CN101041814A - 一种磁性纳米细胞自动分选装置及其应用 - Google Patents

一种磁性纳米细胞自动分选装置及其应用 Download PDF

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本发明涉及一种磁性纳米细胞自动分选装置及其应用，该装置至少由磁性分选系统、样品传输系统和电脑控制系统组成，磁性分选系统至少包括磁分选溶液、分选柱和可移动磁场，所说的磁分选溶液含有壳聚糖包裹的γ－Fe2O3磁性纳米粒子。可用于从外周血或脐带血中分离出造血干细胞，并采用微型计算机和现代控制技术，对细胞分选和洗涤过程进行全程自动控制，可以批量、安全、高效，快速地对干细胞进行分离，得到的大量高纯度的造血干细胞，可作为细胞学研究、药物大通量筛选、体外培养和动物实验的细胞源。

Description

一种磁性纳米细胞自动分选装置及其应用
技术领域
本发明属生物医学技术领域，特别是涉及利用磁性纳米粒子进行细胞分选的装置。
背景技术
自20世纪80年代起，造血干细胞移植成为恶性肿瘤(如一些恶性血液病和非血液系统的实体瘤等)大剂量放疗、化疗后造血支持治疗的主要措施。有了造血干细胞移植的支持，临床医生就可以使用超大剂量的放疗、化疗，最大限度地消除患者体内的癌细胞，然后植入造血干细胞，重建被破坏的造血和免疫系统，提高了恶性肿瘤的治疗效果和病人的生存期。由于成人体内造血干细胞主要存在于骨髓中，因此最初最多采用骨髓来源的造血干细胞进行移植。后来动员的外周血成为造血干细胞移植的另一来源。与骨髓移植相比，外周血干细胞移植具有几个显著的有点，如采集方便、造血功能重建快、免疫功能恢复早、并发症轻等。1988年，第一例应用人类脐带血移植治疗凡科尼贫血症的成功开创了人类脐带血移植的先河。脐带血含有丰富的造血干细胞/祖细胞，并且其免疫细胞的抗原性较弱，移植相关的移植物抗宿主病(GVHD)相对骨髓和外周血发生较低、严重程度较弱，因此被认为是极具潜力的继骨髓和外周血后的第三种造血干细胞的来源。随着同胞间脐带血移植的发展，人们又把目光转移到非血缘脐带血移植上来。其前提是建立脐带血库。2005年6月4日青年报报导了上海市脐带血采集重新启动。脐带血造血干细胞是用来根治白血病的有效手段，据统计，我国白血病患者以每年十万分之四的速度增长，每年新发病的患者就达4万-5万人，其中少年儿童占50％。虽然造血干细胞捐献者资料库的入库人数已经达到了26万人，但还是远远满足不了白血病患者移植的需求。
进行造血干细胞移植前首先必须对干细胞进行分离纯化，其目的在于：在异体PBSCT中它可去除T细胞、减少和减轻GVHD发生、尤其是提高了供受者2-3个HLA位点不合间移植的安全性；在自体PBSCT中它可净化残留肿瘤细胞而减少移植后的复发；对难治性自身免疫性疾病可经干细胞纯化除去异常免疫细胞；同时经纯化后可以提高干细胞体外扩增及基因转导的效率等。最初分离富集造血干细胞的方法是依据造血干细胞具有细胞体积小，浮力密度低等物理学特性。采用包括速度离心沉淀，密度梯度离心以及后来的逆流离心淘洗等技术进行分离。七十年代中后期流式细胞分析及分选技术和单克隆抗体的出现和发展，使细胞分离技术出现了质的飞跃。应用单克隆抗体荧光染色与流式细胞分选相结合的荧光激活细胞分选技术极大地提高了细胞分离纯化的效率，使得高效快速分离纯化一些含量极少的细胞群成为可能。近年出现的免疫磁珠细胞分离技术，进一步简化了分离的程序并提高了分离效率。在此基础上，我们研发了一种利用磁性纳米粒子进行造血干细胞自动分选的装置，可以在密闭系统内无菌地分选大量细胞。其主要特性是自动、省时、安全、高效。可广泛应用于生物学、医学等多个领域。
发明内容
所要解决的技术问题
本发明所要解决的技术问题是提供一种磁性纳米细胞自动分选装置及其应用，以克服现有分选系统无法实现自动化和大量细胞的分选。
技术方案
本发明的技术方案之一是提供一种磁性纳米细胞自动分选装置，至少由磁性分选系统、样品传输系统和电脑控制系统组成，其特征在于，所说的磁性分选系统中至少包括磁分选溶液、分选柱和可移动磁场，所说的磁分选溶液含有壳聚糖包裹的γ-Fe2O3磁性纳米粒子。
上述的磁性纳米细胞自动分选装置的优选方案之一为，所说的可移动磁场强度为4000-6000高斯。
上述的磁性纳米细胞自动分选装置的优选方案之二为，所说的磁性纳米粒子-生物分子复合物粒径范围为50～200nm。
上述的磁性纳米细胞自动分选装置的优选方案之三为，所说的磁性纳米粒子-生物分子复合物为磁性纳米粒子表面连接CD34单克隆抗体所构成的复合物。
上述的磁性纳米细胞自动分选装置的优选方案之四为，所说的磁性纳米粒子-生物分子复合物为γ-Fe2O3磁性纳米粒子表面用壳聚糖包裹继而连接CD34单克隆抗体所构成的复合物。
上述的磁性纳米细胞自动分选装置的优选方案之五为，所说的磁性分选系统由永磁铁、分选单元和磁性纳米分离液组成，且所说的磁性纳米分离液中含有磁性纳米粒子-生物分子复合物。
上述的磁性纳米细胞自动分选装置的优选方案之六为，所说的分选单元至少由一个永久性磁铁和一个铁磁化的基材组成。
上述的磁性纳米细胞自动分选装置的优选方案之七为，所说的样品传输系统是由蠕动泵、阀门及管道组成的细胞悬液输送和洗涤系统。
上述的磁性纳米细胞自动分选装置的优选方案之八为，所说的电脑控制系统由主控模块控制电磁阀、蠕动泵和步进电机。
本发明的技术方案之二是提供一种利用上述装置进行磁性纳米细胞自动分选的方法。
本发明是通过如下方式实现的：
自动细胞纳米磁性分选装置由磁性分选系统、样品传送系统、电脑控制系统和外壳组成。
(1)磁性分选系统
磁性分选系统由永磁铁、分选单元和磁性纳米分离液组成。特别地，可以有如下部件和性质：
1)分选单元
磁性分选单元由一个特制、高效的永久性磁铁和一个铁磁化的基质组成。这种系统可产生强磁性，并且又可快速退磁，当分选单元移出磁场后，柱基质的快速退磁可使吸附有细胞的粒子得以解离。
2)磁性纳米分离液
可以由化学沉淀法合成具有超顺磁性的γ-Fe2O3磁性纳米粒子，用壳聚糖包裹磁性纳米粒子，形成核壳型超顺磁性磁性纳米粒子。该磁性纳米粒子具有生物相容性和生物降解功能。在核壳型磁性纳米粒子上连接生物大分子构建纳米粒子-生物分子复合物，以造血干细胞自动磁分选系统为例，生物大分子为CD34单克隆抗体，纳米粒子-生物分子复合物与合适的悬浮溶液配制成磁性纳米细胞分离液。利用免疫反应，对目的造血干细胞进行磁性标记，从而在磁场中将造血干细胞从细胞混合群体中分离出来。
(2)样品传输系统
样品传输部分是由蠕动泵、多个阀门及连接管道组成的血样悬液输送和分离洗涤系统。
以上述所说的造血干细胞自动磁分选系统为例，蠕动泵及电磁阀可以采用美国科尔帕默Cole-Parmer公司的产品，Cole-Parmer的Masterflex@系列蠕动泵已有50多年的生产历史，在美国、欧洲占有市场主导地位，目前在中国被广泛应用于科研、制药、监测、生物、环境保护、化学反应过程等广阔领域，全部符合国际IS9001、CE、UL标准。Masterflex变速数控蠕动泵，无刷免维护电极，双向运转，液晶显示转速可调，是针对于制药、血液、组织及细胞培养的Pharmed TC卫生泵，可抵抗臭氧及紫外线辐射，无细胞毒素及无溶血剂，管道可重复高压消毒不影响寿命。流速可调。
(3)电脑控制系统
电脑控制系统负责整个仪器的运作流程，根据该仪器用于医疗卫生领域的要求，所以需要根据产品设计的可靠性、稳定性、准确性和可操作性进行硬件选型及功能设计。具体而言，电脑控制系统由主控模块控制电磁阀、蠕动泵和步进电机。其模块结构见附图1所示。各模块功能如表1所示。
       表1电脑控制系统各模块功能
  模块名称   功能
  控制电脑   负责控制流程设计、数据统计分析
  主控模块   负责各控制模块的动作及时序
  电磁筏   负责各个节点管道开闭
  蠕动泵   负责控制管道中的液体流速
  步进电机   负责控制块状磁体的运动
(4)自动细胞纳米磁性分选装置还可以配置便于操作各项功能和带有调节样品流速、磁场强度和管道/样品清洗过程的仪器控制表盘的外壳。
有益效果
本发明设计开发的大量细胞自动分选仪采用微型计算机和现代控制技术，对分离过程和管道清洗进行全程自动控制，可以批量、安全、精确、快速地对干细胞进行分离，采用该分离系统后，可以使造血干细胞分离成本成倍地降低。用于临床后可为众多的肿瘤和免疫疾病的患者带来治疗和治愈的机会，用该分选系统分选后，在异体PBSCT中它可去除T细胞、减少和减轻GVHD发生、尤其是提高了供受者2-3个HLA位点不合间移植的安全性；在自体PBSCT中它可净化残留肿瘤细胞而减少移植后的复发；对难治性自身免疫性疾病可经干细胞纯化除去异常免疫细胞后行自体移植；还可提高干细胞体外扩增及基因转导的效率等。
用该分选系统分选后，由于采用的纳米粒子具有巨大的表面积，所以对目标细胞的结合速度和结合效率大大提高。分离采用的磁场强度为4000-6000高斯，使磁性纳米粒子的磁聚集效果更佳。实验证实，无论外周血还是骨髓有核细胞分离产物CD34+细胞的纯度和回收率皆分别在90％和60％以上，T细胞去除率在90％以上，分离产物CD34+细胞经体外培养证明有很强的增殖能力。磁性纳米粒子-生物分子复合物在分选后的细胞溶液中残留极低，特别是由于采用壳聚糖包裹在γ-Fe2O3磁性纳米粒子表面，所以具有生物相容性和生物降解功能，对分选细胞和移植受体安全无毒性。临床移植后所有移植物皆较快植活，且在未给预防GVHD的情况下移植也是安全的。利用大量细胞自动分选仪分离CD34+细胞，并进行体外扩增，在前期扩增造血干细胞的基础上中药蛋白质，加入以人骨髓基质细胞为基础的体外扩增体系中，研究骨髓基质层和中药蛋白质对造血干细胞的扩增数量的影响，并不断调整体系中的各种成分的比例，筛选出一种新的培养体系，扩增出能够满足临床移植要求的造血干细胞。
附图说明
图1为电脑控制系统各模块示意图。
图2是带有磁性纳米粒子的CD34+细胞SEM照片。借助SEM可以看到，分离后的CD34+细胞仍保持正常形态，而且同时我们还可以看到细胞表面连接的磁性纳米粒子。
图3是在显微镜下观察经过体外液体培养的CD34+细胞扩增图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如：操作手册，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
磁性纳米粒子的合成
FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O的混合溶液及NaOH溶液采用共沉淀法形成γ-Fe2O3纳米粒子，然后采用反向微乳液法使正硅酸乙酯水解的同时将壳聚糖包裹在γ-Fe2O3外面，以形成核壳型的磁性纳米粒子，并通过TEM和穆斯堡尔谱仪表征。
实施例2
磁性纳米粒子上连接抗CD34单克隆抗体
将一定量上述连接氨基的磁性纳米粒子分散在磷酸缓冲液(Phosphatebuffered saline，PBS，0.1M，pH7.4)中，加入一定量的戊二醛，反应4-5个小时后，将多余的戊二醛洗去，重新分散在PBS中，然后加入一定量的抗CD34单克隆抗体，反应1.5-2.5小时，再将多余的抗体用PBS充分洗去，同时收集残液(抗体与磁性纳米粒子反应后残余的液体)、两次的漂洗液(分别称为一洗、二洗)。
实施例3
分离出的CD34+细胞形态
图2是带有磁性纳米粒子的CD34+细胞SEM照片。借助SEM可以看到分离后的CD34+细胞仍保持正常形态，而且同时我们还可以看到细胞表面连接的磁性纳米粒子。从图中我们还可以看出磁性纳米粒子相对于细胞粒径很小，在复杂的生物体系中磁性纳米粒子虽有一定团聚现象存在，但不影响细胞的分离效果和对细胞的形态没有太大的影响。因此，采用磁性纳米粒子分离CD34+细胞，对细胞的形态几乎没有影响。
实施例4
分选装置的工作流程
将磁珠的粒径由微米级缩小至纳米级，制备出磁性纳米粒子用于细胞分离。其分离原理是在磁性纳米粒子表面修饰着能识别、结合细胞的生物分子。构成磁性纳米粒子-生物分子复合物。用该复合物去捕获目标细胞，再通过磁性纳米细胞自动分选装置中的可移动磁场将目标细胞吸附、洗脱分离出来。
实施例5
CD34+细胞的液体培养
2mL RPMI1640体系中含20％胎牛血清(FBS，Gibco)，干细胞因子(SCF)40ng/mL，粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)30ng/mL，白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-6(IL-6)、血小板生成素(TPO)各20ng/mL，促红细胞生成素(EPO)5U/mL，5％牛血清白蛋白(BSA)，细胞2×105/mL，将上述体系接种于培养瓶中。置37℃，5％CO2饱和湿度下培养一周，倒置显微镜下观察。经过液体培养的CD34+细胞，经过五天，在液体培养基中有核细胞总数可扩增20多倍，如图3。表明经过磁性纳米粒子分离的CD34+细胞保持高度增殖能力和自我更新能力。

Claims (10)

1.一种磁性纳米细胞自动分选装置，至少由磁性分选系统、样品传输系统和电脑控制系统组成，其特征在于，所说的磁性分选系统中至少包括磁分选溶液、分选柱和可移动磁场，所说的磁分选溶液含有壳聚糖包裹的γ-Fe2O3磁性纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的磁性纳米细胞自动分选装置，其特征在于，所说的可移动磁场强度为4000-6000高斯。
3.根据权利要求1所述的磁性纳米细胞自动分选装置，其特征在于，所说的磁分选溶液中的磁性纳米粒子-生物分子复合物粒径范围为50～200nm。
4.根据权利要求1所述的磁性纳米细胞自动分选装置，其特征在于，所说的磁性纳米粒子-生物分子复合物为磁性纳米粒子表面连接CD34单克隆抗体所构成的复合物。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的磁性纳米细胞自动分选装置，其特征在于，所说的磁性纳米粒子-生物分子复合物为γ-Fe2O3磁性纳米粒子表面用壳聚糖包裹继而连接CD34单克隆抗体所构成的复合物。
6.根据权利要求1所述的磁性纳米细胞自动分选装置，其特征在于，所说的磁性分选系统由永磁铁、分选单元和磁性纳米分离液组成，且所说的磁性纳米分离液中含有磁性纳米粒子-生物分子复合物。
7.根据权利要求6所述的磁性纳米细胞自动分选装置，其特征在于，所说的分选单元至少由一个永久性磁铁和一个铁磁化的基材组成。
8.根据权利要求1所述的磁性纳米细胞自动分选装置，其特征在于，所说的样品传输系统是由蠕动泵、阀门及管道组成的细胞悬液输送和洗涤系统。
9.根据权利要求1所述的磁性纳米细胞自动分选装置，其特征在于，所说的电脑控制系统由主控模块控制电磁阀、蠕动泵和步进电机。
10.一种利用权利要求1所述装置进行自动细胞分选的方法。
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