CN101088002A - 固定剂组合物 - Google Patents
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Abstract
本文涉及一种用于保存组织和生物样品的固定剂组合剂。现有的固定剂组合物的缺点是,它们不能提供抗DNA/RNA降解的充分保护。此外,它们的使用损害了可提取性且危害了提取的DNA的可扩增性。本发明解决了这些结合的但相关的问题,并且提供了一种固定剂组合剂,该组合物包含一种或多种烷醇、分子量为200-600的聚乙二醇、一种或多种弱有机酸以及水,其中每升所述固定剂组合物中前三种组分的总浓度为0.01-0.10摩尔。所述固定剂组合物基本上不含任何交联剂例如甲醛。
Description
发明背景
本发明涉及一种用于保存组织和生物样品的固定剂组合物。组织保存产生于追溯到文艺复兴时期的早期解剖学研究中对尸体保存的需要。这在某种程度上利用了通过更为古老的尸体防腐法、皮革和食品加工/保存的实践而获得的知识。在十七和十八世纪,专家们特别重视并且制作了(家畜和人类起源的)畸形体标本集,用于在整个欧洲运输。这需要一种在操作时没有毒性的、透明的、容易获得的流体或溶液。最初,正如在食品保存中使用的那样,酒精被广泛地用于该目的,但是从十九世纪开始,甲醛(“福尔马林”)逐渐可加以利用,它是不能饮用的而且不用征税,因而它提供的优点超过其缺点:变色和组织变化。除此之外,它具有强的杀真菌/杀细菌特性,这即使在知道病原生物体的发育之前就察觉到了。
甲醛依然是临床和研究组织和生物样品保存的支柱,因为组织学、细胞生物学和组织病理学这些基于显微镜检查的科学的整个知识库需要图象特征的连续性。
随着免疫细胞化学和早期DNA研究的发展,人们首次探查了甲醛对组织的作用的精确化学基础。虽然很快就确定了在结构组织蛋白与脂蛋白和糖蛋白的蛋白部分之间形成交联的倾向,但是几乎没有探寻另外的知识。遗憾的是,没有研究过组织渗透的特征和动力学。也没有研究过这种中等强度的还原剂(是一种醛)通过环境氧的氧化作用的降解速率。
交联作用导致充当表位的三维蛋白结构的掩蔽,这种交联作用被视为对不能采用很多抗原的原位标记来检测这些抗原的解释。这即使在新鲜组织提取物的悬浮液中和使用奥克特罗尼法(Ouchterlony technique)时,这些也是明显存在的。对于一些应用,通过使组织过热、破坏交联键(抗原挽回)而对这种缺陷进行了校正。其它方案涉及通过向基于甲醛的溶液的各种添加降低交联形成的程度。这些之中有很大毒性的、重金属(其中包括汞)盐。为了在组织处理之前造成不完全的交联,还尝试了各种降低强度的甲醛。少数方案利用纯酒精作为冷冻的切片或很小的活检的固定剂。
对于实现为常规诊断目的而获得的组织和生物样品的分析(以构成组织的细胞中存在的DNA为目标)而进行的分子生物技术而言,交联的形成现在被视为一个主要障碍。
组织样品外层的蛋白组分的最初交联的一个附加作用是建立一种扩散屏障,这种扩散屏障阻碍固定剂进一步进入尺寸在几个毫米以上的生物组织样品(即,大多数临床上有关的活检,特别是外科切除术标本)的更深部分。
甲醛的缓慢渗透使这类样品中存在的大量DNA/RNA在这类过程被固定剂的渗透阻止之前就被降解得无法利用。除了增强降解之外,交联最终形成时掩蔽DNA/RNA,使其不受为了原位杂交或聚合酶链反应而使用的探针和引物的作用。结构上结合在DNA和RNA的大分子中的蛋白质与样品中存在的其它蛋白质的交联作用损害了从组织和其它分析用生物样品中提取DNA。经常采用诱导附加断裂的试剂进行提取时,这些片段常常太短了,只能使基于聚合酶链反应的研究中非常短的片段得以扩增,这显著降低了可能从这类研究中获得的信息量。
可能最为重要的是,这类技术在诊断程序中难于实现,正如随后的低的到非常低的程序灵敏度一样,不能自信地解释阴性结果。
因此,现有的技术状况是,在进一步分析处理或为制备显微镜载玻片而进行的处理之前基于组织和生物样品的保存坚定地基于使用单独的甲醛或者使用甲醛作为各种混合物的主要成分。作为甲醛的替代物,已经使用过C1-6的醛(很多是与甲醛组合使用以及除了甲醛之外还使用);这些都导致相当的有害作用(见下文)。
这不仅事实上阻碍了为常规诊断和研究目的快速实现改进的免疫细胞化学测试,而且更为重要的是,完全阻碍了在常规临床实践中有效地引入旨在DNA研究的分子生物技术。
此外,前文没有提到过,在工作场所大规模使用甲醛溶液有各种严重的缺点。它是一种已知的致畸剂,与癌症的发生有关,可能促进工业变态反应的发生,而且在直接暴露时有相当毒性。这在实验室、运输容器和组织处理设备的设计和操作中需要广泛而昂贵的安全措施。
从临床实践中彻底消除该试剂仍然有待实现。
目前,非交联的保存剂的不可利用性导致使用分子生物技术的生物(例如疯牛病中的兽医CNS样品)样品的集中研究的高成本。这类样品是在没有固定的情况下被运输的,因而潜在地是有传染性的。这已经需要使用昂贵而麻烦的抗传染程序和措施。
过去已经开发了不含福尔马林的替代固定剂,即Kryofix(Merck,产品号5211)。它是乙醇和聚乙二醇的混合物,并且已经上市,用于低温恒温器技术中的固定。它不仅用于恒冷切片(cryosection),而且用于塑料和石蜡切片(M.E.Boon c.s.,Path.Res.Pract.188,832-835(1992))。
虽然过去已经成功地使用Kryofix作为一种替代性固定剂,还用于组织学目的,但是现在不再使用它。Kryofix的缺点是,它不能提供抗DNA/RNA变性的充分保护。在当前的临床实践中,在几乎所有标本中都应当保存DNA/RNA。
US专利3 997 656公开了在一种固定剂,它由用于增强渗透的乙酸、作为重金属的氯化锌和标准浓度的甲醛组成。对DNA的保存、可提取性和可扩增性的全范围的有害影响是可以预期的。
US专利申请2003/0119049 A1中所述的一种固定剂旨在用于细胞学,在该情况下渗透-保存和可提取性全然不是一个问题。所述固定剂含有交联剂例如甲醛,而且优选含有戊二醛。这种固定剂对DNA的可扩增性将具有破坏性的作用。
US专利5 679 333中所述的一种固定剂旨在用于组织学-组织样品。虽然它不含甲醛,但是它代替甲醛的是具有与交联剂相当的强度的另一种基于碳水化合物的醛:乙二醛。
US专利5 849 517中所述的一种固定剂使用一种悬浮液,它通过使用缓慢释放的甲醛供体物质而相对地不含未结合的甲醛。目的是当甲醛被释放时让所有甲醛立即被结合在组织内,从而保护实验室人员免受毒性作用。这种固定剂将显示对DNA的全范围的破坏性作用(保存、可提取性和可扩增性)。实际上,导致组织破坏的待释放甲醛的最终量超过了常用的3.6-4%甲醛水容液中存在的量。
US专利申请2002/0094577 A1中所述的一种固定剂使用浓度为0.2-4%的C1-C6链烷醛例如戊二醛、甲醛、仲甲醛、乙醛、丙醛或丁醛。它旨在仅仅用于细胞学中,在这种情况下组织渗透和可提取性可能不是一个重要的问题,但是这些还原性物质的直接有害作用是一个大问题。
对解决DNA保存-保守-降解、提取和扩增这些相关问题的需要迄今还没有得到解决。事实上,尽管在某些现有技术中将“保存”定义为一个目的,但是还没有评估还原剂的有害作用的证据。提取或扩增根本没有得到解决。
因此,仍然迫切需要一种不含甲醛和其它交联剂的组织学固定剂。
发明概述
本发明提供一种用于保存组织和生物样品的固定剂组合物,它包含一种或多种烷醇、分子量为200-600的聚乙二醇、一种或多种弱有机酸以及水,所述前三种组分的总浓度为0.01-0.10摩尔/升所述固定剂组合物,所述固定剂组合物基本上不含任何交联剂。
因此,本发明的固定剂组合物包含四种组分,这四种组分形成一种溶液。
所述一种或多种烷醇适宜地是具有1-6个碳原子的低分子量烷醇,例如甲醇、乙醇或异丙醇。优选地,使用乙醇或者乙醇和甲醇的混合物。
所述聚乙二醇的分子量为200-600、优选分子量为200-300。所述分子量可以根据样品性质(固体组织活检、尿液、子宫颈涂片、血液等)而变化。
所述一种或多种弱有机酸适宜地是甲酸、乙酸或其它羧酸。优选地,所述酸是乙酸。所述一种或多种酸以0.01-0.1摩尔/升所述固定剂组合物、优选0.025-0.05摩尔/升的浓度存在。所用的具体酸和浓度可以不同并且与组织本身的酸度和缓冲能力以及糖胺聚糖的相对含量有关。
其它组分的量和比率可以在宽范围内变化。适宜地,本发明的固定剂组合物包含含量为10-60体积%的所述一种或多种烷醇、含量为1-20体积%的所述聚乙二醇,而且所述组合物的余量为水。优选地,所述聚乙二醇以5-10体积%的含量存在。
本发明的固定剂组合物基本上不含任何交联剂。
本文中使用的术语“交联剂”限定了固定剂领域中公知的那些试剂。交联剂是还原性化合物,它们包括但是不限于醛类例如C1-C6链烷醛和C1-C8亚烷基二醛。这些醛的例子包括甲醛、戊二醛、乙二醛、仲甲醛、乙醛、丙醛和丁醛。术语“交联剂”还包括实际上是交联剂的前体的物质。例如,二偶氮烷基脲(diazolidinyl urea)是一种已知的甲醛供体。
本发明的固定剂组合物
a.具有可量化地加速的组织/生物样品
渗透,
b.具有可量化地改进的组织/生物样品中DNA/RNA的
稳定率,达到或超过原始存在的DNA/RNA的80%。虽然取决于样品大小,但是这种作用存在于直径大于1cm的样品,
c.在更长的时间内可量化地
保守组织/生物样品内存在的DNA/RNA,在测试条件下、在室温下以大于80%的比率长达6个月时间,
d.可量化地促进DNA/RNA从组织/生物样品的
可提取性,在测试条件下、在室温下以>80%的分数长达6个月时间,
e.可量化地保证暴露后和/或从暴露的和/或处理的组织/生物样品提取后DNA/RNA的
可扩增些,在测试条件下高达600个碱基对的扩增片段长度。
就此而论,本发明的固定剂提供的功能性是其它的历史上可获得的或近期开发的、具有相同的整体目的的流体或溶液实际上没有提供的。
因此,本发明的固定剂可以被明确地用作组织学固定剂,但是,它当然也可以被用于细胞学。
定义
对本发明来说,组织和生物样品保存方法中涉及的一些单独的组成方法已经需要更新的或者首次的(再)定义。
快速初始脱水
在这个方法中,样品组织的含水量被快速降低到生物学过程被阻止的水平。这些生物学过程中最重要的是:正常存在的RNA酶对mRNA的自然快速降解以及通过溶酶体蛋白酶的释放由局部缺血引起的细胞成分(包括DNA和RNA在内)的自溶。该功能是例如水果以及肉和鱼蛋白质的食品保存中使用的空气干燥法的一种快速形式。
该功能是通过水从样品向高渗透值溶液的初始流出而实现的。在第二个、部分重叠的阶段,发生样品内的水通过体积平衡(volume equilibration)被低分子量的醇替代。在这个阶段,通过改变蛋白质和其它的水依赖性结构的三维结构,变性作用附加地阻止了所有细胞功能。这个过程还已经被本发明人和其他人描述为代表一种形式的凝固。
这个过程通过样品外的高浓度聚乙二醇(PEG)得到增强。
与糖胺聚糖平衡和竞争,PEG还可以改变的水的天然结构状态,这可以通过改变大分子的水合状态和三维构型而增加大分子的失活。缔合水幕(associatedwater mantle)的静电屏蔽的变化导致一些分子的沉淀。
与破坏性的酶失活相互独立,脱水导致DNA在水环境中水解的倾向的非线性降低。这种水解可能是显著的,以便导致DNA片段向围绕样品/标本的液体空间的可识别的/可检测的/可定量的释放。该DNA由逐步缩短的(通过持续的水解)片段组成,妨碍了扩增所含基因组信息节段的尝试。这个过程是由本发明人首次描述和量化的。
使用低分子量的烷醇存在有几分不希望有的副作用。这些化合物将具有还原剂性质,具有取决于烷醇的分子量以及OH-基团的数量和位置的可变K-值。乙醇和甲醇本身是有效的还原剂,而且在太高的浓度下,特别是与解螺旋的和游离的DNA一起时,可能是破坏性的。这个特性的这些作用需要使用溶液成分保持低的酸性pH而加以控制,在所述低的酸性pH下所述还原剂作用按指数规律地不太活跃,而且所述低的酸性pH有助于将DNA保持在螺旋状态,这有效地减少这些大分子中易受还原剂攻击的位点的暴露。
体积置换:
在这个过程中,PEG缓慢地置换了最初脱除的大量水,使最初已经损失了一些体积的样品再次膨胀到原始尺寸。
使用任何固定剂都发生这个过程,可能是部分或完全持久的,而且通过组织成分(上皮/结缔组织-粘蛋白/胞质)之间的差异在所述组织内产生剪切力,也称作或描述为“收缩”。这个现象随后被增强或掩蔽,至少受到对组织和细胞的石蜡最终处理的继发影响,其中总的脱水与尺寸减小和再次膨胀的大规模、循环的过程有关,该过程本质上如同定量意义上一样很难理解。由差分收缩/膨胀动力学导致的组织切片中的裂隙在样本之间可能不同,所述样本与保存前局部缺血的期间(可能通过自由水的糖胺聚糖相关结合的差异)、样本组成的差异(特别是(年龄相关的-见下文)基质的组成,特别是样本尺寸)有关,因为这些竞争性/协同性过程中每一个的扩散依赖性相对进程之间的平衡受到延长的扩散途径的影响。
因此,只有当样品尺寸/切片厚度被控制并保持在预定的限度之内,才可以在一定的置信范围内确定关于固定剂组合物的最佳结果。
糖胺聚糖稳定作用
糖胺聚糖在含水环境中迅速水解以便结合自由水,这在细胞或基质中是潜在地破坏性的,因此出于进化原因已经产生了控制机制。这实际上几乎有效地去除了真正的水溶液,大部分细胞酶必须在该水溶液中起作用并且通过该水溶液的任何水溶解的治疗性或生物学部分扩散移动进入组织和细胞小室、在组织和细胞小室内或者通过组织和细胞小室。虽然通过细胞内甚至细胞间通道促进了分子成分的大部分胞内转运和穿过胞膜的转运,但是尤其是在基质本身(活细胞中间的空间)内,所有转运是通过水内的扩散。糖胺聚糖的水解是个快速过程,在分离活检或组织样品/器官片段后该水解过程迅速减少自由水量,固定剂持续近入样品中或在样品中的固定剂分布进程随时间越来越减慢。
已发现糖胺聚糖的水解实际上被微小的pH下降完全阻止(与正在讨论的键的K-值相关),所述微小的pH下降是通过将一种低浓度的酸加到固定剂中来实现的。这种酸必须具有足够低的K-值,以便不会导致在低pH条件下非常不稳定的DNA的破坏。弱有机酸满足关于保持或提高固定剂的活性组分的组织渗透性/进入的需要,已经使用依赖于组织特性的不同物质证明了这一点。一种特定试剂,乙酸,在低浓度下对于实际应用是足够稳定的并且通过广泛测试显示出期望的效果。在使用的浓度下,至今未解释的,乙酸本身在水中确实仅消极地影响DNA,然而与本发明的固定剂的其它成份相组合并且在组织环境内,这种对DNA的有害影响似乎并不存在,并且,事实上将该组分添加到整个固定剂中对获得的结果来说是至关重要的。
从上文显而易见的是,在临床情况下存在许多困惑,它们几乎妨碍了采用实际临床标本的对一种新提出的固定剂的相对优势或好处所进行的最粗略评价。
这些之中最重要的有:
a.手术中有体温的局部缺血时间
在手术期间,特别是在癌症情况下,器官将有它们的动脉供给并且其后它们的静脉引流在该过程中的早期被中断。然后,在任何这种标本最终从身体上移除并交到病理学或实验组之前,这种情况可长达若干小时。因此,局部缺血有体温时间(37摄氏度)变化非常大。
b.手术后的移除冷却中的变数
在移除后,可以将样品直接移送到病理学实验室或可以在那里保持相当长的时间。常常将组织放置在用量与样品大小不成比例的固定剂中,如果固定剂冷藏储存,这将妨碍冷却到室温或低于室温。如果将样本的切碎延迟过夜,任何固定剂可能不会渗透至任何坚实样品的中心并且该样品中心保持在27摄氏度以上长达14小时或更长时间。
c.固定剂的手术后扩散中以及样品的制备中的变数
固定剂的渗透非常依赖于保持一个尽可能高的、通过样品表面的梯度。对于小(打孔)皮肤活检或肝和肾的(贯穿切口)针吸活检易于实现溶液体积与样品体积的比例大于20倍。但是乳房切除术或结肠切除术样品需要30升的容器并且这些容器通常是不可得的。因此大于1kg的样品通常只用少至300ml的固定剂浸湿,用在固定剂中浸泡过的毛巾或纸巾覆盖样品,因此,就液体和组成性活性剂两者的任何相关梯度的维持而言,都处于非常不利的条件。由于随者需要缓冲的酸物质的渐进释放,局部缺血组织的质量远远超过缓冲液的质量,因此,使用缓冲的甲醛不能提供解决方案。
机理
也是为了本发明的目的,描述了组织和生物样品保存中涉及的机理。但是,不应认为本发明受该机理描述的约束或限制。
a.进入、流体交换过程,
三个动力学/4隔室模型,
DNA/RNA 降解
如上提出的,进入组织/生物样品由被动扩散的特征来控制。水与溶液的溶解组分的局部结合造成各种使模型构建复杂化的穴(sinks)。这被水从样品进入介质和在不同阶段从介质进入样品的补偿转移进一步复杂化。这实际上在一系列不同特征的半透膜内发生和穿过半透膜发生,至于更复杂的问题,在这些特征方面,这些半透膜以不同的方式在时间的不同时刻受到与固定剂的组成部分的相互作用的影响。
这些膜产生/分开4个隔室:
a.介质本身
b.细胞间隙(主要充满基质)
c.细胞内空间,再分为
c.1.细胞质,和
c.2.细胞核内空间
正是在这后一个空间(c.2.)内含有用于分子生物学目的的靶大分子。用于免疫细胞化学目的的靶表位分布遍及隔室b.和c.1/2。
根据这一点人们必须接受的是,如果一个人想尝试这个问题的理论模型化,则需要非常复杂的一系列模型计算。因此我们已经做出选择,目的在于:一方面承认各种竞争性地和互助性地、至少潜在地、增强的机理的存在,而另一方面仅仅利用一系列连续的更复杂的经验方法处理该问题。
b.适当的固定过程,DNA/RNA-组织成分-与固定剂组分
之间的化学相互作用,保存
DNA和RNA稳定于主要对抗破坏性的溶酶体酶或核酶的作用的组织内,所述那些酶将降解这些分子,作为旨在保存消耗的化学能的常规过程的一部分。DNA酶和RNA酶本身都是蛋白质。另外,DNA和RNA易于被水和固定剂中存在的许多溶解的生物学存在物或化学药品或试剂氧化、还原和水解。
固定剂或保存方法要么目的在于中和生物酶(通过脱水作用、冷却或甚至冷冻),要么目的在于破坏这些酶(交联、加热)。脱水作用可以采用干燥的形式,但用醇或其它溶剂置换水同样有用。用盐结合水具有相当的功效。这些方法中大部分已经在食物保存中得到开发,但它们同样适用于组织和生物样品的保存。
所有这些作用之间的净平衡依赖于固定剂组分对组织的渗透。就这一点而论,难以根据理论方法进行预测或推导。
c.组织处理,DNA/RNA提取/可提取性
在组织处理过程中,为了用固体石蜡取代存在于组织内的水分(达其体积的70%或更多),将组织连续浸入可选择的流体,这些流体的唯一目的是去除所有水分,所述固体石蜡允许制备为显微镜检查准备的非常薄的切片。这需要递增浓度的醇的混合物,该混合物可以与水混合。在那些过程中,细胞和组织的很多分子内容物,包括溶解的DNA(片段),从组织移除并进入悬液内。正是发明人的工作强调了这个过程的重要性,尤其是对于DNA。
去除水分后,通过用有机溶剂进行相当的漂洗去除乙醇或类似的醇,所述有机溶剂一方面可以与乙醇混合,另一方面可以与石蜡混合。所述有机溶剂的后一方面的性质使去除有机溶剂和用液体(温热的)石蜡取代的最终步骤得以实现。此外,随着液体轮换(fluid shifts),许多溶解的物质被丢失。对于脂肪的情况这可能是可取的,并且因此采取一个使用氯仿或丙酮(脂肪溶剂)的中间步骤。
这个过程中的每个步骤都具有组织的重复体积变化的效应,同时产生沿最小阻力的线和平面引起裂隙和断裂(rifts and fractures)的内部剪切力。可以在许多组织样品内看到这种人为现象。
微波和真空增强处理技术的使用已对组织保存、可染色性、损伤性人为现象的减少以及免疫细胞化学显示了有益的作用,这些作用可能主要基于洗提步骤的数量的减少和暴露于含水溶剂相的持续时间。
由于在与表面不同距离处进入的流体和流出的流体之间的平衡从来不处于同一状态,所以这成为另外一个无法预知的问题并且只能通过实验方法进行研究。
d.DNA/RNA扩增/可扩增性
在分析前,存在于组织和生物样品内的DNA可能已经受各种处理的影响,所有这些处理都对采用分子生物学技术研究这个部分的能力造成渐进性的限制。
水解作用会产生可变长度的DNA片段。某种程度上,原位杂交(FISH和采用放射性探针的其它原位杂交)要求只保留长度很短的DNA(6-14个碱基对)。在概率基础上,这样一个片段通常会持续可得,并且在与这样一个保守位点结合后识别正信号之后,DNA损伤程度自身可能没有被注意到。
与其它DNA链或与其它组织蛋白质或组蛋白的交联也发生这种情况。ISH可能很好地继续起作用并且由此该处理的重要性不被认识到。许多现有的涉及固定剂的DNA保存研究都采用这种形式的评估作为功能性要求的基础。
PCR类似地只需要短区段的保存DNA,用于引物的最初结合,所述这些引物通常具有相当的碱基时长度。但是,在这之后在附着位点之间的DNA区段,这可能是数百碱基对的长度,为了产生完整长度(从一个引物附着位点到另一个)的扩增产物必须不被(通过水解分裂或通过交联)间断,这形成PCR应用所依据的连续指数式扩增过程的基础。
因此,为满足PCR评估、目前和未来的临床和实验分子生物学的构架(backbone)的需要,要求一套关于DNA保存的更高标准,该更高标准无法通过使用甲醛或使用利用延长暴露于水溶液而不防氧化、尤其是水解作用的技术来满足。
由于没有任何基础性工作作为对一种新设计的固定剂的进一步改进的效应进行任何预测的基础,本发明人已经选择了经验研究。这些研究包括各种可供选择的固定剂、本发明的固定剂对PCR可扩增性的效果的一系列研究,以及它的各个构成组分对纯化的、商业可得的、用于PCR质量控制的确定参比DNA的影响。
实施例和实验
总体实验设计、一般方法和材料:
由于用于几乎所有商业可得的PCR检测分析的内部质量控制采用人β-球蛋白基因的引物,并且由于该基因在犬和人之间是保守的,该商业可得的引物组在本研究中被用于质量控制。狗中的扩增产物的长度与人中的完全相同。
为进行关于本发明的固定剂组合物的各组分单独以及纽合时对纯DNA的影响的次级研究(substudy),我们采用了得自LightCycler Control Kit DNA的人参照DNA (Roche,Germany,cat.no.2158833),前述影响是与KryoFix和甲醛的影响相比校的(见下文)。
实施例中使用的本发明的固定剂的具体组成(除非另作说明)如下:
通过混合如下物质制备10升溶液:
4.84升乙醇(100%)、4.44升水、0.7升PEG 200和0.025升冰乙酸。
使用的Kryofix具有下列组成:
通过混合如下物质制备10升溶液:
5.0升乙醇(96%)、4.3升水和0.7升PEG 300
使用的甲醛溶液具有下列组成:
通过混合如下物质制备0.5升溶液:
50.0毫升37%甲醛
412.5毫升pH 7.0的缓冲液(依据Bancroft的缓冲液:4.5克NaH2PO4·2H2O和16.4克Na2HPO4·12H2O)
由于糖胺聚糖含量和精子含量的预期方差(expected variances),形成如下几个动物研究组:
n
a.年龄小于6个月的幼年雄狗 60
b.年龄大于6个月且小于2岁的青年雄狗 60
c.年龄大于2岁的成年雄狗 62
每组由研究目的所要求的数量的动物组成。这些组的规模大致相等,从182只雄狗得到共计361个睾丸(3个睾丸不适于研究:2个萎缩,1个可能是肿瘤)。
从每个组,将睾丸切开并且将各部分:
a.在液氮中速冻以备后用
b.对于所有的基线以及在可变的悬液中对于所有的T0实验着手即刻的实验工作
c.依据研究方案放置在可变的悬液内,用于随后所有的T(30分钟、1小时、2小时、12小时、24小时、48小时、7天、14天、4周)值实验。
对最终的提取的DNA完成经过时间点的现场试验(直到T-24和48小时),最终的提取的DNA在稳定后,被转送到Leiden Cytology and PathologyLaboratory(LCPL),用于随后通过可提取性/保存的定量DNA浓度评估的比较研究和分析,以及用于通过定量PCR分析的可扩增性的评估。
打算用于>12小时T-值的样品被转送到LCPL并且内部处理用于随后的值。
试剂和设备在实验地点和LCPL实验室之间转送以确保结果和结论的直接可比性。
为了研究样品大小和所有实验的结果之间的关系,在获取睾丸样品后在产地立即将样品制备成组织样品:
a.1×1×1mm
b.2×2×2mm
c.4×4×4mm
对于所有样品,除了来源动物的大小和年龄组之外,还记录了样品的湿重(以4位小数计),作为提取液中所有DNA浓度的基础计算值。利用洗脱液体的最终体积(以ml计,2位小数),所有样品的DNA产量/湿重的克数被计算并记录在Excel1数据文件内,采用SPSS统计软件包通过关联的一元和多元分析用于随后的分析。
在扩增研究前,DNA被纯化并且通过采用QuiaGen微柱反复洗涤浓缩的DNA以及洗涤液体变化来去除可能残留的不同保存液体(尤其是甲醛)。
为了可扩增性研究起见,纯化和提取的DNA被归一化到一个在固定体积反应悬液内的标准数量DNA,使得能够直接比较结果。
利用DNA的解链温度,提取的DNA样品被连续稀释用于扩增结果的简单比较,并且通过RealTime LightCycler PCR(Roche,Germany)提供温度曲线,用于扩增过程的质量控制。
对于所有样品大小的所有样品,所有研究完全重复两次。所有实验利用取自6个不同动物的单独样品进行6次(时间/样品大小/固定剂-液体变量)。
材料和方法的细节:
蛋白酶K:Qiagen,Germany,cat.no.19133
DNA纯化:QIAamp DNA Mini Kit,和组织方法(Qiagen,Germany,cat.no.51306)-DNA结合至小柱中的硅胶,洗脱液乙醇
在渐进乙醇梯度中提取后洗脱 DNA。
最后悬浮于TRIS-缓冲液中。
高流通量技术:QIAvac 6S(Qiagen,Germany,cat.no.19503)
双链DNA的测量:SmartSpec 3000(BioRad,USA),采用260-280nm的范围,微量比色池(Brand,Nether lands)。
PCR:定性的,采用SYBR-Green 1。
FastStart DNA Master SYBR Green 1 Kit (Roche,Germany,cat.no.2239264)
PCR混合物:2微升LC-FastStart DNA Mas ter SYBR Green(终浓度1x),2.4微升MgCl2(终浓度4mM)和2微升β-珠蛋白(beta-globine)引物混合物(各自终浓度0.5μM),用添加的PCR级水增至18微升。添加2微升的标准模板DNA。
PCR程序:
第1个循环10分钟,95℃。扩增循环,95℃(10秒)、55℃(5秒)、72℃(10秒)的循环数n=45。在72℃步骤的最后有一个单色检测。该轮之后是一个用于解链曲线/温度的判定的一个循环,起始于95℃(0秒)、65℃(15秒)、95℃(0秒,转换率0.1,连续的颜色检测)。最后步骤,冷却至40℃。
PCR:定量的,采用LC-red 640探针。
LightCycler-Control Kit DNA和LightCycler FastStart MasterHybridisation Probes(Roche Germany cat.no.2158833 and 2239272)。
PCR混合物:2微升LC-DNA Master Hybridisation Probes(终浓度1x),2.4微升MgCl2(终浓度4mM)和2微升β-珠蛋白引物混合物(各自终浓度0.5μM),2微升β-珠蛋白Hybridization Probe混合物、LC-red 640标记d的(终浓度 Probe 1:0.2μM,Probe 2:0.4μM),用PCR级水增至体积为18微升。向其添加2微升模板DNA。
PCR程序:
第1个30分钟的循环(95℃),用45个循环扩增(95℃,0秒)、55℃(10秒)和72℃(5秒)。在55℃有一个单色检测。最后冷却至40℃。
PCR靶:引物之间110bp的人β-珠蛋白基因片段。扩增子的解链温度:85℃。解链温度的变化表示由于片段丢失或重组导致的扩增子的缩短-延长。
a.液体交换,DNA/RNA稳定/降解
从最初的那些实验明显看出,从组织样品(无论大小)的DNA提取都没有沿数学上确定的反时数或指数曲线产生一条曲线。相反,从贮存在盐水或蒸馏水或甚至没有保存剂的PCR缓冲液中的组织的DNA提取结果以一种模式产生DNA,尽管存在动物年龄、样品大小和环境温度的总体影响,但该模式的特征在于一个初始的极低产率、一个至12-24小时的上升产率、一个在24-48小时的稳定的更高产率、接着是在随后7天-4周的一个程度不同的快速产率下降。较小的样品显示一个48小时后产率的更快下降,但是一个更快的初始上升。年幼动物的总体产率都明显低于那些年老动物的总体产率(结果未示出)。在该阶段,能推测出,氧化作用在有限的程度上是、而主要是水解作用才是测试条件下DNA提取损失的主导原因。
大于4周以后对代表性样品的最后再分析显示,在测试的所有样品和样品类型中在大约12-14周后下降至0产率。结果,所有的提取结果和以DNA/原始样品湿重计的所有计算产率作为平均数的%被重新计算,所述平均数是根据关于蒸馏水、室温、关于幼年、青年和老年动物状态以及关于原始样品大小组的产率曲线,对于给定样品大小和时间点而预期的。
b.DNA/RNA保存
与可提取性分来评价DNA的保存是困难的。通过在电泳凝胶上对得自代表性提取系列的小例样进行电泳来测定DNA片段大小分布。在这个阶段,以及至2小时,可以识别出非常有限的(如果有的话)DNA断裂,在24小时后提取的DNA中大部分不再以缠绕的-解旋的大DNA螺旋形式存在,而是以大小非常不同的片段形式出现。随着时间,这些片段的分布改变为更小的片段,再一次证实了在这些条件下水解作用的影响作为DNA降解的主要决定因素。
可扩增性(见下文)被认为是最重要的参数,并且对于项目中研究的所有溶液变化形式,代表性的时间点和中间样品大小(2×2×2mm)提取的DNA被进行有限的电泳。
c.组织处理,DNA/RNA提取
在研究的每个时间点以及对于每个悬液变化形式,将组织样品洗涤3次以去除多余的保存液(变化形式),并且采用利用一次性刀片的机械分解和利用搅拌机的组织破碎进行均质化处理。这之后接着是在洗涤用PCR缓冲液中重悬(2次)并沉降以去除任何溶液的最后残留,使得不影响蛋白酶K的功能。该步骤之后接着是,利用对于每个研究点固定量的湿重组织质量的厂商说明的蛋白酶K溶液和标准化反应悬浮液体积(蛋白酶K-浓度和蛋白酶-K组织质量比例)的组织消化。
产生的悬液用于利用上述方法提取DNA。
在图1中呈现了最能提供信息的DNA提取结果,其中所有数据相对于水被标准化。这些涉及成年动物的提取结果,年幼动物呈现出不能用管中缺乏成熟精子物质来解释的出乎意料的较低结果。结论是,糖胺聚糖含量存在差异,所述糖胺聚糖含量在重要性方面占主导地位,超过与其它参数方面的变化相关的变化形式。
注意,与水相比,本发明的固定剂产生>100%DNA产率,但采用Kryofix时的产率不具有该特征。
本发明固定剂的各组分单独以及组合的所有变化形式,以及使用可变浓度的单独的PEG,造成明显更低的产率。添加低浓度的弱有机酸例如乙酸是特别关键的。没有这个添加,仅仅基于PEG和乙醇的固定剂不能给出比单独用KryoFix或乙醇更好的结果。
注意,本发明的固定剂出现的稳定平台期产生大约80%的起始产率,未见于其它固定剂。
当在组织处理后采用来自这种石蜡块的切片重复该研究时,结果仍然相似。这将表明,在各种交换之内组织处理不会造成样品中大量额外的DNA损失。
结果表明,通过浸入固定24小时后,与甲醛相比,本发明的固定剂从石蜡包埋组织产生5倍的DNA回收(DNA return)。在7天这种差别更大地增加至40倍,并且在甲醛悬液中固定28天后从包埋之前或之后的组织样品不能有效回收DNA。
采用各种固定剂进行进一步的实验,其中改变了聚乙二醇、乙醇和乙酸的百分比。结果表示于表1.1-1.3。注意,乙酸的量用体积百分比的形式表示,然而在权利要书中是按照摩尔/升给出该量的。具有更高浓度乙酸的组合物中的一些并没有被本发明的范围覆盖。
表1.1.与浸入固定剂/溶液24小时后的湿重组织相关的DNA产率,相时于在PCR级水中悬浮24小时后可提取的DNA进行了标准化。
关于PEG 2%、分子量200的数据,所有试验基于2×2×2mm、成年狗睾丸的组织样品。
%乙醇
70 | 11 | 21 | 18 | 13 | 4 | 2 | 3 | 2 | 3 | 3 |
60 | 14 | 38 | 60 | 42 | 17 | 11 | 16 | 11 | 9 | 4 |
50 | 12 | 39 | 63 | 65 | 43 | 23 | 18 | 16 | 9 | 2 |
40 | 9 | 36 | 64 | 68 | 67 | 41 | 21 | 13 | 5 | 1 |
30 | 6 | 28 | 32 | 24 | 26 | 36 | 13 | 8 | 6 | 1 |
20 | 4 | 11 | 18 | 13 | 11 | 8 | 7 | 4 | 2 | 2 |
0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0.5 | 0.6 | 0.7 | 0.8 | 0.9 | 1.0 |
%乙酸
表1.2.与浸入固定剂/溶液24小时后的湿重组织相关的DNA产率,相对于在PCR级水中悬浮24小时后可提取的DNA进行了标准化。
关于PEG 7%体积、分子量200的数据,所有试验基于2×2×2mm、成年狗睾丸的组织样品。
%乙醇
70 | 13 | 24 | 19 | 15 | 7 | 4 | 3 | 3 | 5 | 4 |
60 | 19 | 49 | 33 | 37 | 41 | 32 | 12 | 8 | 9 | 5 |
50 | 16 | 41 | 81 | 83 | 65 | 45 | 35 | 16 | 7 | 3 |
40 | 14 | 38 | 79 | 80 | 67 | 36 | 21 | 14 | 7 | 2 |
30 | 9 | 31 | 48 | 56 | 33 | 18 | 1 3 | 4 | 5 | 2 |
20 | 5 | 16 | 14 | 15 | 13 | 9 | 9 | 6 | 3 | 4 |
0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0.5 | 0.6 | 0.7 | 0.8 | 0.9 | 1.0 |
%乙酸
表1.3.与浸入固定剂/溶液24小时后的湿重组织相关的DNA产率,相对于在PCR级水中悬浮24小时后可提取的DNA进行了标准化。
关于PEG 14%、分子量200的数据,所有试验基于2×2×2mm、成年狗睾丸的组织样品。
%乙醇
70 | 4 | 11 | 13 | 9 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 |
60 | 7 | 14 | 17 | 22 | 18 | 14 | 9 | 4 | 2 | 1 |
50 | 8 | 15 | 19 | 32 | 26 | 21 | 14 | 12 | 6 | 1 |
40 | 7 | 17 | 24 | 25 | 24 | 23 | 15 | 11 | 5 | 2 |
30 | 5 | 18 | 15 | 16 | 19 | 12 | 11 | 9 | 4 | 1 |
20 | 3 | 4 | 5 | 6 | 4 | 5 | 3 | 2 | 2 | 1 |
0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0.5 | 0.6 | 0.7 | 0.8 | 0.9 | 1.0 |
%乙酸
使用各种固定剂来进行进一步的实验,其中包括不同类型的PEG。结果如表2.1-2.3所示。表2.1和2.3的所有固定剂以及表2.2的某些固定剂没有落入本发明的范围。
表2.1.与浸入固定剂/溶液24小时后的湿重组织相关的DNA产率,相对于在PCR级水中悬浮24小时后可提取的DNA进行了标准化。
数据结果,没有添加的PEG,增加的乙醇体积7%,所有试验基于2×2×2mm,成年狗睾丸的组织样品。
%乙醇
70 | 3 | 3 | 3 | 2 | 2 | 2 | 2 | 1 | 1 | 1 |
60 | 2 | 6 | 7 | 9 | 12 | 6 | 3 | 2 | 1 | 1 |
50 | 1 | 8 | 14 | 17 | 13 | 7 | 5 | 3 | 2 | 1 |
40 | 1 | 4 | 13 | 19 | 15 | 8 | 7 | 4 | 2 | 1 |
30 | 1 | 5 | 6 | 8 | 9 | 4 | 3 | 2 | 1 | 1 |
20 | 1 | 2 | 3 | 3 | 2 | 1 | 2 | 1 | 1 | 1 |
0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0.5 | 0.6 | 0.7 | 0.8 | 0.9 | 1.0 |
%乙酸
表2.2.与浸入固定剂/溶液24小时后的湿重组织相关的DNA产率,相对于在PCR级水中悬浮24小时后可提取的DNA进行了标准化。
关于PEG 7%体积、分子量600的数据,所有试验基于2×2×2mm、成年狗睾丸的组织样品。
%乙醇
70 | 5 | 5 | 6 | 9 | 7 | 5 | 4 | 4 | 3 | 3 |
60 | 5 | 27 | 29 | 34 | 29 | 17 | 11 | 5 | 4 | 2 |
50 | 4 | 31 | 48 | 51 | 42 | 22 | 15 | 9 | 4 | 3 |
40 | 6 | 36 | 53 | 56 | 40 | 25 | 13 | 8 | 5 | 3 |
30 | 5 | 19 | 27 | 20 | 18 | 14 | 7 | 7 | 4 | 2 |
20 | 5 | 7 | 8 | 11 | 9 | 8 | 5 | 3 | 3 | 3 |
0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0.5 | 0.6 | 0.7 | 0.8 | 0.9 | 1.0 |
%乙酸
表2.3.与浸入固定剂/溶液24小时后的湿重组织相关的DNA产率,相对于在PCR级水中悬浮24小时后可提取的DNA进行了标准化。
关于PEG 7%体积、分子量1600的数据,所有试验基于2×2×2mm、成年狗睾丸的组织样品。
%乙醇
70 | 4 | 4 | 5 | 3 | 3 | 2 | 4 | 2 | 3 | 2 |
60 | 4 | 15 | 17 | 18 | 8 | 5 | 5 | 3 | 3 | 1 |
50 | 6 | 12 | 29 | 23 | 12 | 9 | 5 | 4 | 2 | 2 |
40 | 6 | 11 | 27 | 18 | 13 | 8 | 3 | 2 | 2 | 2 |
30 | 5 | 9 | 16 | 11 | 9 | 6 | 3 | 2 | 2 | 3 |
20 | 4 | 5 | 4 | 6 | 2 | 5 | 4 | 1 | 1 | 1 |
0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0.5 | 0.6 | 0.7 | 0.8 | 0.9 | 1.0 |
%乙酸
d.DNA/RNA扩增
首先,研究了将参比人DNA直接暴露于固定剂以及构成组分的效应。
结果如图2所示。显而易见的是,对提取的DNA的主要损伤,无论在组织中发生在提取之前而原地,还是在提取之后,都是对以各种不同方式保存的DNA的PCR分析结果之间的差异的主要因素。
这些结果能部分地但不能完全地解释从组织样品提取的DNA的分析结果的重要性。
有趣的是,这些结果并不能从本发明固定剂的单独组分的结果的加合效应进行预测。特别是,低浓度的乙酸,尽管能稳定参比DNA,但当以低浓度加到混合物中时,具有显著的出乎预料的协同效应。可以看到,在更高浓度和更低浓度下,在浓度与对保存/可提取性的影响和对可扩增性的影响之间没有线性关系。
总之,这些稀释实验的结果表明,对于这个特定样品使用本发明的固定剂可扩增的DNA在量上是暴露于Kryofix后的大约20倍,并表明与甲醛接触甚至更有害。
图3显示了使用标准化用量的提取DNA(参见MM原文)以及扩增程序的代表性分析的结果。提供了1天(24小时)和7天的原样品(primary sample)的一系列的稀释。
从这些结果可以明显看出,与由参比标准化的人DNA接触得到的那些相比,在实际提取之后产率差异增加了。对于所述量的扩增产物,在24小时已经存在30-40倍的差异。
可以发现,随着样品尺寸增加到4×4×4mm,即使是在延长的接触之后,本发明的固定剂仅有轻微的降低。相反,使用Kryofix并且尤其是甲醛,在该样品尺寸下,存在显著较差的结果(结果未示出)。
使用各种固定剂进一步了进一步的实验,其中改变了PEG(MW 200)以及乙酸的百分比。结果如表3所示。具有更高浓度乙酸的组合物并没有落入本发明的范围。
表3.
乙酸变化对扩增产物产率的结果,平均自稀释系列产物系列,相对于水中的结果进行了标准化。
样品大小:中等(0.5×0.5 0.5cm),
在悬浮液中固定接触24小时,
在研磨和标准化的蛋白酶-K消化(3小时,56℃)后提取DNA。利用Qiagen提取和微型柱进行DNA纯化的人β珠蛋白基因引物PCR系统的结果,
在扩增前标准化用于反应的提取的DNA量(浓度)后进行扩增,RealTimeLight Cycler,Roche.
%PEG
48 | 1 | 1 | 11 | 17 | 21 | 14 | 6 | 3 | 1 | 1 | 1 |
36 | 2 | 4 | 18 | 30 | 33 | 36 | 15 | 11 | 4 | 1 | 1 |
24 | 5 | 7 | 22 | 55 | 63 | 54 | 25 | 19 | 5 | 1 | 1 |
12 | 6 | 13 | 33 | 74 | 79 | 87 | 44 | 30 | 5 | 1 | 1 |
6 | 8 | 34 | 66 | 78 | 112 | 98 | 64 | 15 | 6 | 1 | 1 |
3 | 3 | 28 | 57 | 71 | 92 | 85 | 56 | 13 | 5 | 2 | 1 |
1 | 2 | 16 | 36 | 42 | 84 | 46 | 46 | 12 | 4 | 1 | 1 |
0 | 0.02 | 0.05 | 0.1 | 0.2 | 0.4 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 |
%乙酸
根据上文提供的发现,显而易见的是,对于所有尺寸的组织样品内的目标诊断DNA的保存、提取和扩增,本发明的固定剂组合物产生了可证明的且可定量的结果。
浸入
看起来,整体效应中的部分效应是由于固定剂向组织的增强浸入作用。相对于小样品,这在采用本发明固定剂的较大样品内DNA保留的保存作用中尤其明显,在小样品中在其它固定剂的研究中情况不是这样的。
保存
根据实验,看起来显而易见的是,在研究条件下的DNA保存达到最大可能值的80%并且保持稳定达到4周以后。随后的实验证实,该效应维持达6个月。
提取
有很好的证据表明,本发明的固定剂改善了DNA/RNA从组织-生物样品的可提取性,比例达可供选择的那些溶液的20-40倍。
可扩增性
类似地,有定量信息表明,与可供选择的那些固定剂相比,暴露于本发明的固定剂后增加了DNA/RNA的可扩增性。
在这方面,本发明的固定剂提供了其它历史上可获得的或近期开发的有相同总体目的液体或溶液所不能有效提供的功能性。
根据结果显而易见的是,不能从单独的结果或从基于模型的计算预测本发明的固定剂组合物。对于所研究的类型和特性的样品,该组合物是最佳的。可能对于更大或小得多的样品,该组合物可以基于新试验采用进一步的改进进行改良。但是看起来是,根据发现的差别的一致性,如果DNA保存是整体目的,固定剂的明显更快浸入表明,本发明的固定剂甚至可能优先用于非常大的样品。
Claims (8)
1.一种用于保存组织和生物样品的固定剂组合物,它包含一种或多种烷醇、分子量为200-600的聚乙二醇、一种或多种弱有机酸以及水,其中每升所述固定剂组合物中前三种组分的总浓度为0.01-0.10摩尔,所述固定剂组合物基本上不含任何交联剂。
2.权利要求1的固定剂组合物,它包含:含量为10-60体积%的所述一种或多种烷醇,含量为1-20体积%的所述聚乙二醇,而且该组合物的余量是水。
3.权利要求2的固定剂组合物,它含有含量为5-10体积%的所述聚乙二醇。
4.前述权利要求中任一项的固定剂组合物,其中所述一种或多种弱有机酸以0.025-0.05摩尔/升的总浓度存在。
5.前述权利要求中任一项的固定剂组合物,其中所述烷醇具有1-6个碳原子。
6.权利要求5的固定剂组合物,其中所述烷醇包含乙醇。
7.前述权利要求中任一项的固定剂组合物,其中所述聚乙二醇的分子量为200-300。
8.前述权利要求中任一项的固定剂组合物,其中所述弱有机酸是乙酸。
Applications Claiming Priority (3)
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