CN101078013A - 神经营养因子BDNF、NT－3信号通路新成员Dok5的鉴定和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及神经营养因子BDNF、NT－3信号通路一个新成员Dok5的鉴定和应用。本发明克隆了人dok5的基因，该基因编码一个胞浆信号蛋白。通过酵母双杂交实验、pulldown实验和免疫共沉淀实验，我们证明Dok5能够以依赖于受体磷酸化的方式结合BDNF、NT－3的受体TrkB、TrkC胞内区的NPQY模体。细胞荧光实验显示Dok5与TrkB、TrkC受体在PC12细胞中共定位。对MAPK信号通路的检测显示，Dok5能够有效增强BNDF、NT－3诱导的MAPK信号通路的活化水平并延长其活化时间。BDNF、NT－3作为多种神经系统疾病的治疗药物，已经进入临床实验，而Dok5能够结合BDNF、NT－3的受体TrkB、TrkC，并能够有效增强BDNF、NT－3信号通路的活化，这为治疗多种神经系统疾病提供了新的作用靶点，因此可用于开发神经系统疾病的药物。

Description

神经营养因子BDNF、NT-3信号通路新成员Dok5的鉴定和应用

技术领域

本发明属于基因克隆和功能、药物研发和治疗领域。具体地说，本发明涉及人基因dok5的克隆，涉及神经营养因子BDNF、NT-3信号通路的新成员Dok5的鉴定和应用，涉及使用酵母双杂交技术、Western Blot技术和细胞荧光技术验证蛋白相互作用，涉及利用Dok5基因和蛋白以及Trk-Dok5介导的BNDF、NT-3信号通路进行药物设计以及临床诊断和治疗等领域。

背景技术：

神经系统是目前所知的最为复杂的系统之一。神经系统相关疾病一直困扰着人类健康。尤其是随着全球逐渐步入老龄化社会，神经系统退行性疾病例如阿尔茨海默病(Alzheimer’sDisease)、帕金森病(Parkinson’s Disease)等已经成为威胁人类健康和社会正常发展的重要因素。寻找和开发治疗神经系统相关疾病的新药物、新方法已经成为各国和各大制药巨头的研发重点和热点。

神经退行性疾病多是由于神经元的凋亡引起的，如阿尔茨海默病表现为广泛的大脑皮层神经元丧失，尤其是海马和基底前脑的胆碱能神经元的退化；帕金森病表现为黑质纹状体多巴胺能神经元的大量缺失。除了环境中的氧化应激损害导致的神经元凋亡，随着年龄的增长，中枢神经系统的神经元不能获得足够的营养因子，也是神经元大量死亡的重要原因。而如果为神经元提供充足的营养因子就能够有效维持神经元的存活，延缓神经退行性疾病的进程。因此，有效增加神经元外部环境的营养因子浓度或是增加神经元对有限的营养因子的反应性，成为治疗神经退行性疾病重要的选择方案之一。

神经营养素家族营养因子是神经系统重要的营养因子，参与神经细胞的增殖、发育、分化、迁移和损伤后再生等。该家族因子BDNF(brain derived neurotrophic factor)和NT-3(neurotrophin-3)能够有效保护神经元，维持神经元的存活，并参与神经损伤后的修复过程。目前，已有美国医药公司正在进行BDNF、NT-3的开发与临床实验。

本发明克隆了人神经系统高表达的dok5基因，该基因编码一个细胞信号蛋白。我们通过酵母双杂交实验证明了Dok5参与BDNF、NT-3信号转导。随后我们通过突变分析、pulldown实验、免疫共沉淀实验证明Dok5以依赖于受体磷酸化的方式结合BDNF、NT-3的受体TrkB、TrkC胞内区的NPQY模体。在PC12细胞中Dok5与TrkB、TrkC受体共定位。通过对信号通路的检测，我们发现Dok5能够有效提高BDNF、NT-3诱导的MAPK信号通路的活化程度和延长其活化时间。因此，Dok5参神经营养因子BDNF、NT-3的信号转导，并可以有效增强其效果。Dok5作为BDNF、NT-3信号通路新成员的发现，为治疗神经退行性疾病提供了新的靶点，以TrkB、TrkC和Dok5为把点的药物设计可以增强神经元对有限的BNDF、NT-3的反应性，具有十分广阔的临床应用前景。

发明内容

本发明是在研究神经营养因子BDNF、NT-3信号通路在神经系统中的功能和应用的基础上进行的。通过生物信息学分析和相关文献分析，我们鉴定了BDNF、NT-3信号通路的一个新成员Dok5。Dok5是神经系统高表达的接头蛋白，是细胞信号网络的重要成员之一。已有文献报道Dok5参与神经系统重要的营养因子神经胶质细胞衍生生长因子(GDNF，glial cell line-derivedneurotrophic factor)的信号传导，并可能参与神经元的发育分化。

本发明克隆了人dok5基因，并首次证明Dok5能够参与神经营养因子BDNF、NT-3的信号通路。通过酵母双杂交实验，我们证明Dok5通过PTB结构域结合神经营养因子BDNF、NT-3受体TrkB、TrkC的胞内区。随后通过突变分析，我们确定Dok5以依赖于受体磷酸化的方式结合TrkB、TrkC受体胞内区的NPQY模体。GST pulldown实验证明GST-Dok5-PTB融合蛋白可以在体外结合BDNF、NT-3刺激后活化的TrkB、TrkC受体。通过免疫共沉淀实验进一步证明，Dok5能够结合磷酸化的TrkB、TrkC受体NPQY模体。PC12细胞系是研究神经细胞体外分化的很好的模型，细胞荧光实验显示Dok5与TrkB、TrkC受体在分化的PC12细胞中共定位。通过对MAPK信号通路的检测，我们发现Dok 5能够有效增强BDNF、NT-3介导的MAPK信号通路的活化并延长该通路的活化时间。

神经营养因子BNDF、NT-3在神经系统中具有重要的功能，参与神经元的增殖、发育、分化、维持其正常的生理功能和存活。BDNF、NT-3在神经系统退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化等的临床治疗中具有广泛的应用前景，目前BDNF、NT-3作为神经系统疾病的治疗药物在美国已经进入临床试验。Dok5作为BDNF、NT-3信号通路新成员的鉴定，为研发治疗多种神经退行性疾病的药物提供了新的靶点。并且，Dok5能够增强细胞对BDNF、NT-3的反应性，有效增强MAPK信号通路的活化程度，而该通路在神经损伤后修复、保护神经细胞免受外界氧化损害维持神经元存活等过程具有重要作用。因此，Dok5参与BDNF、NT-3信号通路的发现具有重要的临床意义，可能在针对神经系统疾病的药物研发和治疗中具有潜在的应用价值。

本发明的主要技术特征在于：

(1)人神经系统高表达基因dok5的克隆；

(2)利用酵母双杂交实验和GST pulldown实验确定Dok 5通过PTB结构域结合TrkB、TrkC受体的胞内区；

(3)利用酵母双杂交实验和免疫共沉淀实验确定Dok5以依赖于受体磷酸化的方式结合TrkB、TrkC受体胞内区的NPQY模体；

(4)细胞荧光实验显示Dok5与TrkB、TrkC在PC12细胞中共定位；

(5)MAPK信号通路检测显示Dok5有效增强BDNF、NT-3信号通路的活化水平并延长其活化时间。

附图说明

下面结合所附图表对本发明作进一步详细描述。

序列表1，人dok5的cDNA序列。

序列表2，人Dok5蛋白的氨基酸序列。

图1，酵母双杂交验证Dok5与BDNF、NT-3受体TrkB、TrkC胞内区相互作用。

上图：Dok5结合TrkB、TrkC受体胞内区。

下图：Dok5 PTB结构域结合TrkB、TrkC受体。

图2，酵母双杂交验证Dok5结合TrkB、TrkC受体胞内区NPQY模体。

上图：TrkB突变体M1，M2不能结合Dok5，说明Dok5以依赖于磷酸化方式结合TrkB受体。TrkB突变体：BM1(K572A)，BM2(Y516F)，BM3(Y702A)，BM4(Y706D)，BM5(Y707E)，BM6(Y817F)。

下图：TrkC突变体M1，M2不能结合Dok5，说明Dok5以依赖于磷酸化方式结合TrkC受体。TrkB突变体：CM1(K572A)，CM2(Y516F)，CM3(Y705A)，CM4(Y709D)，CM5(Y710E)，CM6(Y820F)。

图3，GST pulldown实验验证Dok5 PTB结构域在体外结合磷酸化的TrkB、TrkC受体。GST-Dok5PTB融合蛋白只能结合BDNF、NT-3刺激后活化的(磷酸化的)TrkB、TrkC受体，不能结合未活化的受体。

图4，免疫共沉淀实验证明Dok5以依赖于磷酸化的方式结合TrkB、TrkC受体NPQY模体

左图：Dok5以依赖受体磷酸化的方式结合TrkB受体的NPQY模体。

右图：Dok5以依赖受体磷酸化的方式结合TrkC受体的NPQY模体。

图5，Dok5与TrkB、TrkC受体在分化的PC12细胞中共定位

A Dok5-EGFP在分化的PC12细胞中的定位

B TrkB-mRFP在分化的PC12细胞中的定位

C Dok5-EGFP与TrkB-mRFP在分化的PC12细胞中共定位

D Dok5-EGFP在分化的PC12细胞中的定位

E TrkC-mRFP在分化的PC12细胞中的定位

F Dok5-EGFP与TrkC-mRFP在分化的PC12细胞中共定位

图6，Dok5参与BDNF、NT-3介导的MAPK信号通路的活化，可以有效增强活化强度延长活化时间。

A：Dok5增强BDNF诱导的MAPK信号通路的活化水平，并延长活化时间

B：Dok5增强NT-3诱导的MAPK信号通路的活化水平，并延长活化时间

具体实施方式

在下面的实施例中进一步说明了本发明，但并不限制本发明的范围。

实施例1

本发明中使用的引物序列及用途：

引物名称	序列	用途
			Dok5 pACT2upper	5′-CGGAATTCGAATGGCTTCCAATTTTAATGACATAGT-3′	酵母双杂交验证
Dok5 pACT2lower	5′-CCGCTCGAGTCAGTGCTCAGATCTTAGGCT-3′	酵母双杂交验证
			Dok5 PH domainpACT2 upper	5′-CGGAATTCGAATGGCTTCCAATTTTAATGACATAGT-3′	酵母双杂交验证
Dok 5PH domainpACT2 lower	5′-CCGCTCGAGTACACACTCCATCTGGAGTCATTTG-3′	酵母双杂交验证
			Dok 5PTBdomain pACT2upper	5′-CGGAATTCGAGCCACTGGGGTTGAGAGA-3′	酵母双杂交验证
Dok5 PTBdomain pACT2lower	5′-CCGCTCGAGCTCGGCTATGGCCAAGG-3′	酵母双杂交验证

Dok5C-terminuspACT2 upper	5′-CGGAATTCGACAGCACGAGCGCTTGC-3′	酵母双杂交验证
			Dok5C-terminuspACT2 lower	5′-CCGCTCGAGTCAGTGCTCAGATCTTAGGCT-3′	酵母双杂交验证
Dok5 PH domainpACT2 upper	5′-CGGAATTCGAATGGCTTCCAATTTTAATGACATAGT-3′	酵母双杂交验证
			Dok 5PH domainpACT2 lower	5′-CCGCTCGAGTACACACTCCATCTGGAGTCATTTG-′3	酵母双杂交验证
Dok5 PTBdomian pACT2upper	5′-CGGAATTCGAGCCACTGGGGTTGAGAGA-3′	酵母双杂交验证
			Dok5 PTBdomian pACT2lower	5′-CCGCTCGAGCTCGGCTATGGCCAAGG-3′	酵母双杂交验证
Dok5C-terminuspACT2 upper	5′-CGGAATTCGACAGCACGAGCGCTTGC-3′	酵母双杂交验证
			Dok5C-terminuspACT2 lower	5′-CCGCTCGAGTCAGTGCTCAGATCTTAGGCT-3′	酵母双杂交验证
Dok5 EGFP-N1lower	5′-CGGAATTCGGTGCTCAGATCTGTAGGC-3′	绿色荧光蛋白表达
			Dok5 pcDNA3.1FLAG lower	5′-CCGCTCGAGTCAGTGCTCAGATCTTAGGCT-3′	真核细胞表达
Dok5 EGFP-N1upper	5′-CCGCTCGAGACCATGGCTTCCAATTTTAATG-3′	绿色荧光蛋白表达
			Dok5 EGFP-N1lower	5′-CGGAATTCGGTGCTCAGATCTGTAGGC-3′	绿色荧光蛋白表达

实施例2

酵母双杂交验证Dok5与TrkB、TrkC受体的相互作用

选择数个直径为2-3mm的酵母菌落，接入10ml YPD液体培养基中，30℃振荡培养过夜。将这些过夜培养物转入200-500ml的YPD培养基，230rpm培养3-5小时，使OD600nm达到0.4～0.5。室温下(20-21℃)，4,000rpm离心15分钟，弃去上清。用300ml无菌去离子水洗涤细胞，4,000rpm离心15分钟，弃上清。用新配制的1×TE/LiAc溶液重悬细胞即成为感受态细胞。在1.5ml离心管中加入100ul变性的鲑精DNA(10mg/ml)和一定量的转化质粒，混匀后加100ul感受态细胞，再加入0.6mlPEG/LiAc溶液，剧烈振荡混匀。30℃，200rpm，振荡培养30分钟。加入约70ulDMSO至终浓度为10％，颠倒数次混匀，42℃热击15分钟(每5分钟振荡混匀)，后置冰浴中冷却。室温，12,000rpm离心30秒收集细胞，沉淀用50ul 1×TE溶液重悬。将酵母细胞铺于特定的营养缺陷选择培养基上，30℃倒置培养4-7天。将长出的阳性克隆从培养板上挑到标记的新的SD/-Trp，-Leu，-His，20mmol/L3-AT培养基上，倒置培养24～36小时。将各个克隆印记到滤纸上，涂布均匀。将滤纸在液氮中处理15秒，立即取出，室温放置直至融化，如此反复冻融数次。在平皿中加2ml Z buffer/X-gal缓冲液，将涂布有酵母菌的滤纸菌放置于被Zbuffer/X-gal溶液中，于30℃温浴。每隔30分钟观察滤纸上菌落颜色的变化情况，记录下内菌落变蓝的时间，直至8小时。

实施例3

GST Pulldown验证Dok5PTB结构域结合活化的TrkB、TrkC受体

1.GST融合蛋白的表达纯化

构建pGEX6P-1-Dok5 PTB原核表达克隆，测序证实插入序列正确，读码框正确。将该克隆转化进入大肠杆菌菌株中诱导表达GST融合蛋白。挑取上述转化阳性的大肠杆菌单菌落，加入5ml新鲜的含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃剧烈摇动培养过夜。将过夜菌液按1/20比例接种到500ml含相应抗生素的LB锥形瓶中，37℃剧烈振荡培养，至菌液的OD_600nm值达0.6-0.8。加入适当浓度的IPTG诱导表达3-4小时。5000rpm离心10分钟收集菌体。PBS溶液洗涤菌体沉淀。按照5ml/g(约为菌液体积的1/25，即20ml)的量用PBS溶液重悬菌体沉淀，冰浴下超声破碎细胞：工作10秒(300W)，冷却20秒，共75次。12,000rpm离心20分钟，收集上清。

取一定量Glutathione Sepharose 4B树脂树脂悬液加到聚丙烯柱内，使树脂在重力作用下沉积。以5倍柱体积的PBS溶液洗涤树脂。将收集的蛋白上清溶液加入柱子，使样品靠重力缓慢流过柱子。以30倍柱体积的PBS溶液洗涤树脂。加入1倍柱体积的GST洗脱缓冲液(50mmol/LTris-HCl pH 8.0，10mmol/L Glutathione)，室温孵育10分钟后，收集流出液，其中含有被纯化蛋白质。

2.细胞抽提物的制备

将细胞以3×10⁶接种于90mm培养板，过夜培养至90％汇合后进行转染。DNA用量为40μg，LIPOFECTAMINE^TM2000用量为60μl。48小时后收获细胞。PBS溶液洗涤细胞后，将培养板置于冰上，每个培养板加入1ml裂解液，重复几次，让细胞充分裂解。收集裂解液，于4℃12,000rpm离心20分钟，收集上清，-70℃保存备用。

3 Pull-Down实验

在两个平行装有50μl Glutathione Sepharose 4B的柱中，分别加入GST-HSD-0.7(1.1nmol)和GST(1.3nmol)，并以10倍柱体积的PBS冲洗。在两个柱中各加入500μl睾丸提取液，孵育1h后，以50倍柱体积PBS-T(138mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na₂HPO₄，1.8mmol/L KH₂PO₄，0.05％Tween 20)冲洗。以100μl GST Elution Buffer(50mmol/L Tris-HCl pH8.0，10mmol/L Glutathione)洗脱。洗脱液进行SDS-PAGE，并以相应抗体进行Western印迹分析。

实施例4

免疫共沉淀实验验证细胞内Dok5与TrkB、TrkC受体相互作用

1)lysis buffer：150mM NaCl，50mM Tris，pH8.0，1％Triton-X-100.向lysis buffer中加入混合蛋白酶抑制剂：10μM leupeptin，1mM EDTA，1μM pepstatin，1μM PMSF.

2)将培养的细胞倒去培养基，用PBS清洗一次。

3)向细胞中加入lysis buffer，细胞与lysis buffer的比例大约是0.5-1×10⁶ cell：1mllysis buffer。置于冰上10分钟，小心刮下裂解物。

4)裂解物10,000g 4℃离心20分钟。

5)小心将上清转移到另一无菌离心管中，置于冰上。

6)每ml上清中加入50μl Protein-A Sepharose，预清除裂解物。

7)4℃摇动混匀1小时。

8)4℃10,000g离心1分钟。

9)小心将上清转移到另一无菌离心管中，置于冰上。

10).加入1-2μg一抗和50μl Protein-A Sepharose，4℃摇动混匀2-24小时。

11).除去上清。用lysis buffer清洗树脂两次。

12).加入SDS-PAGE上样缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 6.8，100mM DTT，2％SDS，0.001％溴酚蓝和10％甘油)，98℃变性5分钟，10,000g离心1分钟，取上清进行SDS-PAGE和western-blot检测。

实施例5

Dok5与TrkB、Trk共定位实验

1.试剂：

4％多聚甲醛固定液：60mlPBS中加入4g多聚甲醛，60～80℃水浴中滴加1mol/L的NaOH至溶解透明。待溶液冷却至15℃时用HCl将pH调至7.0。最后用PBS补充至100ml。

透化液：0.5％Triton/PBS

封闭液：3％BSA/PBS

封片剂：以预先配制的2％DABCO/PBS(Triethy lenediamine)制备90％的甘油

2.实验步骤

1)细胞转染：将细胞铺入有盖玻片的12孔板中，待细胞达到50％-60％满度时进行。

2)细胞固定：转染后48小时用PBS清洗细胞两次，取出盖玻片，用滤纸将残留液体吸干，以4％多聚甲醛固定液室温固定10～15分钟。

3)PBS漂洗，3×5分钟。

4)去离子水漂洗去盐，2×5分钟。

5)封片：取10μl封片剂滴在载玻片上，将盖玻片有细胞的一面朝下封片，四周用指甲油封住。立刻用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察并照相。

实施例6

Dok5参与Neurotrophin诱导的MAPK信号通路的激活

1)胰酶消化细胞，计数并铺入24孔板，待细胞90％满度时进行转染。

2)转染细胞：采用lipofectamine2000转染细胞，转染质粒如下：

A：pcDNA3.1V5-Trk         3ug

   pcDNA3.1-Flag          3ug

B：pcDNA3.1V5-Trk         3ug

   pcDNA3.1-Flag-Dok5     3ug

C：pcDNA3.1V5-Trk         3ug

   pcDNA3.1-Flag-Dok5ΔC  3ug

3)转染8小时后换液，继续培养24小时。

4)用相应的neurotrophin处理细胞，分别在处理后0min，5min，15min，30min，60min裂解细胞并制备蛋白样品。

5)western bloting检测Trk受体，Dok5及DokΔC蛋白表达情况，并检测Erk蛋白磷酸化水平变化情况。

                            序列表

<110>中国医学科学院基础医学研究所

<120>神经营养因子BDNF、NT-3信号通路新成员Dok5的鉴定和应用

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>921

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

atggcttcca attttaatga catagtgaag caagggtacg tgaggatccg gagcagacgc    60

ctcgggattt atcagcgatg ctggttagta ttcaagaaag cttcaagcaa aggtccaaaa    120

agactggaga aattttctga tgaacgtgct gcatatttca ggtgttatca taaggttaca    180

gaactcaata atgtgaagaa cgtagctcga ttgccaaaaa gcaccaagaa acatgccata    240

gggatttatt tcaatgacga tacctccaag acttttgctt gcgaatcaga tcttgaggct    300

gatgagtggt gcaaagtact ccagatggag tgtgtaggaa cacggatcaa tgacatcagc    360

cttggagagc ctgacttact ggccactggg gttgagagag aacagagtga gagattcaat    420

gtgtatttga tgccatctcc taacttagat gtacatggcg aatgtgcctt gcagattaca    480

tatgagtata tctgtctttg ggacgtccag aatcccagag tcaaactcat ctcttggccg    540

ctaagcgccc tgcggcggta tggacgtgat actacgtggt tcacttttga ggcagggagg    600

atgtgtgaga ctggtgaagg gctgtttatc tttcagaccc gagacgggga ggccatctat    660

cagaaagtcc actctgctgc cttggccata gccgagcagc acgagcgctt gctacagagt    720

gtgaaaaact cgatgctcca gatgaagatg agtgagcggg ccgcctcgct gagcaccatg    780

gtgcccctgc ctcgcagcgc ctactggcag cacatcacac ggcagcacag cacgggacag    840

ctctaccgct tgcaagatgt ttccagccct ctgaagcttc atcgaacaga gacttttcca    900

gcctacagat ctgagcactg a                                              921

<210>2

<211>306

<212>蛋白

<213>人工序列

<400>2

MASNFNDIVK QGYVRIRSRR LGIYQRCWLV FKKASSKGPK RLEKFSDERA AYFRCYHKVT    60

ELNNVKNVAR LPKSTKKHAI GIYFNDDTSK TFACESDLEA DEWCKVLQME CVGTRINDIS    120

LGEPDLLATG VEREQSERFN VYLMPSPNLD VHGECALQIT YEYICLWDVQ NPRVKLISWP    180

LSALRRYGRD TTWFTFEAGR MCETGEGLFI FQTRDGEAIY QKVHSAALAI AEQHERLLQS    240

VKNSMLQMKM SERAASLSTM VPLPRSAYWQ HITRQHSTGQ LYRLQDVSSP LKLHRTETFP    300

AYRSEH

Claims (8)

1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括：编码人Dok5蛋白的核苷酸序列，所述的核昔酸序列与序列表1中核苷酸序列有至少90％的同源性。

2.神经营养因子BDNF、NT-3信号通路新成员Dok5的鉴定与应用。Dok5以依赖于受体磷酸化的方式结合BDNF、NT-3受体胞内区的NPQY模体，并参与BDNF、NT-3诱导的MAPK信号通路的活化。

3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一个蛋白，该蛋白具有序列表2所示的序列。

4.一种人Dok5蛋白多肽，其特征在于，它包括：具有序列表2氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有序列表2序列的多肽。

6.一种权利要求1所述DNA分子的应用，其特征在于，它作为模板或引物用于核酸扩增反应或者用制造基因芯片；或者用于制备药物以预防、诊断或治疗人神经系统的疾病。

7.利用权利要求4、5所述蛋白或多肽的应用，其特征在于用于制备药物以预防、诊断或治疗神经系统的疾病。

8.利用权利要求2所述的Trk-Dok5-MAPK信号通路的药物开发和治疗方案，用于治疗神经系统的疾病。

Images