CN108967414A - Usbu无福尔马林固定液及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明是一种无福尔马林的人体和动物标本固定液。USBU®无福尔马林固定液的主要成分是：乙醇、异丙醇、乙二醇、丙三醇、季戊四醇、3,4‑二羟基苯乙醇、无水磷酸氢二钠、磷酸二氢钠配制而成。本发明充分发挥了多羟基复合醇固定细胞组织的特性，即能充分固定人体或动物标本组织而又不破坏细胞结构和DNA、RNA信息，本发明更有意义的是能从根本上解决了福尔马林给科学研究者自身带来的毒害。

Description

USBU无福尔马林固定液及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及人体和动物标本组织固定液及其制备方法和应用领域，特别涉及到一种无福尔马林固定液标本的环保、安全处理方法及其应用。

背景技术

260年前，德国科学家发明了福尔马林用于固定保存人体和动物标本组织，由于福尔马林可以长期保存珍贵标本，在全世界的医学和生物研究中被广泛应用。福尔马林固定标本的优势是由于福尔马林具有较强的反应活性和化学应基，可以和带有—OH（羟基）、—SH（巯基）、—NH2（氨基）基团的分子发生亲核反应，最终作为亚甲基（—CH2—）的提供者，与上述基团中的两个基团反应，使自由的分子链被福尔马林交联起来，被固定组织失去原有的生理功能。人体的细胞和酶系统存在着大量的羟基、巯基、氨基，接触福尔马林后会立即发生反应，形成立体交联，产生蛋白质变性，福尔马林与标本的大分子之间形成三维的空间结构，可以达到长期保存标本的目的；虽然福尔马林在全世界病理实验室得到应用和推广，但是，福尔马林固定标本也给人类带来了极大的危害。

（1）福尔马林是一种有毒性的，致癌性很强的试剂。世界卫组织自2006年10月，把它列为呼吸道病变，过敏和呼吸道疾病，被列为致癌物质。

（2）标本使用福尔马林固定，是医学研究和分子生物学技术在识别靶向治疗的病人分析中的一个主要障碍。由于醛基和固定组织的化学反应－三维醛基结构，严重地干扰了检测信号。

（3）福尔马林的化学作用，严重地与DNA，RNA和蛋白质结合，使组织很难甚至是不可能的提取充足的DNA,RNA,不能精确预测癌症细胞的突变的位点，限制了病理诊断和药物开发的准确性和精确度。

本发明USBU无福尔马林固定液是福尔马林固定液的替代产品，它不但保护了人体和动物标本组织结构和细胞的形态和DNA、RNA的分子结构不变，而且是对人类安全环保的绿色产品。

发明内容

本发明提供USBU无福尔马林固定液及其制备方法和应用，其USBU无福尔马林固定液选用多羟基醇作为主要成分：异丙醇、乙醇、乙二醇、丙三醇、季戊四醇、3,4-二羟基苯乙醇、无水磷酸氢二钠、磷酸二氢钠混合而成。应用以上的固定液可固定人体和动物组织标本，固定后的标本可以应用到普通形态学图像诊断、免疫组织化学（抗原与抗体结合）的图像诊断、信息RNA的原位杂交实验、PCR、DNA抽取与测序、RNA的抽取等生物医学诊断与研究。USBU无福尔马林保护病理标本的固定液是一种新型的对DNA和RNA有高保护性的固定液，保护了DNA，RNA以及细胞结构，保存完整的组织信息，有助于临床病理诊断和细胞靶向精确定位的生物医学研究。

附图为USBU无福尔马林固定液与福尔马林固定液对照组比较的结果

图1是HE形态结构图像

图2是免疫组织化学(Immunohistochemistry)形态成像

图3是原位杂交（in situ hybridization）信号成像

图4是DNA抽取

图5是RNA抽取

图6是无福尔马林固定组织芯片

本发明的实施步骤如下：

实施例一

按体积百分比

乙醇 40 %

异丙醇 40 %

乙二醇 4 %

丙三醇 2 %

季戊四醇 0.5 %

3,4-二羟基苯乙醇 1.5 %

无水磷酸氢二钠 6 %

磷酸二氢钠 4 %

充分搅拌后制成USBU无福尔马林保护病理标本的固定液。

实施例二

按体积百分比

乙醇 46%

异丙醇 34%

乙二醇 5%

丙三醇 1%

季戊四醇 1%

3,4-二羟基苯乙醇 1%

无水磷酸氢二钠 6%

磷酸二氢钠 4%

充分搅拌后制成USBU无福尔马林保护病理标本的固定液。

实施例三

按体积百分比

乙醇 49%

异丙醇 31%

乙二醇 3%

丙三醇 2%

季戊四醇 1.5 %

3,4-二羟基苯乙醇 1.5 %

无水磷酸氢二钠 6%

磷酸二氢钠 4%

充分搅拌后制成USBU无福尔马林保护病理标本的固定液。

本发明的USBU无福尔马林固定液处理过的标本组织与福尔马林固定的组织标本结果对照

1. HE形态结构图像见图1

本发明的USBU无福尔马林固定液处理过的标本组织，皮肤、腺体、器官和癌症细胞的形态清晰可见，形态完整。优于福尔马林固定的标本组织。

2. 免疫组织化学(Immunohistochemistry)形态成像见图2

本发明的USBU无福尔马林固定液处理过的标本组织，清晰可见CD11、IB4、NF-200和c-fos在组织细胞抗原信号。结果证明经过USBU无福尔马林固定液处理过的标本组织优于福尔马林处理过的标本组织。

3. 原位杂交（in situ hybridization）信号成像见图3

本发明的USBU无福尔马林固定液处理过的标本组织， mRNA信息在组织细胞上清晰可见而且信号强，背景干扰低。USBU无福尔马林固定液处理过的标本组织优于福尔马林处理过的标本组织。

4. DNA抽取见图4

本发明的USBU无福尔马林固定液处理过的标本组织，DNA抽取率高出福尔马林和冰冻组织。USBU无福尔马林固定液处理过的标本组织的DNA质量比福尔马林固定的标本好，获得的样本可以很容易地测序。

5. RNA抽取见图5

本发明的USBU无福尔马林固定液处理过的标本组织，RNA抽取率高于冰冻组织和福尔马林处理过的标本组织。

6. 本发明的USBU无福尔马林固定组织芯片见图6

结论：1. 本发明的USBU无福尔马林固定液处理过的标本组织，它不仅能保护组织和细胞的结构，而且保护了DNA，RNA信息。

2. 本发明的USBU无福尔马林固定液处理过的标本组织，病理切片的HE和免疫组织化学染色信号强于福尔马林处理过的标本。

3. 本发明的USBU无福尔马林固定液处理过的标本组织，可用于组织芯片的制备。处理过的组织不干脆，适合集约化组织信息，可为组织芯片制备仪器提供优质标本，优于福尔马林处理的标本。

4. 本发明的USBU无福尔马林固定液处理过的标本组织，含高质量的病理及生物信息，靶向定位信号强于福尔马林处理的标本组织，适合用于开发新药和找到靶向位点。

5. 本发明的USBU无福尔马林固定液处理过的标本组织，从根本上解决了福尔马林给科学研究者带来的危害。

Claims (4)

1.本发明的USBU无福尔马林固定液及其制备方法和应用，其USBU无福尔马林固定液是由如下重量百分比的原料制备而成：异丙醇、乙醇、乙二醇、丙三醇、季戊四醇、3,4-二羟基苯乙醇、无水磷酸氢二钠、磷酸二氢钠混合而成，应用以上的固定液可固定人体和动物标本组织固定后的标本，经过USBU无福尔马林固定液处理的标本，可以应用到临床病理诊断、普通形态学图像诊断、免疫组织化学（抗原与抗体结合）的图像诊断、信息RNA的原位杂交实验、PCR、DNA抽取与测序、RNA的抽取等生物医学领域。

2.根据权利要求1所述的USBU无福尔马林固定液及其制备方法和应用，其USBU无福尔马林固定液的特征在于：异丙醇为固定液总量的25-45%，其中选用32-39%为最佳；乙醇为固定液总量的31-49%，其中选用39-49%为最佳；乙二醇固定液总量的2-9%， 其中选用3-7为最佳；丙三醇为固定液总量的0.5-3%，其中1-2为最佳；季戊四醇为固定液总量的0.3-3%， 其中0.8-1.2为最佳。

3.根据权利要求1所述的USBU无福尔马林固定液及其制备方法和应用，其USBU无福尔马林固定液的特征在于使用固定液固定标本时，依据标本厚度而定时间；标本厚度为3毫米、5毫米、10毫米、20毫米时，固定时间以此为4小时、8小时、24小时和48小时以后，可提供医学诊断和生物研究使用。

4.根据权利要求1所述的USBU无福尔马林固定液及其制备方法和应用，其USBU无福尔马林固定液的特征在于：使用固定液固定整个人体和动物标本时，需要灌流标本，灌流液是体重的二倍，灌流后浸泡在100%的固定液里保存标本。