JP2008529000A - 生物サンプルの化学的像形成装置および方法 - Google Patents
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Abstract
一実施形態において、本開示は染色されたサンプルの照明パラメーターを決定する方法に関し、方法は染色されたサンプルを提供してサンプルの吸収帯域を得ること、サンプルの発光帯域を得て、サンプルの吸収帯域と発光帯域の関数としてサンプルの照明パラメーターを決定することを含むことができる。
Description
本出願は本願の発明者の名称で2005年1月31日出願された出願番号第11/045,081号の部分継続であり、その明細書は背景情報のためにその全体を参照して本出願に組み込まれている。
分光学的像形成はデジタル像形成と分子分光学技術が組み合わされて、ラマン散乱、蛍光、ホトルミネセンス、紫外線、可視および赤外吸収スペクトルを含むことができる。材料の化学分析に用いられるとき、通常、分光学的像形成は化学的像形成と称される。分光学的(すなわち化学的)像形成を行う装置は典型的に像収集光学系、焦点面像形成検出器、および像形成分光計を含む。
一般に、サンプルのサイズによって像収集光学系の選択が決定される。例えば、サブミクロンからミリメートルの空間寸法のサンプルには典型的に顕微鏡が用いられる。ミリメートルからメートルの範囲のより大きな対象物にはマクロレンズ光学系が適している。比較的アクセスしにくい環境内に位置するサンプルには可撓性ファイバースコープまたはボアスコープを用いることができる。惑星対象物などの非常に大規模の対象物には望遠鏡が適切な像収集光学系である。
光学系装置の種類にかかわらず、あらゆる分光学的研究において、第1ステップはサンプルを照明するための適切な波長を画定することである。複数のサンプル像を同時に調査するとき、サンプル照明の適切な波長を画定するステップはより重要になる。従来の方法は、第1像を得るために第1波長(例えば、NIRまたはVIS)でサンプルを照明し、続いて第2像(例えば、ラマンまたは分散性ラマン)を得るために第2波長でサンプルを照明することを示唆する。したがって、従来の工程は時間がかかり、サンプルの同時像形成には適していない。サンプル照明に先立って、サンプルの照明パラメーターを決定する装置および方法が必要である。
本開示は上述の必要性に対処する。一実施形態において、本開示は、フルオロフォアで標識を付けた生物サンプルを提供することと、照明波長範囲内の波長を有するフォトンでサンプルを照射することと、サンプルのスペクトル像を得ることと、スペクトル像から化学的像を形成することとによって生物サンプルの化学的像を得る方法に関する。化学的像は少なくとも2つの同時に得られたサンプルのスペクトル像を画定することができる。スペクトル像はラマン像および蛍光像を含むことができる。
他の実施形態において、生物サンプルのスペクトル像を得るための装置は、サンプルと相互作用してサンプルの第1と第2スペクトルを同時に提供する照明波長の範囲を決定する手段と、範囲内の波長を有するフォトンをサンプルに導き、照明フォトンがサンプルと相互作用して相互作用したフォトンを生成するフォトン源と、相互作用したフォトンを受け取り、サンプルのスペクトル像を形成するための調整可能なフィルターとを含む。
さらに他の実施形態において、本開示は生物サンプルの多重スペクトルを得るシステムに関する。本システムは、前記サンプルの発光帯域幅の関数としてサンプルの照明パラメーターを決定するための命令をプログラムされたプロセッサーと、サンプルの照明パラメーター内の波長を有するフォトンを導き、照明フォトンがサンプルと相互作用して相互作用したフォトンを提供する照明源と、サンプルから相互作用したフォトンを受け取り、サンプルの少なくとも第1と第2スペクトルを提供するための調整可能なフィルターとを含むことができる。
本開示は、全体的にサンプルの照明パラメーターを決定する方法および装置に関する。サンプルのスペクトル像を得るための最適照明パラメーター(例えば、最適照明波長範囲)の知識を先験的に有することは、最適照明パラメーターによって1つ以上のサンプルのスペクトルが同時に検出可能になる点で特に重要である。また、最適照明パラメーターは、広い領域、ラマン化学的像形成、多重点、分散性単一点および分散性線など、異なる検出モードで用いることができる。
図1は強度とサンプルの波長の関係をグラフで示す。吸収と発光帯域を得る方法は従来から知られている。また、蛍光像形成に付随する発光波長が吸収波長よりも長いことも知られている。したがって、第1ステップとしてサンプルを異なる波長のフォトン(互換可能に検出フォトンまたは照明フォトン)で照明してサンプルの吸収および発光波長を求めることができる。
図1において、線125は照明フォトンに露出されたサンプルのエネルギー吸収関係を表す。ピーク130はサンプルの吸収スペクトルのピーク波長(λAbs,P)を示し、ピーク150はサンプルの発光スペクトル(λm)のピーク波長を示し、ラマン散乱はそれよりも短い波長のピーク150で発生する。サンプルの吸収エネルギーを検出することのできる波長範囲はλabs−Lからλabs−Hへ展在することが示される。同様に、サンプルの発光エネルギーを検出することのできる波長範囲はλEm−LからλEm−Hへ展在する。
詳細に論じるであろうように、本開示の一実施形態によれば、多重スペクトル像形成のための最適波長は略λabs−Lよりもわずかに長い波長で存在する。したがって、方法は照明パラメーターを画定するために開示され、(i)サンプルの吸収波長の範囲を画定すること、(ii)サンプルの発光波長の範囲を画定すること、(iii)吸収波長と発光波長の関数としてサンプルの適切な照明パラメーターを評価することを含む。これらのステップは逐次的にまたは同時に行うことができる。例として、図1に155で示した領域は、吸収および発光スペクトルのピーク波長よりも短くすることの可能な照明波長を示す。また、照明パラメーターは照明レーザー線または適切なラマン照明波長を画定するために用いることができる。波長と周波数は逆比例するので、ステップ(i)〜(iii)は周波数帯域を考慮して実施し画定することができる。すなわち、サンプルの吸収波長範囲を考慮してサンプルの等価周波数帯域幅を画定することができる。
本開示の他の実施形態において、サンプルの照明パラメーターを決定する方法は、照明フォトンでサンプルを同時に照明することを含む。照明フォトンはいくつかの異なる波長を有しまたは広範囲の波長を画定することができる。次に、サンプルの発光および吸収波長を画定することができる。替わりに、サンプルの発光と吸収帯域幅を決定することができる。また、発光および吸収帯域はピーク強度波長ならびに各帯域の下方と上方の波長範囲を画定することができる。出発点として吸収帯域(λabs−L)の下方波長を用いて、サンプルの最適ラマン波長検出波長は、λabs−Lまたはそれよりも長い波長を有するラマン散乱フォトンとして画定することができる。例として、それらの1つの領域は図1の領域155として示される。このようにして得られた照明パラメーターを用いて、異なる波長の照明フォトンでサンプルを照明し、サンプルのスペクトル像を同時に得ることができる。照明フォトンは、レーザー線、広い領域、ラマン化学的像形成、多重点像形成、分散性単一点および特に望ましい波長範囲内にあるようにした分散性線によって提供することができる。
図2A〜2Gは、各々、異なる励起波長を受け取るサンプルのスペクトル像を示す図である。さらに詳細には、図2A〜2Gは、染料で染色した生物サンプルの吸収、発光、およびラマンスペクトルを示し、サンプルの吸収および発光スペクトルを考慮してサンプルの照明パラメーターを決定する方法を示す。本開示の一実施形態において、染料はフルオロフォアである。適切なフルオロフォア染色剤は免疫蛍光化合物、好塩基性化合物、好酸性化合物、中性染色剤、および天然産出発光分子を含む。染色されると、サンプルはサンプルのスペクトル像を得るために照明波長内の波長を有するフォトンで照射することができる。
図2Aにおいて、ピーク110は染色されたサンプルの発光ピークを示す。従来から知られたように、発光帯域幅(またはその等価波長範囲)は材料の特性である。図2Aにおいて、発光範囲はλA〜λBに及び、ピーク発光波長はλPに発生する。照明(励起)波長は任意にλX1で設定される。ラマンピークはピーク160で識別される。ラマンピークはラマン振動によるエネルギー損失に比例した固定波長だけ励起波長(λX1)からシフトする。励起波長の増加または減少はラマンピークの発生する波長に直接影響を与える。これは図2A〜2Gに図示されており、励起エネルギーを波長λX1からλX7に変化させることによってラマンピーク160が発生する波長がシフトする。再び図2Aを参照すれば、ラマンピーク160は波長λX1−1/Ψに発生し、Ψは波数で表されるラマン励起によるラマンエネルギー損失であり、
Ψ=(1/2Πc)(k/μ)1/2で表すことができ、ここで、kは化学結合力定数であり、cは光の速度であり、μは分子振動子の質量減少である。
Ψ=(1/2Πc)(k/μ)1/2で表すことができ、ここで、kは化学結合力定数であり、cは光の速度であり、μは分子振動子の質量減少である。
図2Bおよび2Cにおいて、ピーク110は吸収ピークを表し、ピーク160は研究中のサンプルのラマン散乱ピークを表す。ピーク130はサンプルの蛍光発光スペクトルを示す。図2Bおよび2Cにおいて、励起波長は、サンプルの蛍光スペクトルが図示した励起領域近傍の波長で発生するように、それぞれλX2とλX3に設定される。図2Bおよび2Cから見ることができるように、サンプルの蛍光スペクトルは、ラマンピーク160に重なり合い、述べたように、励起波長から固定波長で発生する。重なり合いは、ラマン信号が蛍光信号に埋没するので、不可能ではなくてもスペクトル分析を困難にする。
対照的に、図2Dにおける照明パラメーターλX4は、ラマンピーク160が蛍光スペクトル130の開始点直下に発生するように選択される。ここで、ラマン160、蛍光発光130および吸収110スペクトルの各々は狭い波長範囲内に見ることが可能であり、ラマンおよび蛍光発光信号は単一検出デバイスで実質上同時に検出することができる。
図2Eにおいて、サンプルは二重蛍光ピーク130および135を有する。蛍光ピーク135は蛍光ピーク130に比べてより低い強度のピークを画定する。ラマンピーク165からの信号はピーク135を示す蛍光信号よりも容易に検出可能である。図2Eにおいて、照明波長λX5はラマンピーク160が蛍光ピーク135に重なり合うように選択される。しかし、ラマン信号はより高い強度を有するので、ラマンピーク160は発光スペクトル135から識別することができる。
図2Fにおいて、励起波長はλX6へシフトし、ラマンピーク160はもはや蛍光ピーク130及び135によって隠蔽されない。しかし、それでもなおラマン信号はピーク110の吸収スペクトルによって減衰することがある。ラマンピーク160の少なくとも一部は蛍光ピーク135と吸収ピーク110の間にあるので、ラマン信号は少なくとも部分的に識別可能である。図2Gにおいて、励起波長λX7はより低い波長へシフトし、ラマンピーク160をシフトさせる。ここで、吸収ピーク110はラマンピーク160に重なり合い、それによってラマン信号を減衰させることが可能であるが、必ずしもラマン散乱の検出を妨げない。
図2A〜2Gに見ることができるように、励起波長は、サンプルの少なくとも2つのスペクトルを狭い波長範囲内に同時に見ることができるように選択することができる。本開示の一実施形態によれば、ラマンピークが実質上他の信号からの妨害がない波長に現れるように励起波長が選択される。他の実施形態によれば、励起波長は、ラマンピークからの信号が発光または蛍光スペクトルを示す信号から識別可能なように選択することができる。本開示のさらに他の実施形態によれば、励起波長は像形成デバイスが蛍光ならびにサンプルのラマンスペクトルを同時に捕捉できるように選択される。本開示のさらに他の実施形態によれば、励起波長は像形成デバイスが蛍光発光ならびにサンプルのラマンスペクトルを同時に捕捉できるように選択される。
本開示の一実施形態において、組織学的な標識を付けたサンプルの照明パラメーターを評価する装置が提供される。サンプルはフルオロフォア物質などの従来の識別子で標識を付けることができる。次に、発光ピークとラマン散乱ピークの両方が1つの像形成装置で検出できるように、適切な照明波長を画定する照明パラメーターを選択することができる。像形成装置は、収集光学系(例えば、放出されたフォトン、ラマン散乱、サンプルから透過または反射されたフォトンを収集するための光学列)と、1個以上の調整可能なフィルター(例えば、調整可能な液晶(LCTF)、音響光学フィルター(AOTF)またはファイバーアレイスペクトル中継器)を含むことができる。スペクトルを捕捉するために、電荷結合デバイスまたは他の適切なカメラまたは記録媒体を像形成装置に結合させることができる。
本開示の一実施形態によるシステムにおいて、サンプルの照明パラメーターは1個以上の照明源、光学列、および照明フォトンでサンプルを同時に照明しサンプルの発光帯域を検出するための命令をプログラムされたプロセッサーを含む。また、命令は帯域の下方波長範囲と上方波長範囲の画定を含み、サンプルの吸収と発光帯域の関数としてサンプルの照明パラメーターを決定することができる。最終的に、命令は発光スペクトルの下方波長範囲(λEM,L)よりも短い波長でサンプルの適切なラマン波長を画定することを含むことができる。
図3は本開示の一実施形態によるシステムの機能図である。図3において、システム300はサンプル310の化学的像を得て分析するように考案されている。サンプル310は組織学的研究に適した生物学的、有機または無機サンプルとすることができる。照明源330は励起フォトン332をサンプル310に提供するように配置される。照明源330はサンプルの上方、近く、または下方に配置することができる。励起フォトン332は、広範囲のスペクトル(例えば、λX1〜λX7)を包含することのできる励起波長を画定する。さらに、照明源330はプロセッサー320による通信命令に基づいて励起波長を変化させるようにすることができる。検出器340はサンプル340の近くに配置されて相互作用したフォトン342を受け取る。相互作用したフォトン342は、蛍光、反射、透過、発光およびラマンフォトンを含むことができる。相互作用したフォトンは、広い波長のフォトンを集めて分析するのに適した電子光学デバイスを含むことのできる検出器340によって受け取り収集することができる。検出器340は、例えば、相互作用したフォトンを集め焦点を合わせるための光学列と、望ましくない波長のフォトンを排除するための1個以上の光学フィルターと、サンプル310のスペクトル像を得るためのLCTFと、サンプル310のスペクトル像に基づいて化学的像を描く電荷結合デバイスとを含むことができる。検出器340は、プリンター、ビデオレコーダー、またはインターネット通信システムなどの周辺ネットワークデバイス360と通信することができる。
プロセッサー320はサンプルのスペクトル像を検出器340から受け取り、照明波長を変更すべきかどうかを決定することができる。例えば、検出器340が図2Cと類似のサンプルのスペクトル像を描くならば、プロセッサー320はピーク160からのラマン信号が蛍光信号130から認識不能であることを決定することができる。この決定に基づいて、プロセッサー320は、信号の妨害が図2Dに示したものへ低減されるように、照明源330によって発生した励起波長を変更することができる。また、プロセッサー350はCPU350と通信して実行可能な命令を受け取り、または化学的識別子またはサンプル310に用いたフルオロフォアの特性などの関連情報のデータベースにアクセスすることができる。CPU350を用いてプロセッサーに追加の情報を伝達することができる。
1回以上の繰り返しの後、プロセッサー320は、1個以上のスペクトル像を同時に検出できるようにサンプルの最適照明パラメーターを決定することができる。サンプルのスペクトル像を用いて、1個以上のサンプルの化学的像を画定し研究中のサンプルを識別することができる。それらの分析は、単一の検出および識別システムを用いて実施することができ、組織学的分析の効率を高める。
本開示の原理を特定の例示的実施形態に関して開示したが、本発明の原理はそれに制限されず、本明細書に開示された特定の実施形態に対する全ての修正及び変形を含むものである。
Claims (31)
- フルオロフォアで標識を付けた生物サンプルを提供すること、
照明波長範囲内の波長を有するフォトンでサンプルを照射すること、
サンプルのスペクトル像を得ること、
スペクトル像から前記化学的像を発生させることを含み、
前記化学的像が、サンプルの少なくとも2つの同時に得られたスペクトル像を画定する、生物サンプルの化学的像を得る方法。 - 前記標識を付けたサンプルの照明パラメーターを決定し、前記照明波長範囲がサンプルの同時スペクトル像を提供することをさらに含む請求項1に記載の方法。
- 照明波長を決定するステップが、標識を付けたサンプルの蛍光発光ピークを画定し、発光ピークよりも小さな波長を選択することをさらに含む請求項2に記載の方法。
- 前記サンプルの化学的像が蛍光信号とラマン信号の少なくとも1つを含む請求項1に記載の方法。
- 前記サンプルのスペクトル像の化学的像が蛍光、反射、吸収、透過、光学的およびラマン像からなる群から選択される請求項1に記載の方法。
- 前記フルオロフォアが、免疫蛍光化合物、好塩基性化合物、好酸性化合物、中性染色剤、および任意の天然産出発光分子をさらに含む請求項1に記載の方法。
- 前記好酸性染色剤がエオシンである請求項6に記載の方法。
- 前記好塩基染色剤がヘマトキシリンである請求項6に記載の方法。
- 前記照明波長が吸収帯域の領域に重なり合う請求項1に記載の方法。
- 前記サンプルと相互作用してサンプルの第1と第2スペクトルを同時に提供する照明波長の範囲を決定する手段と、
前記範囲内の波長を有するフォトンをサンプルに導き、前記照明フォトンがサンプルと相互作用して相互作用したフォトンを生成するフォトン源と、
相互作用したフォトンを受け取り、サンプルのスペクトル像を形成する調整可能なフィルターとを含む、生物サンプルのスペクトル像を得るための装置。 - 前記サンプルの第1および第2スペクトルが同じ相互作用したフォトンから形成される請求項10に記載の装置。
- 前記第1スペクトルがサンプルのラマンスペクトルである請求項10に記載の装置。
- 前記第2スペクトルが前記サンプルの蛍光スペクトルである請求項10に記載の装置。
- 前記装置が、前記フォトン源からのフォトンを濾波するための排除フィルターをさらに含む請求項10に記載の装置。
- 前記装置が、相互作用したフォトンを濾波するための排除フィルターをさらに含む請求項10に記載の装置。
- 前記装置が、相互作用したフォトンを収集し、相互作用したフォトンを調整可能なフィルターへ導くための対物レンズをさらに含む請求項10に記載の装置。
- 前記調整可能なフィルターが、LCTF、AOTF、およびファイバーアレイスペクトル中継器からなる群から選択される請求項10に記載の装置。
- 前記サンプルのスペクトル像が、蛍光信号とラマン信号の少なくとも1つを含む請求項10に記載の装置。
- 前記サンプルがフルオロフォア物質をさらに含む請求項10に記載の装置。
- 前記照明波長を決定する手段が、サンプルを選択するための蛍光発光ピークを画定する手段と、前記発光ピークよりも短い波長の範囲を選択する手段とをさらに含む請求項10に記載の装置。
- 前記照明波長を決定する手段が、サンプルの吸収帯域を画定する手段と、前記吸収帯域幅に重なり合う波長の範囲を選択する手段とをさらに含む請求項10に記載の装置。
- 前記照明波長が、吸収帯域幅の領域に重なり合う波長の範囲である請求項10に記載の装置。
- 前記サンプルの発光バンド幅の関数として前記サンプルの照明パラメーターを決定するための命令をプログラムされたプロセッサーと、
前記サンプルの照明パラメーター内の波長を有するフォトンを導き、前記照明フォトンがサンプルと相互作用して相互作用したフォトンを提供する照明源と、
前記サンプルから相互作用したフォトンを受け取り、前記サンプルの少なくとも第1と第2スペクトルを提供するための調整可能なフィルターとを含む、生物サンプルの多重スペクトルを得るためのシステム。 - 前記第1および第2スペクトルが前記サンプルから実質上同時に検出される請求項23に記載のシステム。
- 前記第1スペクトルが前記サンプルの蛍光スペクトルである請求項23に記載のシステム。
- 前記第1スペクトルが前記サンプルの吸収スペクトルである請求項23に記載のシステム。
- 前記第2スペクトルが前記サンプルのラマンスペクトルである請求項23に記載のシステム。
- 前記照明源が、排除フィルターをさらに含む請求項23に記載のシステム。
- 前記システムが、前記相互作用したフォトンを収集し前記調節可能なフィルターへ導くための光学レンズをさらに含む請求項23に記載のシステム。
- 前記調整可能なフィルターが、LCTFおよびAOTFからなる群から選択される請求項23に記載のシステム。
- 前記照明パラメーターが、前記サンプルの少なくとも2つのスペクトルを包含的に検出可能である周波帯域を画定する請求項23に記載のシステム。
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