CN101085348B

CN101085348B - 用于禽流感灭活抗原的鼻腔免疫复合佐剂

Info

Publication number: CN101085348B
Application number: CN2007100243855A
Authority: CN
Inventors: 杨倩; 张晓文
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2007-06-18
Filing date: 2007-06-18
Publication date: 2010-08-18
Anticipated expiration: 2027-06-18
Also published as: CN101085348A

Abstract

本发明涉及一种用于禽流感灭活抗原的鼻腔免疫复合佐剂，属于生物技术领域，专用于禽流感灭活抗原的应用。按动物体重每公斤使用免疫佐剂用量为0.1mg/kg，该复合佐剂由CpG DNA和胆酸钠按质量比为5∶2混合或配合而成。本发明用于禽流感灭活抗原的鼻腔免疫复合佐剂配合禽流感灭活抗原通过鼻腔免疫能够有效提高黏膜局部免疫和全身体液免疫力，避免肌肉注射免疫程序，减少鸡群应激反应，也为提高鸡肉品质提供了保证。为禽流感的预防提供了一条较理想的免疫途径。

Description

用于禽流感灭活抗原的鼻腔免疫复合佐剂

一、技术领域

本发明涉及一种用于禽流感灭活抗原的鼻腔免疫复合佐剂，属于生物技术领域，专用于禽流感灭活抗原鼻腔黏膜免疫的免疫效果。

二、背景技术

1呼吸道黏膜免疫的特点

鼻腔生理环境温和，抗原诱导免疫反应的阈值比较低。一些研究发现，鼻腔免疫既可有效的激发局部免疫应答，亦可诱导全身免疫应答。因此，鼻腔免疫越来越受到免疫学家们的关注。许多研究报道鼻腔免疫能够诱导呼吸道产生较高的特异性抗体水平。但是单独应用灭活苗通过鼻腔免疫一般不能有效的刺激机体产生免疫应答。最近发现，灭活苗配合免疫佐剂通过鼻腔免疫能诱导体内产生特异性抗。如将CpG和福尔马林灭活的流感病毒共同免疫动物，在血清、唾液和阴道分泌物中均能产生高水平的特异性抗体。Higaki等研究发现，流感灭活疫苗与聚苯乙烯磺酸钠树脂结合后在小鼠鼻内进行免疫，可诱导较高水平的IgA。Alan Coulter等曾报道用灭活的流感疫苗添加佐剂后鼻腔免疫小鼠，能够提高局部IgA水平和血清中IgG水平；国内外多许多学者证实鼻腔免疫动物后均能够诱导局部和全身的抗体应答。

2黏膜免疫佐剂的研究进展

目前，黏膜免疫佐剂已成为黏膜免疫的研究热点之一，黏膜免疫佐剂主要类型有细菌佐剂、核酸佐剂、细胞因子佐剂、无机成分佐剂和投递系统。

研究发现卡介苗中含有特殊的核酸序列——单链CpG(胞嘧啶，鸟嘌呤)序列，能特异性的增加抗原的免疫原性。目前把含有未甲基化CpG基序的DNA、细菌的质粒DNA以及人工合成的寡核甘酸统称为CpG DNA，即核酸佐剂或具有免疫刺激作用的DNA序列(immunostimulatory sequences，ISS)，当将它们与蛋白质抗原的疫苗共同使用时，可诱导以细胞免疫为主的免疫反应。实验证实，CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)作为黏膜佐剂能促进机体对乙型肝炎表面抗原(HbsAg)的系统和黏膜免疫应答。CpG DNA可改进其它佐剂诱导Th2类型应答的缺点，如把CpG-ODN与CT或氢氧化铝等佐剂联用，先诱导出混合型的Th1和Th2类应答，然后转向Th1类型的应答。

细胞因子是机体在免疫反应时T淋巴细胞产生的免疫调节物质，细菌毒素与CpG都是通过细胞因子发挥佐剂效应的，而大多数细胞因子又具有调整和重建免疫应答的能力，因此可直接作为佐剂发挥作用。目前进行实验研究的主要有IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γ、GM-CSF等。IL-2是动物体内免疫应答的重要调节因子，具有多效性、高效性和反应快等特点，可以改善免疫功能，对多种抗原均有增强作用。IL-2在淋巴细胞的增殖过程中起轴心作用，可激发和维护淋巴细胞的生长，最终导致淋巴细胞的分化与增殖，维持免疫自身稳定。

应用氟化物作为黏膜免疫佐剂的研究已有报道。Sumio等研究发现黏膜佐剂NaF能够消除口服耐受，引起抗体反应增加。鸡同时口服抗原与NaF后，血清IgG抗体水平明显增加。尽管鸡群有个体差异，并且抗体滴度较低，但在胆汁和泪液中均检测到IgA抗体。氟化铝可诱导大鼠T细胞中多聚磷酸肌醇降解为磷酸肌醇，升高细胞内自由Ca2+，并使T细胞受体的γ和ε链进行磷酸化，从而T细胞进入活化的早期阶段。另外，合成多聚体和亲脂性季铵盐也可作为黏膜佐剂。

植物雌激素-大豆黄酮是一种存在于豆科植物中的植物异黄酮类化合物，具有雌激素样或抗雌激素样的双重作用。研究表明，植物雌激素对机体的非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫均有不同程度的影响。植物雌激素可影响巨噬细胞的吞噬功能。高峰等在雏公鸡的基础日粮中添加大豆黄酮后发现雏鸡的免疫器官胸腺和法氏囊的相对重量显著提高，脾脏无明显变化，同时T淋巴细胞对植物血凝素(PHA)的刺激反应显著提高，说明雏公鸡细胞免疫增强。如果大豆黄酮能用作黏膜免疫佐剂，不仅可以提高动物的生产能力，还可以预防家禽的传染病。

3黏膜免疫佐剂在预防禽流感中的意义

禽流感(Avian Influenza，AI)是由正黏病毒科A型流感病毒属的流感病毒引起的一种烈性传染病，它不仅给世界的养禽业造成了巨大的损害，而且对人类的健康和生命安全亦构成了严重的威胁。禽流感病毒具有极强的抗原变异性，容易从弱毒株变异成高致病力毒株，所以预防禽流感不宜使用弱毒疫苗。目前禽流感油乳剂灭活苗通过肌肉注射是养鸡场常用预防禽流感的办法。但肌肉注射常常导致动物过强的应激反应从而影响动物的生长，此外，油乳剂注射到肌肉后还可引起肌肉品质的降低。因此寻找一条有效的免疫途径势在必行。

禽流感的传播主要以呼吸道为主要途径。弱毒疫苗经鼻腔免疫不仅可有效的激发局部免疫应答，直接切断病原微生物的入侵，还可诱导全身免疫应答。而单独应用灭活苗通过鼻腔免疫一般不能有效的刺激机体产生免疫应答。最近研究发现，灭活苗如果配合免疫佐剂通过鼻腔免疫则能诱导体内产生特异性抗。因此，本研究选取免疫佐剂CpG和重组IL-2分别与禽流感灭活抗原的配合，通过鼻腔免疫探讨对鸡呼吸道局部细胞、体液免疫水平以及全身免疫水平的影响，为更有效、便捷、安全的预防禽流感提供一条较理想的免疫途径。

4黏膜吸收促进剂在在鼻腔免疫的意义

黏膜吸收促进剂可以降低黏膜层黏度、提高膜通透性，使与抗原接触部位上皮细胞间的紧密连接暂时疏松，增强抗原在细胞间和细胞内的通透性，有利于灭活抗原的吸收。本文选取吸收促进剂胆酸钠与免疫佐剂CpG混合，然后再与禽流感灭活抗原配合，通过鼻腔免疫，证实禽流感灭活抗原通过鼻腔免疫可以提高鸡呼吸道局部免疫水平以及全身免疫水平，为更有效、便捷、安全的预防禽流感提供理论基础。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种鼻腔黏膜免疫的复合佐剂，专用于与禽流感灭活抗原配合通过鼻腔免疫，用于增强机体局部黏膜免疫力和全身免疫力，更有效、便捷、安全的预防禽流感的发生。

技术方案

本发明提供了一种用于禽流感灭活抗原鼻腔黏膜免疫的复合佐剂：该复合佐剂由寡脱氧核苷酸CpG DNA和胆酸钠按质量比为5∶2混合或配合而成，按动物体重每公斤使用免疫佐剂0.1毫克即可。

有益效果

1.鼻腔黏膜免疫复合佐剂配合禽流感H5N2灭活抗原经过鼻腔免疫鸡后，鸡呼吸道局部细胞免疫水平明显提高，具体表现在气管、气管叉和肺中上皮内淋巴细胞数量、CD3+阳性细胞数量、肥大细胞数量比对照组显著或极显著增多(P＜0.05或P＜0.01)；而单独使用禽流感灭活抗原这些细胞的数量则无显著变化。(图7，图8，图9，图10)

2.鼻腔黏膜免疫复合佐剂配合禽流感H5N2灭活抗原经过鼻腔免疫鸡后，鸡呼吸道局部体液免疫水平也明显提高。具体表现在气管、气管叉和肺中IgA和IgG分泌细胞数量比对照组显著或极显著增多(P＜0.05或P＜0.01)。而单独使用禽流感灭活抗原这些细胞的数量则无显著变化。(图7，图9)

3.鼻腔黏膜免疫复合佐剂配合禽流感H5N2灭活抗原经过鼻腔免疫鸡后，鸡全身免疫水平也明显增加。具体表现在血清中禽流感特异性抗体水平比对照组明显升高。而单独使用禽流感灭活抗原血清中基本上没有产生特异性抗体。血清特异性IgA抗体水平增加，但差异不显著。(图11)

4.以上复合佐剂配合禽流感H5N2灭活抗原经过鼻腔免疫鸡后攻毒试验表明，(首免后21天选用ELD50为10^6.2的H5N1强毒株，以0.1ml/只的剂量经鼻腔人工感染鸡群)。从攻毒后第2天开始，单独使用禽流感灭活抗原组和对照组的鸡陆续发病，至第3天全部死亡。而使用复合佐剂攻毒后第3天，存活率为91.7％；至攻毒后12天，鸡才全部死亡。结果表明复合佐剂明显推迟了鸡群发病和死亡的时间，而对照组和单独使用禽流感灭活抗原的鸡对H5N1强毒株无抵抗力，提示CpG佐剂组的免疫效果明显高于单独使用禽流感灭活抗原组和对照组，禽流感灭活抗原与佐剂配合鼻腔免疫后，鸡群能够在一定程度上抵抗H5N1强毒株的攻击。

5.本发明所提供的复合黏膜免疫佐剂可用于禽流感H5N2灭活抗原，显著提高疫苗的免疫效果。复合佐剂中胆酸钠有成品出售，CpG DNA经提取后(CpG DNA公知公用，见参考文献：崔义邦，何孔旺，陆承平，郭爱珍细菌CpGDNA对鸡接种禽流感病毒H9亚型灭活苗的免疫增强作用中国兽医学报2005 25(2)：135～137)即可使用。同时，复合佐剂成本较低，每只平均为2.5016分。禽流感灭活抗原的价格比禽流感灭活疫苗的低的多。因此，本发明(复合黏膜免疫佐剂)配合禽流感灭活抗原通过鼻腔免疫能够有效提高黏膜局部免疫和全身体液免疫力，避免肌肉注射免疫程序，减少鸡群应激反应，为提高鸡肉品质提供了保证。同时也大大降低免疫预防的成本价格，为禽流感的预防提供了一条较理想的免疫途径。

四、附图说明

图1气管的上皮内淋巴细胞

图2气管叉的CD3⁺T细胞

图3喉部的肥大细胞

图4肺中的IgA分泌细胞

图5气管叉的IgA分泌细胞

图6气管叉的IgG分泌细胞

图7禽流感灭活抗原与佐剂配合鼻腔免疫后对气管叉中IgA分泌细胞的影响

图8禽流感灭活抗原与佐剂配合鼻腔免疫后对气管中CD3+细胞的影响

图9禽流感灭活抗原与佐剂配合鼻腔免疫后对气管中IgG分泌细胞的影响

图10禽流感灭活抗原与佐剂配合鼻腔免疫后对气管中上皮内淋巴细胞的影响

图11禽流感灭活抗原与佐剂配合鼻腔免疫后血清中HI效价的水平

五、具体实施方式

将胆酸钠与CpG DNA和禽流感H5N2灭活抗原配合鼻腔免疫SPF鸡，每只鸡(约700克)：CpG 50μg+胆酸钠20μg，研究对鸡呼吸道局部和全身免疫水平的影响。首先，本项目进行了第一期试验。按照计划分别应用CpG DNA(提取方法见参考文献：崔义邦，何孔旺，陆承平，郭爱珍细菌CpGDNA对鸡接种禽流感病毒H9亚型灭活苗的免疫增强作用中国兽医学报2005 25(2)：135～137)、胆酸钠为黏膜免疫佐剂与禽流感灭活抗原(购自农业部动物检疫所)配合。

以上鼻腔黏膜免疫复合佐剂分别与禽流感灭活抗原配合免疫1日龄健康SPF鸡，14日龄加强免疫一次。禽流感灭活抗原的用量为每只EID50 10⁶，胆酸钠用量为20μg。CpG的剂量为每只鸡50μg。

分别于首免后第3、5、7周杀鸡取材，每次每组宰杀10只。于相同部位取鼻腔、喉部、气管、气管叉及肺，用Bouin氏液固定，常规石蜡切片，切片8μm厚。通过饮水免疫雏鸡，在首免后第3、5、7周取材。分别检测了呼吸道各段(喉部、气管、气管叉和肺)各种免疫活性细胞的数量变化以及血清中禽流感特异性抗体的变化。结果发现上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocytes，IEL)、CD3+T细胞以及肥大细胞(mast cell，MC)数量显著和极显著增多(P＜0.05和P＜0.01＝(图8)，IgA和IgG分泌细胞数量也呈显著和极显著增多(P＜0.05和P＜0.01＝(图7和图9)，同时血清中禽流感血凝抑制(Haemagglutination inhibition，HI)效价明显升高＝(图11)。而单独应用禽流感灭活抗原进行鼻腔免疫对呼吸道局部以上免疫细胞没有明显影响，动物血清中也没有禽流感特异性抗体产生(图11)。研究表明CpG DNA和胆酸钠可明显增加禽流感灭活抗原黏膜免疫效果。

攻毒保护试验：用复合黏膜免疫佐剂与新城疫疫苗免疫鸡群，共24只鸡。免疫后第67天用新城疫强毒株F48E2对鸡群进行攻击。复合佐剂组的鸡在攻毒后第4天有2只出现轻微精神症状，其它正常；攻毒后第7天后全部正常，存活率为100％。新城疫组的鸡在攻毒后第4天死亡3只，存活率50％；攻毒后第5天死亡2只，存活率16.67％；攻毒后第6天全部死亡；对照组的鸡在攻毒后第四天全部死亡。结果表明，添加复合黏膜免疫佐剂后可以有效保护鸡群。

将CpG与胆酸钠和禽流感H5N2灭活抗原配合鼻腔免疫SPF鸡。首免后7天加强免疫一次，首免后21天，选用ELD50为106.2的H5N1强毒株，以0.1ml/只的剂量(此剂量为肌肉注射所需)经鼻腔人工感染鸡群。从攻毒后第2天开始，单独使用禽流感H5N2灭活抗原组和对照组的鸡陆续发病，至第3天全部死亡。而复合佐剂配合禽流感H5N2灭活抗原免疫的SPF鸡至攻毒后第3天，存活率为91.7％；至攻毒后12天，鸡全部死亡。结果表明复合佐剂可明显推迟了鸡群发病和死亡的时间，而对照组和单独使用禽流感灭活抗原的鸡对H5N1强毒株无抵抗力，提示禽流感灭活抗原与佐剂配合鼻腔免疫后，鸡群能够在一定程度上抵抗H5N1强毒株的攻击。

在本次攻毒保护试验中，我们选用的禽流感H5N1为特强毒株，而且剂量与肌肉注射的相同(鼻腔攻毒剂量至少要减半，目前国内有关通过黏膜进行攻毒剂量还未见报道)，至使复合佐剂配合禽流感H5N2灭活抗原免疫的SPF鸡只坚持活到11天。

表1.免疫鸡在禽流感病毒H5N1亚型强毒株攻击后的存活情况

Claims

1.一种专用于禽流感灭活抗原的鼻腔免疫复合佐剂，其特征在于，该复合佐剂由CpG DNA和胆酸钠按质量比为5∶2混合而成，在动物实施鼻腔免疫时，按动物体重每公斤使用免疫佐剂0.1毫克即可。