CN101028257A

CN101028257A - 盐酸替络欧及其化学类似物在制备抗肝纤维化药物中的应用

Info

Publication number: CN101028257A
Application number: CN 200710065094
Authority: CN
Inventors: 蔡国平; 赵学文; 张雅鸥
Original assignee: Shenzhen Graduate School Tsinghua University
Current assignee: Shenzhen Graduate School Tsinghua University
Priority date: 2007-04-03
Filing date: 2007-04-03
Publication date: 2007-09-05
Anticipated expiration: 2027-04-03
Also published as: CN100490792C

Abstract

本发明公开了盐酸替络欧及其化学类似物的一种新用途。该新用途，即盐酸替络欧及其化学类似物在制备抑制肝纤维化药物中的应用。本发明为防治抗肝纤维化提供了一条新途径，在医药学领域的应用前景广阔。

Description

盐酸替络欧及其化学类似物在制备抗肝纤维化药物中的应用

技术领域

本发明涉及盐酸替络欧及其化学类似物的一种新用途，特别是涉及它们在制备抗肝纤维化药物中的应用。

背景技术

肝纤维化是指肝脏纤维结缔组织的过度沉积，是纤维增生和纤维分解不平衡的结果。肝纤维化是多种慢性肝病发展至肝硬化的共同病理学基础，其主要表现为肝组织内细胞外基质的过度沉积，分布异常，近年认为是细胞外基质、特别是胶原合成的增加、降解减少。纤维增生是机体对于损伤的一种修复反应，各种病因所致反复或持续的慢性肝实质炎症、坏死可导致肝脏持续不断的纤维增生而形成肝纤维化，从许多慢性肝病，特别是慢性病毒性肝炎的临床及病理演变来看，肝纤维化和肝硬化是连续的发展过程，二者难以截然分开。一个人只要患有慢性肝病，必然伴有肝纤维化，如不及时治疗将持续发展，直到引起肝硬化乃至死亡。调查显示，肝硬化占据国际上疾病死亡病因的第六位。基于肝纤维化带来的危害之重，国际现代肝脏病学的奠基人汉斯·鲍勃曾指出：“谁能预防和治疗肝纤维化，谁就能治愈大多数慢性肝病。”在国际上，“肝纤维化”一直是不可解的世界性医学难题：20世纪80年代前，肝纤维化被公认为“不可逆转”；20世纪90年代起，病理学研究的进展提示肝纤维化“可逆转”，趋向恢复正常。

化学合成药2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴肟-9二盐酸盐(2.7-Bis[2-(biethylamino)ethoxy]fluorene-9-oxime Dihydrochloride)，分子式为C₂₅H₃₅N₃O₃.2HCl，分子量为498.49，商品名为盐酸替络欧，又称矽宁。中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所程玉海等完成国家科技攻关计划项目新药盐酸替络欧治疗矽肺临床试治研究，表明盐酸替络欧可以改善矽肺患者的临床症状，提高机体免疫力，增强肺通气功能，并延缓矽肺病变进展的疗效作用。并且，该药引起的临床不良反应不明显，临床应用安全，对小鼠、大鼠和狗的毒性实验以及Ames实验表明，盐酸替络欧毒性低，无诱发突变和染色体畸变的副作用。另外，宋志芳等也报道了盐酸替络欧试验性治疗矽肺的临床疗效(矽宁治疗矽肺的二年临床疗效观察，职业卫生与病伤1997，12(3)143-145)。

发明内容

本发明的目的是提供盐酸替络欧及其活性化学类似物的一种新用途。

本发明所提供的盐酸替络欧及其活性化学类似物的新用途，是它们在制备抗肝纤维化药物中的应用。

所述盐酸替络欧的活性化学类似物为2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴.二盐酸盐或2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9二盐酸盐。

所述抗肝纤维化药物是以盐酸替络欧和/或其活性化学类似物为有效成分制备得到。

所述抗肝纤维化药物的成人口服用量10-100mg有效成分(盐酸替络欧)/60kg体重/次，每天服一次，优选为50mg有效成分(盐酸替络欧)/60kg体重/次。所述2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二盐酸盐(作为抗肝纤维化药物的有效成分)的口服用量为10-100mg/60kg体重/次；所述2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二盐酸盐(作为抗肝纤维化药物的有效成分)的口服用量为10-100mg/60kg体重/次。所述2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二盐酸盐(作为抗肝纤维化药物的有效成分)和2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二盐酸盐(作为抗肝纤维化药物的有效成分)的口服用量均优选为50mg/60kg体重/次。

在制备所述抗肝纤维化药物的时候，还可以加入一种或多种药学上可接受的辅料(载体)，所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂、稳定剂等，必要时还可加入香味剂、甜味剂及色素等制成各种不同的剂型；

所述抗肝纤维化药物的剂型可为胶囊、片剂(含包糖衣片等)、散(粉)剂、粒剂、丸剂、冲剂、口服液、注射液、输液剂、喷雾剂、凝胶剂、混悬剂、缓释制剂和控释制剂等多种药物形式，总之，药学上可接受的剂型对本发明的药物都是适用的。上述各种剂型的药物均可按药学领域的常规方法制备。

通过细胞水平和实验动物的药效和毒性实验，表明以盐酸替络欧为有效成分的抗肝纤维化药物，可预防和治疗肝纤维化。通过肝纤维化实验动物模型实验的肝脏组织病理学观察和血清学检测的数据表明，该抗肝纤维化药物能显著改善小鼠实验性肝纤维化程度。细胞学实验显示，抗肝纤维化药物能显著抑制人肝脏星形细胞系LX-2细胞的增殖，并显著抑制与肝纤维化密切相关的基质金属蛋白酶-2(Matrixmetalloproteinases-2，MMP-2)与组织金属蛋白酶抑制因子-1(Tissue inhibitorof metalloproteinase-1，TIMP-1)mRNA的细胞表达。

盐酸替络欧及其活性化学类似物作为预防和治疗肝纤维化的药物的有效成分，具有以下优点：1)抑制和改善肝纤维化效果显著；2)毒性低、安全性高；3)用药方便；4)制备该药物的成本较低，从而可减轻病人的经济负担。盐酸替络欧及其活性化学类似物可能成为一种有很好前景的抗肝纤维化新药。

本发明的盐酸替络欧及其活性化学类似物的新用途为制备抗肝纤维化新药提供了一条新途径，在医药学领域的应用前景广阔。

附图说明

图1为肝脏组织形态学观察

图2为肝脏组织切片病理学观察

图3为各组肝脏组织MMP-2 and TIMP-1 mRNA表达的凝胶电泳图

图4为各组肝脏组织MMP-2 and TIMP-1蛋白表达的Western印迹图

图5为盐酸替络欧对LX-2细胞的增殖的抑制作用

图6为LX-2细胞MMP-2，TIMP-1 mRNA表达的RT-PCR结果

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、盐酸替络欧抗肝纤维作用的动物实验

以盐酸替络欧直接作为抗肝纤维药物(即有效成分的质量含量为100％)为例，进行如下动物实验，以鉴定该药物的药效和毒性。

盐酸替络欧：2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴肟-9·二盐酸盐(2.7-Bis[2-(biethylamino)ethoxy]fluorene-9-oxime Dihydrochloride)，分子式为C₂₅H₃₅N₃O₃.2HCl，分子量为498.49，商品名为盐酸替络欧。盐酸替络欧均由中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所药物合成实验室提供。将体重18-22g的雄性昆明小鼠96只，分为8组，每组12只，分别为正常对照组(不进行肝纤维化造模，也不用盐酸替络欧处理)，模型对照组(进行肝纤维化造模，不用盐酸替络欧处理)，高剂量处理正常组(不进行肝纤维化造模，用盐酸替络欧按14.6mg/kg的量灌胃处理)、中剂量处理正常组(不进行肝纤维化造模，用盐酸替络欧按7.3mg/kg的量灌胃处理)、低剂量处理正常组(不进行肝纤维化造模，用盐酸替络欧按3.65mg/kg的量灌胃处理)、高剂量处理模型组(进行肝纤维化造模，用盐酸替络欧按14.6mg/kg的量灌胃处理)、中剂量处理模型组(进行肝纤维化造模，用盐酸替络欧按7.3mg/kg的量灌胃处理)、低剂量处理模型组(进行肝纤维化造模，用盐酸替络欧按3.65mg/kg的量灌胃处理)。

其中，肝纤维化实验动物模型的造模方法为：将小鼠，按0.05ml/10g(每只注射0.1-0.2ml)体重，皮下注射30％四氯化碳花生油溶液，每四天注射一次。共注射8周得到肝纤维化动物模型。造模过程中，每次注射四氯化碳后可见动物活动增多，攀越舔毛。注射四氯化碳次日，动物活动均减少，毛蓬松，三天后逐渐恢复常态，注射四氯化碳后24小时以内，食量和饮水量明显减少，48小时后增加。注射四氯化碳后24小时，动物体重下降，48-96小时回升。

盐酸替络欧灌胃处理小鼠的方法为：肝纤维化造模2周后，将上述8组小鼠，除了正常对照组和模型对照组，其它6组，均进行灌胃盐酸替络欧处理，按照1/40，1/80，1/160 LD50设置三个药物浓度组：14.6mg/kg(高剂量处理正常组和高剂量处理模型组的灌胃剂量)，7.3mg/kg(中剂量处理正常组和中剂量处理模型组的灌胃剂量)，3.65mg/kg(低剂量处理正常组和低剂量处理模型组的灌胃剂量)，按照10ml/kg灌胃给药(盐酸替络欧用生理盐水溶解)，每天灌药一次，持续灌胃六周，正常对照组，纤维化模型对照组分别灌胃相同体积的生理盐水。于第8周处死动物，进行如下检测。

1)盐酸替络欧处理对肝脏组织纤维化抑制作用的病理学观察：

取步骤1所述各处理组处死的小鼠的肝组织取出，分别用质量百分浓度为4％多聚甲醛固定，然后用石蜡包埋，切片，分别采用HE染色或VG染色。然后在光学显微镜(尼康，日本)400(40×10)倍下观察照相。将纤维组织增生程度分为5个等级，0级：无纤维化，肝细胞正常，肝细胞索排列正常；1级：纤维结缔组织局限于汇管区或汇管区扩大，胶原纤维有轻度延伸，肝索排列较乱；2级：胶原纤维从汇管区或中央静脉周围向外延伸较明显，但未互相包绕整个肝小叶；3级：胶原纤维延伸明显，但未互相包绕整个肝小叶，肝细胞脂肪样变；4级：胶原纤维延伸明显，互相连接，包绕肝小叶，有假小叶形成，肝正常结构破坏，假小叶形成，以大方形假小叶为主，肝内广泛纤维组织增生。

各组肝脏外观变化部分结果如图1所示，组织病理学变化见图2，并根据上述纤维组织增生程度分级标准，进行评级，它们的纤维化程度见表1。实验结果表明，正常对照组和高剂量、中剂量、低剂量处理正常组肝脏外观光滑鲜润，组织学上，肝细胞正常，肝细胞索排列正常，均未出现纤维样变化和异常的病理变化。模型对照组，均显示明显的肝纤维化病变，胶原纤维延伸明显，部分或完全包绕整个肝小叶，肝细胞脂肪样变，纤维组织增生程度为3级或4级。而高剂量、中剂量、低剂量处理模型组随着用药剂量的升高，病情均有所好转，病变纤维化程度逐渐减轻至二级。

表1 各组动物肝脏不同纤维化程度的动物数(只)

分组(每组12只)	0级	1级	2级	3级	4级
分组(每组12只)	0级	1级	2级	3级	4级	正常对照组	12	0	0	0	0
模型对照组	0	0	0	4	8	正常对照组	12	0	0	0	0
模型对照组	0	0	0	4	8	低剂量处理模型组	0	0	0	3	9
中剂量处理模型组	0	0	2	6	4	低剂量处理模型组	0	0	0	3	9
中剂量处理模型组	0	0	2	6	4	高剂量处理模型组	0	0	6	3	3

2)盐酸替络欧处理对肝脏组织纤维化小鼠的血清学指标影响的检测：

取步骤1所述的各处理组处死后的小鼠，眼眶取血，分别采用赖氏法测定谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、γ-谷氨酰转移酶(γ-GT)等肝功能指标，采用竞争性放免分析法测定与肝纤维化密切相关的透明质酸(HA)和IV胶原(C_IV)。

各组动物的血清学指标数据结果如表2所示，结果表明，模型对照组的上述各项肝功能指标和HA与C_IV均显著高于正常组，模型对照组显示了典型的肝纤维化引起的血清学改变。低、中、高剂量盐酸替络欧处理的正常对照组的上述各项指标与正常对照组比较，没有明显的差异。在上述各个血清学指标数据方面，各剂量盐酸替络欧处理模型组明确地显示剂量-效应的相关性，低剂量处理模型组的各项指标没有显著改善，中高剂量处理模型组的各项指标均显著低于模型组，尤其高剂量处理模型组降低更大，反映中高剂量盐酸替络欧处理可以较明显改善肝纤维化实验模型小鼠的肝纤维化程度。

表2 各组动物的血清学指标数据

分组	HA(ng/ml)	C_IV(ng/ml)	ALT(U/L)	AST(U/L)	γ-GT(U/L)	MDAμmol/g蛋白
分组	HA(ng/ml)	C_IV(ng/ml)	ALT(U/L)	AST(U/L)	γ-GT(U/L)	MDAμmol/g蛋白	正常对照组	77.33±26.96	86.49±35.47	62.59±29.77	105.67±29.51	35.12±15.78	1.12±0.5
模型对照组^c	230.39±62.27	255.98±58.45	279.34±53.66	219.13±48.27	89.45±38.05	6.23±0.4	正常对照组	77.33±26.96	86.49±35.47	62.59±29.77	105.67±29.51	35.12±15.78	1.12±0.5
模型对照组^c	230.39±62.27	255.98±58.45	279.34±53.66	219.13±48.27	89.45±38.05	6.23±0.4	低剂量处理模型组	254.48±43.77	242.09±34.01	259.23±38.91	225.61±37.54	83.03±24.46	5.88±0.8
中剂量处理模型组^f	203.91±46.15	195.44±38.68	188.37±40.28	200.74±27.41	66.21±15.89	3.42±0.7	低剂量处理模型组	254.48±43.77	242.09±34.01	259.23±38.91	225.61±37.54	83.03±24.46	5.88±0.8
中剂量处理模型组^f	203.91±46.15	195.44±38.68	188.37±40.28	200.74±27.41	66.21±15.89	3.42±0.7	高剂量处理模型组^f	146.86±25.67	167.71±34.99	153.73±35.45	133.34±23.97	38.25±10.78	2.49±0.8

注：^c：P＜0.01，相较于正常对照组；^f：P＜0.01，相较于模型对照组。

3)盐酸替络欧处理对肝脏组织纤维化小鼠的肝脏组织MMP-2(基质金属蛋白酶-2)和TIMP-1(金属蛋白酶组织抑制因子-1)mRNA的表达量的影响检测

半定量逆转录PCR(半定量RT-PCR，Semi-quantitative reverse transcriptasepolymerase chain reaction)实验：提取各处理组小鼠肝脏组织总RNA，以MMP-2、TIMP-1和β-actin(内参照)各自的引物(用于扩增的引物，MMP-2为5’-GATGTCGCCCCTAAAACAAGA-3’和5’-GCCCAAAGAACTTCTGCATCA-3’；TIMP-1为5’-CTGGCATCCTCTTGTTGCTA-3’和5’-AGGGATCTCCAGGTGCACAA-3’.β-actin为5’-TTCGTGGAT GCCACAGGACT-3’和5’-TCACCAACTGGGACGACATG-3’)，进行半定量RT-PCR，对各组肝脏组织MMP-2 and TIMP-1mRNA的表达予以测试。半定量RT-PCR实验采用按照TOYOBO公司pervertra Ace-alpha反转录试剂盒，并按照该试剂盒说明书的程序进行。部分结果如图3所示，结果表明，模型对照组肝脏组织MMP-2和TIMP-1mRNA的表达明显高于正常对照组，而高剂量(14.65mg/kg盐酸替络欧)处理模型组肝脏组织MMP-2和TIMP-1mRNA的表达显著低于肝纤维化模型对照组，结果表明盐酸替络欧能够降低肝纤维化密切相关的MMP-2给我TIMP-1mRNA的表达。其中，图3中a为正常对照组，b为模型对照组，c为高剂量处理模型组。β-actin(β-肌动蛋白)mRNA的表达为参照。

Western印迹实验：按照以抗MMP-2抗体探针的Western印迹实验，对各组肝脏组织提取液中，未活化(静息型)的MMP-2和活化的MMP-2的含量予以测试。所采用的兔抗小鼠MMP-2抗体和兔抗小鼠β-actin抗体的第一抗体和HRP标记的羊抗兔IgG二抗探针购自美国Calbiochem and Sigma公司。

部分Western印迹图如图4所示，结果表明，模型对照组肝脏组织未活化(静息型)的MMP-2含量明显高于正常对照组，并且有活化的MMP-2产生，而14.6mg/kg盐酸替络欧药物处理组肝脏组织未活化(静息型)的MMP-2和活化的MMP-2的含量均显著低于肝纤维化模型对照组，表明，盐酸替络欧能够抑制与肝纤维化密切相关的MMP-2尤其活化的MMP-2的产生。其中，图4中a为正常对照组，b为模型对照组，c为高剂量处理模型组。β-actin mRNA的表达为参照。

实施例2、盐酸替络欧抗肝纤维化的细胞学实验

1、盐酸替络欧对细胞增殖的影响实验

采用经典的四唑盐(MTT)比色法(Mosmann T，Rapid colorimetric assay forcellular growth and survival：application to proliferation and cytotoxicityassays.J.Immunol.Meth.，1983(65)：55-63)测定培养的人肝脏星形细胞系LX-2细胞的生长与增殖。人肝脏星形细胞系LX-2细胞接种于96孔板内，加盐酸替络欧处理前12h小时换为无血清DMEM培养基培养，然后加入0.016、0.08、0.4、2μmol/L盐酸替络欧处理，48h后，每孔加入5mg/L MTT(购自上海生工院)20μl继续培养4h，弃去孔内培养液，每孔加入150μl DMSO，轻微振荡10min，紫外分光光度计490nm检测OD值，显示细胞的生长与增殖。

结果如图5所示，结果表明，盐酸替络欧能够剂量依赖性地抑制人肝脏星形细胞系LX-2细胞的增殖。同时平行设立其它三株非肝脏来源的细胞系(293T，3T3-L1，COS-7细胞系)为对照，按照上述培养方法，用盐酸替络欧处理293T，3T3-L1，COS-7细胞系，结构表明盐酸替络欧对这三株细胞的增殖的抑制作用效果显著弱于对肝细胞来源的LX-2细胞的作用，表明盐酸替络欧对细胞作用有细胞特异性，对人肝脏星形细胞系细胞增殖的抑制作用明显。

2、盐酸替络欧对LX-2细胞MMP-2和TIMP-1表达量的影响实验

按步骤1)所述方法培养人肝脏星形细胞系LX-2细胞培养3天后，将培养的人肝脏星形细胞系LX-2细胞分组后，分别加入0μmol/L(对照组)、0.08μmol/L(0.08μmol/L药物处理组)、0.4μmol/L(0.4μmol/L药物处理组)或2.0μmol/L(2.0μmol/L药物处理组)的盐酸替络欧，继续孵育48h后过夜，提取各组细胞上清液的总RNA，按照实施例1中步骤3)的方法，以上述MMP-2、TIMP-1和β-actin各自的引物进行半定量逆转录PCR(RT-PCR)，对各个加入盐酸替络欧处理组和未加入盐酸替络欧处理的对照组的人肝脏星形细胞系LX-2细胞MMP-2和TIMP-1mRNA的表达予以测试。RT-PCR实验中，提取细胞总RNA，调整所有样品RNA浓度至同一水平，每样本中取出1μg，按照TOYOBO公司pervertra Ace-alpha反转录试剂盒说明书进行反转录，以反转录获得的cDNA为模版PCR扩增MMP-2与TIMP-1片段，所用引物为：MMP-2：上游5’-CACTTTCCTGGGCAACAAAT-3’，下游5’-TGATGTCATCCTGGGACAG A-3’；TIMP-1：上游：5’-TGCGGATACTTCCACAGGTCC-3’下游：5’-TCAGGCTATCTGGGACCGCA-3’；β-actin：上游5’-TTCGTGGA TGCCACAGACT-3’下游5’-TCACC AACTGGG ACGACATG-3’。

结果如图6所示，结果表明加入盐酸替络欧处理过LX-2细胞的MMP-2和TIMP-1mRNA的表达明显低于未加入盐酸替络欧处理组，并呈现剂量依赖关系，表明，盐酸替络欧能够抑制LX-2细胞表达与肝纤维化密切相关的MMP-2和TIMP-1 mRNA。其中，图6中，1为对照组；2为0.08μmol/L药物处理组；3为0.4μmol/L药物处理组；4为2.0μmol/L药物处理组。

实施例3、盐酸替络欧化学类似物2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二盐酸盐(C₂₅H₃₄N₂O₃.2HCl)抗肝纤维化作用的动物实验

以2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二盐酸盐(C₂₅H₃₄N₂O₃.2HCl)直接作为抗肝纤维药物(即有效成分的质量含量为100％)为例，进行如下动物实验，以鉴定该药物的药效和毒性。

2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二盐酸盐(C₂₅H₃₄N₂O₃.2HCl)由中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所药物合成实验室提供。将体重18-22g的雄性昆明小鼠96只，分为8组，每组12只，分别为正常对照组(不进行肝纤维化造模，也不用2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二盐酸盐处理)，模型对照组(进行肝纤维化造模，不用2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二盐酸盐处理)，高剂量处理正常组(不进行肝纤维化造模，用2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二盐酸盐按14.6mg/kg的量灌胃处理)、中剂量处理正常组(不进行肝纤维化造模，用2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二盐酸盐按7.3mg/kg的量灌胃处理)、低剂量处理正常组(不进行肝纤维化造模，用2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二盐酸盐按3.65mg/kg的量灌胃处理)、高剂量处理模型组(进行肝纤维化造模，用2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二盐酸盐按14.6mg/kg的量灌胃处理)、中剂量处理模型组(进行肝纤维化造模，用2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二盐酸盐按7.3mg/kg的量灌胃处理)、低剂量处理模型组(进行肝纤维化造模，用2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二盐酸盐按3.65mg/kg的量灌胃处理)。

2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二盐酸盐灌胃处理小鼠的方法为：肝纤维化造模2周后，将上述8组小鼠，除了正常对照组和模型对照组，其它6组，均进行灌胃2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二盐酸盐处理，按照1/40，1/80，1/160LD50设置三个药物浓度组14.6mg/kg(高剂量处理正常组和高剂量处理模型组的灌胃剂量)，7.3mg/kg(中剂量处理正常组和中剂量处理模型组的灌胃剂量)，3.65mg/kg(低剂量处理正常组和低剂量处理模型组的灌胃剂量)，按照10ml/kg灌胃给药(2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二盐酸盐用生理盐水溶解)，每天灌药一次，持续灌胃六周，正常对照组，纤维化模型对照组分别灌胃相同体积的生理盐水。于第8周处死动物，进行如下检测。

2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二盐酸盐处理对肝脏组织纤维化抑制作用的病理学观察：

取上述各处理组处死的小鼠的肝组织取出，分别用质量百分浓度为4％多聚甲醛固定，然后用石蜡包埋，切片，分别采用HE染色或VG染色。然后在光学显微镜(尼康，日本)400(40×10)倍下观察照相。将纤维组织增生程度分为5个等级，0级：无纤维化，肝细胞正常，肝细胞索排列正常；1级：纤维结缔组织局限于汇管区或汇管区扩大，胶原纤维有轻度延伸，肝索排列较乱；2级：胶原纤维从汇管区或中央静脉周围向外延伸较明显，但未互相包绕整个肝小叶；3级：胶原纤维延伸明显，但未互相包绕整个肝小叶，肝细胞脂肪样变；4级：胶原纤维延伸明显，互相连接，包绕肝小叶，有假小叶形成，肝正常结构破坏，假小叶形成，以大方形假小叶为主，肝内广泛纤维组织增生。

根据上述纤维组织增生程度分级标准，进行评级，它们的纤维化程度见表3。实验结果表明，正常对照组和高剂量、中剂量、低剂量处理正常组肝脏外观光滑鲜润，组织学上，肝细胞正常，肝细胞索排列正常，均未出现纤维样变化和异常的病理变化。模型对照组，均显示明显的肝纤维化病变，胶原纤维延伸明显，部分或完全包绕整个肝小叶，肝细胞脂肪样变，纤维组织增生程度为3级或4级。而高剂量、中剂量、低剂量处理模型组随着用药剂量的升高，病情均有所好转，病变纤维化程度逐渐减轻至二级。

表3.各组动物肝脏不同纤维化程度的动物数(只)

分组(每组12只)	0级	1级	2级	3级	4级
分组(每组12只)	0级	1级	2级	3级	4级	正常对照组	12	0	0	0	0
模型对照组	0	0	0	4	8	正常对照组	12	0	0	0	0
模型对照组	0	0	0	4	8	低剂量处理模型组	0	0	0	3	9
中剂量处理模型组	0	0	2	4	6	低剂量处理模型组	0	0	0	3	9
中剂量处理模型组	0	0	2	4	6	高剂量处理模型组	0	0	4	5	3

实施例4、盐酸替络欧化学类似物2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二盐酸盐(C₂₅H₃₄N₂O₃.2HCl)抗肝纤维化作用的动物实验

以2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二盐酸盐(C₂₅H₃₄N₂O₃.2HCl)直接作为抗肝纤维药物(即有效成分的质量含量为100％)为例，进行如下动物实验，以鉴定该药物的药效和毒性。

2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二盐酸盐(C₂₅H₃₄N₂O₃.2HCl)也由中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所药物合成实验室提供。将体重18-22g的雄性昆明小鼠96只，分为8组，每组12只，分别为正常对照组(不进行肝纤维化造模，也不用2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二盐酸盐处理)，模型对照组(进行肝纤维化造模，不用2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二盐酸盐处理)，高剂量处理正常组(不进行肝纤维化造模，用2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二盐酸盐按14.6mg/kg的量灌胃处理)、中剂量处理正常组(不进行肝纤维化造模，用2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二盐酸盐按7.3mg/kg的量灌胃处理)、低剂量处理正常组(不进行肝纤维化造模，用2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二盐酸盐按3.65mg/kg的量灌胃处理)、高剂量处理模型组(进行肝纤维化造模，用2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二盐酸盐按14.6mg/kg的量灌胃处理)、中剂量处理模型组(进行肝纤维化造模，用2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二盐酸盐按7.3mg/kg的量灌胃处理)、低剂量处理模型组(进行肝纤维化造模，用2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二盐酸盐按3.65mg/kg的量灌胃处理)。

2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二盐酸盐灌胃处理小鼠的方法为：肝纤维化造模2周后，将上述8组小鼠，除了正常对照组和模型对照组，其它6组，均进行灌胃2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二盐酸盐处理，按照1/40，1/80，1/160 LD50设置三个药物浓度组14.6mg/kg(高剂量处理正常组和高剂量处理模型组的灌胃剂量)，7.3mg/kg(中剂量处理正常组和中剂量处理模型组的灌胃剂量)，3.65mg/kg(低剂量处理正常组和低剂量处理模型组的灌胃剂量)，按照10ml/kg灌胃给药(2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二盐酸盐用生理盐水溶解)，每天灌药一次，持续灌胃六周，正常对照组，纤维化模型对照组分别灌胃相同体积的生理盐水。于第8周处死动物，进行如下检测。

2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二盐酸盐处理对肝脏组织纤维化抑制作用的病理学观察：

根据上述纤维组织增生程度分级标准，进行评级，它们的纤维化程度见表4。实验结果表明，正常对照组和高剂量、中剂量、低剂量处理正常组肝脏外观光滑鲜润，组织学上，肝细胞正常，肝细胞索排列正常，均未出现纤维样变化和异常的病理变化。模型对照组，均显示明显的肝纤维化病变，胶原纤维延伸明显，部分或完全包绕整个肝小叶，肝细胞脂肪样变，纤维组织增生程度为3级或4级。而高剂量、中剂量、低剂量处理模型组随着用药剂量的升高，病情均有所好转，病变纤维化程度逐渐减轻至二级。

表4.各组动物肝脏不同纤维化程度的动物数(只)

分组(每组12只)	0级	1级	2级	3级	4级
分组(每组12只)	0级	1级	2级	3级	4级	正常对照组	12	0	0	0	0
模型对照组	0	0	0	4	8	正常对照组	12	0	0	0	0
模型对照组	0	0	0	4	8	低剂量处理模型组	0	0	0	3	9
中剂量处理模型组	0	0	2	5	5	低剂量处理模型组	0	0	0	3	9
中剂量处理模型组	0	0	2	5	5	高剂量处理模型组	0	0	5	4	3

Claims

1、盐酸替络欧及其活性化学类似物在制备抑制肝纤维化药物中的应用。

2、根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抑制肝纤维化药物是以盐酸替络欧和/或其活性化学类似物为有效成分制备的药物。

3、根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述盐酸替络欧的活性化学类似物为2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二盐酸盐。

4、根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述盐酸替络欧的活性化学类似物为2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二盐酸盐。

5、根据权利要求1-4中任意一项所述的应用，其特征在于：所述药物中还含有药学上可接受的载体。

6、根据权利要求5中任意一项所述的应用，其特征在于：所述药物的剂型为药学上可接受的任一一种剂型。

7、根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述药物的剂型为口服制剂。

8、根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述盐酸替络欧作为有效成分的药物的口服用量为10-100mg盐酸替络欧/60kg体重/次；所述2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二盐酸盐作为有效成分的药物的口服用量为10-100mg有效成分/60kg体重/次；所述2.7-双[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二盐酸盐作为有效成分的药物的口服用量为10-100mg有效成分/60kg体重/次。