CN102498127B - 用于治疗氧化应激相关障碍的肽类 - Google Patents

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Abstract

披露了分离的DJ-1相关肽以及包括它的药物组合物用于治疗氧化应激相关障碍。

Description

用于治疗氧化应激相关障碍的肽类
技术领域和背景技术
在一些实施方式中，本发明涉及用于治疗氧化应激相关障碍的肽试剂。
自由基是极具反应性的化学物质，它们引起生物系统的显著破坏。自由基与生物分子的不加区别的反应会导致细胞和细胞组分(例如线粒体)的破坏，由此通过使细胞失去它们的结构和/或功能来影响这些生理过程。
在生物系统中，自由基总体上称为活性氧(ROS)。ROS是从内源性来源通过含氧物种的代谢，以及来自外源性来源例如毒素和大气污染物。
ROS对生物分子的攻击被称为“氧化应激”。氧化应激已经暗示是多种退行性疾病中的诱发因素。
帕金森氏病(PD)是由遗传和环境因素引起的一种多因素疾病。虽然患有PD的大多数患者具有散发性疾病，近年来已经鉴别出数个遗传原因。引起PD的遗传形式的日渐增加数量的基因提供了对该疾病的根本性机理进行全新认知的可能性。这些基因包括α-突触核蛋白、parkin、PINK1、dardarin(LRRK2)、以及DJ-1。
目前的PD发病机理的观念集中在ROS的形成以及导致对黑质致密部造成氧化损害的氧化应激的启动。广泛的事后剖析研究已经提供了支持氧化应激涉及PD发病机理的证据；具体地说，这些包括脑中铁含量的改变、线粒体功能的损害、抗氧化保护系统的改变(最值得注意的是超氧化物歧化酶[SOD]和还原型谷胱甘肽[GSH])，以及对脂质、蛋白、和DNA氧化性损害的证据。铁可以诱导氧化应激，并且已经显示黑质内注射诱导了进行性帕金森综合征的模型。
多发性硬化症(MS)是一种中枢神经系统(CNS)的炎性、脱髓鞘疾病，其特征在于神经机能障碍的多种征状。MS及其动物模型，实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)，被认为是起因于自身免疫介导的活化了的免疫系统，例如T淋巴细胞和B淋巴细胞以及巨噬细胞和小胶质细胞。在病理学上，MS被表征为淋巴细胞和巨噬细胞静脉周浸润进入CNS薄壁组织，导致了称为斑块的脱髓鞘性损伤。这些斑块(它们是MS的标志)与少突胶质细胞死亡、轴突损伤以及神经元缺失相关联。可以将MS视为一种炎性神经退行性疾病的观点得到了证明区域中神经元和轴突损伤远离极性斑块的研究，以及证明正常出现的白质和灰质改变的成像研究的支持。
MS的病因学还未被完全阐明，已经将它归因于遗传和环境原因两者。累积的数据显示在MS的发病机理中氧化应激起主要作用。主要由活化了的小胶质细胞过量产生的导致氧化应激的活性氧(ROS)已经隐含作为MS和EAE中脱髓鞘和轴突损伤的介质。
神经递质谷氨酸酯是MS中氧化应激来源之一，主要是通过活化它的亲离子受体。少突胶质细胞，CNS的髓鞘生产细胞，对于谷氨酸酯兴奋性毒性也是高度脆弱的(主要是通过AMPA/红藻氨酸盐受体)。ROS引起对主要细胞部件例如脂类、蛋白类以及核酸类的损伤，导致了细胞死亡。导致对ROS作用脆弱性增加的MS病人的CNS中削弱的细胞抗氧化剂防御系统可以增加CNS损害。
肌萎缩性侧索硬化(ALS)，也称为葛雷克氏症，是一种进行性致命的神经疾病，它影响多达30,000名美国人，其中每年美国新增5,000个病例。该障碍属于称为运动神经元病的一类障碍。当大脑和脊髓中控制随意运动的特定的神经细胞逐渐退化时，就会发生ALS。家族性肌萎缩性侧索硬化(FALS)是与更常见的散发性变异体的区别仅在于它的家族性背景的ALS的一种形式。
有实质性证据来支持氧化应激造成运动神经元死亡的假说。例如，已经发现的是抗氧化酶的突变，超氧化物歧化酶1(SOD1)，在显著少量的病例中引起疾病。
DJ-1是一种小的189个氨基酸的蛋白，它在不同的种类中是普遍地表达的并且是高度保守的。累积的数据显示它涉及多种细胞过程，尤其是在氧化应激中。已知DJ-1具有数种亚型，其中等电点在5.5至7之间，在正常情况下主要是碱性亚型。当ROS暴露时，存在DJ-1的更多酸性亚型的累积(通过半胱氨酸残基的氧化来介导)[Bandopadhyay R，et al.，Brain127：420-430，2004；Canet-Aviles et al.，Proc Natl Acad Sci USA 101：9103-9108，2004]。
DJ-1分布广泛并且在大脑中高度表达，并且不限于一个单功能系统或解剖学位置。DJ-1表达于不同神经递质表型的神经元中以及所有神经胶质细胞类型，例如星形细胞、小胶质细胞以及少突胶质细胞中。近来，多种DJ-1突变被发现并且与家族性帕金森氏病相关联(PD)[Bonifati et al.，2003，Science 299：256-9，2003]。来自散发性PD大脑对比对照物的脑样品死后研究发现在PD大脑中DJ-1的酸性亚型更丰富[Bandopadhyay R，et al.，Brain 127：420-430，2004]。在其他神经退行性疾病中检测出DJ-1免疫反应性，包括多系统萎缩、阿尔茨海默病、进行性核上麻痹、具有与染色体17相关帕金森综合征的额颞痴呆、以及皮克氏病[Bandopadhyay R，et al.，Brain 127：420-430，2004；Neumann N.et al.，Acta Neuropathol(Berl)107：489-496，2004；Rizzu P.et al.，Ann Neurol 55：113-118，2004]。
WO2007/119237对DJ-1水平的分析以及用于诊断氧化应激相关障碍的活性进行了讨论。
美国专利申请号20060153807和美国专利申请号20060171935讨论了例如DJ-1相关试剂用于治疗神经退行性疾病例如帕金森病的载体介导的基因调节。
WO2008/111063讨论了能够上调DJ-1-依赖性VMAT2转录用于治疗神经退行性疾病的肽试剂。
发明内容
根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种包括如SEQ ID NO：3中列出的序列的不长于25个氨基酸的分离肽，其中在氧化应激条件下该分离肽使细胞活力增加。
根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种包括包含来自如SEQ ID NO：1中列出氨基酸序列的至少2个连续氨基酸的不长于25个氨基酸的分离肽，或其肽模拟物的药物组合物，以及药学上可接受的载体，其中在氧化应激条件下该分离肽使细胞活力增加。
根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种包括包含来自如SEQ ID NO：2中列出氨基酸序列的至少2个连续氨基酸的不长于25个氨基酸的分离肽，或其肽模拟物的药物组合物，其中在氧化应激条件下该分离肽使细胞活力增加。
根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种治疗对其有需要的受试者体内氧化应激相关障碍的方法，该方法包括将向受试者给予治疗有效量的本发明的药物组合物，由此治疗该氧化应激相关障碍。
根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种包括来自如SEQID NO：1中列出的氨基酸序列的至少2个连续氨基酸的不长于25个氨基酸的分离肽，或其肽模拟物，以及药学上可接受的载体，其中在氧化应激条件下该分离肽使细胞活力增加。
根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种包括来自如SEQID NO：2中列出的氨基酸序列的至少2个连续氨基酸的不长于25个氨基酸的分离肽，或其肽模拟物，其中在氧化应激条件下该分离肽使细胞活力增加。
根据本发明的一些实施方式，该分离肽包括如SEQ ID NO：3中列出的序列。
根据本发明的一些实施方式，该分离肽包括如SEQ ID NO：14中列出的序列。
根据本发明的一些实施方式，该分离肽是如SEQ ID NO：24中列出的。
根据本发明的一些实施方式，该分离肽包括来自如SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸。
根据本发明的一些实施方式，该分离肽包括来自如SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸。
根据本发明的一些实施方式，该分离肽包括来自如SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列的不多于15个连续氨基酸。
根据本发明的一些实施方式，该分离肽包括包含来自如SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列的不多于15个连续氨基酸。
根据本发明的一些实施方式，该分离肽不长于20个氨基酸。
根据本发明的一些实施方式，该分离肽包括如SEQ ID NO：38中列出的序列。
根据本发明的一些实施方式，该分离肽包括如SEQ ID NO：39中列出的序列。
根据本发明的一些实施方式，该分离肽包括如SEQ ID NO：10中列出的序列。
根据本发明的一些实施方式，该分离肽包括如SEQ ID NO：11中列出的序列。
根据本发明的一些实施方式，该分离肽包括如SEQ ID NO：1或3中列出的序列。
根据本发明的一些实施方式，该分离肽包括如SEQ ID NO：40中列出的序列。
根据本发明的一些实施方式，该分离肽包括如SEQ ID NO：13中列出的序列。
根据本发明的一些实施方式，该分离肽包括如SEQ ID NO：41中列出的序列。
根据本发明的一些实施方式，该分离肽包括如SEQ ID NO：42中列出的序列。
根据本发明的一些实施方式，该分离肽包括如SEQ ID NO：2中列出的序列。
根据本发明的一些实施方式，这些氨基酸中至少一个是天然存在的氨基酸。
根据本发明的一些实施方式，这些氨基酸中至少一个是合成的氨基酸。
根据本发明的一些实施方式，该分离肽附连到细胞渗透剂上。
根据本发明的一些实施方式，该附连是共价附连。
根据本发明的一些实施方式，该细胞渗透剂是一种肽试剂。
根据本发明的一些实施方式，该肽细胞渗透剂包括选自由SEQ ID NO：21-23组成的组中的一种氨基酸序列。
根据本发明的一些实施方式，该分离肽是如SEQ ID NO：24-36中列出的。
根据本发明的一些实施方式，该细胞包括神经元细胞。
根据本发明的一些实施方式，这些ROS条件选自由6-羟基多巴胺毒性、过氧化氢毒性、UV辐射以及多巴胺毒性组成的组。
根据本发明的一些实施方式，该氧化应激相关障碍是神经退行性疾病。
根据本发明的一些实施方式，该神经退行性疾病是选自由帕金森病、多发性硬化症、ALS、多系统萎缩、阿尔茨海默病、中风、进行性核上麻痹、具有与染色体17相关帕金森综合征的额颞痴呆以及皮克氏病组成的组。
根据本发明的一些实施方式，该分离的肽用于治疗氧化应激相关障碍。
除非另外定义，在本文中使用的所有技术的和/或科学的术语具有与本发明所属领域中普通技术人员所通常理解的相同的含义。虽然与在本文中所述的那些类似或等效的方法和材料可以用于实践或测试本发明的实施方式，示例性的方法和/或材料说明如下。在冲突的情形下，本专利申请(包括定义)将具有支配力。此外，这些材料、方法、以及实例仅是说明性的而并非意在进行必要地限制。
附图说明
在此参考附图仅通过举例对本发明的一些实施方式进行说明。现在特别详细地参考这些附图，应当强调的是所显示的这些细节是通过举例方式并且用于说明性地讨论本发明实施方式的目的。在此方面，用图进行的说明使本领域普通技术人员清楚本发明的实施方式可以如何实践。
在这些附图中：
图1A-图1F是柱状图，它们示出了针对氧化损伤和毒性损伤DJ-1相关肽TAT 2a(SEQ ID NO：24)在体外是保护性的。在暴露于氧化应激之后通过暴露于H2O2进行诱导，与仅用盐水相比较，发现使用DJ-1相关肽治疗增加了细胞活力(A)，减少了线粒体损害(B)并且增加了代谢活性(C)。通过定量[3H]胸腺嘧啶核苷结合对细胞增殖进行测量。在暴露于这些肽(D)下，不存在增加的细胞增殖。对抗6-羟基多巴胺和多巴胺毒性的保护作用对应地示于图1E和F中。所提呈的实验是在人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞上完成的，并且重复至少3次。与用运载体治疗并且暴露于相同毒性损伤的对照细胞相比较，*p＜0.05。
图2A-图2B是柱状图，它们示出了针对6-羟基多巴胺毒性DJ-1相关肽在体外是保护性的。在暴露于6-羟基多巴胺之前，与盐水相比较，当用DJ-1相关肽预处理人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y时发现增加了代谢活性，DJ-1相关肽#2的衍生物对抗6-羟基多巴胺毒性的保护作用示于图2A中并且DJ-1相关肽#5的衍生物对抗6-羟基多巴胺毒性的保护作用示于图2B中。突变的肽不能保护对抗6-羟基多巴胺毒性(如图2A-图2B中所示)。所提呈的实验是在人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞上完成的，并且重复至少3次。与暴露于相同毒性损伤的对照细胞相比较，*p＜0.05。
图3示出了针对6-羟基多巴胺毒性DJ-1相关肽在体外是保护性的。在暴露于6-羟基多巴胺之前，与盐水相比较，当用DJ-1相关肽II(SEQ IDNO：8)预处理人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y时发现增加了活力，与暴露于相同毒性损伤的对照细胞相比较，*p＜0.05。
图4A是柱状图，示出了针对血清剥夺(或不含血清，serumdeprivation)DJ-1相关肽是保护性的。在血清剥夺期间与盐水相比较，当用DJ-1相关肽(SEQ ID NO：10)、II(SEQ ID NO：8)以及短的2a(SEQID NO：9)预处理人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y时发现增加了活力，*p＜0.05。
图4B是柱状图，示出了针对氧化毒性和毒素诱导的毒性对照DJ-1相关肽不是保护性的。在使用或不使用对照肽X和Y(不期望诱导神经保护的序列)进行预处理下将细胞暴露于不断增加剂量的6-羟基多巴胺(0-25uM)或暴露于过氧化氢(H2O2，0-50uM)。所提呈的实验是在人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞上完成的，并且重复3次。与用运载体治疗并且暴露于相同毒性剂量的对照细胞相比较，未观察到显著差异。
图5A-B是柱状图，示出了在原代培养中通过TAT 2a(SEQ ID NO：24)肽对抗H2O2和6-羟基多巴胺毒性的保护作用。在从出生后野生型C57/b1小鼠的皮质中得到的原代混合的神经元和神经胶质培养物中证明了对抗逐渐增加浓度的过氧化氢和6-羟基多巴胺的类似的保护作用。每个实验重复3次。与用运载体治疗并且暴露于相同毒性损伤的对照细胞相比较，*p＜0.05。
图6是柱状图，示出了在神经元分化的鼠类神经干细胞中针对氧化损伤DJ-1相关肽I(SEQ ID NO：23)和II(SEQ ID NO：8)是保护性的。在暴露于过氧化氢(H2O2)之前，与盐水相比较，当用DJ-1相关肽I或II预处理这些细胞时发现增加了活力，与暴露于相同毒性损伤的对照细胞相比较，*p＜0.05。
图7A-图7B是照片，示出了在幼稚型成神经瘤细胞(图7A)和用A53T突变体α-突触核蛋白稳定转染的细胞中(图7B)α-突触核蛋白的免疫组织化学染色。Aα-突触核蛋白被Alexa-568连接的二抗染成红色。细胞核被DAPI复染色(蓝色)。该实验一式三份重复3次。
图8是示出了α-突触核蛋白的图形定量的柱状图，以及在假转染的成神经细胞瘤细胞以及用野生型(WT)α-突触核蛋白或A53T突变型α-突触核蛋白稳定转染的细胞中代表针对α-突触核蛋白蛋白质印迹的照片。该实验一式三份重复3次。
图9是柱状图，示出了在过表达突变型α-突触核蛋白的细胞中肽#2衍生物对抗6-羟基多巴胺毒性的保护作用。当用DJ-1相关肽#2的衍生物进行处理时，在暴露于6-羟基多巴胺过表达A53T α-突触核蛋白的成神经细胞瘤细胞中证明了显著增加的代谢活性。每个实验重复3次。与用运载体治疗并且暴露于相同毒性损伤的对照细胞相比较，*p＜0.05。
图10是柱状图，示出了在过表达突变型α-突触核蛋白的细胞中通过肽TAT 2a(SEQ ID NO：24)对抗过氧化氢毒性的保护作用。当用DJ-1相关肽TAT 2a(SEQ ID NO：24)进行处理时，在暴露于过氧化氢过表达A53Tα-突触核蛋白的成神经细胞瘤细胞中证明了显著增加的活力。与用运载体治疗并且暴露于相同毒性损伤的对照细胞相比较，*p＜0.05。
图11是柱状图，示出了针对多巴胺毒性DJ-1相关肽在体内是保护性的。在使用或不使用DJ-1相关肽#2的衍生物进行预处理下，将细胞暴露于逐渐增加剂量的多巴胺(0-50uM)。所提呈的实验是在人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞上完成的，并且重复3次。与用运载体治疗并且暴露于相同多巴胺剂量的对照细胞相比较，*p＜0.05。
图12A-图12B是柱状图，示出了在NSC-34细胞中针对过氧化氢和SIN-I毒性DJ-1相关肽是保护性的。在暴露于过氧化氢(图12A)或SIN-I(图12B)毒性之前，与盐水相比较，当用DJ-1相关肽TAT 2a(SEQ ID NO：24)或TAT 2b(SEQ ID NO：25)预处理NSC-34细胞时发现增加了活力，与暴露于相同毒性损伤的对照细胞相比较，*p＜0.05，**p＜0.01。
图13是柱状图，示出了在ALS的细胞模型中DJ-1相关肽#2的衍生物是保护性的。在暴露于SIN-I毒性之前，与盐水相比较，当用DJ-1相关肽#2的衍生物预处理NSC-34细胞时发现增加了代谢活性，突变的肽#2不能保护对抗SIN-I毒性(如所示)。所提呈的实验重复3次。与暴露于相同毒性损伤的对照细胞相比较，*p＜0.05。
图14是柱状图，示出了在对抗紫外线辐射的细胞模型中DJ-1相关肽是保护性的。在暴露于紫外线辐射之前，与盐水相比较，当用DJ-1相关肽II(SEQ ID NO：8)或TAT 2a(SEQ ID NO：24)预处理HaCaT细胞时发现增加了代谢活性。所提呈的实验重复3次。与对照物相比较，*p＜0.05。
图15A-图15B是柱状图，示出了纹状体内的TAT 2a肽注射保护对抗体内6-羟基多巴胺半帕金森病的小鼠模型。6-羟基多巴胺损害之前一小时，将溶于盐水的2μl 100μM肽TAT 2a(SEQ ID NO：24)或单独的盐水立体定位地注入右侧纹状体中。与对照相比较，在该肽治疗的小鼠体内在损害之后2周和4周发现了显著减少的苯丙胺诱导的旋转，*p＜0.01(图15A)。此外，响应于苯丙胺注射，较小部分的受损害小鼠旋转(图15B)。该实验重复两次。
图16A-图16B是柱状图，示出了静脉内肽()TAT 2a(SEQ ID NO：24)注射保护对抗体内6羟基多巴胺半帕金森病的小鼠模型。在6-羟基多巴胺损害之前4小时，将50μg肽TAT 2a(SEQ ID NO：24)或单独的盐水静脉内注入。与对照相比较，在IV肽治疗的小鼠体内证明了显著地减少的苯丙胺诱导的旋转，*p＜0.01(图16A)。响应于苯丙胺注射，较小部分的受损害小鼠旋转(图16B)。
图17是柱状图，示出了皮下注射肽(SEQ ID NO：25)保护对抗MPTP帕金森病的模型。
具体实施方式
许多神经退行性障碍被认为与氧化应激相关联，例如帕金森病和中风。逐渐累积的数据显示DJ-1，一种小的189个氨基酸蛋白，涉及多种细胞过程，尤其是在氧化应激中，并且提出了它用于治疗神经退行性疾病的用途。
在其一些实施方式中，本文披露内容涉及用于治疗氧化应激相关障碍的DJ-1相关肽。与本披露相联系已经鉴别出DJ-1蛋白上的两个最小核心序列，它们包括治疗活性。已经制备出多种肽，它们包括一个或多个这样的核心序列，并且已经证明了神经保护特性。
具体地说，已经发现的是在体外细胞系统中包括这两个核心序列中至少一项的DJ-1相关肽能够保护对抗毒性损伤，包括6-羟基多巴胺、多巴胺以及H2O2(图1A-图1F、图2A-图2B、图3、图11、图12A)，以及血清剥夺(图4A)，同时不包括该鉴别的核心序列之一的其他DJ-1相关肽不包括这类神经保护特性(图4B)。这些实验在原代培养物(图5A-图5B)以及具有相同结果的分化神经干细胞(图6)中重复。
本文披露内容的另一个方面涉及在成神经细胞瘤细胞中过表达突变型A53Tα-突触核蛋白的帕金森障碍的一种体外细胞模型。本披露实施方式的DJ-1相关肽被证明在体外细胞模型中针对6-羟基多巴胺毒性(图9)和H2O2毒性(图10)具有保护性。
本文披露内容的又另一个方面涉及用于ALS和紫外线照射的一种细胞模型，其中本披露实施方式的DJ-1相关肽被证明在这些测定中也具有保护性(图13和图14)。
最后，在帕金森病的体内模型中对本披露实施方式的DJ-1相关肽进行测试。在局部(图15A-图15B)和全身(图16A-图16B)给药两者之后某些DJ-1相关肽显示治疗活性。
总之，根据本文披露内容，已经发现的是从DJ-1衍生的肽(DJ-1相关肽)可以用于治疗氧化应激相关障碍。如在此使用的短语“氧化应激条件”是指这些使活性氧(ROS)的水平升高超过正常水平的条件。如提及的，这可能起因于缺乏抗氧化剂或起因于过多的自由基。示例性的ROS条件包括但不限于6-羟基多巴胺毒性、过氧化氢毒性、紫外线辐射以及多巴胺毒性。
在某些实施方式中，本文披露内容的某些方面，如在此更全面详细说明的，涉及长度不长于20个氨基酸的短DJ-1相关肽。更具体地，根据本披露的一个方面，提供了包括来自如SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列的至少2个连续氨基酸不长于25个氨基酸的一种分离的DJ-1相关肽，或其肽模拟物，其中在氧化应激条件下该分离肽增加了细胞活力。
KGAEEMETVIPVDVMRRAGI-(SEQ ID NO：1；在此也称为#肽2)
根据本文披露内容这个方面的实施方式，该肽包括来自如SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续氨基酸。
KGAEEMETVIPVDVMRRAGI-(SEQ ID NO：1)
根据本文披露内容这个方面的一个实施方式，该肽包括SEQ ID NO：1的不多于10个连续氨基酸。
根据本文披露内容这个方面的其他实施方式，该肽包括SEQ ID NO：1的不多于15个连续氨基酸。
包含在本文披露内容这个方面的肽中的示例性序列包括SEQ ID NO：1-12、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：39。
根据本文披露内容的另一个方面，提供了一种包括来自SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列的至少2个连续氨基酸的不长于25个氨基酸的分离肽，或其肽模拟物，其中在氧化应激条件下该分离肽使细胞活力增加。
KEGPYDVVVLPGGNLGAQNLS-(SEQ ID NO：2；在此也称为肽#5)。
根据本文披露内容这个方面的实施方式，该肽包括来自如SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续氨基酸。
根据本文披露内容这个方面的一个实施方式，该肽包括SEQ ID NO：2的不多于10个连续氨基酸。
根据本文披露内容这个方面的其他实施方式，该肽包括SEQ ID NO：2的不多于15个连续氨基酸。
包含在本文披露内容这个方面的肽中的示例性序列包括SEQ ID NO：2、13-20、40-42。
如在此使用的术语“肽”是指一种天然的或合成的氨基酸的聚合物，包括天然肽(降解产物，合成方式合成的多肽或重组体多肽)和假肽(典型地，合成方式合成的肽)，以及作为肽类似物的类肽类和半类肽类，它们可以具有例如使这些肽在体内时甚至更稳定或更能够穿透进入细胞内的修饰。
这类修饰包括但不限于N端修饰、C端修饰、多肽键修饰(包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S＝O、O＝C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S＝C-NH、CH＝CH或CF＝CH)、主链修饰、以及残基修饰。用于制备模拟肽化合物的方法是本领域熟知的并且例如在Quantitative Drug Design，C.A.Ramsden Gd.，第17.2章，F.Choplin Pergamon Press(1992)中进行详细说明，通过引用将其结合于本文就像在此完全列出一样。下面提供这个方面进一步的细节。
多肽内的多肽键(-CO-NH-)可以被下面各项取代例如N-甲基化的键(-N(CH3)-CO-)、酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、酮亚甲基键(-CO-CH2-)、α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)，其中R是任何烷基，例如甲基，卡巴键(-CH2-NH-)、羟基亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)、硫代酰胺键(-CS-NH-)、烯属双键(-CH＝CH-)、反酰胺键(-NH-CO-)、多肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)，其中R是天然存在于碳原子上的“正常的”侧链。
这些修饰可以发生在沿着该多肽链这些键的任何一个上，并且甚至同时在数个(2-3个)上。
天然芳香族氨基酸，Trp、Tyr以及Phe，可以取代合成的非天然酸例如苯基甘氨酸、TIC、萘基丙氨酸(Nol)、Phe的环甲基化的衍生物、Phe的卤化的衍生物或邻甲基-Tyr。
除了上述之外，本发明的多肽还可以包括一个或多个修饰的氨基酸或一个或多个非氨基酸单体(例如，脂肪酸、复杂的碳水化合物等)。
如在本文中使用的在说明书中以及在下面的权利要求部分中术语“氨基酸”或“氨基酸类”被理解为包括20个天然存在的氨基酸；通常体内翻译后修饰的那些氨基酸，包括例如羟基脯氨酸、磷酸丝氨酸以及磷酸苏氨酸；以及其他非常见氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羟基赖氨酸、异锁链素、正缬氨酸、正亮氨酸以及鸟氨酸。此外，术语“氨基酸”包括D-和L-氨基酸两者(立体异构体)。
下面的表1和表2列出天然存在的氨基酸(表1)和非常规的或修饰的氨基酸(表2)，它们可以与本发明一起使用。
表1
  氨基酸   三字母缩写   单字母符号
  丙氨酸   Ala   A
  精氨酸   Arg   R
  天冬酰胺   Asn   N
  天冬氨酸   Asp   D
  半胱氨酸   Cys   C
  谷氨酰胺   Gln   Q
  谷氨酸   Glu   E
  甘氨酸   Gly   G
  组氨酸   His   H
  异亮氨酸   Iie   I
  亮氨酸   Leu   L
  赖氨酸   Lys   K
  甲硫氨酸   Met   M
  苯丙氨酸   Phe   F
  脯氨酸   Pro   P
  丝氨酸   Ser   S
  苏氨酸   Thr   T
  色氨酸   Trp   W
  酪氨酸   Tyr   Y
  缬氨酸   Val   V
  上述任何氨基酸   Xaa   X
表2
续表2
本发明肽的氨基酸可以被保守地或非保守地取代。
如在此使用的术语“保守取代”是指用天然的或非天然存在氨基酸或具有类似空间特性的假肽替换存在于肽中自然顺序中的氨基酸。当有待替换的天然氨基酸的侧链是极性的亦或疏水性的时，保守取代可以是用一个天然存在的氨基酸、一个非天然存在的氨基酸或用一个也是极性的或疏水性的模拟肽部分(加上具有与被替换的氨基酸的侧链相同的空间特性)。
因为典型地天然存在的氨基酸根据它们的特性被分组，记住以下事实可以容易地确定通过天然存在氨基酸的保守取代，即根据本发明通过空间类似的不带电荷氨基酸替换带电荷氨基酸被认为是保守取代。
为了通过非天然存在氨基酸来产生保守取代，还有可能使用本领域熟知的氨基酸类似物(合成的氨基酸)。天然存在的氨基酸的模拟肽被良好地记录在本领域技术人员已知的文献中。
当进行保守取代时，取代的氨基酸应当在侧链中具有与初始氨基酸相同的或类似的官能团。
如在本文中使用的短语“非保守取代”是指通过另一种天然的或非天然存在具有不同电化学的和/或立体特性的氨基酸来替换存在于母体序列中的氨基酸。因此，取代氨基酸的侧链可以显著地大于(或小于)被取代的天然氨基酸的侧链和/或可以具有多种官能团，这些官能团具有与被取代的氨基酸显著不同的电特性。这种类型非保守取代的实例包括用苯丙氨酸或环己基甲基甘氨酸取代丙氨酸，用异亮氨酸取代甘氨酸，或用-NH-CH[(-CH2)5-COOH]-CO-取代天冬氨酸。落在本发明范围内的这些非保守取代是仍然构成具有抗菌特性肽的那些。
如提及的，可以通过多种官能团来保护本发明肽的N端和C端。适当的官能团描述于Green和Wuts，″Protecting Groups in Organic Synthesis″，John Wiley和Sons，第5章和第7章，1991中，其教导的内容通过引用结合在此。优选的保护基团是有助于将附连到其上的化合物转运到细胞中的那些(例如通过降低化合物的亲水性以及增加亲油性)。
这些部分可以在体内切割(在细胞内通过水解亦或酶解)。羟基保护基团包括酯类、碳酸盐类以及氨基甲酸酯保护基团类。胺保护基团包括烷氧基以及芳氧基羰基基团(如上述用于N-端保护基团)。羧酸保护基团包括脂肪族、苄型以及芳基酯类(如上述用于C-端保护基团)。在一个实施方式中，本发明肽中的一个或多个谷氨酸或天冬氨酸残基侧链中的羧酸基团优选地用一个甲基、乙基、苄基、或取代的苄基酯来保护。
N-端保护基团的实例包括酰基基团(-CO-R1)以及烷氧基羰基或芳氧基羰基基团(CO-O-R1)，其中R1是脂肪族、取代的脂肪族、苄基、取代的苄基、芳香族或取代的芳基基团。酰基基团的具体实例包括乙酰基、(乙基)-CO-、正丙基-CO-、异丙基-CO-、正丁基-CO-、仲丁基-CO-、叔丁基-CO-、己基、月桂酰基、棕榈酰基、肉豆蔻酰基、硬脂基、油酰基、苯基-CO-、取代的苯基-CO-、苄基-CO-以及(取代的苄基)-CO-。烷氧基羰基和芳氧基羰基基团的实例包括CH3-O-CO、(乙基)-O-CO-、正丙基-O-CO-、异丙基-O-CO-、正丁基-O-CO-、仲丁基-O-CO-、叔丁基-O-CO-、苯基-O-CO-、取代的苯基-O-CO-以及苄基-O-CO-、(取代的苄基)-O-CO-。金刚烷、萘、肉豆蔻酰基、甲苯基、联苯基、肉桂酰基、硝基苯甲酰基、甲苯酰基、糠酰基、苯甲酰基、环己烷、降莰烷、Z-己酸。为了有助于N-酰化，一至四个甘氨酸残基可以存在于该分子的N-端。
该化合物C-端的羧基基团可以被保护(例如通过酰胺(即C-端的羟基基团被-NH2、-NHR2以及-NR2R3替换)或酯(即C-端的羟基基团被-OR2替换))。R2和R3独立地是一个脂肪族、取代的脂肪族、苄基、取代的苄基、芳基或取代的芳基基团。此外，与氮原子在一起，R2和R3可以形成具有从约0-2个额外杂原子(例如氮、氧或硫)的C4至C8杂环。适当杂环的实例包括哌啶基、吡咯烷基、吗啉代、硫代吗啉代或哌嗪基。C-端保护基团的实例包括-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-NH(乙基)、-N(乙基)2、-N(甲基)(乙基)、-NH(苄基)、-N(C1-C4烷基)(苄基)、-NH(苯基)、-N(C1-C4烷基)(苯基)、-OCH3、-O(乙基)、-O(正丙基)、-O(正丁基)、-O(异丙基)、-O(仲丁基)、-O(叔丁基)、-O苄基和-O苯基。
本发明的DJ-1相关肽可以附连(共价地或非共价地)到渗透剂上。
如在此使用的短语“渗透剂”是指一种试剂，该试剂增强任何附连的肽横过细胞膜的易位。
根据一个实施方式，该渗透剂是一种肽并且通过肽键附连到该DJ-1相关肽(直接地或非直接地)上。
典型地，肽穿透剂具有包含高相对丰度的正电荷氨基酸(例如赖氨酸或精氨酸)的氨基酸构成亦或具有包含极性/带电荷氨基酸和非极性疏水性氨基酸交替模式的序列。
肽穿透剂的实例包括SEQ ID NOs：21-23中列出的那些。通过非限制性实例，可以使用细胞穿透肽(CPP)序列来增强细胞内穿透。CPP可以包括TAT(YGRKKRR-SEQ ID NO：21和YGRKKRRQRRR-SEQ ID NO：22)以及PTD(RRQRR-SEQ ID NO：23)的短的和长的形式。然而，该披露不是这样限制的，并且如本领域普通技术人员已知的，可以使用任何适当的渗透剂。
根据一个具体实施方式，本发明的肽是不长于25个氨基酸(这包括DJ-1相关肽与任何额外的附连序列一起，例如如上所述的细胞穿透肽)。
本发明的肽还可以包括非氨基酸部分，像例如，附连到这些肽上的疏水性部分(不同直链的、分支的、环的、多环的或杂环的烃以及烃衍生物)；非肽渗透剂；不同的保护基团，尤其是当化合物是直链的时，它们附连到化合物的末端从而减少降解。可以包括该化合物中存在的化学(非氨基酸)基团用来提高多种生理特性例如减少降解或清除率；减少多种细胞泵排斥，增加免疫原性活性，提高多种给药模式(例如附连允许穿透通过多种屏障，穿过肠等的多种序列)；增加特异性，增加亲和性，减少毒性等。
将本发明肽的氨基酸序列组分附连到其他非氨基酸试剂上可以是通过共价连接，通过非共价复合，例如通过复合到疏水性聚合物上(该聚合物可以被降解或切割产生能够持续释放的化合物)，通过将该肽的氨基酸部分截留在脂质体或胶束中从而生成本发明的最终肽。这个关联可以是通过将氨基酸序列截留在其他组分内(脂质体、胶束)或将氨基酸序列注入聚合物中从而生成本发明的最终肽。
本发明的肽可以是直链的或环的(环化可以改善稳定性)。可以通过本领域已知的任何方式来进行环化作用。当该化合物主要地由氨基酸组成时，环化作用可以是经由N-端至C-端，N-端至侧链以及N-端至骨架，C-端至侧链，C-端至骨架，侧链至骨架以及侧链至侧链，以及骨架至骨架环化。还可以通过包括在该肽中的非氨基酸有机部分进行肽的环化作用。
本发明的肽可以是生物化学合成的(例如通过使用标准固相技术)。这些方法包括唯一的固相合成，部分的固相合成方法，片段缩合，经典的溶液合成。固相多肽合成步骤是本领域熟知的并且通过John MorrowStewart和Janis Dillaha Young，Solid Phase Polypeptide Syntheses(2nd Ed.，Pierce Chemical Company，1984)来进一步说明。
大规模肽合成通过Andersson Biopolymers 2000；55(3)：227-50来说明。
可以通过制备型高效液相色谱法[Creighton T.(1983)Proteins，structures and molecular principles.WH Freeman and Co.N.Y.]将合成的肽纯化并且其构成可以通过氨基酸测序来证实。
还可以使用重组技术来产生本发明的肽。为了使用重组技术来生产本发明的肽，将编码本发明肽的多核苷酸连接到一个核酸表达载体上，该载体包括处于适合于指导本发明多肽在宿主细胞中构成型，组织特异性或可诱导性转录的一个顺式调节序列(例如启动子序列)的转录控制下的该多核苷酸序列。
除了可在宿主细胞中合成，本发明的肽还可以利用体外表达系统来合成。这些方法是本领域熟知的并且该系统的组分是可商购的。
如提及的，本发明的肽可以用于治疗氧化应激相关障碍。
如在此使用的短语“氧化应激”是指当氧化剂在数目上超过抗氧化剂时一种不希望的失衡。如果ROS产生的速率压倒现存抗氧化剂的防护，这种情况可能出现。在这类情况下，可能发生一系列的细胞应答，它们可能导致ROS生产甚至更大的增加。过量的ROS生产以及它的另外的无效调节可以对细胞核组织有害，引起可能最终导致细胞死亡(细胞凋亡)的细胞损伤。氧化应激相关损伤还可能引起细胞结构和功能完整性不令人希望的改变，这可能导致细胞增殖而不是凋亡。此外，氧化损伤的细胞大分子可以触发可能导致疾病的免疫应答。总体上参见D.G.Lindsay等人(2002)Mol.Aspects of Med.23：1-38，，通过引用将其结合于本文。
应当理解的是氧化应激可以负责引发或另外地引起疾病。替代地，或另外地，可以通过任何得到的氧化应激来影响疾病的进展。
因此如在此使用的短语“氧化应激相关疾病”是指疾病或医学症状(包括综合征)其中其发作或进展是由氧化应激来促进的。因为氧化应激被认为负责多种神经疾病，心脏病、恶性疾病和年龄相关疾病的发病机理，本发明考虑了所有这类疾病包括例如动脉硬化、自身免疫疾病、癌、心血管疾患、白内障、痴呆、糖尿病以及糖尿病血管病变、以及神经退行性疾病。
示例性的神经退行性疾病包括，但不限于，帕金森病、多发性硬化症、ALS、多系统萎缩、阿尔茨海默病、中风、进行性核上麻痹、具有与染色体17相关帕金森综合征的额颞痴呆以及皮克氏病。
本发明的肽可以本身或作为药物组合物的一部分(当它与适当的载体或赋形剂混合时)来提供。
如在此使用的“药物组合物”是指由在此说明的一种或多种活性成分与其他化学组分(例如生理学适当的载体和赋形剂)构成的一种制剂。药物组合物的目的是有助于将一种化合物给予生物。
在此术语“活性成分”是指起生物效应的DJ-1相关肽。
此后，短语“生理上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”(它们可互换地使用)是指不引起对生物显著刺激以及不废除所施用化合物的生物活性和特性的一种载体或稀释剂。辅助剂包括在这些短语下。
在此术语“赋形剂”是指被添加到药物组合物中用来进一步有助于活性成分给药的惰性物质。赋形剂的实例(不限于此)包括碳酸钙、磷酸钙、不同的糖以及多种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油、以及聚乙二醇。
用于配置和施用药物的技术可以在“Remington’s PharmaceuticalSciences，”Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版中找到，通过引用将其结合在此。
适当的给药途径可以例如包括口服的、直肠的、经粘膜的、尤其是经鼻的、在肠内的或肠胃外的递送，包括肌内、皮下以及髓内注射以及鞘内、直接心室内、心内，例如进入右侧或左侧心室的中，进入共同的冠状动脉中，静脉内、腹膜内、鼻内、或眼内注射。
用于药物递送至中枢神经系统(CNS)的常规方法包括：神经手术策略(例如，脑内注射或脑室内注入)；分子操纵该试剂(例如生产包括对于内皮细胞表面蛋白具有亲和性的一种转运肽与其本身不能杂交BBB的一种试剂结合的嵌合体融合蛋白)以试图探索BBB的内源性转运途径之一；设计成增加一种试剂的脂类溶解度的药理学策略(例如，将水溶性试剂结合到脂类或胆固醇载体上)；以及通过高渗破坏短暂地破坏BBB的完整性(起因于甘露醇溶液注入颈动脉中或使用生物学活性试剂例如血管紧张素肽)。然而，这些策略的每一种都有局限性，例如与侵入性手术操作相关联的固有的风险、由内源性转运系统中固有的限制施加的尺寸限制、与全身施用由一种在CNS外面可能是活性的载体基序构成的嵌合体分子相关联的潜在地不希望的生物学副作用，以及当BBB被破坏时在大脑的多个区域中可能的脑损伤风险，这给予它一种最适度以下的递送方法。
可替代地，人们可以将药物组合物以局部方式而不是全身方式给药，例如通过将药物组合物直接注射到病人的组织区域中。
本发明的药物组合物可以通过本领域熟知的方法来制造，例如通过常规的混合、溶解、造粒、制糖衣片、水溶、乳化、装胶囊、截断(entrapping)或冷冻干燥方法。
因此根据本发明使用的药物组合物可以用常规方式使用一种或多种生理上可接受的包括赋形剂和助剂(它们有助于处理活性成分进入可以药学上使用的制剂中)的载体来配制。适当的配制品取决于所选择的给药途径。
对于注射而言，可以将该药物组合物的活性成分配制于水溶液中，优选地生理上相容的缓冲液中例如Hank溶液、Ringer溶液、或生理盐水缓冲液。对于经粘膜给药而言，将对于有待渗透的屏障适当的渗透剂用于该配制品中。这类渗透剂总体上是本领域已知的。
对于口服给药而言，可以通过将这些活性化合物与本领域熟知的药学上可接受的载体结合来容易地配制该药物组合物。这类载体能够将该药物组合物配制成片剂、丸剂、糖衣片、胶囊剂、液体、凝胶剂、糖浆剂、淤浆、悬液等，用于通过病人口服服下。口服使用的药物制剂可以如下制造：使用固体赋形剂，任选地研磨所得到的混合物，并且在添加适当的助剂之后(如果希望的话)加工颗粒混合物，从而得到片剂或糖衣片芯层。具体地，适当的赋形剂是填充剂类，例如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露醇、或山梨糖醇；纤维素制剂类，例如，玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理上可接受的聚合物类例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果希望的话，可以添加崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或海藻酸或其盐例如海藻酸钠。
糖衣片芯层配备有适当的涂层。为此目的，可以使用浓的糖溶液，它可以任选地包含阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液以及适当的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料类或色素类添加到片剂或糖衣片涂层中用于鉴别或用于表征活性化合物剂量的不同组合。
可以口服使用的药物组合物包括由明胶制成的推入契合胶囊，以及由明胶和增塑剂(例如甘油或山梨糖醇)制成的软的密封胶囊。该挤出契合胶囊可以包含与填充剂例如乳糖，粘合剂例如淀粉，润滑剂例如滑石或硬脂酸镁以及任选地稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，这些活性成分可以溶于或悬浮于适当的液体，例如脂肪油、液状石蜡、或液体聚乙二醇类中。此外，可以添加稳定剂。口服给药的所有配制品应当在剂量上适合于所选择的给药途径。
对于口腔含服给药而言，这些组合物可以采用按照常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于通过鼻吸入给药而言，根据本发明使用的活性成分使用适当的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳)以从加压包装或喷雾器呈递的喷雾剂形式方便地进行递送。在加压气溶胶的情况下，可以通过提供阀门来递送经计量的量以确定剂量单位。可以配制例如用于在分配器中使用的明胶胶囊或药筒，这些胶囊或药筒包含该化合物和适宜的粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
可以将在此所述的药物组合物配制为用于例如，通过推注或连续输注进行肠胃外给药。用于注射的配制品可以以单位剂型而存在，例如具有任选地添加的防腐剂的安瓿中或在多剂量容器中。这些组合物可以是油性或水性载体中的混悬液、溶液、或乳剂，并且可以包含多种配制剂，如助悬剂、稳定剂、和/或分散剂。
肠胃外给药的药物组合物包括处于可溶于水形式的活性制剂的水溶液。此外，活性成分的悬液可以制备成适当的油性或水基的注射悬液。适当的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油例如芝麻油，或合成的脂肪酸酯类例如油酸乙酯、甘油三酯类或脂质体类。水性注射悬液可以包含多种物质(它们增加了该悬液的粘度)，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。可选地，该悬液还可以包含适当的稳定剂或增加活性成分溶解度的试剂从而允许制备高度浓缩液。
可替代地，该活性成分可以为粉末的形式，用于在使用之前与一种适合的载体(例如，无菌无热原水基溶液)进行构造。
还可以使用例如常规的栓剂基质例如可可脂或其他甘油酯将本发明的药物组合物配制成直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠剂。
适合用于本发明背景中的药物组合物包括多种组合物，其中以有效实现预期目的的数量包含这些活性成分。更具体地，治疗有效量是指有效地防止、缓解或改善障碍(例如帕金森病)症状或延长所治疗的受试者存活时间的活性成分(DJ-1相关肽)的量。
治疗有效量的确定是适当的在本领域普通技术人员能力之内的，尤其是在本文提供的详细披露的启发下。
对于本发明方法中使用的任何制剂而言，最初可以从体外或细胞培养测定来估计治疗有效量或剂量。例如，可以在动物模型中配制剂量从而实现希望的浓度或滴度。可以使用这样的信息来更精确地确定人体内的有用剂量。
可以通过体外、细胞培养物中或实验动物体内标准的药物操作确定在此所述的活性成分的毒性和疗效。从这些体外测定和细胞培养测定以及动物研究中得到的数据可以用于配制一定范围的剂量用于人体中。该剂量可以根据所使用的剂型以及所使用的给药途径而变化。可以由各个医生根据病人状况选择确切的配方、给药途径以及剂量。(参见，例如.，Fingl，et al.，1975，在″The Pharmacological Basis of Therapeutics″中，Ch.1p.1)。
可以针对大脑个别地调节给药数量和间隔或活性成分的血液水平是足以诱导或抑制生物效应(最小有效浓度，MEC)。针对每个制剂MEC可以变化，但是可以从体外数据进行估计。实现MEC所必需的剂量将取决于个体特征以及给药途径。可以使用多种检测测定法来确定血浆浓度。
取决于有待治疗病症的严重性和反应性，剂量可以具有一个单次或多次给药，其中疗程持续从数天至数周或直至实现治愈或实现病情降低。
有待施用的组合物数量当然应当取决于被治疗的受试者，痛苦的严重性、给药方式、开处方医生的判断等。
如果希望的话，本发明的组合物能够以包装或分配器装置型式呈现，例如FDA批准的试剂盒，它可以包括含有活性成分一个或多个单位的剂型。该包装可以例如包括金属或塑料箔片，例如气泡包装。该包装或分配器装置可以附有施用说明书。该包装或分配器还能够以管理药物制造、使用或销售的管理机构所规定的形式附有与容器相关通告，该通告反映了管理机构批准这种形式的组合物或人类或兽医给药。这样的通告，例如，可以具有美国食品药品管理局批准处方药的标签或具有批准的产品插入物。包括配制于相容的药用载体中的本发明制品的组合物还可以被制备、放置在一个适当的容器中，并且针对治疗指示病症进行标记(如上进一步详述的)。
如在本文中使用的术语“约”是指10％。
术语“包括”、“包括了”、“包含”、“包含了”、“具有”以及它们的结合物是指“包括但不限于”。
术语“由...构成”是指“包括并且限于”。
术语“基本上由...构成”是指该组合物、方法或结构可以包括额外的成分、步骤和/或部分，但仅要求这些额外的成分、步骤和/或部分不实质性地改变所要求的组合物、方法或结构的基本的或新颖性的特征。
如在此使用的，单数形式“一种/一个”和“该”包括复数的引用，除非在上下文中的其他地方清楚地指出。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”包括多个化合物，包括它们的混合物。
在本申请全文中，能够以一个范围的形式呈现本发明的不同实施方式。应当理解的是在范围形式中的说明仅处于方便和简捷的目的并且不应解释为本发明范围上的硬性限制。因此，一个范围的说明应当被认为已经确切地披露了所有可能的子范围以及该范围内的单个数字值。例如，一个范围的说明，例如从1至6应当认为已经确切地披露了子范围例如从1至3，从1至4，从1至5，从2至4，从2至6，从3至6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5、以及6。无论该范围的宽度，这都适用。
无论何时在此指示了一个数值范围，它意味着包括该指示范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语“范围/范围在一个第一指示数字和一个第二指示数字之间”和“范围/范围在一个第一指示数字至一个第二指示数字之间”在此可互换地使用并且意味着包括该第一和第二指示数字以及它们之间所有分数和整数。
如在此使用的术语“方法”是指用于完成一个给定任务的方式、方法、技术以及步骤，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学以及医学领域执业者针对已知的方式、方法、技术以及步骤已知的亦或从中容易开发的那些方式、方法、技术以及步骤。
如在此使用的术语“治疗”包括废除、基本上抑制、减缓、或反转病症的进程，基本上改善病症的临床或美学症状，或基本上防止出现病症的临床或美学症状。
应当理解的是本发明的某些特征(为了清楚的目的在分开的实施方式的背景中对它们进行说明)还能够以组合方式提供在一个单个实施方式中。相反地，本发明的多个特征(为了简短的目的在一个单个实施方式的背景中对它们进行了说明)还可以分开地或以任何适当亚组合方式或以适当方式提供在本发明任何其他说明的实施方式中。不同实施方式的上下文中说明的某些特征不应认为是这些实施方式的本质特征，除非没有这些要素该实施方式是不工作的。
如上面描述的以及如下面权利要求部分中要求的本发明的不同实施方式和方面在下面实例中找到实验支持。
实施例
现在参考下面实施例，它们与上文说明书一起以非限制性方式示出了本发明的一些实施方式。
总体上，在此使用的命名法以及本发明中使用的实验步骤包括分子的、生物化学的、微生物学的以及重组DNA技术。这些技术在文献中被充分地说明。参见，例如，″Molecular Cloning：A laboratory Manual″Sambrook et al.，(1989)；″Current Protocols in Molecular Biology″VolumesI-III Ausubel，R.M.，ed.(1994)；Ausubel et al.，″Current Protocols inMolecular Biology″，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，″A Practical Guide to Molecular Cloning″，John Wiley & Sons，New York(1988)；Watson et al.，″Recombinant DNA″，Scientific American Books，NewYork；Birren et al.(eds)″Genome Analysis：A Laboratory Manual Series″，Vols.1-4，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998)；如美国专利第4,666,828号、第4,683,202号、第4,801,531号、第5,192,659号以及第5,272,057号中提出的方法；″Cell Biology：A Laboratory Handbook″，Volumes I-III Cellis，J.E.，ed.(1994)；″Culture of Animal Cells-A Manual ofBasic Technique″by Freshney，Wiley-Liss，N.Y.(1994)，Third Edition；″Current Protocols in Immunology″Volumes I-III Coligan J.E.，ed.(1994)；Stites et al.(eds)，″Basic and Clinical Immunology″(8th Edition)，Appleton &Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds)，″Selected Methods inCellular Immunology″，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)；可供使用的免疫测定广泛地描述于专利和科学文献中，参见，例如，美国专利第3,791,932号、第3,839,153号、第3,850,752号、第3,850,578号、第3,853,987号、第3,867,517号、第3,879,262号、第3,901,654号、第3,935,074号、第3,984,533号、第3,996,345号、第4,034,074号、第4,098,876号、第4,879,219号、第5,011,771号以及第5,281,521号；″OligonucleotideSynthesis″Gait，M.J.，ed.(1984)；“Nucleic Acid Hybridization″Hames，B.D.，and Higgins S.J.，eds.(1985)；″Transcription and Translation″Hames，B.D.，and Higgins S.J.，eds.(1984)；″Animal Cell Culture″Freshney，R.I.，ed.(1986)；″Immobilized Cells and Enzymes″IRL Press，(1986)；″A PracticalGuide to Molecular Cloning″Perbal，B.，(1984)以及″Methods inEnzymology″Vol.1-317，Academic Press；″PCR Protocols：A Guide ToMethods And Applications″，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshaket al.，″Strategies for Protein Purification and Characterization-A LaboratoryCourse Manual″CSHL Press(1996)；通过引用将它们全部结合在此就像在此完全地提出一样。贯穿本文件提供了其他一般性参考。其中的步骤被认为是本领域熟知的并且为了读者的方便来提供。其中包含的所有信息通过引用结合在此。
材料与方法
DJ-1相关肽类：基于生物信息学数据以及DJ-1蛋白的筛选，可以选择基于DJ-1的20个氨基酸的数个肽序列。证明神经保护特性的肽序列被设计成肽#2和#5，并且它们的序列如下：
肽#2：KGAEEMETVIPVDVMRRAGI-SEQ ID NO：1
肽#5：EGPYDVVVLPGGNLGAQNL S-SEQ ID NO：2
可以如下合成肽#2的较短的肽衍生物：
KGAEEMETVIPVD(Pep2a；SEQ ID NO：3、TVIPVDVMRRAGI(Pep2b；SEQ ID NO：4)、EMETVIPVDVMRR(Pep2c；SEQ ID NO：5)、KGAEEMETVIPVDVM(SEQ ID NO：6)、METVIPVDVMRRAGI(SEQ IDNO：7)、VDVMRRAGI(Pep II；SEQ ID NO：8)、KGAEEMETVIPV(Pepshort2a；SEQ ID NO：9)、GAEEME-(Pep I；SEQ ID NO：10)、DVMRRAGI(Pep short II；SEQ ID NO：11)、TVIPV-(Pep III；SEQ ID NO：37)、VIP(PepIV；SEQ ID NO：12)。
可以如下合成肽#5的较短的肽衍生物：
DVVVLPGG(Pep V；SEQ ID NO：13)、EGPYDVVVLPGGN(SEQ IDNO：14)、VLPGGNLGAQNLS(SEQ ID NO：15)、DVVVLPGGNLGAQ(SEQID NO：16)、EGPYDVVVLPGGNLG  (SEQ ID NO：17)、VVVLPGGNLGAQNLS(SEQ ID NO：18)、EGPYDVVVL(SEQ ID NO：19)、以及GNLGAQNLS(SEQ ID NO：20)。
使用生产厂家的说明书，使用PULSin方法将这些肽引入细胞中。
然后将这些肽附连到细胞穿膜肽(CPP)序列上用来增强细胞内穿透。所使用的CPP包括TAT(YGRKKRR-SEQ ID NO：21和YGRKKRRQRRR-SEQ ID NO：22)以及PTD(RRQRR-SEQ ID NO：23)的短的和长的形式。
肽#2的肽衍生物(附连到细胞穿透肽上)如下：
Pep 2TAT a：YGRKKRRKGAEEMETVIPVD-SEQ ID NO：24
Pep 2TAT b：YGRKKRRTVIPVDVMRRAGI-SEQ ID NO：25
Pep 2TAT c：YGRKKRREMETVIPVDVMRR-SEQ ID NO：26
Pep 2PTD-5a：RRQRRKGAEEMETVIPVDVM-SEQ ID NO：27
Pep 2PTD-5b：RRQRRMETVIPVDVMRRAGI-SEQ ID NO：28
Pep 2nuc TAT：YGRKKRRQRRRVDVMRRAGI-SEQ ID NO：29
肽#5的肽衍生物(附连到细胞穿透肽上)：
Pep5TAT a：YGRKKRREGPYDVVVLPGGN-SEQ ID NO：30
Pep5TAT b：YGRKKRRVLPGGNLGAQNL S-SEQ ID NO：31
Pep5TAT c：YGRKKRRDVVVLPGGNLGAQ-SEQ ID NO：32
Pep 5PTD-5a：RRQRREGPYDVVVLPGGNLG-SEQ ID NO：33
Pep 5PTD-5b：RRQRRVVVLPGGNLGAQNLS-SEQ ID NO：34
Pep 5nuc TAT a：YGRKKRRQRRREGPYDVVVL-SEQ ID NO：35
Pep 5nuc TAT b：YGRKKRRQRRRGNLGAQNLS-SEQ ID NO：36
细胞：人神经母细胞瘤SH-SY5Y蛋白是从美国组织模式菌种收集所获得的(ATCC，Rockville，USA)。在37℃下在5％CO2潮湿气氛中在无菌条件下在补充有10％热灭活胎牛血清(FCS)、庆大霉素(50mg/ml)、以及谷氨酰胺(5mM)的DMEM培养基中使细胞生长成单层。每隔4天定期更换培养基，并且每隔8天将细胞传代。所有实验都是在接近会合的细胞上完成的。
使用无限增殖的人类HaCaT角质化细胞来测试DJ-1相关肽的保护避免紫外线辐射诱导损伤的能力。将细胞维持在5cm培养皿中含有0·075mM Ca2+(MEM-75)和10％FCS的最小必需培养基中并且每3-4天进行传代培养。
原代培养和神经干细胞：从出生后的c57/bl小鼠的鼠类皮质中分离神经祖细胞/干细胞并且培养成神经球。诱导神经和星形神经胶质分化。
分化的和未分化的神经祖细胞/干细胞对氧化和毒性损伤的敏感性是在具有或不具有用DJ-1相关肽进行预处理下确定的。
制备并且使用源于出生后c57/bl小鼠皮层组织的鼠类神经元和星形细胞原代培养物用来检测DJ-1相关肽的保护潜力。
稳定的细胞转染：人类野生型或A53T突变型α-突触核蛋白cDNA的编码区被亚克隆到pcDNA3.1-质粒(BD Biosciences，Clontech)中。为了实现A53T突变体α-突触核蛋白的过表达，用包含A53T突变体α-突触核蛋白的质粒稳定地转染SH-SY5Y成神经细胞瘤细胞。使用阳离子脂质体2000(lipofectamine 2000)试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行转染。通过用致死剂量的遗传霉素(G-418)处理性这些细胞来完成转染细胞的选择。使用幼稚的成神经细胞瘤细胞以及用空运载体稳定转染的细胞作为对照。
施用实时PCR以及蛋白质印迹法通过测量α-突触核蛋白mRNA以及蛋白水平来证实稳定转染。
处理：使成神经细胞瘤细胞与过氧化氢(H2O2)(0-1mM；Sigma，Chemicals Co.，St.Louis，MO，USA)、6-羟基多巴胺(0-100μM；Sigma，Chemicals Co.，St.Louis，MO，USA)、多巴胺(0-500μM；Sigma，ChemicalsCo.，St.Louis，MO，USA)以及3-(4-吗啉基)-斯德酮亚胺(SIN-I)(0-5mM；Sigma)(它是一种过氧化亚硝酸盐自由基供体)相接触，从而生成ROS构造。
细胞毒性和活力测定：使用数种方法用来确定氧化损伤类、神经毒素类以及多巴胺在设备代谢活性、线粒体活性以及细胞活力上的毒性作用。
阿尔玛蓝(Alamar blue)：将细胞以5000个细胞/孔的浓度种在96孔板中并且允许贴附过夜。第二天，在无血清培养基中将这些细胞暴露于增加剂量的多巴胺(0-500uM)持续4小时。阿尔玛蓝是一种无毒试剂，它结合一种氧化还原指示剂，该指示剂响应于代谢活性而改变颜色。还原诱导的颜色改变与细胞数量和时间成比例地变化。在暴露于增加剂量的多巴胺之后4小时，将10％阿尔玛蓝的溶液添加到无血清培养基中，持续2小时。在激发波长为544nm并且发射波长为590nm下通过FLUOstar分光荧光计对阿尔玛蓝荧光进行测量。针对每次处理一式三份地进行每个实验。实验重复3次。
乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性：按照生产厂商的说明书，使用LDH细胞毒性检测试剂盒(Clontech laboratories，CA，USA)来确定受损细胞释放进入细胞培养上清液中的LDH。LDH活性的数量与培养物中受损细胞的数量相关联。培养物上清液中存在的LDH参与一个偶联反应，将一种黄色四唑鎓盐转化成一种红色甲腊产物。通过吸光度值的下式计算出死亡细胞的百分比：
(三份吸光度-低对照物)/(最大吸收-低对照物)×100。
通过用1％Triton X-100处理这些细胞得到最大吸收。通过490nm处的吸光度在酶标仪中测量酶活性的数量。针对每次处理一式三份地完成每个实验。实验重复3次。
Hoechst 33342：为了研究凋亡细胞的细胞核形态的改变，这些细胞标记有细胞核染剂Hoechst 33258并且在荧光显微镜下进行检测。Hoechst33342是一种细胞荧光可透过的染料，具有DNA亲和性。在毒素暴露之后，将这些细胞用冷的70％乙醇固定，并且用Hoechst 33258(10ug/ml)来孵化。在荧光显微镜(Olympus，bx52，Leeds，Minneapolis，MN)下对细胞核形态进行观察。显示细胞核尺寸减少、染色质凝聚、荧光强烈、以及细胞核碎裂的细胞被认为是凋亡的。
Hoechst 33342进入具有完整的或损坏膜的细胞并且将DNA染成蓝色，由此还允许对每个孔中细胞数量进行评估。在暴露于不同剂量的多种不同毒素之后，可以使用FLUOstar分光荧光计酶标仪来对每个孔中细胞数量进行评估。在346nm下进行激发，并且确定发射波长为460nm。针对每次处理一式三份地进行实验。所有实验重复至少3次。
蛋白质印迹法：使用蛋白质印迹法来确定WT和突变型α-突触核蛋白的过表达。用PBS来洗涤细胞，用胰蛋白酶消化，并且通过离心进行收集。为了制备全细胞溶解产物，将细胞再悬浮于裂解缓冲液中(包含50mMTris-HCl、0.1％SDS、1％Triton X-100、1mM EDTA、1％去氧胆酸钠以及胰蛋白酶抑制剂混合物(Sigma))。使用蛋白测定试剂盒(Pierce)来确定蛋白浓度。通过12％SDS-PAGE凝胶分离来自每个样品的25微克总蛋白并且转移到一个硝酸纤维素膜上。在室温下在5％脱脂乳中将这些膜封闭1小时并且在4℃下用单克隆抗α-突触核蛋白抗体(LB509，1∶2000；ZymedLaboratories)孵化过夜，接着用辣根过氧化物酶连接的二抗(1∶10000；Sigma)处理，并且用ECL plus检测系统(Amersham Pharmacia Biotech)进行显色。为了将α-突触核蛋白抗体表达水平针对β-肌动蛋白水平进行归一化，这些膜还用小鼠抗β-肌动蛋白抗体(1∶10000，Sigma)来孵化，紧接着用辣根过氧化物酶连接的二抗(1∶10000；Sigma)处理，并且用ECL plus检测系统进行显影。
α-突触核蛋白的免疫细胞化学：将这些细胞用4％多聚甲醛固定并且用0.5％Triton X-100进行渗透。随后，在封闭溶液中孵化固定细胞，紧接着在4℃下用单克隆抗α-突触核蛋白抗体(LB509，1∶2000；ZymedLaboratories)孵化过夜，紧接着用alexa-568附连的二抗进行处理。用DAPI(Sigma)将细胞核复染色。在荧光显微镜(Olympus，bx52，Leeds，Minneapolis，MN)下对细胞核形态进行观察。
通过免疫细胞化学对凋亡速率进行评估这些细胞用4％多聚甲醛进行固定并且用0.5％Triton X-100进行可渗透化处理。然后在封闭溶液中孵化这些固定的细胞，紧接着用Hoechst 33258(10ug/ml)来孵化。在荧光显微镜(Olympus，bx52，Leeds，Minneapolis，MN)下对细胞核形态进行观察。显示细胞核尺寸减少、染色质凝聚、荧光强烈、以及细胞核碎裂的细胞被认为是凋亡的。
体内6-羟基多巴胺诱导的半帕金森小鼠模型：雄性c57/bl小鼠用于PD的这种体内模型。使用脑功能区定位的手术操作使小鼠接收4g 6-羟基多巴胺氢溴化物(溶于包含0.02％抗坏血酸的2μl盐水中)单向纹状体内注射。使用如下坐标使注射靶向中心纹状体：前囟点之前0.7mm、前囟点侧面2.0mm、以及深度3.5mm。
通过加速转杆检查以及腹膜内苯丙胺(2.5mg/Kg)诱导的旋转行为对纹状体内的6-羟基多巴胺损害的行为影响进行评估。
在损害之后一个月完成通过高效液相色谱(HPLC)测量儿茶酚胺水平以及通过免疫组织化学评估病理学损害的程度。
统计分析使用SPSS软件完成统计分析。使用双尾学生t检验进行两组之间的比较。使用方差分析(ANOVA)紧接着最小显著差数(LSD)事后比较来完成三组或更多组之间的统计分析。结果通过平均值±标准差来表示。如果误差概率(p)小于5％(p≤0.05)，则组间差别被认为是显著的。
实施例1
如在细胞系中分析的本发明肽的神经保护活性的分析
结果
使用体外细胞平台，对Tat2A(SEQ ID NO：24)进行测试用来确定它对抗神经毒素的保护作用。通过PULSin试剂盒(Polyplus)，并且随后附连到细胞渗透肽上将这些肽递送到成神经细胞瘤细胞中。如图1A-F中显示的，所检查的肽中一些显示对抗通过暴露于过氧化氢、6-羟基多巴胺、以及多巴胺诱导的血清剥夺、氧化损伤和神经毒性损伤的显著的保护作用。这些肽减少了线粒体损害(通过MTT测定法评估)，减少了代谢损害(由阿尔玛蓝方法指示)，减少了细胞毒性(通过LDH细胞毒性检测试剂盒(Clontech)评估)，并且增加了细胞活力(通过Hoechst染色)。
DJ-1突变的肽未显示它们相应的未突变肽的保护性作用，如图2A-B中示出的，这些图显示了数种DJ-1相关肽的保护作用(*p＜0.05)。
图3示出了DJ-1相关肽在体内针对6羟基多巴胺毒性具有保护性，而图4A示出了DJ-1相关肽针对血清剥夺具有保护性。
使用不同的非保守DJ-1肽作为对照用来证实本发明肽的特异性作用。成神经瘤细胞暴露于这些肽未保护这些细胞避免由6-羟基多巴胺或过氧化氢处理诱导的损伤(如图4B中示出的)。
实施例2
如在原代鼠类培养物中分析的本发明肽的神经保护活性的分析
结果
对DJ-1肽在原代培养物上，以及在从C57/bl小鼠大脑中得到的分化的和未分化的神经干细胞上T保护作用进行评估。结果显示选择的DJ-1相关肽显著地保护对抗过氧化氢和6羟基多巴胺毒性。具体地，图5A-图5B示出了在来自出生后小鼠大脑的原代混合的神经元和星形细胞培养物中Tat 2A对抗氧化和毒性损伤的保护作用。从出生后的c57/bl小鼠的鼠类皮质中分离神经祖细胞/干细胞并且培养成神经球。诱导神经和星形神经胶质分化。
分化的和未分化的神经祖细胞/干细胞对氧化和毒性损伤的敏感性是在使用或不使用DJ-1相关肽进行预处理下确定的(如图6中示出的)。
实施例3
保护对抗突变体α-突触核蛋白毒性
A53T突变体α-突触核蛋白是基因遗传的帕金森病的原因之一。使用过表达突变的α-突触核蛋白的成神经细胞瘤细胞作为帕金森病的细胞平台。为了实现A53T突变体α-突触核蛋白的过表达，用包含A53T突变体-α突触核蛋白的质粒稳定地转染SH-SY5Y成神经细胞瘤细胞。
通过针对α-突触核蛋白的免疫细胞化学染色，完成α-突触核蛋白过表达的验证。图7A示出了幼稚的成神经瘤细胞的α-突触核蛋白染色，而图7B示出了A53T突变体α-突触核蛋白转染细胞的α-突触核蛋白染色。
使用蛋白质印迹法进行α-突触核蛋白定量(如图8中示出的)。
DJ-1相关肽显示针对过表达突变体A53T α-突触核蛋白的成神经瘤细胞中6-羟基多巴胺毒性(图9)以及针对由过氧化氢(H2O2)暴露所诱导的纯氧化损伤(图10)具有保护性。
实施例4
针对多巴胺毒性DJ-1相关肽是保护性的
在使用或不使用DJ-1相关肽进行前处理下，将成神经瘤SH-SY5Y细胞暴露于增加剂量的多巴胺。针对多巴胺的脆弱性被DJ-1相关肽治疗统计显著地减弱(如图11中示出的)。
实施例5
针对肌萎缩性侧索硬化(ALS)细胞模型的保护作用
使用NSC-34细胞作为ALS的细胞模型。使用增加剂量的过氧化氢以及SIN-I(一种NO供体，它参与ALS的发病机理)。DJ-1相关肽#2显示在ALS的这个细胞模型中针对H2O2以及SIN-I毒性的保护作用(如图12A-图12B和图13中示出的)。
实施例6
DJ-1相关肽保护对抗紫外线辐射的能力
使用培养的角质形成细胞来检查DJ-1相关肽保护对抗紫外线辐射损害作用的能力。若干DJ-1相关肽显示针对紫外线辐射诱导的细胞死亡的显著的保护作用(如图14中示出的)。
实施例7
针对体内帕金森病模型DJ-1相关肽是保护性的
近期研究显示在静脉以及腹膜内给药之后附连到tat上的蛋白可以穿透并且影响大脑[Kim等人，2010；Doeppner等人，2010]。本发明诸位发明人将肽2a(具有13个氨基酸)附连到tat上并且在良好建立的6-羟基多巴胺半帕金森病小鼠模型中对它进行测试。
接下来，对纹状体内注射的DJ-1相关肽的保护性能力进行测试。两组雄性c57/bl小鼠接收溶于盐水中的2μl 100μM的TAT 2a DJ-1-相关肽(SEQ ID NO：24)亦或仅盐水，定向地注射到右侧纹状体中。一小时后，使用同一坐标注射4μg 6-羟基多巴胺。行为研究包括苯丙胺诱导的旋转行为以及加速的转杆检查(rotarod examination)。
DJ-1相关肽在6-羟基多巴胺模型中的作用测试两次。总计1十只c57/bl雄性小鼠用于第一实验并且26只用于第二实验。在两者中，与对照相比较，在该肽治疗的小鼠中发现显著减少的苯丙胺诱导的旋转(p＜0.01)。在2个实验的每一个中这被证实两次：首先，在6-羟基多巴胺纹状体损害之后2周，并且随后，在4周之后(如图15A-图15B中示出的)。
加速转杆检查显示了TAT 2a肽(SEQ ID NO：24)治疗的小鼠与盐水治疗的对照之间的显著差异(p＝0.02)。针对酪氨酸羟化酶(TH)的免疫组织化学染色显示在受损的纹状体中6-羟基多巴胺诱导的TH染色缺失被tat 2a DJ-1相关肽(SEQ ID NO：24)逆转。
接下来，对进行全身施用DJ-1相关肽的效果进行检查。静脉递送该肽作为用来调节6-羟基多巴胺半帕金森病小鼠模型的一种手段来实现。6-羟基多巴胺损害之前4小时，将50μg肽静脉给药。与对照相比较，发现在损害之后2周和4周在该肽治疗的小鼠中苯丙胺诱导的旋转显著减少(图16A-图16B)。
实施例8
为了产生针对帕金森病的动物模型，用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)来治疗小鼠。在存在和缺少DJ-1相关肽(0.4mM皮下；SEQID NO：25)下用20mg/kg MPTP(腹腔内)注射5只小鼠(C57/bl)持续连续的5天。18天后，将小鼠处死并且通过HPLC对两个半球中多巴胺水平进行测量。
结论
实例结果表示于图17中。
虽然结合其具体实施方式已经对本发明进行了说明，应当清楚的是任何替代方案、变更以及变化对于本领域普通技术人员将是清楚的。引起，预期的是包括落在随附权利要求的精神和广义范围内的所有这类替代方案、改变以及变化。
在本说明书中提及的所有的出版物、专利和专利申请都通过引用以其全部内容结合在此进入本说明书中，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被明确地并且单独地指明通过引用结合在此。此外，本说明书中任何引用的引用文件或鉴定不应被解释为承认这样的引用可用作本发明的现有技术。对于使用章节标题的程度而言，它们不应被解释为进行必要的限制。

Claims (2)

1.直接附连至细胞渗透剂的DJ-1肽，其中，所述DJ-1肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示，其中，当所述细胞渗透剂为肽细胞渗透剂时，所述肽细胞渗透剂由选自由SEQ ID NO: 21-23构成的组的氨基酸序列组成。
2.一种分离的肽，其由如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成。
3. 一种分离的肽，其由如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列组成。
4. 根据权利要求1-3中任一项所述的肽在制备鉴定用于治疗神经退行性疾病的药物中的用途。
5. 根据权利要求4所述的用途，其中，所述神经退行性疾病选自由帕金森病、多发性硬化症、ALS、多系统萎缩、阿尔茨海默病、中风、进行性核上麻痹、具有与染色体17相关帕金森综合征的额颞痴呆以及皮克氏病组成的组。
6. 一种药物组合物，包含权利要求1-3中任一项所述的肽，以及药学上可接受的载体。
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