CN101065494A - 微乳液中的酶反应 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备光学活性的有机化合物的不对称酶促方法。本发明的方法在所谓的微乳液中进行。本发明还涉及呈微乳液的酶促反应混合物。

Description

微乳液中的酶反应
本发明涉及制备光学活性的有机化合物的方法。待制备的光学活性的有机化合物的特征是它们是通过一或多种立体选择性酶促转化反应而不对称地获得的。这些反应是在所谓的微乳液(miniemulsions)中进行的。本发明还涉及可优先发生这种反应的反应系统。
在制备有机化合物的工业方法中也逐渐增多使用酶促程序步骤。这是由于以下事实：用作生物催化剂的酶已经以较少的量呈现出适当的工业效应，催化作用原则上可以在温和反应条件(温度、压力和pH)下发生，并且同时酶促转化与高度的对映选择性、区域选择性或化学选择性相关。为此，仍在尝试改良这些转化反应，并使其可用于工业生产过程，以在尽可能宽的范围内应用这些优势。
为此，详细研究了通过不对称酶促转化工业制备有机化合物的可能性。为此，经常发现在大规模工业生产中使用酶的缺点，所述缺点(例如溶剂使用过多以及溶解度或材料运输问题)使得对于将酶用于这些目的而产生怀疑。为此，使用高底物浓度进行生物催化反应尤其具有挑战性。
Landfester等描述了在呈现连续水相的系统中内酯的酶促聚合，所述系统中分布着称作微乳液液滴的不连续疏水相。这种微乳液通过对具有这两种相的混合物进行超声或高压均质处理获得。另外，在所述混合物中存在疏水性辅助物质和表面活性剂以使得液滴稳定(Macromol.Rapid Commun.2003，24，512-516；DE10248455)。
本发明的目的是阐述利用不对称酶促反应步骤制备光学活性的有机化合物的方法。特别地，该方法在效率方面优于现有技术的方法，但仍存在前面所提及的酶促转化的优势。
本发明实现了这一目的。权利要求1描述了本发明的方法。权利要求2-10意在保护本发明的方法的优选实施方式。权利要求11涉及本发明的反应混合物。
所述目的通过在微乳液中进行光学活性有机化合物(尤其是低分子量、非聚合的、手性分子)的不对称酶促制备方法而令人惊奇及非常方便地实现。使用微乳液还可以进行酶促转化，所述转化以优于现有技术的、尤其是更有效的方式进行。因此，与先前已知的方法相比，有可能使用相同量的酶减少反应时间或者增加待转化的有机化合物的可利用量，这两种情况均有助于达到更高的空/时产量。
根据本发明，应理解微乳液是一种混合物，其中小的稳定液滴优选在反应期间以分散形式存在于第二种连续相中，所述的液滴是通过加强使用剪切力尤其是超声、钢制分散器或微型流化剂而获得的。
优选地，具有疏水性特征的液滴在水性介质中产生。根据本发明，水性介质应理解为其中水是主要成分的均相。然而，在该相中也可以混和可溶水的其它有机溶剂，例如醇(如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、仲异丁醇、叔异丁醇、甘油和乙二醇)或酮(尤其是丙酮和MIBK)、或DMSO、DMF、NMP或环丁砜。本领域技术人员为此目的所考虑到的任何液体均可用作疏水相。当选择液体时，本领域技术人员首先要基于该液体与水在给定反应条件下是否形成两相混合物，以及其对于酶促转化是否是惰性反应。在适当情况下，当待使用的底物是液体时，可以无需加入这种疏水性液体，其自身可以呈现疏水相的功能。这在不同底物之间不同，必须由技术人员在个案中单独验证。如果除了底物之外还必需加入另外的疏水性液体(疏水相)，例如由于底物是固体，则技术人员为此优选从醚、酯和烃中选择一种液体。特别优选的是使用MTBE、乙酸乙酯、正己烷、正庚烷、环己胺和甲苯。
在这方面，可通过例如超声、钢制分散器或者微型流化剂处理所述混合物而分散液滴(K.Landfester，M.Antonietti，“Miniemulsionsfor the convenient synthesis of organic and inorganic nanoparticles and“single molecule”applications in materials chemistry”in：Colloids andColloid Assemblies(Ed.：F.Caruso)，Wiley VCH Verlag，Weinheim，Germany，2004，pp.175-215及其引用的文献)。所述微乳液液滴优选平均直径为20-1000nm，特别优选30-600nm，尤其优选50-500nm。
为了制备微乳液，优选在产生液滴之前向混合物中加入表面活性剂。所述表面活性剂基于乳液的量的用量以重量计优选为1-20％，更优选2-15％，特别优选3-10％。原则上，本领域技术人员为此目的所考虑到的以及不失活待应用的酶的任何表面活性剂均适于所述应用。但是，优选使用非离子表面活性剂，例如A.Taden，M.Antonietti，K.Landfester，Macromol.Rapid Commun.2003，24，512-516中所描述的非离子表面活性剂。特别优选的是使用选自如下一组表面活性剂：烷基聚乙二醇醚的乙氧基化物，优选Lutensol AT，特别优选Lutensol AT 50(C16/18-EO8-50)。
另外，形成的乳液液滴通过另外加入通常为疏水性的惰性物质而稳定。先决条件是这些物质在水中与在疏水相中相比呈现更低的溶解度。这种性质的合适物质特别是脂肪烃或芳烃。优选的脂肪烃特别是C6-C20烃类。这些物质特别优选选自烃，特别是十六烷。这些疏水性物质基于所述微乳液优选用量以重量计为0.001-70％，优选0.1-3％，特别优选0.5-2％。
用于不对称制备光学活性的有机化合物的酶可以由本领域技术人员以适当方式选择。原则上，本发明的方法可使用技术人员为此目的所考虑到的任何酶。已发现，可优选应用选自氧化还原酶、水解酶、异构酶、转移酶和裂合酶的酶。特别优选使用脂肪酶和氧化还原酶。极其优选使用Amano公司的脂肪酶PS。
所述酶优选取自以下生物体：节杆菌属(Arthobacter)菌株，尤其是石蜡节杆菌(Arthobacter paraffineus)；曲霉属(Aspergillus)菌株，尤其是黑曲霉(Aspergillus niger)；芽孢杆菌属(Bacillus)菌株，尤其是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)；伯克霍尔德属(Burkholderia)菌株，尤其是洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)；假丝酵母属(Candida)菌株，尤其是南极假丝酵母(Candida antarctica)、博伊丁氏假丝酵母(Candida boidinii)和皱褶假丝酵母(Candidarugosa)；乳芽孢杆菌属(Lactobacillus)菌株，尤其是Lactobacillus kefir和短小乳芽孢杆菌(Lactobacillus brevis)；毛霉菌(Mucor)菌株，特别是爪哇毛霉(Mucor javanicus)；青霉属(Penicillium)菌株，尤其是沙门氏柏干酪青霉(Penicilliumcamemberti)；假单胞菌属(Pseudomonas)菌株，尤其是葱头假单胞菌(Pseudomonas cepacia)和荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)；根霉属(Rhizopus)菌株，尤其是米根霉(Rhizopusoryzae)；红球菌属(Rhodococcus)菌株，尤其是红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)、赤红球菌(Rhodococcus ruber)和紫红红球菌(Rhodococcus rhodocrous)；及嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)。
原则上，本领域技术人员考虑到的与酶反应的任何化合物均可用作底物。所述底物优选是固体或液体，且不具有或者具有至少一个手性中心。在本发明的反应中所产生的产物是光学富集形式，即意味着优先形成两种可能的对映异构体的混合物中的一种对映异构体，或者得自前手性化合物。所述产物中产生的过量对映异构体优选＞80％，更优选＞90％，更优选＞95％，特别优选＞98％。
在本发明反应中优选应用的物质种类可选自例如外消旋α-或β-氨基酸酯、α-或β-羟基羧酸酯和前手性酮。特别优选使用外消旋β-氨基酸酯，尤其是正丙基外消旋-3-氨基-3-苯丙酸酯作为底物。
本发明的酶促反应可优选在相对高的底物浓度下进行。在微乳液中进行酶促转化时优选使用底物起始量为＞300g/l，优选＞450g/L，更优选＞600g/L。
参与制备光学活性的有机化合物的一或多种酶可以以本身形式或者以展示一或多种这些酶的微生物的形式用于反应中。根据本发明，术语“本身形式”是指所述酶以天然的形式或如所需的高纯度形式重组制备的蛋白质的形式加入微乳液中。然而，原则上也可以使用作为微生物组分的一或多种酶。所述微生物因此是其中至少表达一种基因的细胞，也就是存在至少一种可以催化本发明的转化的蛋白质。如果所述基因以重组形式存在于微生物中，则该微生物之后被称作宿主生物体。所述宿主生物体可含有以整合形式存在于染色体中或质粒上的基因。如果一些酶参与酶促转化并以重组形式由宿主生物体一起表达，则在本申请中将所述宿主生物体称作全细胞催化剂。
当一些酶以本身形式或以全细胞催化剂形式使用时，例如在一反应级联中，根据本发明，至少一种酶足以引起相应底物的不对称转化(EP1216304-在该文中是乙内酰脲消旋酶/乙内酰脲酶/立体选择性氨基甲酰酶)。
在这方面可以提及的宿主生物体是这样的生物体，例如酵母(如多形汗逊氏酵母(Hansenula polymorpha)、毕赤氏酵母(Pichia sp.)和啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae))、原核生物(如大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、或真核细胞(如哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞)。克隆方法为本领域技术人员所熟知(Sambrook，J.；Fritsch，E.F.and Maniatis，T.(1989)，Molecular cloning：a laboratory manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork)。为此目的优选使用大肠杆菌菌株。特别优选的是：E.coliXL1 Blue、NM 522、JM101、JM109、JM105、RR1、DH5α、TOP10-、HB101、BL21 codon plus、BL21(DE3)codon plus、BL21，BL21(DE3)和MM294。
原则上，可为本领域技术人员为此目的所利用的任何实施方式均适合用作质粒或载体以克隆所述基因。这些质粒和载体可见于例如Studier及其同事的描述(Studier，W.F.；Rosenberg A.H.；Dunn J.J.；Dubendroff J.W.；(1990)，Use of the T7 RNA polymerase to directexpression of cloned genes，Methods Enzymol.185，61-89)，或者由Novagen、Promega、New England Biolabs、Clontech或Gibco BRL、提供的手册。其它优选的质粒和载体可见于：Glover，D.M.(1985)，DNA cloning：a practical approach，Vol.I-III，IRL Press Ltd.，Oxford；Rodriguez，R.L.und Denhardt，D.T(eds)(1988)，Vectors：a survey ofmolecular cloning vectors and their uses，179-204，Butterworth，Stoneham；Goeddel，D.V.(1990)，Systems for heterologous geneexpression，Methods Enzymol.185，3-7；Sambrook，J.；Fritsch，E.F.andManiatis，T.(1989)，Molecular cloning：a laboratory manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York。
可用于将含有所研究的核酸序列的基因构建体以非常优选的方式克隆进宿主生物体中的质粒是或基于：pUC18/19(RocheBiochemicals)、pKK-177-3H(Roche Biochemicals)、pBTac2(RocheBiochemicals)、pKK223-3(Amersham Pharmacia Biotech)、pKK-233-3(Stratagene)或pET(Novagen)。
已证明，当实施本发明的方法时，优选对微生物或宿主生物体进行预处理，优选在使用之前进行预处理，由此使得其细胞膜对底物和产物的通透性与未经处理的系统相比得以增加。在这方面，特别优选的是其中微生物或宿主生物体通过例如冷冻预处理和/或用有机溶剂尤其是甲苯进行处理的方法。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种呈微乳液形式的反应混合物，其包含连续水相和不连续疏水相、参与有机化合物的不对称制备的立体选择性酶或含这种酶的微生物、表面活性剂、使乳液液滴稳定的疏水性物质及待被所述酶转化的前手性或外消旋或对映异构体富集的有机化合物和/或该化合物的反应产物。本发明方法的优选实施方式依此类推是有效的。
参见在本申请开始所引用关于产生微乳液形式的本发明的反应混合物的现有技术。在该现有技术中阐述的不同制备方法可以相应的方式用于本发明。
因此，微乳液可以例如通过将由有机溶剂和水相组成的混合物进行超声处理而形成。这种处理产生均质的乳状液体，其在给定条件下及添加所述添加剂的条件下，在酶促转化期间不再分层，因此在本发明中被认为是稳定的。其它反应参数如pH或温度的设置取决于酶促转化，并可以由本领域技术人员通过常规实验确定。
因此，例如可以通过超声将含有表面活性剂和含有十六烷的水性混合物(其包含正丙基-3-氨基-3-苯丙酸酯)的转化为微乳液。当使用脂肪酶时获得的液滴如图1中所示。在这方面，脂肪酶可以在进行超声处理之前加入或者在超声处理之后搅拌入微乳液中。在这种情况中，酶促转化的产物(S)-3-氨基-3-苯基-正丙酸在反应期间从该微乳液中沉淀出来，并可以通过简单过滤从反应混合物的残余物中分离出。当使用微乳液时，发现反应速度与先前的程序相比增加(见实施例1(对比实施例)和实施例2)。令人惊奇地，在反应期间固体的形成不会使微乳液变得不稳定，即使固体可以使微乳液去稳定也如此。因此，所述微乳液即使在第三相(即固相)正在形成时也保持稳定，这有些未曾预料到。更令人惊奇地，所形成的固体的颗粒直径适于(工业化)过滤。这是未曾预料到的，因为根据定义微乳液是由非常小的在空间上分离的液滴组成，所述液滴随后由于结晶核的数目的增加(与标准沉淀方法相比)而产生具有小颗粒直径的细碎粒状固体，这反过来导致相应的过滤上的难度。
再令人惊奇的是，由于使用微乳液，可能增加底物浓度同时保留搅拌特性并实现高周转率。使用几百克/升(例如482g/L)的底物浓度进行实验(见实施例3)。这是迄今为止已报道的酶促对映异构体选择性反应的最高底物浓度之一。长久以来，已知将超声用于羧酸酯的水解(Yim et al.，Chemistry Letters 2001，p.938；Moon et al.Tetrahedron Letters 1979，41，3917)。据报道，利用超声可提高对酯的水解。在这种情况下，令人惊奇的是，在刚刚描述的反应中由于利用超声而未发生所述酯的对称裂解，并形成不需要的外消旋物而非所需的光学活性产物；事实上只有酶促不对称水解是显著的，这从产物的极佳ee值清楚可见。实际上，不需要的对称水解最多只发挥从属作用，即当利用超声时在微乳液中作为背景反应。
再令人惊奇的是，所使用的酶不受超声脉冲或所应用的其它剪切力的影响，由此不过分丧失其功能性。鉴于超声在被超声处理的介质中产生微气泡这一事实，该气泡连同崩解产生达5000K的温度和达1000bar的压力，应用如酶那样易碎的化合物的优势肯定是非常令人惊喜的。
使用微乳液酶促制备光学活性的低分子量的分子的观念目前还未知。从前只是在微乳液中进行了内酯的酶促聚合作用(参见上述)。在本发明的用于制备光学活性的有机化合物的酶促转化中，可以实现与常规方法相比反应时间更短和/或应用的底物量更高。这相对于本发明之前的现有技术的背景而言绝非是显而易见的。
                      实施例
实施例1(对比实施例)：脂肪酶催化的外消旋β-氨基酸酯在底物浓度为242g/L的两相系统中的对映异构体选择性水解
最初先导入80ml水，向其中加入1.45g的Amano脂肪酶PS(Pseudomas cepacia；得自Amano Enzymes公司)。然后过滤出未溶解的固体。向所述酶的水溶液中加入80ml甲基叔丁基醚(MTBE)作为有机溶剂成分，这样产生滤过物。使用自动pH stat调节所述两相系统至pH8.2，并通过加入1M氢氧化钠溶液(得自Merck)使其恒定在该pH。一达到20℃温度，加入39g外消旋化合物正丙基外消旋-3-氨基-3-苯丙酸酯，开始反应。反应时间为18小时，在此期间产生包含所需产物(S)-3-氨基-3-苯丙酸的白色沉淀。加入160ml丙酮以完成沉淀，随后将混合物搅拌45分钟。过滤出固体并用少量丙酮洗涤。
1小时后，首先观察到13.9％的转化率。在15小时反应时间后，观察到大约50％的转化率。经后处理后分离的产物的ee值＞99％，产率为41％。
实施例2：脂肪酶催化的外消旋β-氨基酸酯在底物浓度为242g/L的微乳液中的对映异构体选择性水解
最初先导入40ml表面活性剂溶液，向其中加入1.45g的Amano脂肪酶PS(Pseudomas cepacia，得自Amano Enzymes公司)。然后过滤出未溶解的固体。
在每种情况中，将1/3待使用的丙酯(共39g)和1/3的十六烷(共1.638g)及每种情况中各40ml的1％表面活性剂溶液混和，使用磁力搅拌器进行搅拌。将每种情况中的这三种乳液使用超声探头在200W处理4分钟。
将滤过物与这三种微乳液合并，使用自动pH stat调节混合物至pH 8.2，并通过加入1M氢氧化钠溶液(得自Merck)使其恒定在该pH。反应温度为20℃，反应时间为17小时，在此期间产生包含所需产物(S)-3-氨基-3-苯丙酸的白色沉淀。加入160ml丙酮以完成沉淀，随后将该混合物搅拌45分钟。过滤出固体并用少量丙酮洗涤。
1小时后，首先观察到17.5％的转化率。在6小时反应时间后获得大约49％的转化率。经后处理后分离的产物的ee值＞99％，产率为41％。
实施例3：脂肪酶催化的外消旋β-氨基酸酯在底物浓度为484g/L的微乳液中的对映异构体选择性水解
最初先导入40ml表面活性剂溶液，向其中加入1.21g的Amano脂肪酶PS(Pseudomas cepacia，得自Amano Enzymes公司)。然后过滤出未溶解的固体。
在每种情况中，将1/3待使用的丙酯(共65.21g)和1/3的十六烷(共1.369g)及每种情况中各32ml的1％表面活性剂溶液混和，使用磁力搅拌器进行搅拌。将每种情况中的这三种乳液使用超声探头在200W处理4分钟。
将滤过物与这三种微乳液合并，使用自动pH stat调节混合物至pH 8.2，并通过加入1M氢氧化钠溶液(得自Merck)使其恒定在该pH。反应温度为20℃，反应时间为18小时，在此期间产生包含所需产物(S)-3-氨基-3-苯丙酸的白色沉淀。加入160ml丙酮以完成沉淀，随后将该混合物搅拌45分钟。过滤出固体并用少量丙酮和100ml MTBE洗涤。
1小时后，首先观察到10.2％的转化率。在18小时反应时间后达到大约45％的转化率。经后处理后分离的产物的ee值＞99％，产率为37％。

Claims (11)

1.用于在微乳液中制备光学活性的有机化合物的不对称酶促制备方法。
2.权利要求1的方法，其特征在于在水性介质中产生疏水性液滴的微乳液。
3.权利要求1和/或2的方法，其特征在于产生平均液滴直径为20-1000nm的乳液液滴的微乳液。
4.前述一或多项权利要求的方法，其特征在于所述微乳液含有表面活性剂。
5.前述一或多项权利要求的方法，其特征在于所述微乳液含有非离子表面活性剂，优选Lutensol AT 50。
6.前述一或多项权利要求的方法，其特征在于乳液液滴另外通过加入惰性疏水性物质而稳定，优选加入正十六烷。
7.前述一或多项权利要求的方法，其特征在于所应用的酶选自如下一组：氧化还原酶、水解酶、异构酶、转移酶和裂合酶。
8.前述一或多项权利要求的方法，其特征在于所应用的底物是外消旋氨基酸酯，优选β-氨基酸酯，特别优选正丙基-外消旋-3-氨基-3-苯丙酸酯。
9.前述一或多项权利要求的方法，其特征在于酶促反应在底物浓度＞300g/L、特别是＞450g/L的条件下进行。
10.前述一或多项权利要求的方法，其特征在于参与有机化合物的制备的一或多种酶以其本身形式或以包含一或多种所述酶的微生物的形式应用。
11.呈微乳液的反应混合物，其包含连续水相和不连续疏水相、参与有机化合物的不对称制备的立体选择性酶或包含这种酶的微生物、表面活性剂、使乳液液滴稳定的疏水性物质及待通过所述酶转化的前手性或外消旋或对映异构体富集的有机化合物和/或该化合物的反应产物。
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