクローナル抗体を含む核酸増幅用試薬を室温にて混合し、得られた混合物を少なくとも６０℃に加熱して、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼに特異的なモノクローナル抗体を不活性化し、かつ、プライマー伸長生成物を形成させ、次いで、９０℃以上に加熱して、プライマー伸長生成物を分離させ、さらに、５０〜７０℃に冷却してプライマー伸長生成物を形成させ、前記加熱および冷却を繰り返すことを特徴とする標的核酸の増幅方法である。
【００１４】
【発明の実施態様】
本発明の超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＯＤ１株とは、鹿児島県小宝島の硫気抗から単離された直径約１μｍの球菌であり、複数の極鞭毛を有し、耐熱性を有するところから、パイロコッカス属細菌の１種であると考えられる。
【００１５】
本発明のＫＯＤ１株由来ＤＮＡポリメラーゼとは、超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＯＤ１から採取したＤＮＡポリメラーゼ、該酵素をコードする遺伝子を他の宿主細胞へ導入して得られた組換えＤＮＡポリメラーゼ、または、該遺伝子を改変したＤＮＡポリメラーゼを包含する。
【００１６】
超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＯＤ１から採取したＤＮＡポリメラーゼは下記理化学的性質を有する。
作用：ＤＮＡ合成活性と３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒である。
至適ｐＨ：６．５〜７．５（７５℃にて）
至適温度：７５℃
分子量：８８〜９０Ｋｄａ
該酵素は、ＤＮＡ合成の正確性が高く、伸長速度が早く、さらに耐熱性が高いことを特徴とする。
【００１７】
また、超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＯＤ１のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を他の宿主細胞へ導入し、培養して得られた組換えＤＮＡポリメラーゼは、特開平 7-298879 号公報に詳細に説明されている。
【００１８】
さらに、該遺伝子を改変したＤＮＡポリメラーゼとは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を低減させて酵素であり、例えば、以下の性質を有するものがある。
作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、５％以下である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒である。
至適ｐＨ：６．５〜７．５（７５℃にて）
至適温度：７５℃
分子量：８８〜９０Ｋｄａ
【００１９】
改変されたＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの製法については、特願平 8-198911 号明細書に詳細に記載されている。
【００２０】
改変されたＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼとしては、特開平 7-298879 号公報に記載される配列表・配列番号２に記載されるアミノ酸配列の第１４１、１４３、２１０および３１１番目のアミノ酸の少なくとも１つを他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有する酵素が例示される。具体的な例としては、配列番号２に記載のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの１４１番目のアスパラギン酸をアラニンに置換した改変型 ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＡ）、配列番号２に記載のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの１４３番目のグルタミン酸をアラニンに置換した改変型 ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＡ）、配列番号２に記載のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの１４１番目のアスパラギン酸と１４３番目のグルタミン酸をアラニンに置換した改変型 ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＥＡ）、配列番号２に記載のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの２１０番目のアスパラギンをアスパラギン酸に置換した改変型 ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＤ）、配列番号２に記載のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの３１１番目のチロシンをフェニルアラニンに置換した改変型 ＤＮＡポリメラーゼ（ＹＦ）などがある。これらの改変されたＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼのうち、ＤＡ、ＤＥＡ、ＤＥの３種類は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が検出されない。また、ＮＤまたはＹＦは、それぞれ改変前の酵素の約０．１％、０．０１％の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が検出される。
【００２１】
本発明のＫＯＤ１株由来ＤＮＡポリメラーゼとしては、上記該酵素をコードする遺伝子を他の宿主細胞へ導入して得られた組換えＤＮＡポリメラーゼと該遺伝子を改変したＤＮＡポリメラーゼ、例えば３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失させた変異型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの混合物であってもよい。
改変型ＤＮＡポリメラーゼと改変前のＤＮＡポリメラーゼの比が、１：００２〜０．０１であることが好ましい。
該混合物は、改変前のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ単独に比べ、長い標的核酸の増幅を行うことができる。また、単一酵素系で構成され、ＤＮＡ合成の正確性が高く、伸長速度が早く、さらに耐熱性が高いことを特徴とする。このような混合物としては、ＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）がある。
【００２２】
本発明のモノクロナール抗体は、上記ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ）に特異的に反応する抗体であり、下記特性を有する
ａ）６０℃より低い温度でＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害する能力を有し、かつ、６０℃よりも高い温度で不可逆的に不活性化されることによって、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ活性を回復させる。
ｂ）ＩｇＧ１クラスである抗体。
【００２３】
該モノクローナル抗体は、通常のモノクローナル抗体の調製方法により調製される。すなわち、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼで免疫したマウスの脾臓細胞とミエローマ細胞を細胞融合させ、ハイブリドーマを調製する。ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼに対する抗体産生の認められたコロニーについて、限界希釈法によりクローニングを行い、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を取得する。
【００２４】
次に得られたハイブリドーマ細胞系の中から、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害する働きをを有するモノクローナル抗体を産生する細胞系を選択する。
本発明では、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系として、３Ｇ８細胞系とβＧ１細胞系が選択されたが、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害するモノクローナル抗体であれば、これらに限定されるものではない。
なお、マウス−マウスハイブリドーマ３Ｇ８およびマウス−マウスハイブリドーマβＧ１は、生命工学工業技術研究所にそれぞれ寄託されている（ＦＥＲＭ ＢＰ−６０５６、６０５７）。
【００２５】
本発明のモノクローナル抗体は、改変前のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ法だけではなく、改変前のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼと該酵素をコードする遺伝子を改変したＤＮＡポリメラーゼ、例えば３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失させた変異型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼとの混合物、例えば、ＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）を用いたＰＣＲに対しても有効である。
【００２６】
本発明の核酸増幅用試薬は、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼおよび上記モノクローナル抗体を含む。また、一実施態様としては、少なくとも２種のプライマー、デオキシリボヌクレオシド−５’−リン酸、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼおよび上記モノクローナル抗体を含む。さらに、ＤＮＡポリメラーゼ活性が依存する試薬、例えばマンガン、マグネシウムなどの金属塩、緩衝剤などを含有していてもよい。
【００２７】
デオキシリボヌクレオシド−５’−リン酸とは、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰまたはｄＧＴＰである。また、類似体類、例えば、ｄＩＴＰまたは７−アザ−ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰなどを包含する。
【００２８】
ＰＣＲ法においては、少なくとも２種のプライマーとは増幅されるべき核酸配列に実質的に相補的なオリゴヌクレオチドであり、かつ、増幅されるべき核酸配列の両端を規定し、各プライマーから合成された伸長生成物がその相補体から分離された場合に、さらなる合成のための鋳型として機能するものである。一般的には、プライマーはヌクレオチド数が１２〜６０であるオリゴヌクレオチドである。これらのプライマーはＤＮＡ合成装置により合成されるか、または生物学的供給源から単離されるものである。
【００２９】
核酸増幅用試薬において、モノクローナル抗体とＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼのモル比は、約１：１〜約５００：１であることが望ましい。
モノクローナル抗体のモル比が、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼより少ないと、活性が阻害されず、プライマー２量体を形成する。
【００３０】
本発明の最も好ましい実施態様は、少なくとも２種のプライマー、デオキシリボヌクレオシド−５’−リン酸、上記該酵素をコードする遺伝子を他の宿主細胞へ導入して得られた組換えＤＮＡポリメラーゼと該遺伝子を改変したＤＮＡポリメラーゼ、例えば３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失させた変異型ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼの混合物および上記モノクローナル抗体を含む核酸増幅用試薬である。
【００３１】
本発明の標的核酸増幅方法とは、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼに特異的なモノクローナル抗体を利用したプライマーアニーリング時の活性を阻害する、いわゆるホットスタートＰＣＲであり、具体的には、標的核酸を含む試料に、少なくとも２種のプライマー、デオキシリボヌクレオシド−５’−リン酸、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼおよび本発明のモノクローナル抗体を含む核酸増幅用試薬を室温にて混合し、得られた混合物を少なくとも６０℃に加熱して、該モノクローナル抗体を不活性化し、かつ、プライマー伸長生成物を形成させる。
【００３２】
本発明のホットスタートＰＣＲとは、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼとモノクローナル抗体が、室温時には結合して、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼが不活性型となっているが、ＰＣＲ反応を開始した温度、例えば７５℃以上では、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼが活性型となり、通常のＤＮＡ合成反応がスタートし、モノクローナル抗体は変性して、不可逆的に不活性化される方法であり、加熱および冷却を繰り返すことにより、ＰＣＲ反応が進行する。
【００３３】
さらに、本発明では、標的核酸を含む試料に、少なくとも２種のプライマー、デオキシリボヌクレオシド−５’−リン酸、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼおよび本発明のモノクローナル抗体を含む核酸増幅用試薬を室温にて混合し、得られた混合物を少なくとも６０℃に加熱して、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼに特異的なモノクローナル抗体を不活性化し、かつ、プライマー伸長生成物を形成させ、次いで、９０℃以上に加熱して、プライマー伸長生成物を分離させ、さらに、５０〜７０℃に冷却して、伸長生成物を形成させる。前記加熱および冷却を繰り返すことにより標的核酸を指数的に増幅させることができる。
【００３４】
本発明の最も好ましい実施態様は、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を他の宿主細胞へ導入して得られた組換えＤＮＡポリメラーゼと該遺伝子を改変したＤＮＡポリメラーゼ、例えば３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失させた変異型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの混合物を使用する方法であり、該方法により、組換えＤＮＡポリメラーゼ単独に比べ、長い標的核酸の増幅を行うことができる。また、単一酵素系で構成され、ＤＮＡ合成の正確性が高く、伸長速度が早く、さらに耐熱性が高いとの特徴を有する。
【００３５】
本発明では、上記酵素混合物を使用することにより、１０ｋｂｐ以上の長さのＤＮＡを鋳型とした長鎖ＰＣＲにおいても、増幅効果の上昇が認められ得る。
【００３６】
本発明の核酸増幅法により、増幅された核酸は、通常の方法により、細胞もしくはウイルス、髪、体液または検出可能なＤＮＡまたはＲＮＡを含有する材料中の特定核酸を検出するか、または、遺伝子の配列決定を行うことができる。その用途は、遺伝子診断、未知の遺伝子研究、遺伝子鑑定など種々の範囲に広がるものである。
【００３７】
【実施例】
次に、本発明を実施例を用いて説明する。
実施例１ マウスハイブリドーマ細胞系の作成
ＢａｌＢ／ｃマウス（８週令のメス）の腹腔にＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの抗原調製物５０μｇを注射した。ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの抗原調製物は、大腸菌組換え体から調製したＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）、リン酸緩衝液、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔを混合して、エマルジョン化したものを用いた。２週間後と４週間後に、更に、それぞれ５０μｇの抗原調製物を注射し、追加免疫した。その２週間後に、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ１００μｇをさらに注射し、最終免疫した。
【００３８】
免疫したマウスを失血死させた後、マウス脾臓細胞をナイロンメッシュで濾過し、濾液を遠心分離（９００ｒｐｍ、５分）した。上澄みを除去後、Ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ溶液（１５５ｍＭ ＮＨ4 Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ3 、１ｍＭ ＮａＮ3 ）を０．５〜１．０ｍｌ加えた。直ちに氷浴上で混合した後、ＦＢＳ（牛胎児血清）を０．２〜０．３ｍｌ加えた。更に、セルグロッサーＨ溶液（住友製薬）を１５〜２０ｍｌ加え、該脾臓細胞を分散させて、再び遠心分離した。上澄みを除去後、再びセルグロッサーＨ溶液を１５〜２０ｍｌ加え、該脾臓細胞を分散させた。
【００３９】
ミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１、大日本製薬製）は、凍結細胞を解凍後、セルグロッサーＨ溶液（住友製薬製）１０ｍｌを加え、軽く混合後、遠心分離（１，０００ｒｐｍ、５分）した。沈降した細胞について、同じ操作を繰り返した。沈降した細胞について、セルグロッサーＨ溶液（住友製薬製）を加え、全量を１５ｍｌとした後、プラスチックシャーレにて、炭酸ガスインキュベーター（３７℃、５％ ＣＯ2）にて培養した。培養後、遠心分離（９００ｒｐｍ、５分）し、上澄みを除去後、セルグロッサーＨ溶液（住友製薬製）を１５〜２０ｍｌ加え、細胞を分散させた。
【００４０】
上記脾臓細胞およびミエローマ細胞の密度を細胞密度細胞計数系で測定後、ミエローマ細胞：脾臓細胞＝５：１となるように混合した後、遠心分離（９００ｒｐｍ、５分）した。上澄みを除去後、ポリエチレングリコール１５００溶液（ベーリンガーマンハイム社製）を０．６〜０．７ｍｌ加え、軽く撹拌した。手で温めながら１、２、４分後、セルグロッサーＨ溶液（住友製薬製）を２ｍｌずつ加えた。更に、ＦＢＳ（牛胎児血清）を０．６ｍｌ加えてから、遠心分離（９００ｒｐｍ、５分）後、ＨＡＴ培地を４０〜５０ｍｌ加えた。緩やかに撹拌後、９６穴のマイクロカルチャープレートにパスツールピペットを用いて２滴ずつ加え、更に、１滴ずつＨＡＴ培地を加えた。
【００４１】
コロニーの生育のみられたウェルを、ＥＬＩＳＡ法により検定したところ、複数の陽性のウェルが見られた。陽性のウェルのコロニーについて、ＨＡＴ培地に交換した後、限界希釈法によりクローニングを行った。すなわち、９６穴マイクロカルチャープレートに、１ウェル当たり平均１細胞以下になるように希釈して培養を行った。この時、細胞増殖を補助するために、フィーダー細胞として、Ｂａｌｂ／Ｃマウス腹腔由来マクロファージを使用した。その結果、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼのモノクローナル抗体を産生する１５種類のハイブリドーマ細胞系（セルライン）が得られた。
【００４２】
実施例２ ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ活性阻害能の検討
得られた１５種類のハイブリドーマ細胞系の生産するモノクローナル抗体について、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼに対する活性阻害能を調べた。すなわち、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）１ユニットに対して、１５種類のモノクローナル抗体をそれぞれモル比が１：５０から１：５００の範囲で室温で１０分間混合した。この混合液を反応液（１２ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、１０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ2 、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．００１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＭｇＣl 2 、１２μｇの活性化サケ精子ＤＮＡ）、０．１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びトリチウムラベルされたｄＣＴＰ（２００ｎＣｉ／ｎｍｏｌ）に加えて、４２℃で２時間３０分間インキュベートした後、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定した。
【００４３】
ＤＮＡポリメラーゼ活性の測定は、トリチウムでラベルされたｄＣＴＰの取り込みを液体シンチレーションカウンターで測定することにより行った。その結果を図１にまとめた。図１から明らかなように、１５種類のモノクローナル抗体の内で、３Ｇ８細胞系（ＦＥＲＭ ＢＰ−６０５６）およびβＧ１細胞系（ＦＥＲＭ ＢＰ−６０５７）の生産するモノクローナル抗体３Ｇ８およびβＧ１が、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ活性を強く阻害した。
【００４４】
３Ｇ８細胞系およびβＧ１細胞系の産生するモノクローナル抗体３Ｇ８およびβＧ１について、アイソタイプを検討したところ、両者ともＩｇＧ１タイプであることが分かった。
【００４５】
実施例３ ＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ法でのモノクローナル抗体の添加効果
モノクローナル抗体βＧ１および３Ｇ８をＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）と混合し、ＰＣＲ法での添加効果を確認した。
ＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼに添付された１０×反応緩衝液１０μｌ、２ｍＭ ｄＮＴＰ１０μｌ、２０ピコモルの配列表１、２に記載のプライマー１μｌ、ヒト・プラセンタｃＤＮＡ（クローンテック社製）１ｎｇ、ヒト・ゲノムＤＮＡ１００ｎｇをＰＣＲ反応用チューブに加え、さらに、滅菌蒸留水を加えて９８μｌにした。これに、ＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡ ポリメラーゼ２．５ユニットと２μｇのモノクローナル抗体３Ｇ８またはβＧ１をそれぞれ、室温にて１０分間混合したものを加えて、ＰＣＲを行った。
【００４６】
サーマルサイクラーはパーキンエルマー社製のモデルＰＪ２０００を用いた。また、ＰＣＲ反応条件は９４℃、１５秒間→６１℃、３０秒間→７４℃、３０秒間を３５サイクル繰り返した。
【００４７】
比較として、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑポリメラーゼとＴａｑ抗体（Ｔａｑスタート、クローンテック社製）を混合したもの、ＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）とＢＳＡ（牛血清アルブミン）を混合したもの、および抗体を用いず、ＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼのみで、同様にしてＰＣＲを行った。
ただし、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの反応組成は、その使用説明書（クローンテック社）に従った。また、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのサイクル条件は、上記条件の７４℃を７２℃に代えて行った。その結果を図２に示す。
【００４８】
図２から明らかなように、ＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）とモノクローナル抗体３Ｇ８及びβＧ１を混合して、ＰＣＲを行った場合、他のモノクロナール抗体を使用する条件よりも、明らかに、目的とする１．３ｋｂのターゲットの良好な増幅が確認できた。
【００４９】
実施例４ ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲでのモノクローナル抗体の添加効果
モノクローナル抗体３Ｇ８をＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）と混合し、ＰＣＲでの添加効果を確認した。
ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼに添付された１０×反応緩衝液１０μｌ、２ｍＭｄＮＴＰ１０μｌ、２０ピコモルの配列表３、４に記載のプライマー１μｌ、ヒト・ゲノムＤＮＡ１００ｎｇをＰＣＲ反応用チューブに加え、さらに滅菌蒸留水を加えて９８μｌにした。これにＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニットと２μｇのモノクローナル抗体３Ｇ８を室温で１０分混合したものをくわえて、ＰＣＲを行った。
【００５０】
サーマルサイクラーはパーキンエルマー社製のモデルＰＪ２０００を用いた。また、反応条件は９５℃で５秒間処理した後、５５℃で３０秒→７４℃で３０秒処理し、さらに９５℃で１５秒間処理した後、５５℃、３０秒間→７４℃、３０秒間→９５℃、１５秒間を３５サイクル繰り返した。
【００５１】
比較として、モノクローナル抗体を使用せず、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）を用いた場合、また、両者を使用しないで同様にしてＰＣＲを行った。その結果を図３に示す。
【００５２】
ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼとモノクローナル抗体３Ｇ８を混合して、ＰＣＲを行った場合、明らかに、目的とする５５５ｂｐのターゲットの良好な増幅が確認できた。
【００５３】
【発明の効果】
本発明のモノクローナル抗体を利用して、超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＫＯＤ１株由来ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ホットスタートＰＣＲを行うことにより、効率的に核酸を増幅することが可能となる。また、非特異的副産物やプライマー２量体等の増幅を抑えることができる。さらには、長鎖核酸（＞１０ｋｂ）を増幅することが可能となる。
【００５４】
【配列表】
【００５５】
【００５６】
【００５７】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ハイブリドーマ細胞系１５種類の生産するモノクローナル抗体について、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼに対する活性阻害能を調べた結果を示す図である。
【図２】 モノクローナル抗体βＧ１および３Ｇ８をＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）と混合したＰＣＲ法での添加効果を示す図面に代わる電気泳動写真である。
【図３】 モノクローナル抗体３Ｇ８をＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）と混合したＰＣＲ法での添加効果を示す図面に代わる電気泳動写真である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＯＤ１株由来ＤＮＡポリメラーゼに特異的なモノクローナル抗体、該抗体を利用したホットスタートＰＣＲ法ならびにその試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
１９８６年に開発されたＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法は、極めて微量の核酸を迅速かつ特異的に検出、定量できることから、現在、生命科学分野の研究や検査において必要不可欠な技術のひとつとなっている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このＰＣＲ法に問題点がないわけではない。特に、標的ではない核酸の非特異的な増幅がみられることがある。この非特異的な増幅の多くは、反応液を調製し、サーマル・サイクラーにセットした後、反応温度がアニーリング温度に達するまでにプライマーの３’末端の一部が、鋳型ＤＮＡにアニーリングし、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅がスタートしてしまうこと（ミスプライミング）が原因であると考えられている。
【０００４】
この非特異的な増幅の問題点を解決する方法として、ホットスタートＰＣＲ法が開発された。ホットスタートＰＣＲ法としては、ワックス（Ａｍｐｌｉ−ＷａｘTM ＰＣＲ Ｇｅｍ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）を用いる方法、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのモノクローナル抗体（ＴａｑＳｔａｒｔTM、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いる方法などが知られている (特開平6-209775号公報) 。
【０００５】
ワックスを用いる方法では、ワックスは室温では固形であるが、ＰＣＲ反応条件下では溶解して液状となるという性質を利用する。そこで、このワックスで固形の層を作り、下層にプライマーを含んだ液、上層に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含んだ液を入れることにより、両者を分離し、これにより、前述のミスプライミングを防止する。該方法では、１回目のＰＣＲサイクルに入り、温度が７０℃以上になると、ワックスは溶解するので、上層と下層が混ざりＤＮＡ増幅が始まる。
【０００６】
また、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのモノクローナル抗体を用いる場合は、モノクローナル抗体をＰＣＲ反応液に加えることにより、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの働きは抑えられ、前述のミスプライミングは防止される。１回目のＰＣＲサイクルに入り、温度が７０℃以上になった時点で、モノクローナル抗体は、不可逆的に変性し、ＤＮＡ増幅が始まる。
【０００７】
一方、ＰＣＲに用いられる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼについても、これまでに数多くの改良が行われている。ＰＣＲ法が開発された当初は、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼといったＰｏｌＩ型の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが多く用いられていた。
【０００８】
しかしながら、これらの酵素では、増幅の忠実性が悪い、長い標的核酸の増幅が難しいなどの問題点があり、最近では、ＤＮＡポリメラーゼ活性以外に、３’→５’エキソヌクレアーゼを有するα型の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＯＤ１株由来のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績社）やＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）などが、高い忠実性が必要な増幅に用いられている。また、ＰｏｌＩ型の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとα型の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを適当な割合で混合させた混合型の酵素が、長い標的核酸の増幅に用いられている。特にＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼは、高い正確性と伸長能力を合わせもつことにより、優れたＰＣＲ特性を示すことが実証されている。
しかしながら、これまでに、α型の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに対するモノクローナル抗体や、そのモノクローナル抗体を用いたＰＣＲ法に関しての報告は全くみられない。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼでマウスを免疫し、ハイブリドーマを得て、ＫＯＤ ＤＮＡポリラーゼに特異的なモノクローナル抗体を取得し、その中からＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを阻害するモノクローナル抗体を選択することができた。また、優れたＰＣＲ特性を示す酵素であるＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼに対してモノクローナル抗体を用いたホットスタートＰＣＲを行い、短い反応時間で目的断片の増幅効率を上昇させることができた。さらに、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの改変型であるＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼに対してもモノクローナル抗体を用いたホットスタートＰＣＲが可能であり、従来のＤＮＡポリメラーゼを用いたホットスタートＰＣＲより増幅効率が優れていることも見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は下記性質を有する超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＯＤ１株由来ＤＮＡポリメラーゼに特異的なモノクローナル抗体である。
ａ）６０℃より低い温度でＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害する能力を有し、かつ、６０℃よりも高い温度で不可逆的に不活性化されることによって、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ活性を回復させる。
ｂ）ＩｇＧ１クラスである抗体。
【００１１】
また、本発明は超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＯＤ１株由来ＤＮＡポリメラーゼおよび上記モノクローナル抗体を含む核酸増幅用試薬である。
【００１２】
また、本発明は少なくとも２種のプライマー、デオキシリボヌクレオシド−５’−リン酸、超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＯＤ１株由来ＤＮＡポリメラーゼおよび上記モノクローナル抗体を含む核酸増幅用試薬である。
【００１３】
さらに、本発明は標的核酸を含む試料に、少なくとも２種のプライマー、デオキシリボヌクレオシド−５’−リン酸、超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＯＤ１株由来ＤＮＡポリメラーゼおよび上記モノクローナル抗体を含む核酸増幅用試薬を室温にて混合し、得られた混合物を少なくとも６０℃に加熱して、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼに特異的なモノクローナル抗体を不活性化し、かつ、プライマー伸長生成物を形成させ、次いで、９０℃以上に加熱して、プライマー伸長生成物を分離させ、さらに、５０〜７０℃に冷却してプライマー伸長生成物を形成させ、前記加熱および冷却を繰り返すことを特徴とする標的核酸の増幅方法である。
【００１４】
【発明の実施態様】
本発明の超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＯＤ１株とは、鹿児島県小宝島の硫気抗から単離された直径約１μｍの球菌であり、複数の極鞭毛を有し、耐熱性を有するところから、パイロコッカス属細菌の１種であると考えられる。
【００１５】
本発明のＫＯＤ１株由来ＤＮＡポリメラーゼとは、超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＯＤ１から採取したＤＮＡポリメラーゼ、該酵素をコードする遺伝子を他の宿主細胞へ導入して得られた組換えＤＮＡポリメラーゼ、または、該遺伝子を改変したＤＮＡポリメラーゼを包含する。
【００１６】
超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＯＤ１から採取したＤＮＡポリメラーゼは下記理化学的性質を有する。
作用：ＤＮＡ合成活性と３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒である。
至適ｐＨ：６．５〜７．５（７５℃にて）
至適温度：７５℃
分子量：８８〜９０Ｋｄａ
該酵素は、ＤＮＡ合成の正確性が高く、伸長速度が早く、さらに耐熱性が高いことを特徴とする。
【００１７】
また、超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＯＤ１のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を他の宿主細胞へ導入し、培養して得られた組換えＤＮＡポリメラーゼは、特開平 7-298879 号公報に詳細に説明されている。
【００１８】
さらに、該遺伝子を改変したＤＮＡポリメラーゼとは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を低減させて酵素であり、例えば、以下の性質を有するものがある。
作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、５％以下である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒である。
至適ｐＨ：６．５〜７．５（７５℃にて）
至適温度：７５℃
分子量：８８〜９０Ｋｄａ
【００１９】
改変されたＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの製法については、特願平 8-198911 号明細書に詳細に記載されている。
【００２０】
改変されたＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼとしては、特開平 7-298879 号公報に記載される配列表・配列番号２に記載されるアミノ酸配列の第１４１、１４３、２１０および３１１番目のアミノ酸の少なくとも１つを他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有する酵素が例示される。具体的な例としては、配列番号２に記載のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの１４１番目のアスパラギン酸をアラニンに置換した改変型 ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＡ）、配列番号２に記載のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの１４３番目のグルタミン酸をアラニンに置換した改変型 ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＡ）、配列番号２に記載のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの１４１番目のアスパラギン酸と１４３番目のグルタミン酸をアラニンに置換した改変型 ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＥＡ）、配列番号２に記載のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの２１０番目のアスパラギンをアスパラギン酸に置換した改変型 ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＤ）、配列番号２に記載のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの３１１番目のチロシンをフェニルアラニンに置換した改変型 ＤＮＡポリメラーゼ（ＹＦ）などがある。これらの改変されたＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼのうち、ＤＡ、ＤＥＡ、ＤＥの３種類は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が検出されない。また、ＮＤまたはＹＦは、それぞれ改変前の酵素の約０．１％、０．０１％の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が検出される。
【００２１】
本発明のＫＯＤ１株由来ＤＮＡポリメラーゼとしては、上記該酵素をコードする遺伝子を他の宿主細胞へ導入して得られた組換えＤＮＡポリメラーゼと該遺伝子を改変したＤＮＡポリメラーゼ、例えば３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失させた変異型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの混合物であってもよい。
改変型ＤＮＡポリメラーゼと改変前のＤＮＡポリメラーゼの比が、１：００２〜０．０１であることが好ましい。
該混合物は、改変前のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ単独に比べ、長い標的核酸の増幅を行うことができる。また、単一酵素系で構成され、ＤＮＡ合成の正確性が高く、伸長速度が早く、さらに耐熱性が高いことを特徴とする。このような混合物としては、ＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）がある。
【００２２】
本発明のモノクロナール抗体は、上記ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ）に特異的に反応する抗体であり、下記特性を有する
ａ）６０℃より低い温度でＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害する能力を有し、かつ、６０℃よりも高い温度で不可逆的に不活性化されることによって、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ活性を回復させる。
ｂ）ＩｇＧ１クラスである抗体。
【００２３】
該モノクローナル抗体は、通常のモノクローナル抗体の調製方法により調製される。すなわち、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼで免疫したマウスの脾臓細胞とミエローマ細胞を細胞融合させ、ハイブリドーマを調製する。ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼに対する抗体産生の認められたコロニーについて、限界希釈法によりクローニングを行い、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を取得する。
【００２４】
次に得られたハイブリドーマ細胞系の中から、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害する働きをを有するモノクローナル抗体を産生する細胞系を選択する。
本発明では、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系として、３Ｇ８細胞系とβＧ１細胞系が選択されたが、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害するモノクローナル抗体であれば、これらに限定されるものではない。
なお、マウス−マウスハイブリドーマ３Ｇ８およびマウス−マウスハイブリドーマβＧ１は、生命工学工業技術研究所にそれぞれ寄託されている（ＦＥＲＭ ＢＰ−６０５６、６０５７）。
【００２５】
本発明のモノクローナル抗体は、改変前のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ法だけではなく、改変前のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼと該酵素をコードする遺伝子を改変したＤＮＡポリメラーゼ、例えば３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失させた変異型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼとの混合物、例えば、ＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）を用いたＰＣＲに対しても有効である。
【００２６】
本発明の核酸増幅用試薬は、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼおよび上記モノクローナル抗体を含む。また、一実施態様としては、少なくとも２種のプライマー、デオキシリボヌクレオシド−５’−リン酸、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼおよび上記モノクローナル抗体を含む。さらに、ＤＮＡポリメラーゼ活性が依存する試薬、例えばマンガン、マグネシウムなどの金属塩、緩衝剤などを含有していてもよい。
【００２７】
デオキシリボヌクレオシド−５’−リン酸とは、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰまたはｄＧＴＰである。また、類似体類、例えば、ｄＩＴＰまたは７−アザ−ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰなどを包含する。
【００２８】
ＰＣＲ法においては、少なくとも２種のプライマーとは増幅されるべき核酸配列に実質的に相補的なオリゴヌクレオチドであり、かつ、増幅されるべき核酸配列の両端を規定し、各プライマーから合成された伸長生成物がその相補体から分離された場合に、さらなる合成のための鋳型として機能するものである。一般的には、プライマーはヌクレオチド数が１２〜６０であるオリゴヌクレオチドである。これらのプライマーはＤＮＡ合成装置により合成されるか、または生物学的供給源から単離されるものである。
【００２９】
核酸増幅用試薬において、モノクローナル抗体とＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼのモル比は、約１：１〜約５００：１であることが望ましい。
モノクローナル抗体のモル比が、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼより少ないと、活性が阻害されず、プライマー２量体を形成する。
【００３０】
本発明の最も好ましい実施態様は、少なくとも２種のプライマー、デオキシリボヌクレオシド−５’−リン酸、上記該酵素をコードする遺伝子を他の宿主細胞へ導入して得られた組換えＤＮＡポリメラーゼと該遺伝子を改変したＤＮＡポリメラーゼ、例えば３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失させた変異型ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼの混合物および上記モノクローナル抗体を含む核酸増幅用試薬である。
【００３１】
本発明の標的核酸増幅方法とは、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼに特異的なモノクローナル抗体を利用したプライマーアニーリング時の活性を阻害する、いわゆるホットスタートＰＣＲであり、具体的には、標的核酸を含む試料に、少なくとも２種のプライマー、デオキシリボヌクレオシド−５’−リン酸、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼおよび本発明のモノクローナル抗体を含む核酸増幅用試薬を室温にて混合し、得られた混合物を少なくとも６０℃に加熱して、該モノクローナル抗体を不活性化し、かつ、プライマー伸長生成物を形成させる。
【００３２】
本発明のホットスタートＰＣＲとは、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼとモノクローナル抗体が、室温時には結合して、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼが不活性型となっているが、ＰＣＲ反応を開始した温度、例えば７５℃以上では、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼが活性型となり、通常のＤＮＡ合成反応がスタートし、モノクローナル抗体は変性して、不可逆的に不活性化される方法であり、加熱および冷却を繰り返すことにより、ＰＣＲ反応が進行する。
【００３３】
さらに、本発明では、標的核酸を含む試料に、少なくとも２種のプライマー、デオキシリボヌクレオシド−５’−リン酸、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼおよび本発明のモノクローナル抗体を含む核酸増幅用試薬を室温にて混合し、得られた混合物を少なくとも６０℃に加熱して、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼに特異的なモノクローナル抗体を不活性化し、かつ、プライマー伸長生成物を形成させ、次いで、９０℃以上に加熱して、プライマー伸長生成物を分離させ、さらに、５０〜７０℃に冷却して、伸長生成物を形成させる。前記加熱および冷却を繰り返すことにより標的核酸を指数的に増幅させることができる。
【００３４】
本発明の最も好ましい実施態様は、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を他の宿主細胞へ導入して得られた組換えＤＮＡポリメラーゼと該遺伝子を改変したＤＮＡポリメラーゼ、例えば３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失させた変異型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの混合物を使用する方法であり、該方法により、組換えＤＮＡポリメラーゼ単独に比べ、長い標的核酸の増幅を行うことができる。また、単一酵素系で構成され、ＤＮＡ合成の正確性が高く、伸長速度が早く、さらに耐熱性が高いとの特徴を有する。
【００３５】
本発明では、上記酵素混合物を使用することにより、１０ｋｂｐ以上の長さのＤＮＡを鋳型とした長鎖ＰＣＲにおいても、増幅効果の上昇が認められ得る。
【００３６】
本発明の核酸増幅法により、増幅された核酸は、通常の方法により、細胞もしくはウイルス、髪、体液または検出可能なＤＮＡまたはＲＮＡを含有する材料中の特定核酸を検出するか、または、遺伝子の配列決定を行うことができる。その用途は、遺伝子診断、未知の遺伝子研究、遺伝子鑑定など種々の範囲に広がるものである。
【００３７】
【実施例】
次に、本発明を実施例を用いて説明する。
実施例１ マウスハイブリドーマ細胞系の作成
ＢａｌＢ／ｃマウス（８週令のメス）の腹腔にＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの抗原調製物５０μｇを注射した。ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの抗原調製物は、大腸菌組換え体から調製したＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）、リン酸緩衝液、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔを混合して、エマルジョン化したものを用いた。２週間後と４週間後に、更に、それぞれ５０μｇの抗原調製物を注射し、追加免疫した。その２週間後に、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ１００μｇをさらに注射し、最終免疫した。
【００３８】
免疫したマウスを失血死させた後、マウス脾臓細胞をナイロンメッシュで濾過し、濾液を遠心分離（９００ｒｐｍ、５分）した。上澄みを除去後、Ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ溶液（１５５ｍＭ ＮＨ4 Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ3 、１ｍＭ ＮａＮ3 ）を０．５〜１．０ｍｌ加えた。直ちに氷浴上で混合した後、ＦＢＳ（牛胎児血清）を０．２〜０．３ｍｌ加えた。更に、セルグロッサーＨ溶液（住友製薬）を１５〜２０ｍｌ加え、該脾臓細胞を分散させて、再び遠心分離した。上澄みを除去後、再びセルグロッサーＨ溶液を１５〜２０ｍｌ加え、該脾臓細胞を分散させた。
【００３９】
ミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１、大日本製薬製）は、凍結細胞を解凍後、セルグロッサーＨ溶液（住友製薬製）１０ｍｌを加え、軽く混合後、遠心分離（１，０００ｒｐｍ、５分）した。沈降した細胞について、同じ操作を繰り返した。沈降した細胞について、セルグロッサーＨ溶液（住友製薬製）を加え、全量を１５ｍｌとした後、プラスチックシャーレにて、炭酸ガスインキュベーター（３７℃、５％ ＣＯ2）にて培養した。培養後、遠心分離（９００ｒｐｍ、５分）し、上澄みを除去後、セルグロッサーＨ溶液（住友製薬製）を１５〜２０ｍｌ加え、細胞を分散させた。
【００４０】
上記脾臓細胞およびミエローマ細胞の密度を細胞密度細胞計数系で測定後、ミエローマ細胞：脾臓細胞＝５：１となるように混合した後、遠心分離（９００ｒｐｍ、５分）した。上澄みを除去後、ポリエチレングリコール１５００溶液（ベーリンガーマンハイム社製）を０．６〜０．７ｍｌ加え、軽く撹拌した。手で温めながら１、２、４分後、セルグロッサーＨ溶液（住友製薬製）を２ｍｌずつ加えた。更に、ＦＢＳ（牛胎児血清）を０．６ｍｌ加えてから、遠心分離（９００ｒｐｍ、５分）後、ＨＡＴ培地を４０〜５０ｍｌ加えた。緩やかに撹拌後、９６穴のマイクロカルチャープレートにパスツールピペットを用いて２滴ずつ加え、更に、１滴ずつＨＡＴ培地を加えた。
【００４１】
コロニーの生育のみられたウェルを、ＥＬＩＳＡ法により検定したところ、複数の陽性のウェルが見られた。陽性のウェルのコロニーについて、ＨＡＴ培地に交換した後、限界希釈法によりクローニングを行った。すなわち、９６穴マイクロカルチャープレートに、１ウェル当たり平均１細胞以下になるように希釈して培養を行った。この時、細胞増殖を補助するために、フィーダー細胞として、Ｂａｌｂ／Ｃマウス腹腔由来マクロファージを使用した。その結果、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼのモノクローナル抗体を産生する１５種類のハイブリドーマ細胞系（セルライン）が得られた。
【００４２】
実施例２ ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ活性阻害能の検討
得られた１５種類のハイブリドーマ細胞系の生産するモノクローナル抗体について、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼに対する活性阻害能を調べた。すなわち、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）１ユニットに対して、１５種類のモノクローナル抗体をそれぞれモル比が１：５０から１：５００の範囲で室温で１０分間混合した。この混合液を反応液（１２ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、１０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ2 、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．００１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＭｇＣl 2 、１２μｇの活性化サケ精子ＤＮＡ）、０．１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びトリチウムラベルされたｄＣＴＰ（２００ｎＣｉ／ｎｍｏｌ）に加えて、４２℃で２時間３０分間インキュベートした後、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定した。
【００４３】
ＤＮＡポリメラーゼ活性の測定は、トリチウムでラベルされたｄＣＴＰの取り込みを液体シンチレーションカウンターで測定することにより行った。その結果を図１にまとめた。図１から明らかなように、１５種類のモノクローナル抗体の内で、３Ｇ８細胞系（ＦＥＲＭ ＢＰ−６０５６）およびβＧ１細胞系（ＦＥＲＭ ＢＰ−６０５７）の生産するモノクローナル抗体３Ｇ８およびβＧ１が、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ活性を強く阻害した。
【００４４】
３Ｇ８細胞系およびβＧ１細胞系の産生するモノクローナル抗体３Ｇ８およびβＧ１について、アイソタイプを検討したところ、両者ともＩｇＧ１タイプであることが分かった。
【００４５】
実施例３ ＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ法でのモノクローナル抗体の添加効果
モノクローナル抗体βＧ１および３Ｇ８をＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）と混合し、ＰＣＲ法での添加効果を確認した。
ＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼに添付された１０×反応緩衝液１０μｌ、２ｍＭ ｄＮＴＰ１０μｌ、２０ピコモルの配列表１、２に記載のプライマー１μｌ、ヒト・プラセンタｃＤＮＡ（クローンテック社製）１ｎｇ、ヒト・ゲノムＤＮＡ１００ｎｇをＰＣＲ反応用チューブに加え、さらに、滅菌蒸留水を加えて９８μｌにした。これに、ＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡ ポリメラーゼ２．５ユニットと２μｇのモノクローナル抗体３Ｇ８またはβＧ１をそれぞれ、室温にて１０分間混合したものを加えて、ＰＣＲを行った。
【００４６】
サーマルサイクラーはパーキンエルマー社製のモデルＰＪ２０００を用いた。また、ＰＣＲ反応条件は９４℃、１５秒間→６１℃、３０秒間→７４℃、３０秒間を３５サイクル繰り返した。
【００４７】
比較として、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑポリメラーゼとＴａｑ抗体（Ｔａｑスタート、クローンテック社製）を混合したもの、ＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）とＢＳＡ（牛血清アルブミン）を混合したもの、および抗体を用いず、ＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼのみで、同様にしてＰＣＲを行った。
ただし、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの反応組成は、その使用説明書（クローンテック社）に従った。また、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのサイクル条件は、上記条件の７４℃を７２℃に代えて行った。その結果を図２に示す。
【００４８】
図２から明らかなように、ＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）とモノクローナル抗体３Ｇ８及びβＧ１を混合して、ＰＣＲを行った場合、他のモノクロナール抗体を使用する条件よりも、明らかに、目的とする１．３ｋｂのターゲットの良好な増幅が確認できた。
【００４９】
実施例４ ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲでのモノクローナル抗体の添加効果
モノクローナル抗体３Ｇ８をＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）と混合し、ＰＣＲでの添加効果を確認した。
ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼに添付された１０×反応緩衝液１０μｌ、２ｍＭｄＮＴＰ１０μｌ、２０ピコモルの配列表３、４に記載のプライマー１μｌ、ヒト・ゲノムＤＮＡ１００ｎｇをＰＣＲ反応用チューブに加え、さらに滅菌蒸留水を加えて９８μｌにした。これにＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニットと２μｇのモノクローナル抗体３Ｇ８を室温で１０分混合したものをくわえて、ＰＣＲを行った。
【００５０】
サーマルサイクラーはパーキンエルマー社製のモデルＰＪ２０００を用いた。また、反応条件は９５℃で５秒間処理した後、５５℃で３０秒→７４℃で３０秒処理し、さらに９５℃で１５秒間処理した後、５５℃、３０秒間→７４℃、３０秒間→９５℃、１５秒間を３５サイクル繰り返した。
【００５１】
比較として、モノクローナル抗体を使用せず、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）を用いた場合、また、両者を使用しないで同様にしてＰＣＲを行った。その結果を図３に示す。
【００５２】
ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼとモノクローナル抗体３Ｇ８を混合して、ＰＣＲを行った場合、明らかに、目的とする５５５ｂｐのターゲットの良好な増幅が確認できた。
【００５３】
【発明の効果】
本発明のモノクローナル抗体を利用して、超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＫＯＤ１株由来ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ホットスタートＰＣＲを行うことにより、効率的に核酸を増幅することが可能となる。また、非特異的副産物やプライマー２量体等の増幅を抑えることができる。さらには、長鎖核酸（＞１０ｋｂ）を増幅することが可能となる。
【００５４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ハイブリドーマ細胞系１５種類の生産するモノクローナル抗体について、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼに対する活性阻害能を調べた結果を示す図である。
【図２】 モノクローナル抗体βＧ１および３Ｇ８をＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）と混合したＰＣＲ法での添加効果を示す図面に代わる電気泳動写真である。
【図３】 モノクローナル抗体３Ｇ８をＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）と混合したＰＣＲ法での添加効果を示す図面に代わる電気泳動写真である。
Claims (7)
- 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現在は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）にＦＥＲＭ ＢＰ−６０５６で寄託されているハイブリドーマ細胞系３Ｇ８または通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現：独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）にＦＥＲＭ ＢＰ−６０５７で寄託されているハイブリドーマ細胞系βＧ１により分泌されるモノクローナル抗体であって、下記性質を有する超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＫＯＤ１株由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ）に特異的なモノクローナル抗体。
ａ）６０℃より低い温度でＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害する能力を有し、かつ、６０℃よりも高い温度で不可逆的に不活性化されることによって、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ活性を回復させる。
ｂ）ＩｇＧ１クラスである抗体。 - 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現在は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）にＦＥＲＭ ＢＰ−６０５６で寄託されているハイブリドーマ細胞系３Ｇ８により分泌されるモノクローナル抗体であって、下記性質を有する超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＫＯＤ１株由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ）に特異的なモノクローナル抗体。
ａ）６０℃より低い温度でＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害する能力を有し、かつ、６０℃よりも高い温度で不可逆的に不活性化されることによって、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ活性を回復させる。
ｂ）ＩｇＧ１クラスである抗体。 - 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現：独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）にＦＥＲＭ ＢＰ−６０５７で寄託されているハイブリドーマ細胞系βＧ１により分泌されるモノクローナル抗体であって、下記性質を有する超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＫＯＤ１株由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ）に特異的なモノクローナル抗体。
ａ）６０℃より低い温度でＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害する能力を有し、かつ、６０℃よりも高い温度で不可逆的に不活性化されることによって、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ活性を回復させる。
ｂ）ＩｇＧ１クラスである抗体。 - 超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＫＯＤ１株由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ）および請求項１ないし３のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む核酸増幅用試薬。
- 少なくとも２種のプライマー、デオキシリボヌクレオシド−５’−リン酸、超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＫＯＤ１株由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ）および請求項１ないし３のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む核酸増幅用試薬。
- ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼが超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＯＤ１から採取したＤＮＡポリメラーゼ、該酵素をコードする遺伝子を他の宿主細胞へ導入して得られた組換えＤＮＡポリメラーゼ、または、該遺伝子を改変したＤＮＡポリメラーゼである請求項４または５記載の核酸増幅用試薬。
- ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼが超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＯＤ１から採取したＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を他の宿主細胞へ導入して得られた組換えＤＮＡポリメラーゼと該遺伝子を改変した３’−５’エキソヌクレアーゼ活性欠失変異酵素との混合物である請求項４または５記載の核酸増幅用試薬。
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