CN101065096A - 达菲抗原趋化因子受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及达菲抗原趋化因子受体及其应用。在一个具体实施方式中，本发明提供了一种用于筛选抑制血管形成的药物候选物的方法。该方法包括将一种分子与达菲抗原趋化因子受体接触并确定该分子是否结合到达菲抗原趋化因子受体。在另一个具体实施方式中，本发明提供了一种用于抑制肿瘤生长的方法。在又一个具体实施方式中，本发明提供了一种用于抑制血管形成的方法。在进一步的具体实施方式中，本发明提供了一种用于促进肿瘤坏死的方法。

Description

达菲抗原趋化因子受体及其应用
技术领域
本申请要求于2004年10月21日提交的美国临时申请序列号60/620,993的优先权，因而将其说明书全部内容以引用方式结合与此作为参考。
背景技术
达菲血型蛋白(Duffy blood group protein)是七次跨膜结构域趋化因子受体家族中的一员(Chaudhuri et al.，PNAS，1993，90：10793-10797)。该蛋白能够结合趋化因子，如CXC和CC趋化因子。因此，该蛋白也被称为达菲抗原趋化因子受体(DARC)(Chaudhuri et al.，J Biol Chem.1994，269：7835-7838 and Horuk el al.，Immunol Today 1994，15：169-174)。
除了在红细胞上表达外，DARC也在内皮细胞上存在。例如，DARC在多种非红细胞器官(nonerythroid organ)如肝、肺、甲状腺和脾的微血管内皮细胞上存在；也在肺和肾集管的上皮细胞上存在(Chaudhuri et al.，Blood 1997，89：701-712)。脑的浦肯野氏细胞(Purkinje cell)也包含DARC(Horuk et al.，JLeukocyte Biol.1996，59：29-38)。
血管形成是形成新血管的过程。该过程涉及毛细内皮细胞从预先存在的血管增生、迁移和组织渗透。然而，在健康成人体内的血管内皮细胞通常是静止的，并且它的活化在血管形成中被紧密地调节。
血管形成在正常的生理过程包括胚胎形成、卵泡生长和创伤愈合，以及在涉及肿瘤生长、转移、异常眼部新血管形成、关节炎、牛皮癣的病理条件下和在多种女性生殖系统疾病中是重要的。例如，已报道生长性肿瘤需要快速生长性脉管系统以给肿瘤供应营养。因此，血管形成的调节和/或抑制在病理状态如癌症中将会是有益的。
趋化因子受体家族的配体是趋化细胞因子，也称为趋化因子。趋化因子是通常包含4个高度保守Cys残基(形成两个二硫键)的肽(Baggiolini et al.，New England Journal of Medicine 1998，338：436-445)。有多个趋化因子家族。两个最大的家族是CXC趋化因子和CC趋化因子。其它的趋化因子家族包括C趋化因子和CX3C趋化因子。
趋化因子的CXC家族包含在肽氨基末端由任何氨基酸隔开的两个高度保守的Cys残基。属于CC家族的趋化因子具有彼此邻接的两个Cys残基。
趋化因子通过结合到大量靶细胞上的趋化因子受体来诱导细胞迁移和活化。已经报道了趋化因子涉及多种疾病。作为综述，参见Luster，New England Journal of Medicine 1998，338：436。
已报道了多种趋化因子(包括IL-8)对血管形成有刺激作用(Dawson et al.，Blood 2000，96：1681-1684)。例如Debsaillets et al.(J.Exp.Med.1997，186：1201-1212)研究了增强的IL-8是否将通过结合于DARC而直接和/或间接地促进血管形成。该作者得出结论：必须建立进一步的体内研究来确定IL-8和其它血管形成趋化因子对血管形成响应是否是实质性贡献者，以及这种响应是否通过DARC来介导。
而且，Gershengorn的美国专利第6,365,356号报道，用于血管形成和血管形成停滞(angiostasis)的细胞信号转导涉及内皮细胞中的DARC和趋化因子受体的共表达。然而，DARC的准确功能并没有被报道。
另外，一篇最近的文章报道了表达DARC的肿瘤中的肿瘤坏死的增加和肿瘤相关血管形成的减少。见Addison et al.(BMC Cancer，2004，4：28)
上面描述的参考文献，强调了血管形成中DARC的作用，Debsaillets等报道了需要进一步的体内研究；Gershengorn没有报道DARC的准确功能，以及Addison等报道了表达DARC的肿瘤表现出肿瘤-相关血管形成的减少。因此，DARC在血管形成中的作用是不清楚的。
需要用于抑制血管形成和肿瘤生长、以及用于促进肿瘤坏死的改进方法。还需要用于发现抑制血管形成的药物候选物的筛选方法。
发明内容
本发明实现了这些和其它的目的，提供了一种用于筛选抑制血管形成的药物候选物的方法。该方法包括将一种分子与达菲抗原趋化因子受体接触并确定该分子是否结合于达菲抗原趋化因子受体。结合达菲抗原趋化因子受体的分子是抑制血管形成的药物候选物。
在另一个具体实施方式中，本发明提供了一种用于在需要其的哺乳动物中抑制肿瘤生长的方法。该方法包括给予哺乳动物有效量的抑制血管形成趋化因子与达菲抗原趋化因子受体结合的分子。
在另一个具体实施方式中，本发明提供了一种用于在需要其的哺乳动物中抑制血管形成的方法。该方法包括给予哺乳动物有效量的抑制血管形成趋化因子与达菲抗原趋化因子受体结合的分子。
在进一步的具体实施方式中，本发明提供了一种用于在需要其的哺乳动物中促进肿瘤坏死的方法。该方法包括给予哺乳动物有效量的抑制血管形成趋化因子与达菲抗原趋化因子受体结合的分子。
附图说明
图1：在Dfy(-/-)和Dfy(+/+)小鼠中的肿瘤重量。
图2：在WT[Dfy(+/+)]和DKO小鼠中的LLC注射的肿瘤生长。
(A)用箭头示出了在Dfy(-/-)小鼠中的坏死。(B)与DKO小鼠的肿瘤相比，WT小鼠中的肿瘤更坚实和致密。(C)肿瘤组织的组织结构显示肿瘤的密度，并且与DKO小鼠中的肿瘤组织相比，更多微毛细管形成(箭头)。
图3：在LLC诱导的肿瘤生长中抗-达菲抗体的作用。
具体实施方式
本发明是基于发明人的惊人发现：DARC的抑制可抑制肿瘤生长和血管形成。发明人还意外地发现DARC的抑制剂促进肿瘤坏死。
抑制肿瘤生长
在一个具体的实施方式中，本发明提供了一种用于在需要其的哺乳动物中抑制肿瘤生长的方法。需要抑制肿瘤生长的哺乳动物是那些患有肿瘤的哺乳动物。任何类型的需要血管形成的肿瘤可以根据本发明的方法加以治疗。
肿瘤通常是不正常的组织或细胞块，其通常由于过度细胞分裂所致。肿瘤可出现于任何组织或细胞。组织或细胞的实例包括上皮细胞、内分泌组织、骨细胞、前列腺细胞、脑组织、肾细胞、肺细胞、乳房组织、卵巢组织、结肠组织、视网膜组织等。肿瘤可以是良性的(非癌性的)或恶性的(癌性的)。当肿瘤为恶性时，所述方法特别有效。
用于抑制肿瘤生长的方法包括给予哺乳动物有效量的抑制血管形成趋化因子与DARC结合的一种分子。对于本领域的技术人员来说，DARC是众所周知的。参见背景部分对DARC的简要描述。
在本发明方法中被抑制的DARC可以是在任何细胞，尤其是内皮细胞和上皮细胞上存在的任何DARC。内皮细胞的实例包括但不限于静脉内皮细胞、动脉内皮细胞和微血管内皮细胞。上皮细胞的实例包括肺泡和肾收集管中的细胞。
DARC能够结合于趋化因子，尤其是血管形成趋化因子。如本文使用的，术语“血管形成趋化因子”是指刺激或促进血管形成的趋化因子。血管形成趋化因子可以属于趋化因子的任何家族，如C，CC，CXC和CX3C。
能够结合DARC并且是血管形成的CC趋化因子的实例包括但不限于单核细胞-趋化蛋白-1(MCP-1，也称为CCL2)、MCP-3(CCL7)、RANTES(CCL5)和嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)(CCL11)。
CXC趋化因子可以被细分为在其氨基末端包含序列Glu-Leu-Arg(ELR)的肽(ELR+)和不包含序列Glu-Leu-Arg(ELR)的肽(ELR-)。通常，血管形成CXC趋化因子是ELR+。能够结合DARC的血管形成CXC ELR+趋化因子的实例包括Gro-α(CXCL1)，Gro-β(CXCL2)，ENA-78(CXCL5)，1-TAC(CXCL11)、白介素-8(IL-8，也称为CXCL8)以及稳态趋化因子如TARC(CCL17)。
任何抑制血管形成趋化因子与DARC结合的分子在本发明的方法中都是有用的。可以采用任何阻断结合的机制。例如，该分子可以通过结合到DARC或结合到血管形成趋化因子来阻断血管形成趋化因子与DARC的结合。
所述分子可以是小分子或生物分子。小分子通常是有机化合物，包括有机金属和有机硅化合物等，并且通常具有大约450或更小的分子量。小分子可进一步包括另一方面可能被认为是生物分子的分子，只要它们的分子量不大于450。因此，小分子可以包括具有450或者更小分子量的单糖、寡糖、氨基酸、寡肽、核苷酸、寡核苷酸和它们的衍生物。
应强调的是，小分子可具有任何分子量。它们被称作小分子只是因为它们不被承认为生物分子，并且通常具有小于450的分子量。
生物分子是包含聚氨基酸、多核苷酸或多糖并且通常具有大于450的分子量的分子。聚氨基酸包括蛋白质、多肽和肽。在本发明方法中有用的聚氨基酸的实例包括结合DARC结合或血管形成趋化因子以及抑制血管形成趋化因子与DARC结合的抗体。
在本说明书中，抗体被广泛地定义为特异结合表位的蛋白。特异结合表位的抗体可以包括抗体高变区。包括抗体高变区的蛋白可以是全长抗体或抗体片段。
例如，高变区可以包括全部抗体可变区。抗体可变区可以进一步包含抗体恒定区。抗体可以是多克隆或单克隆的。
适合的非人类抗体的可变区和高变区可以来源于由任何非人类哺乳动物产生的抗体，其中形成单克隆抗体。适合的除了人类的哺乳动物的实例包括例如兔、大鼠、小鼠、马、羊或灵长类。
优选地，抗体是人类抗体。人类抗体可以在转基因小鼠中产生。这样的小鼠的一个实例是Green，LL.“AntibodyEngineering Via Genetic Engineering of the Mouse：XenoMouse Stains are a Vehiclefor the Facile Generation of Therapeutic Human Monoclonal Antibodies，”J.Immunol.Methods，”10；231(1-2)：11-23(1999)描述的所谓XenoMouseTM(Abgenix，Freemont，CA)。
抗体片段具有与全长抗体结合特性相同或相当的结合特性。合适的抗体片段包括任何包含足够的高变(即，互补决定)区部分以特异结合例如DARC或血管形成趋化因子并且具有足够的亲和力的片段。
优选的片段是单链抗体。单链抗体是包含至少抗体重链的可变区和轻链的可变区(具有或没有相互连接接头)的多肽。
非人类抗体可以是嵌合的。嵌合抗体包含非人类抗体的可变区和人类抗体的恒定区。
更优选地，非人类抗体是人源化抗体。人源化抗体包含非人类抗体的高变区(CDR)。可变区而不是超变区(例如框架可变区)和人源化抗体的恒定区是人类抗体的那些。
抗体可以是任何种类的免疫球蛋白如：IgG，IgM，IgA，IgD或IgE，及其亚类的成员。
抗体可以通过任何本领域技术人员已知的方法制备。制备单克隆抗体的方法包括例如由Kohler and Milstin 1975，Nature 256：495-497和Campbell在“Monoclonal Antibody Technology，The Production and Characterization ofRodent and Human Hybridomas”in Burdon，et al.，Eds，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，Volume 13，Elsevier Science Publishers，Amsterdam(1985)中描述的免疫方法。由Huse，et al.1989 Science 246：1275-1281描述的重组DNA方法也适合。
抗体或抗体片段可以从利用例如McCafferty et al.1990.Nature 348：552-554中描述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离，用感兴趣的抗原来选择合适的抗体或抗体片段。Clackson et al.1991.Nature 352：624-628和Markset al.1991.J.Mol.Biol.222：581-597描述了利用噬菌体文库分别分离鼠和人类抗体。后来的出版物描述了通过链漂移(Mark et al.1992.Bio/Technol.10：779-783)，以及作为用于构建非常大的噬菌体文库策略的组合感染和体内重组(Waterhouse et al.1993.Nuc.Acids Res.21：2265-2266)来生产高亲和力(nM范围)的人类抗体。
制备嵌合和人源化抗体的方法也是本领域已知的。例如，制备嵌合抗体的方法包括在Boss(Celltech)和Cabilly(Genentech)的美国专利中描述的那些。分别参见美国专利第4,816,397号和第4,816,567号。制备人源化抗体的方法被描述在例如Winter的美国专利第5,225,539号中。
优选的用于抗体人源化的方法称为CDR-移植(CDR-grafting)。在CDR-移植中，非人类的哺乳动物抗体，优选地小鼠抗体的直接涉及与抗原结合的区域(互补决定区或CDR)被移植到人类可变区，以形成“经改造的人类”可变区。然后这些完全人源化可变区被连接到人类恒定区，以产生完整“完全人源化”抗体。
为了形成与抗原良好结合的完全人源化抗体，有利地，认真设计改造的人类可变区。其中CDR将会被移植的人类可变区应该认真选择，并且经常有必要在人类可变区的框架区(FR)内的关键位置形成少数氨基酸的改变。
用于制备单链抗体的方法在本领域也是已知的。这样的方法包括筛选用免疫球蛋白基因转染的噬菌体文库，如在美国专利5,565,332；美国专利5,5837,242；美国专利5,855,885；美国专利5,885,793；和美国专利5,969,108中描述的。另一种方法包括利用基于计算机的系统来设计将两个分开的多肽链转换为单链抗体的连接肽，描述在美国专利4,946,778；美国专利5,260,203；美国专利5,455,030；和美国专利5,518,889中。
其它用于产生上述抗体的方法由Wels等的欧洲专利申请EP 502 812和Int.J.Cancer 60：137-144(1995)；PCT申请WO 93/21319；欧洲专利申请239 400；PCT申请WO 89/09622；欧洲专利申请338 745；美国专利5,658,570；美国专利5,693,780；和欧洲专利申请EP 332 424所披露。
其它抑制血管形成趋化因子与DARC结合的生物分子的实例包括突变的血管形成趋化因子，如上述血管形成CXC或CC趋化因子的突变体。如在本说明书中使用的，术语“突变的血管形成趋化因子”是指天然的(例如，非突变的)血管形成趋化因子的类似物。该类似物能够结合于DARC，但刺激或促进血管形成的能力下降。
与非突变的血管形成趋化因子相比，如果血管形成被抑制至少约10％，优选至少约25％，更优选至少约50％，甚至更优选至少约75％，以及最优选至少约90％，则认为突变的血管形成趋化因子刺激或促进血管形成的能力下降。
血管形成趋化因子可以通过本领域技术人员知道的任何方法进行突变。例如，突变的血管形成趋化因子可以包含天然血管形成趋化因子的片段。
血管形成趋化因子的片段是活性的(例如，能够与DARC结合，但刺激或促进血管形成的能力下降)。该片段可以来自于血管形成趋化因子的N-末端、C-末端、或N-和C-末端之间。该片段可以例如包含至少约10％，优选约25％，更优选约50％，甚至更优选约75％，以及最优选约90％的该血管形成趋化因子中的氨基酸。例如，如果该血管形成趋化因子的长度是100个氨基酸，则该片段可以包括至少约10，优选约25，更优选约50，甚至更优选约75，以及最优选约90个氨基酸。
可替换地，天然血管形成趋化因子的一个或多个氨基酸可以被其它的氨基酸替代。能够与DARC结合的突变血管形成趋化因子的实例是黑素瘤生长刺激活性(MGSA)E6A。MGSA包含在氨基酸位置6处的丙氨酸而不是谷氨酸。MGSA E6A被披露于例如Hesselgesser et al.，JBC，1995，270：11472-11476。
抑制血管形成趋化因子与DARC结合的生物分子的其它实例包括非免疫原性疟疾寄生虫配体(来自疟疾寄生虫的配体，能够结合至DARC)。这样的配体对于本领域的技术人员来说是已知的，并且包括例如疟疾寄生虫间日疟原虫(plasmodium vivax)配体或其恶性疟原虫(plasmodium falciparum)配体的等价物的达菲结合蛋白(例如，包含达菲结合类(DBL)结构域的红细胞结合抗原-175(EBA-175))。
如在本说明书中使用的，术语“非免疫源性”是指来自疟疾寄生虫的配体的类似物的性质，其能够结合DARC，但缺乏免疫源性。可以通过本领域技术人员已知的任何方法来使来自疟疾寄生虫的配体变成非免疫原性的。例如，非免疫原性疟疾寄生虫配体可以包含免疫原性疟疾寄生虫配体的片段。可替换地，疟疾寄生虫配体的一个或多个氨基酸可以用其它氨基酸替代。
疟疾寄生虫配体片段是活性的(例如，能够结合DARC，但是为非免疫原性的)。该片段可以来自疟疾寄生虫配体的N-末端、C-末端、或N-和C-末端之间。该片段可以例如包含至少约10％，优选约25％，更优选约50％，甚至更优选约75％，以及最优选约90％的该疟疾寄生虫配体的氨基酸。例如，如果疟疾寄生虫配体的长度是100个氨基酸，则该片段可以包括至少约10，优选约25，更优选约50，甚至更优选约75，以及最优选约90个氨基酸。
其它抑制血管形成趋化因子与DARC结合的分子的实例包括上述的聚氨基酸的任何一种的拟肽。如本文使用的，术语“拟肽(peptidomimetic)”是指一种分子，尤其是生物分子，其可再现聚氨基酸结合部分的立体空间性质。
另外，拟肽通常增强原始聚氨基酸的一些性质。这样的性质包括例如增加的稳定性、增加的结合、增加的活性、提高的效率、改进的递送、增加的半衰期等等。基于已知的聚氨基酸序列来制备拟肽的方法描述在例如美国专利第5,631,280号；第5,612,895号；和第5,579,250号中。
拟肽的合成可以包括在给定位置用非酰胺键整合聚氨基酸、非氨基酸残基。例如，为了获得聚氨基酸的拟肽，可以用合适的模拟物替代一个键、主链或氨基酸残基。可能是合适氨基酸模拟物的非自然氨基酸残基的一些非限制性实例包括β-丙氨酸、L-α-氨基丁酸、L-γ-氨基丁酸、L-α-氨基异丁酸、L-ε-氨基己酸、7-氨基庚酸、L-天冬氨酸、N-ε-Boc-N-α-CBZ-L-赖氨酸、N-ε-Boc-N-α-Fmoc-L-赖氨酸、L-蛋氨酸砜(methionine sulfone)、L-正亮氨酸、L-正缬氨酸、N-α-Boc-N-δ-CBZ-L-鸟氨酸、N-δ-Boc-N-α-CBZ-L-鸟氨酸、Boc-p-硝基-L-苯丙氨酸、Boc-羟脯氨酸以及Boc-L-硫代脯氨酸。
抑制血管形成
在另一个具体实施方式中，本发明提供了一种用于在需要其的哺乳动物内抑制血管形成的方法。如在背景技术部分讨论的，血管形成是指新血管的生长。血管形成的抑制可以发生在任何类型的细胞中，尤其是内皮细胞和上皮细胞，例如上文所述的那些。
用于抑制血管形成的方法包括给予哺乳动物有效量的抑制血管形成趋化因子与DARC结合的分子。该分子、血管形成趋化因子、和DARC包括上文所披露的那些。
需要抑制血管形成的哺乳动物是那些患有其中血管形成对该哺乳动物是不利的疾病或病症的哺乳动物。任何这样的疾病或病症可以根据本发明的方法进行治疗。适合的疾病或病症的实例包括但不限于良性或恶性肿瘤生长、转移、异常眼部新血管形成、关节炎、牛皮癣、以及多种女性生殖系统疾病，包括在诸如子宫内膜异位、痛经、子宫内膜癌和子宫癌的疾病中由于增强的血管生长导致的过度出血。
促进肿瘤坏死
在进一步的具体实施方式中，本发明提供了一种用于在需要其的哺乳动物中促进肿瘤坏死的方法。肿瘤坏死是指肿瘤细胞的死亡。通常，肿瘤坏死是由于血液供应缺乏而发生的。肿瘤坏死的促进可以发生在任何类型的需要血液供应的肿瘤中，如上述的那些。
用于促进肿瘤坏死的方法包括给予哺乳动物有效量的抑制血管形成趋化因子与DARC结合的分子。该分子、血管形成趋化因子、和DARC包括上文披露的那些。
需要促进肿瘤坏死的哺乳动物是那些患有肿瘤的哺乳动物。任何类型的需要血液供应的肿瘤可以根据本发明的方法进行治疗。这样的肿瘤的实例包括上面讨论的那些。
筛选药物候选物
在另一个具体实施方式中，本发明涉及一种用于筛选抑制血管形成的药物候选物的方法。药物候选物是具有成为有用药物的潜力的分子，其有待于进一步的生物学试验。
筛选药物候选物的方法的第一步是将一种分子与DARC接触。该分子可以是任何分子，包括上面描述的那些。
如上面讨论的，DARC对本领域技术人员是熟知的。在该筛选方法中有用的DARC可以在细胞上存在。含有DARC的细胞的实例包括内皮细胞和上皮细胞(如上面描述的那些)以及红细胞。
细胞可以例如在体外被固定。用于固定细胞的方法对于本领域的技术人员是熟知的。通常，细胞用含有福尔马林或多聚甲醛的溶液进行固定。也可使用包含DARC的细胞膜的制剂。
可替换地，DARC可以通过本领域熟知的方法在体外加以制备。一种这样的方法包括分离或合成编码DARC的DNA，以及通过可选地在重组载体，在适当的宿主细胞中表达该DNA来制备重组蛋白。用于制备DARC的其它方法包括从细胞分离DARC或合成DARC。合适的用于制备DARC的方法在下文描述。
可以通过任何本领域技术人员已知的方法使所述分子和DARC相互接触。通常地，将DARC或者所述分子固定在固体支持物上。
例如，可以将DARC固定在固体支持物上，如在柱子中的树脂上。通过将所述分子洗提通过包含固定在树脂上的DARC的柱子，DARC可以与所述分子结合。
可替换地，可以将所述分子固定在固体表面，例如在微滴定板的孔上。通过将DARC加入该孔并孵育该板，DARC可与所述分子接触。可以将许多不同的分子固定在板上，因而可以快速筛选所述分子。
筛选的下一步是确定所述分子是否结合于DARC。结合可以通过本领域已知的任何方法来确定。
例如，根据哪个被固定在固体支持物上，标记物可以结合到该分子或DARC上。通常，没有固定的组分是被标记的组分。因此，如果分子被固定，则DARC被标记。如果DARC被固定，则分子被标记。
在该分子和DARC接触后，例如通过检测标记物来检测分子和DARC的结合来指示所述分子是抑制血管形成的药物候选物。
用于筛选药物候选物的方法可选地包括确定该药物候选物是否抑制血管形成的进一步的步骤。任何本领域的技术人员知道的任何方法可以用来确定该药物候选物是否抑制血管形成。
例如，内皮细胞的体外培养物可以与该药物候选物一起孵育。然后通过任何本领域技术人员已知的任何方法来分析该培养物，以与没有该药物候选物的对照培养物相比，确定该药物候选物是否抑制内皮细胞的增生和迁移以及毛细血管的形成。
可替换地，可采用体内血管形成测定分析。这样的测定试验对于本领域的技术人员是熟知的。例如，可以将基质胶(matrigel)植入哺乳动物如大鼠中，接着给予药物候选物或对照化合物。孵育给定的时间期后，取出基质胶并测定化验以确定血管是否在被处理动物的基质胶内存在，并与对照进行比较。与对照动物的基质胶相比，在用药物候选物处理的动物的基质胶中存在更少量的血管或没有血管表明该药物候选物抑制血管形成。
如果至少约10％，优选至少约25％，更优选至少约50％，甚至更优选至少约75％，以及甚至更优选至少约90％的血管形成被抑制，则认为血管形成被抑制。最佳地，100％的血管形成被抑制。
分子的给予
依据本发明的方法给予的有效量的分子是有效用于其目的(例如，抑制肿瘤生长，抑制血管形成或促进肿瘤坏死)的任何量。这样的有效量是赋予有益效果(例如，抑制肿瘤生长，抑制血管形成或促进肿瘤坏死)的那些量。
分子的实际量会根据本领域熟知的多种因素(如使用的特定分子，施加模式，待治疗的特定受治者，肿瘤的大小，血管形成的程度等)而变化。分子的合适量可以在临床前和临床试验过程中被本领域的技术人员容易地确定。
给予哺乳动物的该分子的最小量是能够达到它的效果的最低量。给予哺乳动物的该分子的最大量是不引起不希望的有害作用的最高有效量。
如果分子引起如下的结合的显著减少，则认为该分子抑制血管形成趋化因子与DARC的结合。如果分子引起肿瘤生长或血管形成的显著减少，则认为该分子抑制肿瘤生长或抑制血管形成。例如，如果结合、肿瘤生长或血管形成是在没有该分子抑制的结合、肿瘤生长或坏死的至少约10％，优选至少约25％，更优选至少大约75％，以及最优选至少约90％，则认为所述结合、肿瘤生长或血管形成的减少是显著的。
在另一个具体实施方式中，如果肿瘤的大小被减少至少约10％，优选至少约25％，更优选至少约75％，以及最优选至少约90％，则认为该分子引起肿瘤坏死的显著促进。
任何哺乳动物可以依照本发明的方法进行治疗。哺乳动物包括例如人、狒狒和其它灵长类动物，以及宠物动物如狗和猫，实验动物如大鼠和小鼠，和饲养动物如马、羊和牛。
分子可通过本领域已知的任何方法给予。合适的给予方式的部分实例包括口服和全身给药。全身给药可以是肠内或肠胃外的。可以使用液体或固体(例如，片剂，胶囊)制剂。
分子的肠胃外给药包括例如静脉内、肌内和皮下注射。例如，分子可以通过如本领域所已知的持续释放给予哺乳动物。持续释放给药是一种药物递送方法，以在特定时间期内药物达到一定的水平。
其它给药途径包括口服、局部、支气管内或鼻内给药。对于口服给药，可以使用液体或固体剂型。适合口服给药的剂型的一些实例包括片剂、胶囊、丸剂、锭剂、酏剂、悬浮剂、糖浆和糯米纸囊剂。支气管内给药可以包括吸入器喷雾。对于鼻内给药，分子的给药可以通过喷雾器或液体雾来实现。
可将分子配制到合适的药用载体中。在本说明书中，药用载体被认为与本领域的从业人员理解的载体或赋形剂同义。载体的实例包括淀粉、乳、糖、某些类型的粘土、明胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸镁或钙、滑石粉、植物脂肪或油、树胶和甘醇。
可将分子配制到包含下列物质中的一种或多种的组合物中：稳定剂，表面活性剂，优选非离子表面活性剂以及可选的一种盐和/或缓冲剂。
稳定剂可以例如是氨基酸，例如甘氨酸；或寡糖，例如蔗糖、tetralose、乳糖或葡聚糖。可替换地，稳定剂可以是糖醇，例如甘露醇；或它们的组合。优选地，稳定剂或稳定剂的组合构成该分子重量的约0.1％到约10％的重量。
表面活性剂优选是非离子表面活性剂，如聚山梨醇酯。合适的表面活性剂的一些实例包括为约0.001％(w/v)到约10％(w/v)的吐温20、吐温80；聚氧乙烯聚氧丙二醇，如Pluronic F-68。
所述盐或缓冲剂可以是任何盐或缓冲剂，例如分别为氯化钠、或磷酸钠/磷酸钾。优选地，缓冲剂将该分子制剂的pH保持在约5.5到约7.5的范围内。盐和/或缓冲剂对于将渗透压保持在适合给予哺乳动物的水平也是有用的。优选地，所述盐或缓冲剂以大致的渗透压浓度在约150mM到约300mM范围存在。
可以将所述分子配制到可能另外包含一种或多种传统添加剂的组合物中。这样的添加剂的一些实例包括助溶剂例如甘油；抗氧化剂例如杀藻胺(季铵化合物的混合物，称为“quart”)、苯甲醇、氯惹酮或氯代丁醇；麻醉剂例如吗啡衍生物；或等张剂等，如上面描述的。作为进一步针对氧化或其它破坏的预防措施，该组合物可在氮气下被贮藏在用不可渗透塞子密封的小瓶中。
制备DARC的通用方法
编码DARC的核酸可以在体外进行合成。用于DARC的cDNA在例如Chaudhuri，et al.，PNAS 1993，90：10793-10797中披露了。用于合成DNA的合适方法描述在Caruthers et al.Science 1985，230：281-285和DNA Structure，Part A：Synthesis and Physical Analysis of DNA，Lilley，D.M.J.Dahlberg，J.E.(Eds.)，Methods Enzyrnol.， 211，Academic Press，Inc.New York(1992)中。
DARC DNA可以在合适的宿主细胞中被复制和表达。合适的宿主细胞包括原核宿主细胞和真核宿主细胞。合适的原核宿主细胞是大肠杆菌。合适的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
DARC可以通过蛋白质分离和纯化的标准方法从例如细胞膜碎片分离。一些合适的方法包括沉淀和液相/色谱方案例如高效液相色谱(HPLC)、离子交换、疏水相互作用层析、免疫沉淀、脂质提取、亲和层析和凝胶过滤等。参见，例如，Guide to Protein Purification，Deutscher，M.P.(Ed.)Methods Enzymol.， 182，Academic Press，Inc.，New York(1990)和Scopes，R.K.and Cantor，C.R.(Eds)，Protein Purification(3d)，springer-Verlag，NewYork(1994)
DARC也可以通过合成来制备，即从单个氨基酸制备，或半合成地制备，即从寡肽单元或寡肽单元和单个氨基酸的组合进行制备。用于合成蛋白质的合适方法由Stuart和Young在“Solid Phase Peptide Snthesis，”Second Edition，Piercechemical Company(1984)，Solid Phase Peptide Synthesis，Methods Enzymol.， 298，Academic Press，Inc.，New York(1997)中描述。
在重组DNA和蛋白质方法中反映本领域技术状态的许多标准熟知的克隆和表达以及分离/纯化技术被详细地描述在Sambrook & Russel，Molecular Cloning：A LaboratoryMamual，Third Edition，cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(2001)中。
                          实施例
实施例1：材料和方法
小鼠品系：达菲剔除(DKO)小鼠的构建先前已经被描述(Luo et al.，Genome Research 1997，7：932-941)。将杂种剔除小鼠[Dfy(+/-)]杂交以产生Dfy(+/+)和Dfy(-/-)纯种同属。用年龄和性别匹配的动物实施实验。C57BL/6J小鼠购自Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)。
肿瘤的形成：将路易斯肺癌(LLC)细胞在对数期进行生长，收获并并以1×107个细胞/ml悬浮在PBS中。将100μl的细胞悬浮液在每个动物(n＝5)背部正中线附近皮下注入。注射后14天，监测每组小鼠中的肿瘤生长和坏死。在处死小鼠后，对肿瘤大小用数字摄影记录并称重整个肿瘤生长。
组织化学：为了评价坏死和血管形成，将肿瘤固定在10％的磷酸盐缓冲福尔马林中。依据标准组织学过程，将肿瘤包埋在石腊中。为了组织学研究，将肿瘤(5μm厚)的横断面用苏木素(hematoxilin)和伊红染色。
肿瘤的抗体抑制：在LLC细胞注射后三天，将五组WT C57BL/6J小鼠(n＝5)腹膜内注射1ml的PBS、免疫前血清、抗-血型糖蛋白(Gyp)，抗-Kell或抗-Dfy血清(1∶1稀释)。允许肿瘤生长14天。小鼠被处安乐死并称重肿瘤。将平均重量绘图以比较。
实施例2：在达菲野生型和达菲剔除小鼠中的肿瘤生长
在Dfy(+/+)(野生型，WT)和Dfy(-/-)(达菲剔除，DKO)小鼠中的实体瘤通过注射路易斯肺癌(LLC)细胞来形成。在野生型和剔除小鼠中，肿瘤开始以相同速度生长。有趣的是，在剔除小鼠中的肿瘤开始出现坏死迹象比野生型小鼠更早。
14天后，小鼠被处死。取出肿瘤，称重和比较。结果表明与野生型小鼠相比，DARC剔除小鼠中的实体瘤生长更慢(通过大小和重量)(图1)。
剔除小鼠中的肿瘤经历严重的坏死(见图2a中的箭头)，而在野生型小鼠中的肿瘤没有观察到坏死(图2a)。与Dfy(+/+)小鼠(图2b)相比，达菲剔除小鼠中的肿瘤存在更多坏死和血管破裂。此外，免疫组织学研究表明，与Dfy(+/+)小鼠的肿瘤相比(见图2c中的箭头)，达菲剔除小鼠肿瘤中存在更少的微毛细血管形成。
为了确定针对达菲蛋白的抗体在减少肿瘤生长方面是否具有相似的作用，我们腹膜地注射针对该蛋白N-末端结构域制备的抗-达菲抗体。与注射PBS或免疫前血清的小鼠组相比，注射抗体的小鼠体内肿瘤生长更慢。
为了确定抗体作用不是非特异性的，我们给小鼠组注射了针对两种其它血型抗原如血型糖蛋白和Kell的抗体。有趣的是，针对其它血型抗原的抗体对于肿瘤生长没有任何作用(图3)。当野生型小鼠被注射抗-达菲抗体时，没有观察到增强的肿瘤坏死(数据未示出)。
结果证实DARC在肿瘤生长过程中的血管形成中起重要作用。

Claims (16)

1.一种用于筛选抑制血管形成的药物候选物的方法，所述方法包括：
(i)将一种分子与达菲抗原趋化因子受体进行接触；和
(ii)确定所述分子是否结合于所述达菲抗原趋化因子受体；
其中与所述达菲抗原趋化因子受体结合的分子是抑制血管形成的药物候选物。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括确定所述药物候选物是否抑制血管形成。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子是小分子。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子是生物分子。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述生物分子是聚氨基酸。
6.一种用于抑制需要其的哺乳动物中肿瘤生长的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物有效量的抑制血管形成趋化因子和达菲抗原趋化因子受体结合的分子。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述分子结合于达菲抗原趋化因子受体。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述分子是生物分子。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述生物分子是聚氨基酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述聚氨基酸是达菲抗原趋化因子受体的抗体。
11.根据权利要求6所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
12.根据权利要求6所述的方法，其中所述趋化因子是CXC趋化因子。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述CXC趋化因子是CXC/ELR+趋化因子。
14.根据权利要求6所述的方法，其中所述趋化因子是CC趋化因子。
15.一种用于抑制需要其的哺乳动物中血管形成的方法，所述方法包括给予哺乳动物有效量的抑制血管形成趋化因子和达菲抗原趋化因子受体结合的分子。
16.一种用于促进需要其的哺乳动物中肿瘤坏死的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物有效量的抑制血管形成趋化因子和达菲抗原趋化因子受体结合的分子。
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