CN101072993A - 用于生物试样化学成像的装置和方法 - Google Patents
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Abstract
在一个实施例中,批露了涉及用于确定染色试样照射参数的方法,该方法可以包括提供染色试样和获得试样的吸收频带;获得试样的发射频带和确定试样的照射参数作为试样吸收频带和发射频带的函数。
Description
[0001]本申请是申请系列号11/045,081的继续申请,它是由此次申请的发明人于2005年1月31日申请的,其说明书在此全部引入,作为背景信息。
背景技术
[0002]光谱成像结合了数字成像和分子光谱技术,它可以包括喇曼散射、荧光、光致发光、紫外线、可见光和红外吸收光谱学。当被应用到材料化学分析上时,光谱成像通常被称作化学成像。用于进行光谱(即,化学)成像的器材通常包括图像收集光学系统、焦平面阵列成像探测器以及成像光谱仪。
[0003]通常,试样尺寸决定了成像收集光学系统的选择。例如,显微镜通常用于亚微米到毫米空间尺度试样的分析。对于更大的物体,在毫米到米尺度范围内,宏镜头光学系统是适合的。对于放置于相对难以接近的环境内的试样,可以使用软式纤维镜或刚性管道镜。对于甚大尺寸物体,例如行星物体,望远镜是合适的图像收集光学系统。
[0004]不考虑光学装置的类型,任何光谱研究的第一步是为照射试样定义合适的波长。当寻求同时发生的多个试样图像时,为照射试样定义合适的波长的步骤变得甚至更重要。传统的方法建议用第一波长(例如,NIR或VIS)照射试样以获得第一图像,接着用第二波长照射物体以获得第二图像(例如,喇曼或色散喇曼)。因此,传统的工艺耗时且不适合试样的即时成像。对确定因照射试样而导致的试样照射参数的装置和方法有着需求。
[0005]当前的批露解决了上述的需求。在一个实施例中,所批露的涉及用于通过提供标以荧光团的生物试样而获得生物试样的化学成像的方法;利用具有照射波长范围内波长的光子照射试样;获得试样的光谱图像;以及从光谱图像产生化学图像。化学图像可以定义至少两种同时获得的试样光谱图像。光谱图像可以包括喇曼图像和荧光图像。
[0006]在另一个实施例中,用于获得生物试样的光谱图像的装置,包括确定一定范围的照射波长的工具、与试样交互作用以同时提供试样的第一和第二光谱的照射波长;用于引导具有范围内波长的光子到试样上的光子源,与试样交互作用以产生交互作用的光子的照射光子;用于接收交互作用的光子并形成试样的光谱图像的可调滤光器。
[0007]在另一个实施例中,所批露的涉及一种用于获得生物试样的多个光谱的系统。该系统可以包括按指令工作以确定试样的照射参数作为所述试样发射带宽的函数的处理器;用于引导具有试样照射参数范围内波长的光子的照射源,照射光子与试样交互作用以提供交互作用的光子;以及用于接收来自试样的交互作用的光子并提供试样的至少第一和第二光谱的可调滤光器。
附图说明
[0008]图1用图解的方式示出了试样强度和波长之间的关系;
[0009]图2A-2G分别示意地示出了接收不同激发波长的试样的光谱图像;以及
[0010]图3是根据本发明实施例的系统的功能图;
发明内容
[0011]所披露的主要涉及一种方法和装置,用于确定试样的照射参数。具有用于获得试样的光谱图像的最佳的照射参数(例如最佳照射波长范围)的先验知识尤其重要,原因在于最佳的照射参数使得同时探测试样一个以上的光谱成为可能。也可以结合不同的探测模式例如:宽场、喇曼化学成像、多点、色散单点以及色散线,来使用最佳的照射参数。
[0012]图1以图解的方式示出了试样的强度和波长之间的关系。传统上,获得吸收和发射频带的方法已为人所知。也已知与荧光成像相关联的发射波长比吸收波长要长。因此,作为第一步,可以用不同波长(可交换地,探测光子或照射光子)的光子照射试样以确定试样的吸收和发射波长。
[0013]图1中,线125代表暴露于照射光子的试样的能量吸收关系。峰130表示试样吸收光谱的峰值波长(λAbs,P);峰150表示试样发射光谱(λm)的峰值波长以及喇曼散射发生处的波长短于峰150处的波长。可以探测试样吸收能量的一定范围的波长被显示从λabs-L延长到λabs-H。类似地,可以探测试样发射能量的一定范围的波长从λEm-L延长到λEm-H。
[0014]正如将要更加详细地讨论,根据本发明的一个实施例,用于多光谱成像的最佳波长可以发生于波长恰好长于或大约为λabs-L处。因此,披露了一种用于定义照射参数的方法,包括(i)定义一定范围的试样的吸收波长;(ii)定义一定范围的试样的发射波长;以及(iii)评估适合试样的照射参数作为吸收波长和发射波长的函数。上述步骤可以顺序地或同时进行。作为实例,图1中显示为155的区域显示了可能的照射波长,其短于吸收和发射光谱中的峰值波长。照射参数也可以用于定义照射激光线或适合的喇曼照射波长。由于波长和频率成反比,可以考虑频带而执行并定义步骤(i)-(iii)。也就是说,考虑到试样的一定范围的吸收波长,可以定义试样的等效频率带宽。
[0015]在所披露的另一个实施例中,一种用于确定试样的照射参数的方法包括:用照射光子同时照射试样。照射光子可以具有几种不同的波长或定义广泛的波长。接下来,可以定义试样的发射和吸收波长。或者,可以确定试样的发射以及吸收带宽。发射和吸收频带也可以定义峰值强度波长以及每一频带的下和上波长范围。利用吸收频带的下波长(λabs-L)作为起始点,试样的最佳喇曼波长探测波长可以被定义为具有在λabs-L处或长于λabs-L的波长的喇曼散射光子。作为实例,一个这样的区域在图1中显示为区域155。如此获得的照射参数可以用于结合不同波长的照射光子照射试样以获得试样同时发生的光谱图像。照射光子可以通过特别设计使之处于期望波长范围内的激光线、宽场、喇曼化学成像、多点成像、色散单点以及色散线提供。
[0016]图2A-2G分别示意地示出了接收不同激发波长的试样的光谱图像。更具体而言,图2A-2G描绘了与模片(die)一起染色的生物试样的吸收、发射和喇曼光谱以及考虑试样的吸收和发射光谱而确定试样的照射参数的方法。在所披露的一个实施例中,模片为荧光团。适合的荧光团染色剂包括免疫荧光化合物、嗜碱化合物、嗜酸化合物、中性染料以及自然发生的发光分子。一旦被染色,试样可以被具有照射波长范围内波长的光子照射以获得试样的光谱图像。
[0017]图2A中,峰110显示了染色试样的发射峰。如通常所知的,发射带宽(或其等效范围波长)是材料的一个特性。图2A中,发射区间跨越λA-λB之间,峰值发射波长发生于λP处。照射(激发)波长被任意地设置在λX1处。喇曼峰被识别为峰160。喇曼峰被从激发波长λX1移动一固定波长,该固定波长与因喇曼振动而导致的能量损失相当。增加或降低激发波长将会对喇曼峰发生处的波长产生直接的影响。这在图2A-2G中示意地进行了阐明,其中从波长λX1到λX7改变激活能致使喇曼峰160发生处的波长移动。再次参照图2A,喇曼峰160发生在波长λX1-1/ψ处;其中ψ为因以波数表示的喇曼激发而造成的能量损失并且可以被量化为
ψ=(∏c)(k/μ)1/2;其中k为化学键力常数,c为光速,u为分子振荡器的折算质量。
[0018]图2B和2C中,峰110代表所研究试样的吸收峰,峰160代表喇曼散射峰。峰130示出了试样的荧光发射光谱。图2B和2C中,激发波长分别被设置为λX2和λX3,使得试样的荧光光谱发生在所示激发区附近的波长处。从图2B和2C可以看出,试样的荧光光谱与如前所述发生于由激发波长引起的固定波长处的喇曼峰160重叠。由于喇曼信号变得被荧光信号所覆盖,上述重叠使得光谱分析即使不是不可能的话也是困难的。
[0019]相反,选择了图2D中的照射参数λX4使得喇曼峰160恰好发生在荧光光谱130起始处的下方。此处,喇曼160、荧光发射130和吸收110光谱的每一个在狭窄的波长范围内可见,并且利用单一探测器件,喇曼和荧光发射信号基本上可以同时被探测到。
[0020]图2E中,试样具有双荧光峰130和135。与荧光峰130比较,荧光峰135定义了低强度峰。来源于喇曼峰165的信号可以比表示峰135的荧光信号更容易被探测。图2E中,照射波长λX5是如此选择使得喇曼峰160与荧光峰135重叠。然而,由于喇曼信号具有更高的强度,喇曼峰160可以从发射光谱135中被识别出来。
[0021]图2F中,激发波长被移到λX6,喇曼峰160不再被荧光峰130和135遮盖。然而,因峰110的吸收光谱,喇曼信号可以被减弱。由于至少喇曼峰160的一部分落于荧光峰135和吸收峰110之间,喇曼信号至少可以部分地被识别。在图2G中,激发波长λX7移向低波长,从而导致喇曼峰160的移动。此处,吸收峰110覆盖喇曼峰160,因而可能减弱喇曼信号,但不是必定阻碍喇曼散射的探测。
[0022]从图2A-2G可以看出,激发波长可以如此被选择使得至少试样的两种光谱在狭窄的波长范围内同时可见。根据所披露的一个实施例,激发波长如此被选择使得喇曼峰出现于基本上与其他信号不相干涉的波长处。根据另一个实施例,激发波长可以如此选择使得来源于喇曼峰的信号可以与描述发射或荧光光谱的信号区分开来。仍旧根据所披露的另一个实施例,激发波长如此选择使得成像器件可以同时捕捉试样的荧光以及喇曼光谱。仍旧在所披露的另一个实施例,激发波长如此选择使得成像器件可以同时捕捉试样的荧光发射以及喇曼光谱。
[0023]在所披露的一个实施例中,提供了一种评估以组织学标记的试样的照射参数的装置。可以用传统的鉴定剂(identifier)对试样进行标记,例如荧光团物质。接下来,定义合适的照射波长的照射参数可以如此选择使得可以利用一个成像装置探测出发射峰和喇曼散射峰。成像装置包括聚光光学系统(例如,用于收集由试样发射的、喇曼散射的、透射的或反射的光子的光学链),一个或多个可调滤光器(例如,液体可调晶体滤光器(LCTF)、声学-光学滤光器(AOTF)或纤维阵列光谱译码器)。电荷耦合器件或其他合适的照相机或记录介质可以被耦合到成像装置中以捕捉光谱。
[0024]在根据所披露的实施例的系统中,试样的照射参数包括一个或多个照射源、光学链以及以指令编程的处理器,以同时利用照射光子照射试样并探测试样的发射频带。指令也可以包括定义频带的下波长范围和上波长范围并确定试样的照射参数作为试样吸收和发射频带的函数。最后,指令可以包括定义试样在短于发射光谱下波长范围(λEM,L)的波长处适合的喇曼波长。
[0025]图3是根据所披露的实施例的系统的功能图。图3中,设计了系统300以获得并分析试样310的化学图像。试样310可以是适合组织学研究的生物、有机或无机试样。安置照射源330以向试样310提供激发光子332。照射源330可以位于试样的上方、附近或下方。激发光子332定义可以覆盖广泛范围光谱(例如,λx1-λx7)的激发波长。而且,可以调整照射源330以改变基于处理器320传送的指令的激发波长。探测器340位于试样340附近以接收交互作用的光子342。交互作用的光子342可以包括荧光、反射、透射、发射以及喇曼光子。交互作用的光子可以被探测器340接收和收集,探测器340可以包括适合收集和分析宽波长光子的电光器件。探测器340可以包括,例如,用于收集并聚焦交互作用的光子的光学链;一个或多个用于拒阻不希望有的波长的光子的光学滤光器;用于获得试样310的光谱图像的LCTF;以及用于设计化学图像的电荷耦合器件,该化学图像基于试样310光谱图像。探测器340可以与外围网络器件360,例如打印机、录影机或互联网通信系统进行通信。
[0026]处理器320可以从探测器340接收试样的光谱图像并确定是否应该改变照射波长。例如,如果探测器340设计了类似图2C的试样的光谱图像,处理器320可以确定来源于峰160的喇曼信号是可以与荧光信号130区分开来的。基于上述确定,处理器320可以导致由照射源330产生的激发波长的变化,使得信号干涉被减弱到如图2D所示的情况。处理器350也可以与CPU350通信以接收可执行的指令或访问相关信息例如化学鉴定剂的数据库,或用在试样310上的荧光团的特性。CPU350可以用于向处理器传送附加信息。
[0027]在一个或多个迭代之后,处理器320可以确定试样最佳的照射参数,使得可以同时探测多于一个光谱图像。试样的光谱图像可以用于定义试样的一个或多个化学图像并识别所研究的试样。上述研究可以通过单一探测和识别系统实施并为组织学研究分析提供高效的效率。
[0028]尽管已经披露了本发明的原则,涉及到具体的代表性的实施例,所要指出的是本发明的原则不限于以上所述,而是包括所有的对此处所披露的具体实施例的修改和变更。
Claims (31)
1.一种用于获得生物试样的化学图像的方法,包括:
提供以荧光团标记的生物试样;
利用具有属于照射波长范围内的波长的光子照射试样;
获得试样的光谱图像;以及
从光谱图像产生化学图像;
其中化学图像定义至少两个同时获得的试样的光谱图像。
2.权利要求1的方法,进一步包括为被标记的试样确定照射参数、提供试样同时发生的光谱图像的照射波长范围。
3.权利要求2的方法,其中确定照射波长的步骤进一步包括为被标记的试样定义荧光发射峰并选择短于发射峰的波长。
4.权利要求1的方法,其中试样的化学图像包括荧光信号和喇曼信号至少之一。
5.权利要求1的方法,其中试样的光谱图像的化学图像选自荧光、反射、吸收、透射、光学和喇曼图像。
6.权利要求1的方法,其中荧光团进一步包括免疫荧光化合物、嗜碱化合物、嗜酸化合物、中性染色剂和任何自然生成的发光分子。
7.权利要求6的方法,其中嗜酸染色剂为曙红。
8.权利要求6的方法,其中嗜碱染色剂为苏木精。
9.权利要求1的方法,其中照射波长与吸收带宽的区域重叠。
10.一种用于获得生物试样的光谱图像的装置,包括:
用于确定一定范围的照射波长的工具,所述照射波长与试样交互作用以同时提供试样的第一和第二光谱;
光子源,用于引导具有属于上述范围内波长的光子到试样,照射光子与试样交互作用产生交互作用的光子;
可调滤光器,用于接收交互作用的光子并形成试样的光谱图像。
11.权利要求10的装置,其中试样的第一和第二光谱由相同的交互作用的光子形成。
12.权利要求10的装置,其中第一光谱为试样的喇曼光谱。
13.权利要求10的装置,其中第二光谱为试样的荧光光谱。
14.权利要求10的装置,装置进一步包括拒阻滤光器,用于过滤来自光子源的光子。
15.权利要求10的装置,装置进一步包括拒阻滤光器,用于过滤交互作用的光子。
16.权利要求10的装置,装置进一步包括物镜,用于收集交互作用的光子并引导交互作用的光子到可调滤光器。
17.权利要求10的装置,其中可调滤光器选自LCTF、AOTF以及纤维阵列光谱译码器。
18.权利要求10的装置,其中试样的光谱图像包括荧光信号和喇曼信号至少之一。
19.权利要求10的装置,其中试样进一步包括荧光团物质。
20.权利要求10的装置,其中用于确定照射波长的工具进一步包括用于定义用于选择试样的荧光发射峰的工具,以及用于选择短于发射峰波长的一定范围的波长的工具。
21.权利要求10的装置,其中用于确定照射波长的工具进一步包括用于为试样定义吸收带宽的工具,以及选择覆盖吸收带宽的一定范围的波长的工具。
22.权利要求10的装置,其中照射波长为覆盖吸收带宽区域的一定范围的波长。
23.一种用于获得生物试样的多个光谱的系统,包括:
以指令编程以作为所述试样发射带宽的函数确定试样的照射参数的处理器;
照射源,用于引导具有属于试样照射参数内的波长的光子,照射光子与试样交互作用以提供交互作用的光子;以及
可调滤光器,用于接收来自试样的交互作用的光子并提供试样的至少第一和第二光谱。
24.权利要求23的系统,其中基本上同时地从试样探测第一和第二光谱。
25.权利要求23的系统,其中第一光谱为试样的荧光光谱。
26.权利要求23的系统,其中第一光谱为试样的吸收光谱。
27.权利要求23的系统,其中第二光谱为试样的喇曼光谱。
28.权利要求23的系统,其中照射源进一步包括拒阻滤光器。
29.权利要求23的系统,该系统进一步包括用于收集并引导交互作用的光子到可调滤光器的光学透镜。
30.权利要求23的系统,其中可调滤光器选自LCTF和AOTF。
31.权利要求23的系统,其中照射参数定义了一个波段,所包括的试样的至少两个光谱是可检测的。
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