CN101072576A

CN101072576A - 抑制哺乳动物细胞死亡或炎症的方法

Info

Publication number: CN101072576A
Application number: CN 200580041661
Authority: CN
Inventors: 约翰·M·哈尔兰; 罗伯特·K·威恩; 岩石晶子; 琼·塔普; 约翰·李
Original assignee: University of Washington
Current assignee: University of Washington
Priority date: 2004-10-04
Filing date: 2005-10-04
Publication date: 2007-11-14

Abstract

一方面本发明提供了抑制哺乳动物细胞死亡或炎症的方法，其中所述的方法各自包括将足以抑制哺乳动物细胞死亡或炎症的量的Bc1蛋白质施用于哺乳动物的步骤。本发明还提供了当施用于哺乳动物时抑制细胞死亡和炎症的Bc1蛋白质的鉴定方法。

Description

抑制哺乳动物细胞死亡或炎症的方法

发明领域

本发明涉及外源施用的蛋白质(例如Bcl-2蛋白质)抑制细胞死亡和/或炎症的用途。

发明背景

程序性细胞死亡是哺乳动物发育的正常和必需部分。例如，人类胎儿各手指的发育需要发育中的手指之间的组织的程序性细胞死亡。然而，引起程序性细胞死亡的生物化学过程由多种疾病和损伤触发。例如，程序性细胞死亡可由创伤性损伤、中风、心肌梗塞、器官移植以及肠系膜与外周血管疾病触发。所述的程序性细胞死亡进一步破坏损伤或患病有机体的健康。

各种前述类型的疾病和损伤典型地包括当先前中断的血流恢复至活组织时产生的某些局部缺血和再灌注损伤。例如，冠状动脉的阻塞由于心脏组织暂时性缺乏血液供应可引起心肌死亡。当通过施用溶血栓药物使血流恢复至心肌时其它的肌肉可死亡。

慢性和急性炎症也可损害或杀伤哺乳动物的活细胞。例如，假以时日与肺气肿相关的炎症可引起肺部损伤。炎症可触发程序性细胞死亡，或通过某些其它的机制损伤活组织。因此，持续需要用于抑制哺乳动物细胞死亡和/或炎症的方法和组合物。

发明概述

依照前述，一方面本发明提供了用于抑制哺乳动物细胞死亡和/或炎症的方法，其中所述的方法各自包括将足以抑制哺乳动物细胞死亡和/或炎症的量的Bcl蛋白质施用于哺乳动物的步骤。本发明该方面的方法可用于，例如，治疗哺乳动物的涉及细胞死亡的损伤或疾病(如，局部缺血-再灌注损伤)，和/或治疗哺乳动物的涉及炎症的损伤或疾病(如，哮喘)。本发明该方面的方法也可用于，例如，预防性地治疗哺乳动物以防止或延迟细胞死亡和/或炎症的发作。

另一方面，本发明提供了当施用于哺乳动物时抑制细胞死亡和/或炎症的Bcl蛋白质的鉴定方法，其中本发明该方面的方法各自包括筛选多个蛋白质以鉴定当施用至哺乳动物时抑制细胞死亡和/或炎症的Bcl蛋白质的步骤。本发明该方面的方法可用于，例如，鉴定当施用于哺乳动物时抑制细胞死亡和/或炎症的Bcl蛋白质，以及可用于治疗哺乳动物的涉及细胞死亡和/或炎症的损伤或疾病的Bcl蛋白质。

另一方面，本发明提供了当施用于哺乳动物时抑制细胞死亡和/或炎症的Bcl蛋白质的鉴定方法，其中本发明该方面的方法各自包括分析由实验获得的数据的步骤，其中筛选多个蛋白质以鉴定抑制哺乳动物的细胞死亡和/或炎症的Bcl蛋白质。本发明该方面的方法可用于，例如，鉴定当施用于哺乳动物时抑制细胞死亡和/或炎症以及可用于治疗哺乳动物的涉及细胞死亡和/或炎症的损伤或疾病的Bcl蛋白质。

附图简述

当与附图一起理解时，本发明的前述方面和许多伴随的优点将更容易领会，通过参考以下的详细描述，变得更容易理解，其中：

图1显示了在骨髓细胞中表达外源性人类Bcl-2(hBcl-2)的十一只转基因小鼠血浆中肌酸激酶浓度的柱状图(在图1中标记为Bcl-2)，和在骨髓细胞中不表达外源性hBcl-2的九只非转基因(对照)C57BL/6小鼠血浆中肌酸激酶浓度的柱状图。在所述的小鼠已经经受如实施例1所描述的局部缺血-再灌注损伤后测量肌酸激酶的浓度。肌酸激酶的浓度以单位/升(U/L)表示(^*p＜0.05)。

图2显示了已经经受局部缺血-再灌注损伤的八只对照C57BL/6小鼠(在图2中标记为C57)血浆中肌酸激酶浓度的柱状图，和已经经受局部缺血损伤的八只EμT-Bcl-2小鼠(在图2中标记为EμBcl-2(T细胞))血浆中肌酸激酶浓度的柱状图(^*p＜0.05)。

图3显示了来自六只对照C57BL/6小鼠(缩写为C57)，在T细胞中表达hBcl-2的五只EμT-Bcl-2小鼠(缩写为EμT)，在B细胞中表达hBcl-2的六只EμB-Bcl-2小鼠(缩写为EμB)，和在骨髓细胞中表达hBcl-2的五只hMRP8-骨髓-Bcl-2小鼠(缩写为hMRP)的腿肌肉组织中TUNEL阳性细胞百分数的柱状图。如实施例3所描述，所有的小鼠已经经受局部缺血-再灌注损伤(^*p＜0.05，与C57相比)。

图4显示了局部缺血和再灌注后，六只小鼠(标记为tg+小鼠)血浆中肌酸激酶浓度的柱状图，该六只小鼠在局部缺血前已经接受了从在T淋巴细胞表达hBcl-2的小鼠中提取的血浆的注射。图4还显示了局部缺血和再灌注后，小鼠(标记为tg-小鼠)血浆中肌酸激酶浓度的柱状图，该小鼠在局部缺血前已经接受了从在T淋巴细胞不表达hBcl-2的六只同窝出生对照小鼠中提取的血浆的注射(^*p＜0.05)。

图5显示了已使用表达hBcl-2的Jaws II白细胞注射的18只小鼠血浆中肌酸激酶浓度的柱状图(通过缩写词Bcl-2标记)；已使用表达增强绿色荧光蛋白质的Jaws II白细胞注射的16只对照小鼠血浆中肌酸激酶浓度的柱状图(通过缩写词GFP标记)；和已使用磷酸盐缓冲液注射的12只对照小鼠血浆中肌酸激酶浓度的柱状图(通过缩写词PBS标记)。在小鼠已经经受如实施例5所描述的局部缺血再灌注损伤后测量肌酸激酶的浓度(^*p＜0.05)。

图6显示了局部缺血和再灌注后，十只小鼠(在图6中标记为JAWSII-Bcl-2)血浆中肌酸激酶浓度的柱状图，该十只小鼠在局部缺血前已经被注射了来自表达Bcl-2的hBcl-2-Jaws II细胞培养物的上清液介质。图6还显示了局部缺血和再灌注后，九只小鼠(在图6中标记为JAWSII-GFP)血浆中肌酸激酶浓度的柱状图，该九只小鼠在局部缺血前已经被注射了来自表达增强绿色荧光蛋白质的EGFP-Jaws II细胞培养物的上清液介质。所述的肌酸激酶浓度有显著性差异，p＜0.05。

图7显示了局部缺血和再灌注后，已在局部缺血和再灌注前接受重组人类Bcl-2注射(每只小鼠1μg)的12只小鼠(标记为rBcl-2)血浆中肌酸激酶浓度的柱状图；和局部缺血和再灌注后，已在局部缺血和再灌注前接受重组人类泛激素或用于注射重组Bcl-2的载体溶液注射的12只对照小鼠(标记为对照)血浆中肌酸激酶浓度的柱状图。这两种类型的对照之间肌酸激酶的浓度没有差异，因此将这些对照数据合并。所述的肌酸激酶浓度有显著性差异，p＜0.05。

图8显示了在骨髓细胞中表达hBcl-2的五只hMRP8-Bcl-2小鼠(在图9中标记为Bcl-2/2)和五只C57BL/6对照小鼠的梗死体积(V_梗死)占左心室体积(V_LV)百分数的柱状图；C57BL/6对照小鼠和hMRP8-Bcl-2小鼠的梗死体积(V_梗死)占风险区域(area-at-risk)体积(V_AAR)百分数的柱状图；和C57BL/6对照小鼠和hMRP8-Bcl-2小鼠的风险区域体积(V_AAR)占左心室体积(V_LV)百分数的柱状图。Bcl-2/2小鼠和C57BL/6小鼠之间的V_梗死/V_LV和V_梗死/V_AAR有显著性差异，p＜0.05。

图9显示了六只C57BL/6对照小鼠和四只EμT-Bcl-2小鼠(在T细胞中表达Bcl-2)的梗死体积(V_梗死)占左心室体积(V_LV)百分数的柱状图；C57BL/6对照小鼠和EμT-Bcl-2小鼠的梗死体积(V_梗死)占风险区域体积(V_AAR)百分数的柱状图；和C57BL/6对照小鼠和EμT-Bcl-2小鼠的风险区域体积(V_AAR)占左心室体积(V_LV)百分数的柱状图；EμT-Bcl-2小鼠和C57BL/6小鼠之间的V_梗死/V_LV和V_梗死/V_AAR有显著性差异，p＜0.05。

图10显示了接受表达外源性人类Bcl-2的CD11b+细胞注射(在经受心肌局部缺血和再灌注前)的七只C57BL/6小鼠(这些小鼠在图10中标为Bcl-2/2)，和已接受来自它们同窝出生小鼠的CD11b+细胞(未表达外源性Bcl-2)输注(在经受心肌局部缺血和再灌注前)的六只C57BL/6对照小鼠(标记为同窝出生Tg-)的梗死体积(V_梗死)占左心室体积(V_LV)百分数，梗死体积(V_梗死)占风险区域体积(V_AAR)百分数，和风险区域体积(V_AAR)占左心室体积(V_LV)百分数的柱状图(^*p＜0.05)。

图11显示了在盲肠结扎和穿刺前已使用重组人类Bcl-2(rBcl-2)注射的12只小鼠和在盲肠结扎和穿刺前没有使用rBcl-2注射的12只对照小鼠的存活率曲线。所述的存活率曲线有显著性差异，p＜0.05。

优选实施方案的详细描述

一方面，本发明提供了抑制哺乳动物细胞死亡和/或抑制哺乳动物炎症的方法。各方法包括将足以抑制哺乳动物细胞死亡和/或炎症的量的Bcl蛋白质施用于哺乳动物的步骤。

抑制哺乳动物细胞死亡包括全部或部分抑制哺乳动物细胞死亡。抑制哺乳动物炎症包括全部或部分抑制哺乳动物炎症。

本发明的方法可在任何哺乳动物中实施，例如灵长类(例如，人类)、犬属哺乳动物(例如，家犬)、猫属哺乳动物(例如，家猫)、牛、绵羊、马、山羊和猪。

在本发明的实施中，可将一种或多种类型的Bcl蛋白质施用于正经受细胞死亡的哺乳动物(例如，经受引起细胞死亡的疾病，或接受引起细胞死亡的内科治疗，或正经受引起细胞死亡的损伤)。引起细胞死亡的疾病，或内科治疗的实例包括中风，心肌梗死，心脏停搏，急性冠脉综合征/不稳定型心绞痛，心肺旁路移植，创伤性休克，器官移植，肠系膜、视网膜和外周血管疾病，烧伤，冻伤，肢体或手指脚趾再植，创伤性脑损伤，癫痫持续状态，帕金森病，亨廷顿病，肌萎缩性侧索硬化症，阿尔茨海默病，黄斑变性，急性颅内出血，急性肾衰竭，急性肺损伤/成人呼吸窘迫综合征，败血症，脑膜炎，急性缺血或酒精性肝损伤，斯耶格伦氏病，放射诱发的肠炎，和放射诱发的骨髓衰竭。

在本发明的实施中，可将一种或多种类型的Bcl蛋白质正经受炎症的哺乳动物(例如，正经受炎症性疾病，或正经受引起炎症的损伤，或接受引起炎症的内科治疗)。炎症性疾病的实例包括哮喘，克罗恩氏病，溃疡性结肠炎，肝炎(例如，病毒性慢性肝炎)，银屑病，异位性皮炎，天疱疮，肾小球肾炎，动脉粥样硬化，结节病，类风湿性关节炎，银屑病关节炎，强直性脊柱炎，韦格纳氏(wegener′s)综合征，古德帕斯丘(Goodpasture’s)综合征，巨细胞性动脉炎，结节性动脉外膜炎，特发性肺纤维化，急性肺损伤，慢性阻塞性肺病，流感后肺炎，严重急性呼吸器官综合症(SARS)，肺结核，疟疾，败血症，脑型疟，恰加斯氏(Chagas)病，血吸虫病，细菌和病毒性脑膜炎，囊性纤维病，多发性硬化症，阿尔茨海默病，脑脊髓炎，镰状细胞贫血，胰腺炎，移植(例如，宿主介导的移植组织(例如造血干细胞或器官)的排斥反应，移植物介导的宿主反应，例如移植物抗宿主病(graft vs.host disease)，系统性红斑狼疮，自身免疫糖尿病，甲状腺炎，和放射性肺炎。

另外，在本发明的实施中可将一种或多种Bcl蛋白质施用于没有正经受炎症性疾病或与细胞死亡相关疾病的哺乳动物。例如，可将一种或多种类型的Bcl蛋白质预防性地施用于哺乳动物以防止细胞死亡或炎症的发作，或降低细胞死亡或炎症发作的可能性，或降低随后产生的细胞死亡和/或炎症的严重性。所述的哺乳动物正经受引起细胞死亡和/或炎症的疾病，施用所述的Bcl蛋白质以防止细胞死亡或炎症的发作，或降低细胞死亡或炎症发作的可能性，或降低随后产生的细胞死亡和/或炎症的严重性。例如，以下范畴的人类患者可受益于防止细胞死亡或炎症的发作，或降低细胞死亡或炎症发作可能性的Bcl蛋白质的施用：具有中风风险的经受短暂性脑缺血发作的患者，具有心肌梗死风险的不稳定型心绞痛患者，具有多器官功能障碍综合征风险的创伤或烧伤患者，以及具有术后器官功能障碍风险的正经受心肺旁路移植术的患者。

如此处所用，术语“Bcl蛋白质”指当施用于哺乳动物时抑制哺乳动物细胞死亡，和/或当施用于哺乳动物时抑制哺乳动物炎症的蛋白质，并且其至少是以下蛋白质组之一的成员(标记为组(a)至(g))。

组(a)：包括和下述SEQ ID NO：1列出的氨基酸序列至少有35％相同(例如，至少40％，或至少45％，或至少50％，或至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％相同)的氨基酸序列的蛋白质：

RRVGDELEKEYERAFSSFSAQLHVTPTTARELFGQVATQLF

SDGNINWGRVVALFSFGGFLALKLVDKELEDLVSRLASFLS

EFLAKTLANWLRENGGW(SEQ ID NO：1)。

SEQ ID NO：1列出的氨基酸序列是蛋白质Bcl-2家族成员Bcl结构域的共有序列。

组(b)：包括至少12种氨基酸的蛋白质，其中所述的蛋白质和由SEQ IDNO：2(GenBank登录号AAH27258)列出的氨基酸序列组成的Bcl-2蛋白质片段至少有50％相似(例如，至少55％，至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％相似)。在某些实施方案中，所述的蛋白质与以下的Bcl-2蛋白质片段至少有50％相似：TGYDNREIVMKYIHYKLSQRGYEWD(SEQ ID NO：3)。在某些实施方案中，所述的蛋白质和由SEQ ID NO：2列出的氨基酸序列组成的Bcl-2蛋白质的片段至少有50％相同(例如，至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％相同)。所述的Bcl-2类蛋白质是抑制细胞死亡的细胞内胞质蛋白(参见，例如，J.M.Adams和S.Cory，Science 281：1322-1326(8月28，1998年)；S.Cory，等，Oncogene 22：8590-8607，2003)。

组(c)：包括至少12种氨基酸的蛋白质，其中所述的蛋白质和A-1蛋白质(也称为Bfl-1蛋白质)的片段至少有50％相似(例如，至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％相似)，其中所述的A-1蛋白质由SEQ ID NO：4(GenBank登录号AAC50438)列出的氨基酸序列组成。在某些实施方案中，所述的蛋白质和以下的A-1蛋白质片段至少有50％相似：FGYIYRLAQDYLQCVLQIPQPGSGPSKTSR(SEQ ID NO：5)。在某些实施方案中，所述的蛋白质和由SEQ ID NO：4列出的氨基酸序列组成的A-1蛋白质片段至少有50％相同(例如，至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％相同)。A-1蛋白质是Bcl-2的同源物(homolog)并且是抑制细胞凋亡的细胞内胞质蛋白(参见，例如，A.Karsan等，Blood 87(8)：3089-3096，4月15，1996；S.S.Choi等，Mammalian Genome5：781-782，1997)。

组(d)：包括至少12种氨基酸的蛋白质，其中所述的蛋白质和Bcl-X蛋白质片段至少有50％相似(例如，至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％相似)，其中所述的Bcl-X蛋白质由SEQ ID NO：6(GenBank登录号Q07817)列出的氨基酸序列组成。在某些实施方案中，所述的蛋白质和以下的Bcl-X蛋白质片段至少有50％相似：MSQSNRELVVDFLSYKLSQKGYSWSQF(SEQID NO：7)。在某些实施方案中，所述的蛋白质和由SEQ ID NO：6列出的氨基酸序列组成的Bcl-X蛋白质片段至少有50％相同(例如，至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％相同)。Bcl-X蛋白质是Bcl-2的同源物并且是抑制细胞凋亡的细胞内胞质蛋白(参见，例如，L.H.Boise等，Cell 74(4)：597-608，8月27，1993。

组(e)：包括至少12种氨基酸的蛋白质，其中所述的蛋白质和由SEQ IDNO：8(GenBank登录号AAB09055)列出的氨基酸序列组成的Bcl-W蛋白质片段至少有50％相似(例如，至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％相似)。在某些实施方案中，所述的蛋白质和以下的Bcl-W蛋白质片段至少有50％相似：SAPDTRALVADFVGYKLRQKGYVC(SEQ ID NO：9)。在某些实施方案中，所述的蛋白质和由SEQ ID NO：8列出的氨基酸序列组成的Bcl-W蛋白质片段至少有50％相同(例如，至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％相同)。Bcl-W蛋白质是Bcl-2的同源物，并且是抑制细胞凋亡的细胞内胞质蛋白(参见，例如，L.Gibson等，Oncogene 13(4)：665-675，8月15，1996)。

组(f)：包括至少12种氨基酸的蛋白质，其中所述的蛋白质和Mcl-1蛋白质片段至少有50％相似(例如，至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％相似)，其中所述的Mcl-1蛋白质由SEQ ID NO：10(GenBank登录号AAF64255)列出的氨基酸序列组成。在某些实施方案中，所述的蛋白质和以下的Mcl-1蛋白质片段至少有50％相似：DLYRQSLEIISRYLREQATG(SEQ ID NO：11)。在某些实施方案中，所述的蛋白质和由SEQ ID NO：10列出的氨基酸序列组成的Mcl-1蛋白质片段至少有50％相同(例如，至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％相同)。Mcl-1蛋白质是Bcl-2的同源物，并且是抑制细胞凋亡的细胞内胞质蛋白。

组(g)：和由以下氨基酸序列组成的BH4结构域至少有50％相似(例如，至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％相似)的蛋白质：PRLDIRGLVVDYVTYKLSQNGYEW(SEQ ID NO：12)。在某些实施方案中，所述的蛋白质和由SEQ ID NO：12列出的氨基酸序列组成的BH4结构域至少有50％相同(例如，至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％相同)。BH4(Bcl-2同源结构域4)是在Bcl-2、Bcl-X和Bcl-W蛋白质中发现的N-末端结构域。SEQ IDNO：12列出的氨基酸序列是蛋白质Bcl-2家族BH4结构域的共有序列。

如此处所用，术语“蛋白质”包括具有至少12个氨基酸的蛋白质。

如此处所用，结合本发明实施中有用的蛋白质，术语“片段”指至少12个相连的氨基酸，并且可包括完整的蛋白质氨基酸序列。

两个蛋白质序列上下文中的序列同一性(一般以同一性百分数表示)指当所述的两个序列在特定的对比视窗中进行比对以求最大对应性时两个序列中相同的氨基酸残基数目(例如，如果将两个蛋白质序列进行比对，每个蛋白质具有100个氨基酸，并且第一个序列中的75个氨基酸与第二个序列中的75个氨基酸相同并且比对，那么所述的同一性百分数是75％)。此处提供的序列同一性值指使用GAP(例如，GCG程序(Accelrys，Inc.，SanDiego，Calif.)version 10)利用以下参数获得的值：使用GAP加权50和长度加权3的同一性百分数。将候选蛋白质和参考蛋白质的完整氨基酸序列进行比对。GAP使用Needleman&Wunsch J.MoI.Biol.48：443-53，1970的运算法则，来找出两个完整序列最大化匹配数目和最小化缺口数目的比对。可使用与GAP相当的方法。术语“相当的方法”指任何的序列对比方法，例如序列对比程序，其对任意两个讨论的序列所生成的比对与GAP所生成的相应的比对相比，具有相同的氨基酸残基匹配和相同的序列同一性百分数。

序列相似性是两个被比蛋白质序列相关度的统计度量。相似性百分数通过基于化学相似性(例如，所述的对比氨基酸是否是酸性、碱性、疏水、芳香族等)和/或进化距离(其量度为将编码被比氨基酸对中一个成员的密码子转变为编码所述对中另一个成员的密码子所需要的碱基对变化的最小数目)分配数值至每对被比氨基酸的计算机程序进行计算。在根据经验将两个序列进行最适比对后，通过反复对比所有可能的比对而做出计算(参见，例如，Henikoff， S.，和Henikoff，J.G，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA89：10915-10919，1992)。例如，序列相似性可使用用于完全比对的ClustalW比对程序进行测定，单CPU模式，使用GONNET矩阵，空位开放罚分100，空位封闭罚分-1，空位延伸罚分2和空位分离罚分4。在比对的序列中，相似性定义为两个氨基酸相同或具有保守取代或具有半保守取代。所述的ClustalW比对程序可在例如因特网上的the European BioinformaticsInstitute，Wellcome Trust Genome Campus，Hinxton，Cambridge，CBlO ISD，U.K.网页上获得。

在本发明的实施中有用的Bcl-2蛋白质氨基酸序列的代表性实例在通过国家生物技术信息中心，美国医学实验室，8600 Rockville Pike，Bethesda，Maryland 20894的Entrez搜索工具得到的蛋白质数据库中，于以下的登录号下列出(此处通过引用将每个鉴定的Bcl-2蛋白质氨基酸序列并入本文)：AAN17784.1；AAB17352.1；

AAC53460.1；AAK15454.1；AAC53458.1；AAB17354.1；AAA82174.1；AAF88137.1；

AAC72232.1；CAC10003.1；AAC53459.1；AAA19257.1；CAA57886.1；AAB17353.1；

AAB96881.1；CAA58557.1；AAA82173.1；AAC15799.1；AAA51039.1；AAK15455.1；

AAK31308.1；AAK31307.1；CAA80657.1；AAF89532.1；AAK31306.1；BAB85856.2；

AAP35872.1；AAH19307.1；BAB71819.1；CAA80061.1；AAF33212.1；AAP36940.1；

CAA04597.1；AAB07677.1；AAR92491.1；AAA37281.1；AAH68988.1；AAC60701.2；

AAK92201.1；CAB92245.1；AAA37282.1；BAC33767.1；AAP47159.1；AAA77686.1；

BAA01978.1；BAC37060.1；AAA77687.1；AAA53662.1；CAA29778.1；AAH27258.1；

AAO26045.1；AAB53319.1；BAC24136.1；AAA35591.1；CAA78018.1；BAC81344.1；

BAD05044.1；AAA51814.1；AAA51813.1；AAN03862.1；CAA57844.1；AAH40369.1；

BAB28740.1；BAB62748.1；AAH44130.1；AAH71291.1；AAK81706.1；AAH74505.1；

AAO64470.1；BAD32203.1；CAA57845.1；AAO64468.1；AAH74021.1；AAC64200.1；

AAB86430.1；AAB09056.1；BAB29912.1；BAB23468.1；AAB09055.1；BAA19666.2；

AAH73259.1；CAF93123.1；AAO13177.2；CAF96873.1；AAL35559.1；AAP21091.1；

AAB97953.1；AAG02475.1；AAK55419.1；AAH27536.1；AAB97956.1；AAH28762.1；

AAB97954.1；AAO89009.1；AAP35767.1；AAH16281.1；AAC50438.1；AAC50288.1；

CAG46735.1；AAP36152.1；CAG02784.1；CAA70566.1；AAF89533.1；AAO22992.1；

AAA03620.1；CAG46760.1；BAC40796.1；CAA73684.1；BAC53619.1；AAH55592.1；

AAH66960.1；AAC48806.1；AAF71267.1；AAH04431.1；AAO74828.1；AAA93066.1；

AAA74466.1；CAA58997.1；CAG33700.1；BAB85810.1；AAH14175.1；AAA03619.1；

AAF98242.1；AAM74949.1；CAD10744.1；AAF71760.1；AAD13295.1；AAH78835.1；

AAA75200.1；AAC60700.2；AAH53380.1；AAH18228.1；BAB28776.1；AAA03622.1；

AAD31644.1；AAF36411.1；AAC26327.1；AAM34436.1；CAE54428.1；AAH03839.1；

AAH21638.1；AAH05427.1；AAC31790.1；BAC77771.1；AAA74467.1；AAF64255.1；

AAP36208.1；AAP35286.1；AAH71897.1；AAH17197.1；AAF74821.1；AAD13299.1；

AAG00896.1；AAH78871.1；AAH30069.1；AAAC53582.1；AAB87418.1；BAC21258.1；

AAF09129.1；AAH63201.1；AAK06406.1；AAR84081.1；AAP36565.1；AAP35936.1；

AAH06203.1；AAD51719.1；AAD31645.1；和AAC50142.1。

Bcl蛋白质包括，例如，天然存在的Bcl蛋白质，可引入非天然氨基酸的合成Bcl蛋白质，和其中蛋白质，肽，氨基酸序列，或其它化学结构联接至Bcl蛋白质一个部分(例如，N末端或C末端)的Bcl融合蛋白质。可融合至Bcl蛋白质的蛋白质或化学结构的代表性实例包括：人血清蛋白、免疫球蛋白、聚乙二醇，或其它蛋白质或化学结构，例如增加Bcl蛋白质血清半衰期，或增强Bcl蛋白质功效，或降低Bcl蛋白质免疫原性的蛋白质或化学结构。

Bcl蛋白质抑制哺乳动物细胞死亡和/或抑制哺乳动物炎症的能力可在，例如，经受局部缺血-再灌注损伤的哺乳动物中进行评价。例如，可使用以下的标记物和/或试验中的一种或多种来评价Bcl蛋白质抑制经受局部缺血-再灌注损伤的哺乳动物细胞死亡和/或炎症的能力：1.通过骨骼肌局部缺血-再灌注后哺乳动物血浆或血清中肌酸激酶浓度的降低来显示炎症和/或细胞死亡的抑制(参见，例如，此处的实施例9，和Iwata，A.，等，Blood100：2077，2002)；2.通过继哺乳动物心脏或哺乳动物大脑局部缺血-再灌注后梗死尺寸大小的减少来显示炎症和/或细胞死亡的抑制(参见，例如，此处的实施例10，和Palazzo，A.J.，Am.J.Physiol.275：H2300，1998；Piot，C，Circulation 96：1598，1997)；3.通过继哺乳动物肾脏局部缺血-再灌注后血浆尿素氮(BUN)和/或肌酸的减少来显示炎症和/或细胞死亡的抑制(参见，例如，Daemen，M.，J.Clin.Invest.104：541，1999；Vukicevic，S.，J.Clin.Invest.102：202，1998)；4.通过继哺乳动物肝脏局部缺血-再灌注后谷草转氨酶(AST)和/或谷丙转氨酶(ALT)的减少来显示炎症和/或细胞死亡的抑制(参见，例如，Cursio，R.，FASEB J.13：253，1999)；5.通过继哺乳动物肺局部缺血-再灌注后动脉血氧含量的改善来显示炎症和/或细胞死亡的抑制；6.通过继哺乳动物肺局部缺血-再灌注后肺水肿的减少来显示炎症和/或细胞凋亡的抑制(参见，例如，Kowalski，T.F.，J.Appl.Physiol.65：125，1990)；7.通过经受局部缺血-再灌注损伤的组织中(例如，骨骼肌，心脏，大脑，肺，肠，肾，或肝脏)细胞死亡标记物的减少(例如，通过由末端转移酶末端标记法(TUNEL)评价的DNA链断裂减少，通过半胱天冬酶的活化减少，通过磷脂酰丝氨酸在细胞表面的表达增加，通过电泳后180-200个碱基对的DNA梯度减少)来显示细胞死亡的抑制(参见，例如，Iwata等，Blood 100：2077，2002；Piot，C，Circulation 96：1598，1997；Namura，S.，J Neurosci.18：3659，1998；Noda，T.，Am.J.Physiol.274：G270，1998；和Cursio，R.，FASEB J.13：253，1999)。

作为Bcl蛋白质施用结果的炎症和/或细胞死亡的抑制也可在经受败血症(例如，起因于盲肠结扎和穿刺的败血症，起因于细菌性肺炎的败血症，起因于细菌性腹膜炎的败血症)的哺乳动物，或接受引起败血症的物质(例如，脂多糖、细菌脂蛋白、脂胞壁酸)注射或输注(例如，注射或输注入腹腔，注射或输注入肺，皮下注射或输注，真皮内注射或输注)的哺乳动物中进行评价。作为Bcl蛋白质施用结果的炎症和/或细胞死亡的抑制通过继注射或输注引起败血症的物质引发败血症之后哺乳动物存活率的提高来显示。

Bcl蛋白质的施用通过任何有效的途径达到，例如，口服或胃肠外。胃肠外递送的方法包括局部、动脉内、皮下、骨髓内、静脉内或鼻内施用。Bcl蛋白质可连同适宜的药学上可接受的载体施用，包括赋形剂及其它有助于将Bcl蛋白质施用于哺乳动物受体的化合物。其他详细的制剂和施用技术可见于，例如，最新版的“Remington′SPharmaceutical Sciences”(MaackPublishing Co，Easton PA)。

口服施用的Bcl蛋白质可使用本领域公知的药学上可接受的载体，以适于口服施用的剂量进行配制。此类载体使得Bcl蛋白质能够配制成适于受体摄取的片剂、药丸、锭剂、胶囊、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、膏剂、混悬剂等。

口服使用的Bcl蛋白质可以通过下述方法获得，例如，将一种或多种Bcl蛋白质与固体赋形剂组合，任选地研磨所得的混合物，如果需要，在加入适宜的其它化合物后，加工混合物颗粒得到片剂或锭剂的核心。适宜的赋形剂包括碳水化合物或蛋白质填充剂。这些包括，但不局限于，糖类，包括乳糖，蔗糖，甘露糖醇，或山梨醇，来源于玉米、小麦、水稻、马铃薯或其它植物的淀粉；纤维素例如甲基纤维素；羟丙甲纤维素，或羧甲基纤维素钠；和树胶包括阿拉伯胶和西黄蓍胶；以及蛋白质，例如明胶和胶原。如果需要，可加入崩解剂或增溶剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，海藻酸或其盐，例如海藻酸钠。

锭剂核心具有适宜的包衣例如浓缩的糖溶液，其也可包含阿拉伯胶，滑石粉，聚乙烯吡咯烷酮，卡波普凝胶，聚乙二醇，和/或二氧化钛，漆溶液，和适宜的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或色素加入片剂或锭剂的包衣中用于产品鉴定或表征活性化合物的量(即，剂量)。

可口服使用的Bcl蛋白质可以配制成，例如，如由明胶制成的推合式胶囊，以及由明胶和包衣例如甘油或山梨醇制成的密封软胶囊。推合式胶囊可包含与填充剂或粘合剂例如乳糖或淀粉，润滑剂例如滑石粉或硬脂酸镁，及任选稳定剂混合的Bcl蛋白质。在软胶囊中，所述的Bcl蛋白质可溶解或混悬于适宜的液体，例如脂肪油，液体石蜡，或具有或没有稳定剂的液体聚乙二醇中。

用于胃肠外施用的Bcl蛋白质包括一种或多种Bcl蛋白质的水溶液。为了注射，Bcl蛋白质可在水溶液，优选在生理学上可相容的缓冲液例如汉克氏(Hank′s)溶液，林格氏(ringer′s)液，或生理缓冲盐水中配制。注射用水混悬剂可包含增加混悬液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠，山梨醇，或右旋糖酐。另外，Bcl蛋白质的混悬液可制备为适宜的注射用油混悬剂。适宜的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油例如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或三酸甘油酯，或脂质体。任选地，所述的混悬剂也可包含提高化合物溶解度以允许制备高浓度溶液的适宜稳定剂或试剂。

为了局部或鼻腔施用，一般将适于透过特定屏障的渗透剂用于所述的制剂中。此类渗透剂通常是本领域已知的。

Bcl蛋白质可通过本领域公知的技术(例如，通过常规的混合、溶解、造粒、制备糖衣、磨细、乳化、封装、包埋或冷冻干燥方法)被制成适于施用于哺乳动物的形式。所述的Bcl蛋白质也可进行修饰以提供适宜的释放特征，例如，通过常规方式(例如，包衣)的缓释释放或靶向释放。

所述的Bcl蛋白质可作为盐提供并且可与许多酸构成，包括但不局限于盐酸、硫酸、醋酸、乳酸、酒石酸、苹果酸和琥珀酸。盐比相应的游离碱形式更易溶解于水或其它的质子性溶剂中。

在已经将此类Bcl蛋白质在可接受载体中制成制剂后，可将它们放在适当的容器中并贴上标签使用。

再次通过代表性实例的方式，通过将Bcl蛋白质施用于能够吸收蛋白质的机体膜，例如鼻，胃肠道和直肠膜而将其引入动物机体中。一般将所述的蛋白质结合渗透促进剂施用于吸收性膜。(参见，例如V.H.L.Lee，Crit.Rev.Ther.药物载体系统.5：69，1988；V.H.L.Lee，J Controlled Release13：213，1990；V.H.L.Lee，Ed.，肽和蛋白质药物的递送，Marcel Dekker，NewYork，1991；DeBoer，A.G，等，J Controlled Release 13：241，1990)。例如，STDHF是与胆盐结构相似的类固醇表面活性剂梭链孢酸的合成衍生物，并且已作为鼻腔递送渗透促进剂使用(Lee，W.A.，Biopharm.，11月./12月.22，1990)。

可结合另外的分子，例如脂质将Bcl蛋白质引入，以保护所述的蛋白质免受酶降解。例如，与聚合物，特别是聚乙二醇(PEG)的共价连接，已用于保护机体内某种蛋白质免受酶水解并因此延长了半衰期(Fuertges，F.，等，J Controlled Release 11：139，1990)。已报道了许多用于蛋白质递送的聚合物系统(Bae，Y.H.，等，J Controlled Release 9：271，1989；Hori，R.，等，Pharm.Res.5：813，1989；Yamakawa，L，等，J Pharm.Sci.79：505，1990；Yoshihiro，L，等，J.Controlled Release 70：195，1989；Asano，M.，等，JControlled Release 9：111，1989；Rosenblatt，J.，等，J.Controlled Release 9：195，1989；Makino，K.，J.Controlled Release 2：235，1990；Takakura，Y.，等，J.Pharm.Sci.75：117，1989；Takakura，Y.，等，J.Pharm.Sci.78：219，1989.)。

实际的施用量将取决于待施行治疗的个体，并且优选地是在无显著副作用下获得预期效果的最优化的量。有效剂量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。当然，所述的技术人员应理解分开的部分剂量也在本发明的范围内。

对于任意的Bcl蛋白质，所述的有效剂量最初可在任何适当的动物模型(例如，灵长类、大鼠和豚鼠以及其它实验动物)中进行评价。所述的动物模型也通常用于获得预期的浓度范围和施用途径。然后可使用此类信息确定人类或其它哺乳动物中的有用剂量和施用途径。

Bcl蛋白质的治疗功效和可能的毒性可通过实验动物中的标准药物规程(例如，ED₅₀，半数群体治疗有效剂量；和LD₅₀，50％半数群体致死剂量)进行确定。治疗作用和毒性作用的剂量比是治疗指数，并且其可以ED₅₀/LD₅₀的比值表示。表现出大的治疗指数的Bcl蛋白质是优选的。将由动物研究获得的数据用于制定一个供人类或其它哺乳动物使用的剂量范围。此类化合物的剂量优选地在具有很少或无毒性的包括ED₅₀的循环浓度范围内。所述的剂量通常依赖使用的剂型，患者的过敏性，和施用途径而在所述的范围内变动。

示例性的Bcl剂量包括在足以抑制哺乳动物细胞死亡和/或炎症的时间周期内施用至少50ng/kg/天，例如50ng/kg/天至50mg/kg/天，或例如0.5mg/kg/天至50mg/kg/天。典型地，将所述的Bcl蛋白质多次施用于哺乳动物(例如，每日地)。例如，在1天至20天，或1天至40天，或1天至60天的周期内将Bcl蛋白质至少每天一次地施用于哺乳动物。可将Bcl蛋白质无限期地施用于哺乳动物受体以治疗慢性的医学病症(例如，在接受治疗者剩余的寿命期间各天中至少每天一次)。如恰当，“ng”是纳克(nanogram或nanograms)的缩写词。恰当地，“mg”是毫克(milligram或milligrams)的缩写词。恰当地，“kg”是千克(kilogram或kilograms)的缩写词。

另一方面，本发明提供了当施用于哺乳动物时抑制细胞死亡和/或炎症的Bcl蛋白质的鉴定方法。本发明该方面的方法各自包括筛选多个蛋白质以鉴定当施用于哺乳动物时抑制细胞死亡和/或炎症的Bcl蛋白质的步骤。

在本发明该方面的实施中，至少筛选两种蛋白质以鉴定当施用于哺乳动物时抑制细胞死亡或炎症的Bcl蛋白质。因此，例如，可筛选两种和100种之间的蛋白质以鉴定当施用于哺乳动物时抑制细胞死亡或炎症的Bcl蛋白质；或，例如，可筛选100至500种蛋白质以鉴定当施用于哺乳动物时抑制细胞死亡或炎症的Bcl蛋白质；或，例如，可筛选100至1000种蛋白质以鉴定当施用于哺乳动物时抑制细胞死亡或炎症的Bcl蛋白质；或，例如，可筛选1000种以上的蛋白质以鉴定当施用于哺乳动物时抑制细胞死亡或炎症的Bcl蛋白质。

可使用任何有用的试验来鉴定当施用于哺乳动物时抑制细胞死亡和/或炎症的Bcl蛋白质。例如，所述的有用试验可为体外试验，或体内试验，或包括体外部分和体内部分的试验。有用试验的代表性实例包括在前描述的用于评价Bcl蛋白质抑制哺乳动物细胞死亡，和/或在经受局部缺血-再灌注损伤的哺乳动物中抑制炎症能力的试验。

另一方面，本发明提供了当施用于哺乳动物时抑制细胞死亡或炎症的Bcl蛋白质的鉴定方法。本发明该方面的方法各自包括由其中筛选多个蛋白质以鉴定当施用于哺乳动物时抑制细胞死亡和/或炎症的Bcl蛋白质的实验获得的数据的分析步骤。所述的分析可包括对比候选Bcl蛋白质在体内和/或体外对炎症和/或细胞死亡的作用，和对比候选蛋白质与非Bcl蛋白质，或已修饰(例如，通过定点突变)成无生物学活性的Bcl蛋白质对炎症和/或细胞死亡的作用，或与某些其它的对照治疗进行对比。由候选Bcl蛋白质产生的抑制细胞死亡或炎症的数量，与由对照治疗产生的抑制细胞死亡和/或炎症的数量相比具有统计学上的显著增加，说明所述的候选Bcl蛋白质抑制了细胞死亡或炎症。如果需要，可将所述的Bcl蛋白质做进一步研究。

此处公开的任何用于筛选多个Bcl蛋白质以鉴定抑制哺乳动物细胞死亡或炎症的Bcl蛋白质的方法可用于本发明的该方面。

在本发明该方面的实施中，所述的分析数据是由其中筛选多个蛋白质以鉴定当施用于哺乳动物时抑制细胞死亡或炎症的Bcl蛋白质的实验获得的。例如，可筛选两种和100种之间的蛋白质以鉴定当施用于哺乳动物时抑制细胞死亡或炎症的Bcl蛋白质；或，例如，可筛选100至500种蛋白质以鉴定当施用于哺乳动物时抑制细胞死亡或炎症的Bcl蛋白质；或，例如，可筛选100至1000种蛋白质以鉴定当施用于哺乳动物时抑制细胞死亡或炎症的Bcl蛋白质；或，例如，可筛选1000种以上的蛋白质以鉴定当施用于哺乳动物时抑制细胞死亡或炎症的Bcl蛋白质。

以下的实施例仅举例说明当前讨论的用于实施本发明的最佳方式，而不应认为限制本发明。此处清楚地将所有引用的文献通过引用并入本文。

实施例1

本实施例显示了在骨髓细胞中编码抗凋亡蛋白质、人类Bcl-2(SEQ IDNO：14)的cDNA(SEQ ID NO：13)的表达。骨髓细胞中Bcl-2蛋白质(SEQ IDNO：14)的表达减少了继小鼠后肢长期局部缺血后的损伤。

本试验使用了在骨髓细胞中表达重组人类Bcl-2(SEQ ID NO：14)的小鼠(hMRP8-骨髓-Bcl-2小鼠)，和在骨髓细胞中不表达重组人类Bcl-2(SEQID NO：14)的对照小鼠。所述的hMRP-骨髓-Bcl-2小鼠以前为Lagasse，E.，和LL.Weissman，J.Exp.Med.179：1047，1994所描述，其公开内容通过引用并入本文。这些小鼠是C57BL/6背景，以及对照小鼠是C57BL/6小鼠。

通过将肾动脉的主动脉末梢横断钳闭90分钟造成小鼠骨骼肌的局部缺血，然后移走夹钳并将后肢持续再灌注3小时。再灌注结束时(移走夹钳后3小时)将小鼠处死，并测量血浆肌酸激酶(CK)的浓度且用作为损伤的指标(作为骨骼肌损伤的结果，肌酸激酶浓度增加)。

这些实验的结果示于图1。十一只hMRP8-骨髓-Bcl-2小鼠(标为Bcl-2)的血浆肌酸激酶浓度显著地低于九只对照C57BL/6小鼠的血浆肌酸激酶浓度(^*p＜0.05)，表明人类Bcl-2(SEQ ID NO：14)保护小鼠免受局部缺血-再灌注损伤。然而，文献已报道来源于hMRP8-骨髓-Bcl-2的嗜中性白细胞表现出减少的细胞凋亡(Lagasse，E.，和Weissman，I.L.，J Exp.Med.179：1047，1994)，并且可能所述的嗜中性白细胞凋亡通过在损伤部位释放毒性产物而促使形成局部缺血-再灌注损伤。因此，可能Bcl-2防止了嗜中性白细胞的凋亡，从而减少在骨髓细胞中表达Bcl-2的小鼠的局部缺血-再灌注损伤数量。

然而，由于使用抗CD 18mAb阻止它们迁移进入组织中对局部缺血-再灌注损伤没有影响，因此嗜中性粒细胞参与长期的90分钟局部缺血时间的局部缺血再灌注损伤是不太可能的。(Iwata，A.等，Blood，100：2077(2002))。此外，如实施例2所示，T淋巴细胞中人类Bcl-2(SEQ ID NO：13)的过量表达也保护防御局部缺血-再灌注损伤。因此，骨髓细胞中人类Bcl-2的过量表达通过防止白细胞凋亡保护肌肉似乎是不可能的。

实施例2

本实施例显示了T淋巴细胞中人类Bcl-2(SEQ ID NO：14)的过量表达减少了继小鼠后肢长期局部缺血后的骨骼肌损伤。

本实验使用了在Eμ启动子控制下于T细胞中表达外源性人类Bcl-2(SEQ ID NO：14)的，C57BL/6基因背景的转基因小鼠(EμT-Bcl-2小鼠)，和在T细胞中不表达外源性Bcl-2(SEQ ID NO：14)的八只C57BL/6对照小鼠(C57BL/6小鼠)。所述的EμT-Bcl-2小鼠先前已描述并表现出仅在T淋巴细胞表达Bcl-2(SEQ ID NO：14)(Strasser，A.，等，Cell 67：889，1991，其公开内容通过引用并入本文)。

通过如实施例1所描述的横断钳闭诱发后肢的局部缺血，并且维持局部缺血90分钟随后进行3小时的再灌注。在实验结束时取血液样品用于测定EμT-Bcl-2小鼠和C57Bl/6小鼠的肌酸激酶(CK)浓度。如图2所示，八只EμT-Bcl-2小鼠的血清CK显著地低于八只C57BL/6对照小鼠的血清CK(标为C57)(^*p＜0.05)。

实施例3

本实施例显示了白细胞中Bcl-2(SEQ ID NO：14)的过量表达减少了继后肢长期局部缺血和再灌注后骨骼肌中的DNA链断裂。

本实验使用了在Eμ启动子控制下于T细胞中表达外源性人类Bcl-2(SEQ ID NO：14)的转基因小鼠(Eμ-T-Bcl-2小鼠)；在Eμ启动子控制下于B细胞中表达外源性人类Bcl-2(SEQ ID NO：14)的转基因小鼠(Eμ-B-Bcl-2小鼠)(在Strasser，A.，Proc.Natl Acad.Set 55：8661，1991中报道)；在骨髓细胞中表达外源性人类Bcl-2(SEQ ID NO：14)的转基因小鼠(hMRP8-骨髓-Bcl-2小鼠)(在实施例1中描述)；以及不表达外源性Bcl-2(SEQ ID NO：14)的对照小鼠(C57BL/6小鼠)。

已知随后进行骨骼肌再灌注的长期局部缺血导致了DNA链断裂，并且使用半胱氨酸蛋白酶抑制剂z-VAD的治疗防止了所述的链断裂并减少血浆CK浓度(Iwata，A.，等，Blood 100：2077，2002)。使用如生产商所描述的TUNEL技术将来自对照小鼠、Eμ-T-Bcl-2小鼠、Eμ-B-Bcl-2小鼠和hMRP8-骨髓-Bcl-2转基因小鼠的腿组织在福尔马林中固定并染色以鉴定DNA链断裂(In Situ Cell Death Detection Kit，Roche Applied Science，PO Box 50414，9115 Hague Road，Indianapolis，IN46250-0414)。

全部四种类型小鼠的染色阳性(表明存在DNA链断裂)的核数目占核总数目的百分数示于图3。所述的对照C57BL/6小鼠(标为C57)与每种转基因菌株相比具有显著多的阳性核数目(^*p＜0.05)。在一种细胞类型(在B细胞中的EμB，T细胞中的EμT，或骨髓细胞中的hMRP8)中表达Bcl-2(SEQID NO：14)的小鼠中，在骨骼肌和内皮细胞，而不是表达Bcl-2(SEQ IDNO：14)的其它细胞中防止了DNA链断裂，表明表达Bcl-2的细胞释放了保护细胞防御DNA链断裂的分子。即，保护作为“反”作用而发生。

实施例4

本实施例显示了来自T淋巴细胞过量表达hBcl-2(SEQ ID NO：14)的小鼠的血浆减少了随后进行再灌注的长期局部缺血后的损伤。

本实验使用了在T淋巴细胞中表达外源性人类Bcl-2(SEQ ID NO：14)的转基因小鼠(Eμ-T-Bcl-2小鼠)(在实施例2中描述)；和不表达外源性人类Bcl-2(SEQ ID NO：14)的同窝出生对照小鼠(C57B1/6小鼠)。取EμT-Bcl-2小鼠和它们同窝出生的对照小鼠的血液放入肝素中并通过离心提取血浆。在所述的小鼠经受如此处实施例1所描述的90分钟局部缺血和3个小时再灌注的前一天，将1ml来自EμT-Bcl-2小鼠，或1ml来自同窝出生对照小鼠的血浆，注射入C57BL/6小鼠的腹腔中。再灌注结束时从所述的小鼠抽取血液并测定血浆CK的浓度。这些实验的结果示于图4。接受来自EμT-Bcl-2小鼠(标为tg+)血浆注射的六只小鼠与接受来自未表达外源性Bcl-2(SEQ ID NO：14)的同窝出生对照小鼠(标为tg-)血浆注射的六只小鼠相比，具有显著低的CK浓度(^*p＜0.05)。

这些结果表明hMRP8-Bcl-2小鼠中Bcl-2(SEQ ID NO：14)的过量表达导致了起“反”作用的分子的释放，其可被转移至空白，对照、受体小鼠中并且保护受体小鼠防御局部缺血-再灌注损伤。

实施例5

本实施例显示了将转基因Jaws II白血球细胞(其表达编码Bcl-2蛋白质(SEQ ID NO：14)的cDNA(SEQ ID NO：13))，注射入小鼠与不使用Jaws II白血球细胞注射的对照小鼠相比，减少了局部缺血-再灌注损伤的数量。

高效率逆转录病毒包装细胞系的最新产生，连同含有允许表达两种来自单个mRNA转录物的基因表达的内核糖体进入位点(IRES)元件的逆转录病毒表达的载体的发展，为基因转录至哺乳动物细胞提供了新的工具(参见，例如，Hitoshi，Y.，等，Immunity 8：461，1998；Onishi，M.，等，Exp.Hematol.24：3241 996)。

将编码hBcl-2(SEQ ID NO：14)的cDNA(SEQ ID NO：13)在IRES部位的上游插入所述的pBM-IRES-EGFP逆转录病毒载体中，其中在IRES序列的下游克隆增强绿色荧光蛋白质的cDNA以生成所述的pBM-hBcl-2-IRES-EGFP载体。使用亲嗜性包装细胞系Phoenix生成病毒颗粒以转染由ATCC获得的Jaws II细胞。所述的Phoenix细胞系和逆转录病毒载体为Hitoshi，Y.，等，Immunity 5：461，1998，和Onishi，M.，等，Exp.Hematol.24：324，1996所描述。

对照Jaws II细胞仅表达EGFP。从所述的hBcl-2-JawsII细胞或EGFP-JawsII细胞中挑选出具有EGFP高表达的细胞，然后在C57BL/6小鼠经受长期局部缺血-再灌注的前一天注射入所述的小鼠中。如图5所示，使用hBcl-2-JawsII细胞(标为Bcl-2)注射的18只小鼠与使用磷酸盐缓冲液(标为PBS)注射的12只小鼠，或使用EGFP-JawsII细胞(标为GFP)注射的16只小鼠相比，具有显著低的血浆CK浓度(^*p＜0.05)。

实施例6

本实施例显示了与已使用来自表达增强绿色荧光蛋白质(EGFP，EGFP-JawsII细胞)的Jaws II细胞体外培养物上清液注射的小鼠血浆CK浓度相比，在已使用来自Jaws II细胞(其表达Bcl-2(SEQ ID NO：14))体外培养物上清液注射的小鼠中经受局部缺血再灌注损伤小鼠的血浆CK浓度较低。所述的hBcl-2-Jaws II细胞和EGFP-Jaws II细胞如实施例5所描述。

在培养开始后24小时收集来自hBcl-2-Jaws II细胞和EGFP-Jaws II细胞的细胞培养物的培养基且使用具有将近3kD的分子大小截留(cut-off)的离心过滤器浓缩约10倍。在长期局部缺血-再灌注之前24小时将1ml来自hBcl-2-Jaws II细胞或EGFP-Jaws II细胞的浓缩培养基注射入C57BL/6小鼠的腹腔内。在局部缺血-再灌注后从所述小鼠提取血浆，并测定血浆CK浓度。如图6所示，使用hBcl-2-Jaws II细胞上清液(标为JAWSII-Bcl-2)注射的十只小鼠的血浆肌酸激酶浓度显著地低于(p＜0.05)使用EGFP-Jaws II细胞上清液(标为JAWSII-GFP)注射的九只小鼠的血浆肌酸激酶浓度。

实施例7

本实施例显示了培养的JawsII-Bcl-2细胞将人类Bcl-2(SEQ ID NO：14)分泌至培养物上清液中。

将表达人类Bcl-2(SEQ ID NO：14)或增强的绿色荧光蛋白质(EGFP)的Jaws II细胞(如实施例5所描述)在无血清培养基中培养24小时，并分别收集上清液和浓缩10倍。细胞在蛋白酶抑制剂鸡尾酒(cocktail)中裂解然后将溶胞产物和细胞上清液经受Bcl-2的免疫印迹分析。浓缩的培养物上清液和来自JawsII-Bcl-2的溶胞产物均含有Bcl-2蛋白质，然而在浓缩的培养物上清液或JawsII-GFP细胞的溶胞产物中并没有检测到Bcl-2蛋白质。

实施例8

本实施例显示了在后腿局部缺血和再灌注前使用修饰的重组Bcl-2(SEQ ID NO：15)注射的小鼠中已经经受后腿局部缺血和再灌注的小鼠血浆肌酸激酶浓度显著低于在后腿局部缺血和再灌注前没有使用重组Bcl-2注射的小鼠血浆肌酸激酶浓度。SEQ ID NO：15是在羧基末端缺少17个氨基酸，并且在羧基末端包括一连串的10个组氨酸残基的人类Bcl-2。

在C57BL/6小鼠经受如实施例1所描述的后肢局部缺血(90分钟)和再灌注(180分钟)的前一天，以每只小鼠1μg的重组人类Bcl-2(rBcl-2)(SEQ IDNO：15)或每只小鼠1μg的重组人类泛激素(r泛激素)，或rBcl-2载体溶液对所述小鼠进行腹腔内注射。在90分钟的后肢局部缺血和180分钟的再灌注后取血液样品用于血浆肌酸激酶浓度的测定。两组对照(r泛激素和载体溶液)之间的肌酸激酶浓度没有差异因此将这些数据合并。如图7所示，在后腿局部缺血和再灌注前使用重组人类Bcl-2(SEQ ID NO：15)(标为rBcl-2)注射的12只小鼠中已经经受后腿局部缺血和再灌注的小鼠血浆肌酸激酶浓度显著地(p＜0.05)低于接受r泛激素或载体溶液(标为对照)的12只小鼠血浆肌酸激酶浓度。

实施例9

本实施例显示了受制于骨髓-约束启动子的人类Bcl-2(SEQ ID NO：14)的过量表达减少了继小鼠心脏长期局部缺血后的心肌损伤。

为了确定白细胞中Bcl-2蛋白质的过量表达是否是在组织而不是骨骼肌中起保护作用，使用已知为CD18-非依赖性的局部缺血时间考察心肌的局部缺血-再灌注损伤(Palazzo，AJ.，等，Am.J.Physiol.275：H2300，1998)。麻醉对照C57BL/6和hMRP8-Bcl-2小鼠，将它们的气管插管，并将它们进行机械通气。施行左侧开胸术，然后将一根8-0缝线从左心耳的尖端左前降支冠状动脉(LAD)下方2-3mm通过，并阻塞所述的血管。注意不要损坏所述的血管。阻塞通过颜色改变直观地确定。阻塞1小时后小心地移走结扎线并按照颜色通过直接目测法确定的再灌注被重新建立。小心闭合胸部以除去胸部空气，将所述的动物拔管，给予0.5ml的温盐水，并放入加热的培养箱中。两小时后重新麻醉所述的小鼠，将它们的气管插管，并将它们进行机械通风。通过原先的切口暴露出心脏并将原先的8-0缝线重新打结。通过放血处死所述的小鼠并将夹钳横过主动脉放置，然后通过插入一根30号注射针将1ml的1.5％偶氮蓝注射入主动脉中以便使用染料灌注所述的冠状循环。

切除心脏，垂直长轴切成4部分，将其在5ml的1％氯化三苯基四氮唑(TTC)中培养30分钟。在切除心房和右心室后，将左心室在10％的缓冲甲醛溶液中放置过夜。将各个心脏切片称重，然后在装备有CCD照相机的显微镜下显像。梗死区域(未着色的)，风险区域(AAR)(未着色部位加上红棕色部位)以及左心室部位的总面积(AAR加上偶氮蓝染色部位)通过面积法(planimetry)测量。梗死体积通过以下的方程估计：

V_梗死＝A₁W₁+A₂W₂+A₃W₃+A₄W₄

其中A1、A2、A3和A4分别是1、2、3和4部分中梗死区域的百分数，W1、W2、W3和W4分别是1、2、3和4部分中梗死区域的相应重量。所述的风险体积使用适当的区域以相似的方法进行计算。

图8显示了梗死体积占左心室体积的百分数和占风险体积的百分数。通过对比所述的五只hMRP8-Bcl-2小鼠(标为Bcl-2/2)与五只C57BL/6对照小鼠的两种度量，五只hMRP8-Bcl-2小鼠具有减少的梗死体积，并且这两组之间的风险体积与左心室体积的比无差异。hMRP8-Bcl-2小鼠与C57BL/6相比，V_梗死/V_LV和V_梗死/V_AAR显著地减少(p＜0.05)。这两组之间的风险体积与左心室体积的比(V_AAR/V_LV)无差异。

实施例10

本实施例显示了在T淋巴细胞中表达外源性人类Bcl-2(SEQ ID NO：14)的转基因小鼠，比在T淋巴细胞中不表达外源性Bcl-2蛋白质(SEQ IDNO：14)的对照小鼠更少遭受到随后进行再灌注的局部缺血引起的心肌损伤。

另外的心肌局部缺血-再灌注实验使用在Eμ启动子控制下于T淋巴细胞中过量表达Bcl-2(SEQ ID NO：14)的EμT-Bcl-2小鼠，和C57BL/6对照小鼠施行。所述的实验如实施例9所描述，使冠状动脉阻塞1小时随后通过2小时的再灌注施行。将梗死体积(V_梗死)作为占左心室体积(V_LV)的百分数，或占风险区域体积(V_AAR)的百分数进行计算。如图9所示，Eμ-T淋巴细胞Bcl-2小鼠与C57BL/6小鼠相比，V_梗死/V_LV和V_梗死/V_AAR显著地减少(^*p＜0.05)。所述的两组之间的风险体积与左心室体积的比(V_AAR/V_LV)无差异。

实施例11

本实施例显示了表达外源性Bcl-2蛋白质(SEQ ID NO：14)的骨髓细胞的过继性转移减少了继小鼠心脏长期局部缺血后的心肌损伤。

将hMRP8-骨髓-Bcl-2小鼠和同窝出生的对照小鼠麻醉，处死并从它们的长骨中提取骨髓。使用生产商所描述的磁珠(Miltenyi Biotec，12740Earhart Avenue，Auburn，CA 95602，美国)从提取的骨髓中分离CD11b+细胞。在后肢局部缺血和再灌注之前18至24小时将接近10⁷的所述细胞通过腹腔内注射施用于C57BL/6对照小鼠。局部缺血过程是1小时，随后进行2小时的再灌注。梗死尺寸大小的测定使用与实施例9描述的相同技术完成。

图10显示了梗死体积占左心室体积的百分数和占风险区域体积的百分数。通过对比接受来自hMRP8-Bcl-2小鼠(标为Bcl-2/2)骨髓细胞的七只小鼠与接受来自同窝出生小鼠(标为同窝出生Tg-)骨髓细胞的六只小鼠的两种度量(V_梗死/V_LV和V_梗死/V_AAR)，前者具有显著(^*p＜0.05)减少的梗死体积。所述的两组之间风险体积与左心室体积的比(V_AAR/V_LV)无差异。

实施例12

本实施例显示了Bcl-2的过量表达通过“反”作用在败血症小鼠中提供了保护。

将经盲肠结扎和穿刺(CLP)后的在人类MRP8启动子控制下于骨髓细胞表达外源性Bcl-2(SEQ ID NO：14)的转基因小鼠(hMRP8-Bcl-2小鼠)，或在Eμ启动子控制下于T淋巴细胞表达外源性Bcl-2(SEQ ID NO：14)的转基因小鼠(EμT-Bcl-2小鼠)与C57BL/6对照小鼠的存活率进行对比。100％的hMRP8-Bcl-2小鼠经CLP之后存活，而仅有25％的对照小鼠经CLP之后存活。在单独的实验中，87.5％的EμT-Bcl-2小鼠经CLP之后存活，而仅有22.2％的对照小鼠经CLP之后存活(p＜0.05)。

将来自hMRP8-Bcl-2小鼠，或来自C57BL/6小鼠的CD11b-阳性骨髓细胞引入随后经受CLP的C57BL/6小鼠中。100％接受来自hMRP8-Bcl-2小鼠的CD11b-阳性骨髓细胞的小鼠经CLP之后存活，而接受来自C57BL/6小鼠的CD11b-阳性骨髓细胞的小鼠经CLP之后无一存活。

将来自hMRP8-Bcl-2小鼠，或来自C57BL/6小鼠的CD11b-阳性骨髓细胞引入随后经受CLP的Rag-1-/-小鼠(其无任何成熟的T或B细胞)中。87.5％的接受来自hMRP8-Bcl-2小鼠CD11b-阳性骨髓细胞的小鼠经CLP之后存活，然而仅有12.5％的接受来自C57BL/6小鼠CD11b-阳性骨髓细胞的小鼠经CLP之后存活。(p＜0.05)。

这些实验表明hBcl-2(SEQ ID NO：14)的表达在CLP中起保护作用，并且所述的保护作用独立于淋巴细胞。

实施例13

本实施例显示了腹腔内注射重组人类Bcl-2(SEQ ID NO：15)提高了经受作为盲肠结扎和穿刺结果的严重败血症的小鼠的存活率。

在经受如实施例12所描述的盲肠结扎和穿刺之前12-24小时，给八只C57BL/6小鼠进行每只小鼠1μg的重组人类Bcl-2腹腔注射，给八只C57BL/6小鼠进行每只小鼠1μg的重组人类泛激素腹腔注射。在经受如实施例12所描述的盲肠结扎和穿刺之前12-24小时，给另外四只C57BL/6小鼠皮下注射10μg的麦芽糖结合蛋白-hBcl-2融合蛋白，给四只C57BL/6小鼠进行盐水处理。所述的小鼠每天使用抗生素治疗两次，并且每天使用重组人类Bcl-2或重组人类泛激素或盐水进行另外3天的处理。在10天里通过使用定量的评估形式对不可逆的败血症体征进行每天两次的观察，并且如果认为所述的小鼠正经受不可逆的败血症时将它们处死。图11是基于这些实验结果的存活率曲线，并且清楚地表示了使用重组人类Bcl-2(标为rBcl-2)治疗的12只小鼠与使用重组人类泛激素或盐水处理的12只小鼠(标为对照)相比，具有显著(p＜0.05)改善的存活率。

实施例14

本实施例显示了在后腿局部缺血和再灌注前使用修饰的重组人类A1(在羧基末端减去25个氨基酸并加入6个组氨酸的人类A1)(SEQ IDNO：16)注射的小鼠中已经经受后腿局部缺血和再灌注的小鼠血浆肌酸激酶浓度显著低于在局部缺血和再灌注前使用重组泛激素注射的小鼠血浆肌酸激酶浓度。重组人类A1(SEQ ID NO：16)是Bcl-2蛋白质。

在C57BL/6小鼠经受如实施例1所描述的后肢局部缺血(90分钟)和再灌注(180分钟)的前一天，使用重组人类A1(rAl)(SEQ ID NO：16)或重组人类泛激素(r泛激素)进行腹腔内注射。在180分钟的再灌注后，取血液样品用于血浆肌酸激酶浓度的测定。在后腿局部缺血和再灌注前使用rA1(SEQID NO：16)注射的12只小鼠中已经经受后腿局部缺血和再灌注的小鼠血浆肌酸激酶浓度显著(p＜0.05)低于使用r泛激素注射的12只对照小鼠血浆肌酸激酶浓度。

实施例15

本实施例显示了BH4结构域片段保护了C57BL/6小鼠后肢防御局部缺血-再灌注损伤。

通过在C57BL/6小鼠后肢使用90分钟的止血器制造骨骼肌的局部缺血，然后移走所述的止血器并允许另外3小时的再灌注。使用活性肽1(SEQID NO：17)或活性肽2(SEQ ID NO：18)或活性肽3(SEQ ID NO：19)，或使用乱序(scrambled)的(对照)肽(SEQ ID NO：20)治疗所述的小鼠。肽-1(SEQ IDNO：17)来自Bcl-2的BH4结构域。肽-2(SEQ ID NO：18)来自A1的第一个α螺旋。肽-3(SEQ ID NO：19)来自Bcl-XL的BH4结构域。肽1(SEQ IDNO：17)、肽2(SEQ ID NO：18)、肽3(SEQ ID NO：19)和所述乱序的(对照)肽(SEQ ID NO：20)的氨基酸序列在表1中列出。

表1

TGYDNREIVMKYIHYKLSQRGYEWD 肽-1 (SEQ ID NO：17)

FGYIYRLAQDYLQCVLQIPZPGSGP 肽-2 (SEQ ID NO：18)

MSQSNRELVVDFLSYKLSQKGYSWSQF 肽-3 (SEQ ID NO：19)

TWHMYGNQRDYIGDRSKIVYKLEYE 乱序的肽 (SEQ ID NO：20)

在3个小时的再灌注结束时，将所述的小鼠处死，并取血液用于血浆肌酸激酶(CK)浓度的测定。所述的CK浓度用作为肌肉损伤的指标。CK浓度的提高表明较高水平的肌肉损伤。来自3个独立实验的结果与对照肽相比表现出显著的保护作用(p＜0.05)。肽1(SEQ ID NO：17)治疗的小鼠CK浓度是19,020+/-5481 IU/L(n＝12)，与之相比，使用对照肽(SEQ ID NO：20)的CK浓度是60,530+/-5759 IU/L(n＝12)。肽2(SEQ ID NO：18)治疗的小鼠CK浓度是33,860+/-5997 IU/L(n＝11)，与之相比，使用对照肽(SEQ IDNO：20)的CK浓度是69,430+/-11,170 IU/L(n＝12)。肽3(SEQ ID NO：19)治疗的小鼠CK浓度是49,500+/-3,901IU/L(n＝5)，与之相比，使用对照肽(SEQID NO：20)的CK浓度是80,880+/-11,430 IU/L(n＝6)。

虽然已经对本发明的优选实施方案进行了举例说明和描述，但是应该理解可对其作出各种变化，而不脱离本发明的精神和范围。

要求专有权或特权的本发明的实施方案如下述权利要求所定义。

序列表

<110>华盛顿大学

约翰.M.哈尔兰

罗伯特.K.威恩

岩石晶子

琼.塔普

约翰.李

<120>抑制哺乳动物细胞死亡或炎症的方法

<130>UWOTL126524

<150>US60/714,511

<151>2004-10-04

<150>US60/709,053

<151>2005-08-16

<160>20

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>99

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工肽

<400>1

Arg Arg Val Gly Asp Glu Leu Glu Lys Glu Tyr Glu Arg Ala Phe Ser

1 5 10 15

Ser Phe Ser Ala Gln Leu His Val Thr Pro Thr Thr Ala Arg Glu Leu

20 25 30

Phe Gly Gln Val Ala Thr Gln Leu Phe Ser Asp Gly Asn Ile Asn Trp

35 40 45

Gly Arg Val Val Ala Leu Phe Ser Phe Gly Gly Phe Leu Ala Leu Lys

50 55 60

Leu Val Asp Lys Glu Leu Glu Asp Leu Val Ser Arg Leu Ala Ser Phe

65 70 75 80

Leu Ser Glu Phe Leu Ala Lys Thr Leu Ala Asn Trp Leu Arg Glu Asn

85 90 95

Gly Gly Trp

<210>2

<211>239

<212>PRT

<213>人类

<400>2

Met Ala His Ala Gly Arg Thr Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met

1 5 10 15

Lys Tyr Ile His Tyr Lys Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala

20 25 30

Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ile

35 40 45

Phe Ser Ser Gln Pro Gly His Thr Pro His Pro Ala Ala Ser Arg Asp

50 55 60

Pro Val Ala Arg Thr Ser Pro Leu Gln Thr Pro Ala Ala Pro Gly Ala

65 70 75 80

Ala Ala Gly Pro Ala Leu Ser Pro Val Pro Pro Val Val His Leu Thr

85 90 95

Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Arg Asp Phe

100 105 110

Ala Glu Met Ser Ser Gln Leu His Leu Thr Pro Phe Thr Ala Arg Gly

115 120 125

Arg Phe Ala Thr Val Val Glu Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp

130 135 140

Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Glu Phe Gly Gly Val Met Cys Val Glu

145 150 155 160

Ser Val Asn Arg Glu Met Ser Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp

165 170 175

Met Thr Glu Tyr Leu Asn Arg His Leu His Thr Trp Ile Gln Asp Asn

180 185 190

Gly Gly Trp Asp Ala Phe Val Glu Leu Tyr Gly Pro Ser Met Arg Pro

195 200 205

Leu Phe Asp Phe Ser Trp Leu Ser Leu Lys Thr Leu Leu Ser Leu Ala

210 215 220

Leu Val Gly Ala Cys Ile Thr Leu Gly Ala Tyr Leu Gly His Lys

225 230 235

<210>3

<211>25

<212>PRT

<213>人类

<400>3

Thr Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met Lys Tyr Ile His Tyr Lys

1 5 10 15

Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp

20 25

<210>4

<211>175

<212>PRT

<213>人类

<400>4

Met Thr Asp Cys Glu Phe Gly Tyr Ile Tyr Arg Leu Ala Gln Asp Tyr

1 5 10 15

Leu Gln Cys Val Leu Gln Ile Pro Gln Pro Gly Ser Gly Pro Ser Lys

20 25 30

Thr Ser Arg Val Leu Gln Asn Val Ala Phe Ser Val Gln Lys Glu Val

35 40 45

Glu Lys Asn Leu Lys Ser Cys Leu Asp Asn Val Asn Val Val Ser Val

50 55 60

Asp Thr Ala Arg Thr Leu Phe Asn Gln Val Met Glu Lys Glu Phe Glu

65 70 75 80

Asp Gly Ile Ile Asn Trp Gly Arg Ile Val Thr Ile Phe Ala Phe Glu

85 90 95

Gly Ile Leu Ile Lys Lys Leu Leu Arg Gln Gln Ile Ala Pro Asp Val

100 105 110

Asp Thr Tyr Lys Glu Ile Ser Tyr Phe Val Ala Glu Phe Ile Met Asn

115 120 125

Asn Thr Gly Glu Trp Ile Arg Gln Asn Gly Gly Trp Glu Asn Gly Phe

130 135 140

Val Lys Lys Phe Glu Pro Lys Ser Gly Trp Met Thr Phe Leu Glu Val

145 150 155 160

Thr Gly Lys Ile Cys Glu Met Leu Ser Leu Leu Lys Gln Tyr Cys

165 170 175

<210>5

<211>30

<212>PRT

<213>人类

<400>5

Phe Gly Tyr Ile Tyr Arg Leu Ala Gln Asp Tyr Leu Gln Cys Val Leu

1 5 10 15

Gln Ile Pro Gln Pro Gly Ser Gly Pro Ser Lys Thr Ser Arg

20 25 30

<210>6

<211>233

<212>PRT

<213>人类

<400>6

Met Ser Gln Ser Asn Arg Glu Leu Val Val Asp Phe Leu Ser Tyr Lys

1 5 10 15

Leu Ser Gln Lys Gly Tyr Ser Trp Ser Gln Phe Ser Asp Val Glu Glu

20 25 30

Asn Arg Thr Glu Ala Pro Glu Gly Thr Glu Ser Glu Met Glu Thr Pro

35 40 45

Ser Ala Ile Asn Gly Asn Pro Ser Trp His Leu Ala Asp Ser Pro Ala

50 55 60

Val Asn Gly Ala Thr Gly His Ser Ser Ser Leu Asp Ala Arg Glu Val

65 70 75 80

Ile Pro Met Ala Ala Val Lys Gln Ala Leu Arg Glu Ala Gly Asp Glu

85 90 95

Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Arg Ala Phe Ser Asp Leu Thr Ser Gln Leu

100 105 110

His Ile Thr Pro Gly Thr Ala Tyr Gln Ser Phe Glu Gln Val Val Asn

115 120 125

Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe

130 135 140

Ser Phe Gly Gly Ala Leu Cys Val Glu Ser Val Asp Lys Glu Met Gln

145 150 155 160

Val Leu Val Ser Arg Ile Ala Ala Trp Met Ala Thr Tyr Leu Asn Asp

165 170 175

His Leu Glu Pro Trp Ile Gln Glu Asn Gly Gly Trp Asp Thr Phe Val

180 185 190

Glu Leu Tyr Gly Asn Asn Ala Ala Ala Glu Ser Arg Lys Gly Gln Glu

195 200 205

Arg Phe Asn Arg Trp Phe Leu Thr Gly Met Thr Val Ala Gly Val Val

210 215 220

Leu Leu Gly Ser Leu Phe Ser Arg Lys

225 230

<210>7

<211>27

<212>PRT

<213>人类

<400>7

Met Ser Gln Ser Asn Arg Glu Leu Val Val Asp Phe Leu Ser Tyr Lys

1 5 10 15

Leu Ser Gln Lys Gly Tyr Ser Trp Ser Gln Phe

20 25

<210>8

<211>193

<212>PRT

<213>人类

<400>8

Met Ala Thr Pro Ala Ser Ala Pro Asp Thr Arg Ala Leu Val Ala Asp

1 5 10 15

Phe Val Gly Tyr Lys Leu Arg Gln Lys Gly Tyr Val Cys Gly Ala Gly

20 25 30

Pro Gly Glu Gly Pro Ala Ala Asp Pro Leu His Gln Ala Met Arg Ala

35 40 45

Ala Gly Asp Glu Phe Glu Thr Arg Phe Arg Arg Thr Phe Ser Asp Leu

50 55 60

Ala Ala Gln Leu His Val Thr Pro Gly Ser Ala Gln Gln Arg Phe Thr

65 70 75 80

Gln Val Ser Asp Glu Leu Phe Gln Gly Gly Pro Asn Trp Gly Arg Leu

85 90 95

Val Ala Phe Phe Val Phe Gly Ala Ala Leu Cys Ala Glu Ser Val Asn

100 105 110

Lys Glu Met Glu Pro Leu Val Gly Gln Val Gln Glu Trp Met Val Ala

115 120 125

Tyr Leu Glu Thr Arg Leu Ala Asp Trp Ile His Ser Ser Gly Gly Trp

130 135 140

Ala Glu Phe Thr Ala Leu Tyr Gly Asp Gly Ala Leu Glu Glu Ala Arg

145 150 155 160

Arg Leu Arg Glu Gly Asn Trp Ala Ser Val Arg Thr Val Leu Thr Gly

165 170 175

Ala Val Ala Leu Gly Ala Leu Val Thr Val Gly Ala Phe Phe Ala Ser

180 185 190

Lys

<210>9

<211>24

<212>PRT

<213>人类

<400>9

Ser Ala Pro Asp Thr Arg Ala Leu Val Ala Asp Phe Val Gly Tyr Lys

1 5 10 15

Leu Arg Gln Lys Gly Tyr Val Cys

20

<210>10

<211>350

<212>PRT

<213>人类

<400>10

Met Phe Gly Leu Lys Arg Asn Ala Val Ile Gly Leu Asn Leu Tyr Cys

1 5 10 15

Gly Gly Ala Gly Leu Gly Ala Gly Ser Gly Gly Ala Thr Arg Pro Gly

20 25 30

Gly Arg Leu Leu Ala Thr Glu Lys Glu Ala Ser Ala Arg Arg Glu Ile

35 40 45

Gly Gly Gly Glu Ala Gly Ala Val Ile Gly Gly Ser Ala Gly Ala Ser

50 55 60

Pro Pro Ser Thr Leu Thr Pro Asp Ser Arg Arg Val Ala Arg Pro Pro

65 70 75 80

Pro Ile Gly Ala Glu Val Pro Asp Val Thr Ala Thr Pro Ala Arg Leu

85 90 95

Leu Phe Phe Ala Pro Thr Arg Arg Ala Ala Pro Leu Glu Glu Met Glu

100 105 110

Ala Pro Ala Ala Asp Ala Ile Met Ser Pr0 Glu Glu Glu Leu Asp Gly

115 120 125

Tyr Glu Pro Glu Pro Leu Gly Lys Arg Pro Ala Val Leu Pro Leu Leu

130 135 140

Glu Leu Val Gly Glu Ser Gly Asn Asn Thr Ser Thr Asp Gly Ser Leu

145 150 155 160

Pro Ser Thr Pro Pro Pro Ala Glu Glu Glu Glu Asp Asp Leu Tyr Arg

165 170 175

Gln Ser Leu Glu Ile Ile Ser Arg Tyr Leu Arg Glu Gln Ala Thr Gly

180 185 190

Ala Lys Asp Thr Lys Pro Met Gly Arg Ser Gly Ala Thr Ser Arg Lys

195 200 205

Ala Leu Glu Thr Leu Arg Arg Val Gly Asp Gly Val Gln Arg Asn His

210 215 220

Glu Thr Ala Phe Gln Gly Met Leu Arg Lys Leu Asp Ile Lys Asn Glu

225 230 235 240

Asp Asp Val Lys Ser Leu Ser Arg Val Met Ile His Val Phe Ser Asp

245 250 255

Gly Val Thr Asn Trp Gly Arg Ile Val Thr Leu Ile Ser Phe Gly Ala

260 265 270

Phe Val Ala Lys His Leu Lys Thr Ile Asn Gln Glu Ser Cys Ile Glu

275 280 285

Pro Leu Ala Glu Ser Ile Thr Asp Val Leu Val Arg Thr Lys Arg Asp

290 295 300

Trp Leu Val Lys Gln Arg Gly Trp Asp Gly Phe Val Glu Phe Phe His

305 310 315 320

Val Glu Asp Leu Glu Gly Gly Ile Arg Asn Val Leu Leu Ala Phe Ala

325 330 335

Gly Val Ala Gly Val Gly Ala Gly Leu Ala Tyr Leu Ile Arg

340 345 350

<210>11

<211>20

<212>PRT

<213>人类

<400>11

Asp Leu Tyr Arg Gln Ser Leu Glu Ile Ile Ser Arg Tyr Leu Arg Glu

1 5 10 15

Gln Ala Thr Gly

20

<210>12

<211>24

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工肽

<400>12

Pro Arg Leu Asp Ile Arg Gly Leu Val Val Asp Tyr Val Thr Tyr Lys

1 5 10 15

Leu Ser Gln Asn Gly Tyr Glu Trp

20

<210>13

<211>720

<212>DNA

<213>人类

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(717)

<400>13

atg gcg cac gct ggg aga agt ggt tac gat aac cgg gag ata gtg atg 48

Met Ala His Ala Gly Arg Ser Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met

1 5 10 15

aag tac atc cat tat aag ctg tcg cag agg ggc tac gag tgg gat gcg 96

Lys Tyr Ile His Tyr Lys Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala

20 25 30

gga gat gtg ggc gcc gcg ccc ccg ggg gcc gcc ccc gca ccg ggc ttc 144

Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Ala Pro Gly Phe

35 40 45

ttc tcc tcc cag ccc ggg cac acg ccc cat cca gcc gca tcc cgg gac 192

Phe Ser Ser Gln Pro Gly His Thr Pro His Pro Ala Ala Ser Arg Asp

50 55 60

ccg gtc gcc agg acc tcg cca cta cag acc ccg gct gcc ccc ggc gcc 240

Pro Val Ala Arg Thr Ser Pro Leu Gln Thr Pro Ala Ala Pro Gly Ala

65 70 75 80

gcc gcg ggg cct gcg ctc agc ccg gtg cca cct gtg gtc cac ctg acc 288

Ala Ala Gly Pro Ala Leu Ser Pro Val Pro Pro Val Val His Leu Thr

85 90 95

ctc cgc cag gcc ggc gac gac ttc tcc cgc cgc tac cgc cgc gac ttc 336

Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Arg Asp Phe

100 105 110

gcc gag atg tcc agc cag ctg cac ctg acg ccc ttc acc gcg cgg gga 384

Ala Glu Met Ser Ser Gln Leu His Leu Thr Pro Phe Thr Ala Arg Gly

115 120 125

tgc ttt gcc acg gtg gtg gag gag ctc ttc agg gac ggg gtg aac tgg 432

Cys Phe Ala Thr Val Val Glu Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp

130 135 140

ggg agg att gtg gcc ttc ttt gag ttc ggt ggg gtc atg tgt gtg gag 480

Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Glu Phe Gly Gly Val Met Cys Val Glu

145 150 155 160

agc gtc aac cgg gag atg tcg ccc ctg gtg gac aac atc gcc ctg tgg 528

Ser Val Asn Arg Glu Met Ser Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp

165 170 175

atg act gag tac ctg aac cgg cac ctg cac acc tgg atc cag gat aac 576

Met Thr Glu Tyr Leu Asn Arg His Leu His Thr Trp Ile Gln Asp Asn

180 185 190

gga ggc tgg gat gcc ttt gtg gaa ctg tac ggc ccc agc atg cgg cct 624

Gly Gly Trp Asp Ala Phe Val Glu Leu Tyr Gly Pro Ser Met Arg Pro

195 200 205

ctg ttt gat ttc tcc tgg ctg tct ctg aag act ctg ctc agt ttg gcc 672

Leu Phe Asp Phe Ser Trp Leu Ser Leu Lys Thr Leu Leu Ser Leu Ala

210 215 220

ctg gtg gga gct tgc atc acc ctg ggt gcc tat ctg ggc cac aag tga 720

Leu Val Gly Ala Cys Ile Thr Leu Gly Ala Tyr Leu Gly His Lys

225 230 235

<210>14

<211>239

<212>PRT

<213>人类

<400>14

Met Ala His Ala Gly Arg Ser Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met

1 5 10 15

Lys Tyr Ile His Tyr Lys Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala

20 25 30

Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Ala Pro Gly Phe

35 40 45

Phe Ser Ser Gln Pro Gly His Thr Pro His Pro Ala Ala Ser Arg Asp

50 55 60

Pro Val Ala Arg Thr Ser Pro Leu Gln Thr Pro Ala Ala Pro Gly Ala

65 70 75 80

Ala Ala Gly Pro Ala Leu Ser Pro Val Pro Pro Val Val His Leu Thr

85 90 95

Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Arg Asp Phe

100 105 110

Ala Glu Met Ser Ser Gln Leu His Leu Thr Pro Phe Thr Ala Arg Gly

115 120 125

Cys Phe Ala Thr Val Val Glu Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp

130 135 140

Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Glu Phe Gly Gly Val Met Cys Val Glu

145 150 155 160

Ser Val Asn Arg Glu Met Ser Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp

165 170 175

Met Thr Glu Tyr Leu Asn Arg His Leu His Thr Trp Ile Gln Asp Asn

180 185 190

Gly Gly Trp Asp Ala Phe Val Glu Leu Tyr Gly Pro Ser Met Arg Pro

195 200 205

Leu Phe Asp Phe Ser Trp Leu Ser Leu Lys Thr Leu Leu Ser Leu Ala

210 215 220

Leu Val Gly Ala Cys Ile Thr Leu Gly Ala Tyr Leu Gly His Lys

225 230 235

<210>15

<211>222

<212>PRT

<213>人类

<400>15

Met Ala His Ala Gly Arg Thr Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met

1 5 10 15

Lys Tyr Ile His Tyr Lys Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala

20 25 30

Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ile

35 40 45

Phe Ser Ser Gln Pro Gly His Thr Pro His Pro Ala Ala Ser Arg Asp

50 55 60

Pro Val Ala Arg Thr Ser Pro Leu Gln Thr Pro Ala Ala Pro Gly Ala

65 70 75 80

Ala Ala Gly Pro Ala Leu Ser Pro Val Pro Pro Val Val His Leu Thr

85 90 95

Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Arg Asp Phe

100 105 110

Ala Glu Met Ser Ser Gln Leu His Leu Thr Pro Phe Thr Ala Arg Gly

115 120 125

Arg Phe Ala Thr Val Val Glu Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp

130 135 140

Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Glu Phe Gly Gly Val Met Cys Val Glu

145 150 155 160

Ser Val Asn Arg Glu Met Ser Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp

165 170 175

Met Thr Glu Tyr Leu Asn Arg His Leu His Thr Trp Ile Gln Asp Asn

180 185 190

Gly Gly Trp Asp Ala Phe Val Glu Leu Tyr Gly Pro Ser Met Arg Pro

195 200 205

Leu Phe Asp Phe His His His His His His His His His His

210 215 220

<210>16

<211>158

<212>PRT

<213>人类

<400>16

Met Thr Asp Cys Glu Phe Gly Tyr Ile Tyr Arg Leu Ala Gln Asp Tyr

1 5 10 15

Leu Gln Cys Val Leu Gln Ile Pro Gln Pro Gly Ser Gly Pro Ser Lys

20 25 30

Thr Ser Arg Val Leu Gln Asn Val Ala Phe Ser Val Gln Lys Glu Val

35 40 45

Glu Lys Asn Leu Lys Ser Cys Leu Asp Asn Val Asn Val Val Ser Val

50 55 60

Asp Thr Ala Arg Thr Leu Phe Asn Gln Val Met Glu Lys Glu Phe Glu

65 70 75 80

Asp Gly Ile Ile Asn Trp Gly Arg Ile Val Thr Ile Phe Ala Phe Glu

85 90 95

Gly Ile Leu Ile Lys Lys Leu Leu Arg Gln Gln Ile Ala Pro Asp Val

100 105 110

Asp Thr Tyr Lys Glu Ile Ser Tyr Phe Val Ala Glu Phe Ile Met Asn

115 120 125

Asn Thr Gly Glu Trp Ile Arg Gln Asn Gly Gly Trp Glu Asn Gly Phe

130 135 140

Val Lys Lys Phe Glu Pro Lys Ser His His His His His His

145 150 155

<210>17

<211>25

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工肽

<400>17

Thr Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met Lys Tyr Ile His Tyr Lys

1 5 10 15

Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp

20 25

<210>18

<211>25

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工肽

<400>18

Phe Gly Tyr Ile Tyr Arg Leu Ala Gln Asp Tyr Leu Gln Cys Val Leu

1 5 10 15

Gln Ile Pro Glx Pro Gly Ser Gly Pro

20 25

<210>19

<211>27

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工肽

<400>19

Met Ser Gln Ser Asn Arg Glu Leu Val Val Asp Phe Leu Ser Tyr Lys

1 5 10 15

Leu Ser Gln Lys Gly Tyr Ser Trp Ser Gln Phe

20 25

<210>20

<211>25

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工肽

<400>20

Thr Trp His Met Tyr Gly Asn Gln Arg Asp Tyr Ile Gly Asp Arg Ser

1 5 10 15

Lys Ile Val Tyr Lys Leu Glu Tyr Glu

20 25

Claims

1.一种用于抑制哺乳动物细胞死亡或炎症的方法，所述的方法包括将足以抑制哺乳动物细胞死亡和炎症组成的组中的一员的量的Bcl蛋白质施用于所述哺乳动物的步骤。

2.如权利要求1所述的方法，其中抑制所述哺乳动物细胞死亡。

3.如权利要求1所述的方法，其中抑制所述哺乳动物炎症。

4.如权利要求1所述的方法，其中抑制由败血症引起的细胞死亡。

5.如权利要求1所述的方法，其中抑制由局部缺血-再灌注引起的细胞死亡。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述的哺乳动物患有一种包括细胞死亡或炎症的疾病。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述的哺乳动物是人类。

8.如权利要求1所述的方法，其中将所述的Bcl蛋白质静脉施用。

9.如权利要求1所述的方法，其中将所述的Bcl蛋白质皮下施用。

10.如权利要求1所述的方法，其中将所述的Bcl蛋白质口服施用。

11.如权利要求1所述的方法，其中将所述的Bcl蛋白质透皮施用。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述的Bcl蛋白质选自：

(a)包含和SEQ ID NO：1列出的氨基酸序列至少有35％相同的氨基酸序列的蛋白质；

(b)包含至少12个氨基酸的蛋白质，其中所述的蛋白质与Bcl-2蛋白质片段至少有50％相似，其中所述的Bcl-2蛋白质由SEQ ID NO：2列出的氨基酸序列组成；

(c)包含至少12个氨基酸的蛋白质，其中所述的蛋白质与A-1蛋白质片段至少有50％相似，其中所述的A-1蛋白质由SEQ ID NO：4列出的氨基酸序列组成；

(d)包含至少12个氨基酸的蛋白质，其中所述的蛋白质与Bcl-X蛋白质片段至少有50％相似，其中所述的Bcl-X蛋白质由SEQ ID NO：6列出的氨基酸序列组成；

(e)包含至少12个氨基酸的蛋白质，其中所述的蛋白质与Bcl-W蛋白质片段至少有50％相似，其中所述的Bcl-W蛋白质由SEQ ID NO：8列出的氨基酸序列组成；

(f)包含至少12个氨基酸的蛋白质，其中所述的蛋白质与Mcl-1蛋白质片段至少有50％相似，其中所述的Mcl-1蛋白质由SEQ ID NO：10列出的氨基酸序列组成；以及

(g)与SEQ ID NO：12列出的氨基酸序列组成的BH4结构域至少有50％相似的蛋白质；

13.如权利要求1所述的方法，其中将所述的Bcl蛋白质预防性地施用于哺乳动物受治疗者。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述的哺乳动物受治疗者患有器官或肢体的局部缺血。

15.如权利要求1所述的方法，其中将Bcl蛋白质在足以抑制哺乳动物由细胞死亡和炎症组成的组中的一员的时间周期内以50μg/kg/天至50μg/kg/天的量施用于所述哺乳动物受治疗者。

16.如权利要求15所述的方法，其中将所述的Bcl蛋白质经1天至20天的期间施用于所述的哺乳动物受治疗者。

17.如权利要求15所述的方法，其中将所述的Bcl蛋白质多次施用于所述的哺乳动物受治疗者。

18.如权利要求15所述的方法，其中将所述的Bcl蛋白质每天施用于所述的哺乳动物受治疗者。

19.一种用于鉴定当施用于哺乳动物时抑制细胞死亡或炎症的Bcl蛋白质的方法，所述的方法包括筛选多个蛋白质以鉴定当施用于哺乳动物时抑制细胞死亡或炎症的Bcl蛋白质的步骤。

20.一种用于鉴定当施用于哺乳动物时抑制细胞死亡或炎症的Bcl蛋白质的方法，所述的方法包括分析由至少一个实验获得的数据的步骤，在所述实验中筛选多个蛋白质以鉴定当施用于哺乳动物时抑制细胞死亡的Bcl蛋白质。