CN101024856B

CN101024856B - 一种小分子微阵列的制备方法

Info

Publication number: CN101024856B
Application number: CN 200710036978
Authority: CN
Inventors: 叶邦策; 左鹏
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2007-01-30
Filing date: 2007-01-30
Publication date: 2012-12-26
Anticipated expiration: 2027-01-30
Also published as: CN101024856A

Abstract

本发明涉及生物芯片技术领域。本发明提供了一种新型的小分子微阵列制备方法。该方法先在固相载体上合成一段寡核苷酸序列，并在其末端用特定的化学活性基团修饰，再将该基团与小分子化合物偶联，此后将小分子化合物与寡核苷酸的偶联物与固相载体分离并纯化小分子化合物与寡核苷酸的偶联物，点样于芯片表面，通过紫外光照射使偶联物固定在芯片表面形成小分子微阵列。本发明将传统的基因芯片的制备过程中的紫外(UV)交联固定方法应用于小分子探针的固定，简化了小分子微阵列载体修饰和探针固定步骤，且该方法简便易行，固定时间短，能有效地改善小分子微阵列的制备。

Description

一种小分子微阵列的制备方法

技术领域

本发明涉及生物芯片技术领域，具体涉及小分子微阵列(SMM)的制备方法。

背景技术

近年来，生物芯片技术取得了飞速的发展。生物芯片研究也从原来的单一的基因芯片研究逐渐发展到蛋白芯片、小分子芯片、组织芯片、细胞芯片等多种生物芯片的研究。小分子芯片也叫小分子微阵列，自1999年首次提出以来，近几年得到了快速的发展，与基因芯片等不一样之处在于其固定在芯片表面的探针分子为小分子化合物。目前小分子微阵列的研究主要有两个方向，一是基于小分子微阵列载体表面化学修饰及小分子化合物固定为主的基础性研究，二是拓展小分子微阵列的实际应用。近些年来，小分子微阵列已经成功的应用于各种蛋白质小分子配体的筛选、酶的抑制剂筛选、药物筛选、酶活性图谱研究、小分子与小分子反应以及小分子与大分子反应研究、残留物检测及组合化学等领域。

小分子化合物的固定是小分子微阵列制备过程中最重要的步骤，因而一直是小分子微阵列研究的重点，目前主要有共价交联、光催化合成、原位合成、涂层法等方法应用于小分子化合物的固定，但固定时间长、操作步骤复杂、成本高等因素影响着小分子微阵列的广泛应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种新颖的小分子微阵列的制备方法。

本发明根据DNA分子中的脱氧核糖核苷酸残基在紫外光照射下与玻片表面活性分子进行共价交联的原理，开创性地提出将小分子化合物与寡核苷酸链偶联后，采用寡核苷酸链为偶联臂，利用脱氧核糖核苷酸残基在紫外光照射下与玻片表面活性分子进行共价交联的特性使得小分子化合物固定在芯片载体上的方案。

本发明所说的小分子微阵列的制备方法，包括下列步骤：

(1)将寡核苷酸链与小分子化合物偶联，获得小分子化合物的寡核苷酸偶联物；

(2)将步骤(1)获得的寡核苷酸偶联物通过紫外光照射固定在芯片载体上。

优选的，上述步骤(1)包括下列步骤：

a.在固相载体上合成一段寡核苷酸序列，另一端用特定的化学活性基团修饰；

b.在固相载体上，寡核苷酸链通过末端修饰的化学活性基团偶联小分子化合物，获得小分子化合物的寡核苷酸偶联物；

c.将寡核苷酸偶联物与固相载体分离并纯化。

上述步骤b也可以是在带有化学活性基团寡核苷酸链的固相载体上原位固相合成小分子化合物获得小分子化合物的寡核苷酸偶联物。在本发明的一个优选的实施例中，在带有化学活性基团寡核苷酸链的固相载体上原位固相合成寡糖小分子，从而获得寡糖小分子的寡核苷酸偶联物。

优选的，上述步骤(2)所述的紫外光照射固定方法为UV交联法，UV波长为254nm。

本发明中，固相载体可以是玻璃、金属、硅、陶瓷、可控多孔玻璃微珠(CPG)等材料中的一种，其形状可以为球形、方形及其他不规则形状等，本发明的优选方案中，固相载体为DNA合成用可控多孔玻璃微珠(CPG)。

所说的可控多孔玻璃微珠可采用市售产品，如美国Millipore公司的产品；

本发明中，特定化学活性基团选自氨基、羧基或巯基等活性基团，一种有代表性的为氨基。

在本发明公开的优选的方案中，上述步骤a中，寡核苷酸链5’末端连有可控多孔玻璃珠，3’末端用氨基修饰。

本发明中，将寡核苷酸偶联物与固相载体分离的方法采用浓氨水氨解将寡核苷酸偶联物与固相载体分离。

所说的小分子化合物为带有活性基团或经过修饰、具有化学活性的天然或人工合成的小分子化合物，所说的活性基团包括羧基、氨基、巯基或叠氮基等其它活性化学基团，在本发明的优选方案中，小分子化合物表面带有羧基、氨基或经化学方法修饰羧基、氨基等活性基团，优选的小分子化合物选自琥珀酸氯毒素、葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、岩藻糖中的一种或两种以上。

本发明中，寡核苷酸链和小分子化合物通过化学合成方法偶联，一种有代表性的为利用碳二亚胺法将氨基修饰寡核苷酸链与表面带有羧基的小分子化合物进行偶联。

所说的碳二亚胺法为一种现有技术，如Hermanson，GT.(1996).Bioconjugate Techniques，Academic Press.文献报道的方法；

在本发明中选择特定化学活性基团修饰寡核苷酸链时应遵循下列原则：对表面带有或经过修饰表面带有活性基团的小分子化合物，根据所选择的小分子化合物表面的活性基团，选择相应可与之发生偶联反应的化学活性基团修饰寡核苷酸链，如对表面带有羧基的小分子化合物，对应选择氨基的活性基团修饰寡核苷酸链。所说的寡核苷酸合成及末端修饰是现在普遍采用的DNA固相合成技术——固相亚磷酸酰胺法(熊克勇，DNA的化学合成，生物学通报，1990，10，12-14.)。

在本发明的优选方案中，寡核苷酸链5’末端与可控多孔玻璃珠相连，寡核苷酸链3’末端用氨基修饰；小分子化合物表面带有羧基；将氨基修饰的寡核苷酸链与表面带有羧基的小分子化合物利用碳二亚胺法进行偶联获得小分子化合物的寡核苷酸偶联物。

所说的寡核苷酸链是指单链DNA或RNA的短序列，长度为10-50个碱基，优选30-40，最佳为30个。组成寡核苷酸链的碱基可随机选择排列或按特定需求设计。

有益效果：本发明提供的小分子微阵列的制备方法，简化了小分子微阵列载体修饰和探针固定步骤，且该方法简便易行，固定时间短，检测灵敏度高，能有效地改进小分子微阵列的制备。采用该方法制备的小分子微阵列可用于各种蛋白质小分子配体的筛选、酶的抑制剂筛选、药物筛选、酶活性图谱研究、小分子与小分子反应以及小分子与大分子反应研究、残留物检测及组合化学等领域的研究。

附图说明

图1是带有固相载体和末端氨基修饰的寡核苷酸链示意图；

A：可控多孔玻璃微珠(CPG)

B：长度为30个碱基T的寡核苷酸链

C：氨基

图2是带有羧基的小分子化合物示意图；

图3是小分子化合物与寡核苷酸偶联物示意图；

图4是琥珀酸氯毒素结构式；

图5是琥珀酸氯毒素寡核苷酸偶联物的碳二亚胺法合成路线示意图；

图6是琥珀酸氯毒素寡核苷酸偶联物结构式示意图；

图7是利用本发明提供的方法制备的琥珀酸氯毒素微阵列经荧光免疫试验后荧光扫描结果图。

图8带CPG的寡核苷酸链3’末端氨基与丁二酸酐反应示意图

图9寡糖分子库合成示意图

A为葡萄糖，B为甘露糖，C为半乳糖，D为N-乙酰半乳糖胺，E为N-乙酰葡糖胺，F为岩藻糖，G为神经氨酸

图10寡糖库小分子微阵列荧光免疫试验荧光扫描图

L表示定位点

图11生物素小分子微阵列荧光免疫试验荧光扫描图

NC表示空白对照，PolyT₁₀、PolyT₂₀、PolyT₃₀、PolyT₄₀表示长度分别为10、20、30、40个碱基的PolyT的生物素寡核苷酸偶联物

具体实施方式

本发明的优选方案：

如图1所示，利用DNA的化学合成法先在固相载体可控多孔玻璃微珠(CPG)(图1A)上合成一段长度为30个碱基T的寡核苷酸链(图1B)，合成完毕后再在寡核苷酸链的3’末端采用氨基(图1C)修饰。采用碳二亚胺法将带有羧基的小分子化合物(图2)与固相载体上的寡核苷酸链进行偶联。带有羧基的小分子化合物先溶解在2-N-吗啡啉乙磺酸(MES)缓冲溶液中，再加入已合成的5’末端带有玻璃微珠、3’末端氨基修饰的寡核苷酸链和新配制的1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺(EDC)溶液进行偶联反应。偶联反应结束后除去反应液，用去离子水反复清洗玻璃微珠多次，除去洗液，真空干燥玻璃微珠，然后加入浓氨水在55℃条件下密闭氨解5小时使小分子化合物的寡核苷酸偶联物(图3A)与玻璃微珠在寡核苷酸5’端与玻璃微珠的连接臂的位置裂解。从玻璃微珠上切下来的小分子化合物的寡核苷酸偶联物先经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化，除去未与小分子化合物偶联的寡核苷酸片段，然后再经点样缓冲液稀释后利用点样机器人按设计的矩阵模式将探针点制在玻片表面。点样完毕后，芯片经水合，保持微量的湿润，然后在254nm的紫外线下照射，能量0.65J/cm²下紫外交联，UV交联结束后，用0.2％SDS和水各洗涤1min，甩干备用。

根据本发明提出的小分子微阵列制备方法，下面结合两个具体实施实例进一步阐述本发明，同时须指出，具体实施实例仅用于说明本发明，不用于限制本发明的范围。

实施例1琥珀酸氯毒素小分子微阵列的制备

1、寡核苷酸链的准备

利用DNA的固相化学合成的方法在可控多孔玻璃微珠(CPG)上合成寡核苷酸链，其序列如下：

Sequence(5’to 3’)：CPG-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTTTTT TTT NH₂

其5’末端连在可控多孔玻璃微珠(CPG)上，3’末端用氨基修饰。

2、琥珀酸氯毒素小分子化合物的准备

琥珀酸氯毒素是氯霉素的一种衍生物，其结构式如附图4所示，取氯霉素琥珀酸钠200mg，溶解于500μL新配制的2-N-吗啡啉乙磺酸缓冲溶液(MES)中。

3、琥珀酸氯毒素与寡核苷酸偶联制备琥珀酸氯毒素与寡核苷酸的偶联物

琥珀酸氯毒素寡核苷酸偶联物的碳二亚胺法合成路线示意图见图

5，取100mg上述带有可控多孔玻璃微珠(CPG)的寡核苷酸加入上述刚配制好的氯霉素琥珀酸钠MES缓冲液中，然后再加入200μL新配制的10mg/mL的EDC溶液，旋涡混匀后，于室温下振荡反应2小时。反应1小时后每隔半小时再加入50μLEDC溶液。获得琥珀酸氯毒素与寡核苷酸的偶联物，其结构式见图6。

4、氨解、纯化、浓缩

将上述5’末端带有CPG的琥珀酸氯毒素与寡核苷酸偶联物在浓氨水中55℃氨解5小时将琥珀酸氯毒素与寡核苷酸偶联物从固相载体上切下来。从玻璃微珠上切下来的琥珀酸氯毒素的寡核苷酸偶联物先经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化，除去未与小分子化合物偶联的寡核苷酸片段，然后真空干燥浓缩。

5、小分子微阵列的制备

用3×标准柠檬酸缓冲液(SSC)缓冲液稀释浓缩的小分子与寡核苷酸偶联物配制点样探针溶液，室温下利用ArrayIt SpotBot PersonalMircoarray Robot点样仪将探针溶液按设定的矩阵形式点制在玻片上。点样完毕后，芯片水合，保持微量的湿润，然后在254nm的紫外线下照射，能量0.65J/cm²下紫外交联，最后用0.2％SDS和水各洗涤1min，甩干即得到琥珀酸氯毒素小分子微阵列。然后加入氯霉素抗体与固定在玻片表面的琥珀酸氯霉素寡核苷酸偶联物于37℃湿孵30min使两者充分反应。反应后洗涤甩干，加入荧光标记二抗(cy5标记的羊抗鼠IgG)指示上一步反应后结合在玻片表面的抗原抗体偶联物。通过荧光共聚焦扫描仪扫描玻片表面的荧光信号强弱，图7是制得的琥珀酸氯毒素微阵列经荧光免疫试验荧光扫描结果图。

实施例2 寡糖小分子组合库的构建及微阵列法筛选

1、寡核苷酸链的准备

利用DNA的固相化学合成的方法按设计要在可控多孔玻璃微珠(CPG)上合成14种含30个碱基不同序列的寡核苷酸链，其序列如下：

Sequence(5’to 3’)：CPG-Oligo-NH₂

编号 Oligo序列

1 TTT TGC AGA TCA ATT AAT ACG ATA CCT GCG(SEQ IDNO：1)

1’ CGC AGG TAT CGT ATT AAT TGA TCT GCA AAA(SEQ IDNO：2)

2 TTT TTG GTT CTG TTC TTC GTT GAC ATG AGG(SEQ IDNO：3)

2’ CCT CAT GTC AAC GAA GAA CAG AAC CAA AAA(SEQ IDNO：4)

3 TTT TTT TAG TCT CCG ACG GCA GGC TTC AAT(SEQ IDNO：5)

3’ ATT GAA GCC TGC CGT CGG AGA CTA AAA AAA(SEQ IDNO：6)

4 TTT TTC TGT GAC AGA GCC AAC ACG CAG TCT(SEQ IDNO：7)

4’ AGA CTG CGT GTT GGC TCT GTC ACA GAA AAA(SEQ IDNO：8)

5 TTT TTC CTG GTG GTT GAC TGA TCA CCA TAA(SEQ IDNO：9)

5’ TTA TGG TGA TCA GTC AAC CAC CAG GAA AAA(SEQ IDNO：10)

6 TTT TTG CAT GTA TAG AAC ATA AGG TGT CTC(SEQ IDNO：11)

6’ GAG ACA CCT TAT GTT CTA TAC ATG CAA AAA(SEQ IDNO：12)

7 TTT TTG CTA GAT GAA GAG CAA GCG CAT GGA(SEQ IDNO：13)

7’ TCC ATG CGC TTG CTC TTC ATC TAG CAA AAA(SEQ IDNO：14)

其5’末端连在可控多孔玻璃微珠(CPG)上，3’末端用氨基修饰。编号1’-7’的寡核苷酸链分别为编号1-7的寡核苷酸链的互补链。

带CPG的寡核苷酸链通过3’末端氨基与丁二酸酐反应得到3’末端带羧基修饰的寡核苷酸链(MK Walsh，X Wang，BC Weimer.Optimizingthe immobilization of single-stranded DNA onto glass beads，J.Biochem.Biophys.2001，47，221-231.)，其反应示意图如图8所示。

2、单糖小分子化合物的准备

我们选取葡萄糖、甘露糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺、岩藻糖、神经氨酸等7种单糖，利用2，6-二氨基吡啶在单糖分子上修饰上氨基(Xia B，Kawar Z S，Ju T，Alvarez R A，Sachdev G，CummingsR.Versatile fluorescent derivatization of glycans for glycomic analysis.NatMethods，2005，2(11)：845-850)，分别取200mg，溶解于500μL新配制的2-N-吗啡啉乙磺酸缓冲溶液(MES)中。

3、单糖与寡核苷酸偶联制备单糖与寡核苷酸的偶联物

取100mg上述合成的7种带有可控多孔玻璃微珠(CPG)的寡核苷酸分别加入上述刚配制好的单糖MES缓冲液中，然后各加入200μL新配制的10mg/mL的EDC溶液，旋涡混匀后，于室温下振荡反应2小时。反应1小时后每隔半小时再各加入50μLEDC溶液。

4、寡糖分子库的合成

在7种微珠上分别合成第一个单糖分子后，再利用mix-split固相微球合成技术(one-compound，one-bead)合成结构多样的二糖分子库。其合成示意图如图9所示。图中A为葡萄糖，B为甘露糖，C为半乳糖，D为N-乙酰半乳糖胺，E为N-乙酰葡糖胺，F为岩藻糖，G为神经氨酸。单糖分子与寡核苷酸偶联后洗涤晾干，再将分别连有不同单糖分子的7种微珠混合起来，然后平均分成7份，接下来再分别在均分后的7份微珠加入上述7种单糖以合成第二个糖分子。

5、氨解、纯化、浓缩

将上述反应后7种5’末端带有CPG的二糖与寡核苷酸偶联物在浓氨水中55℃氨解5小时将二糖与寡核苷酸偶联物从固相载体上切下来得到7种混合液。然后每种混合液分别经带有1’-7’寡核苷酸的CPG柱分离，再分别将它们洗脱下来，如此7种混合液共分离纯化得到49种不同的二糖小分子寡核苷酸偶联物。然后真空干燥。

6、寡糖小分子组合库微阵列的制备

用3×标准柠檬酸缓冲液(SSC)稀释上述49种二糖小分子与寡核苷酸偶联物配制点样探针溶液，室温下利用ArrayIt SpotBot PersonalMircoarray Robot点样仪将此49种探针溶液每种两点点制在玻片上。点样完毕后，芯片水合，保持微量的湿润，然后在254nm的紫外线下照射，能量0.65J/cm²下紫外交联，最后用0.2％SDS和水各洗涤1min，甩干即得到寡糖小分子组合库微阵列。

通过加入生物素标记的凝集素DSA(Lectin from Daturastramomium)特异性地与固定在芯片表面末端是N-乙酰葡萄糖胺的二糖反应，然后再利用荧光标记的链霉素亲和蛋白与生物素反应来指示与芯片上固定的二糖反应的凝集素，最后利用激光共聚焦扫描仪检测荧光信号的缺失。图10是制得的寡糖库小分子微阵列经上述荧光免疫试验荧光扫描结果图，因凝集素DSA只特异性地与N-乙酰葡萄糖胺反应，故只有第二个糖分子为N-乙酰葡萄糖胺的探针点有荧光信号。图中L表示定位点。本发明还可以通过寡核苷酸偶联臂的特定序列实现寡糖小分子组合库寻址操作。

实施例3 生物素小分子微阵列的制备

分别用长度为10、20、30、40个碱基的PolyT，3’末端用实施例1的方法偶联生物素小分子，用3×SSC稀释点样，再用cy3标记的链霉素亲合蛋白孵育示踪，所得结果如图11所示，从图中可以看出当碱基长度小于30时信号较弱，碱基长度为30到40时检测信号差别不大。

序列表

<110>华东理工大学

<120>一种小分子微阵列的制备方法

<130>PCNHD070037

<160>14

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>人工合成序列

<400>1

ttttgcagat caattaatac gatacctgcg 30

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>art ificial sequence

<220>

<223>人工合成序列

<400>2

cgcaggtatc gtattaattg atctgcaaaa 30

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>人工合成序列

<400>3

tttttggttc tgttcttcgt tgacatgagg 30

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>人工合成序列

<400>4

cctcatgtca acgaagaaca gaaccaaaaa 30

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>人工合成序列

<400>5

tttttttagt ctccgacggc aggcttcaat 30

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>人工合成序列

<400>6

attgaagcct gccgtcggag actaaaaaaa 30

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>人工合成序列

<400>7

tttttctgtg acagagccaa cacgcagtct 30

<210>8

<211>30

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>人工合成序列

<400>8

agactgcgtg ttggctctgt cacagaaaaa 30

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>人工合成序列

<400>9

tttttcctgg tggttgactg atcaccataa 30

<210>10

<211>30

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>人工合成序列

<400>10

ttatggtgat cagtcaacca ccaggaaaaa 30

<210>11

<211>30

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>人工合成序列

<400>11

tttttgcatg tatagaacat aaggtgtctc 30

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>人工合成序列

<400>12

gagacacctt atgttctata catgcaaaaa 30

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>人工合成序列

<400>13

tttttgctag atgaagagca agcgcatgga 30

<210>14

<211>30

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>人工合成序列

<400>14

tccatgcgct tgctcttcat ctagcaaaaa 30

Claims

1.一种小分子微阵列的制备方法，包括下列步骤：

(1)将寡核苷酸链与小分子化合物偶联获得小分子化合物的寡核苷酸偶联物；

所述小分子化合物选自琥珀酸氯毒素、葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、岩藻糖中的一种；

所述寡核苷酸链的长度为20、30或40个碱基；

(2)将步骤(1)获得的寡核苷酸偶联物在254nm的紫外光照射固定在芯片载体上，紫外光能量为0.65J/cm²。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)包括下列步骤：

c.将寡核苷酸偶联物与固相载体分离并纯化。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤b为在带有化学活性基团寡核苷酸链的固相载体上原位固相合成小分子化合物，获得小分子化合物的寡核苷酸偶联物。

4.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述固相载体选自玻璃、金属、硅、陶瓷或可控多孔玻璃微珠CPG中的一种。

5.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述特定化学活性基团选自氨基、羧基或巯基中的一种。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，寡核苷酸链5’末端与可控多孔玻璃珠相连，寡核苷酸链3’末端用氨基修饰；小分子化合物表面带有羧基；将氨基修饰的寡核苷酸链与表面带有羧基的小分子化合物利用碳二亚胺法进行偶联获得小分子化合物的寡核苷酸偶联物。