CN110922441B - 光定向微阵列dna合成的链接基质物和合成方法 - Google Patents

光定向微阵列dna合成的链接基质物和合成方法 Download PDF

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Abstract

光定向微阵列DNA合成的链接基质物和合成方法，其链接基质物的紫外光脱保护基团使用了‑MENPOC或‑NPPOC；其合成方法通过步骤(1)‑(7)合成出可带有目标碱基序列且可剥离的寡核苷酸。本发明提出的光定向微阵列DNA合成的链接基质物，其无需提前连接起始碱基，减少了起始碱基对后续使用的干扰，解决了现有技术中起始碱基与目标碱基不清楚明确的问题。同时，该特征结构，能在合成最终的寡核苷酸后可自玻片载体剥离开，从而使合成的最终寡核苷酸可自玻璃表面释放出，用于其他下游的基因组学应用中。

Description

光定向微阵列DNA合成的链接基质物和合成方法
技术领域
本发明涉及DNA合成技术领域，尤其涉及光定向微阵列DNA合成的链接基质物和合成方法。
背景技术
传统上在微阵列合成方法中，合成的DNA一般是固定在玻璃片表面的。因此通常会有一到六个起始碱基被预附在玻璃表面，这样使合成的DNA更加稳固。然后，另一终端的5'端是被保护基团，光定向DNA合成就从这个5'端延伸出去。问题是，这些起始的碱基干扰了许多实验，因为你不知道你的目标对象是结合到了这些起始的碱基还是你需要的目标碱基。
同时，当今的高通量基因组应用，尤其是下一代测序，需要大量的寡核苷酸。许多目标测序应用需要数十万个探针来捕获所需的基因组序列。传统上，这些探针是使用传统的DNA合成仪一次一条地合成出来的。合成速度太慢且非常昂贵，不能满足此应用的需要。微阵列法能大批量的合成DNA但目前尚未使用在这个用途上，因为目前合成的寡聚物DNA与玻璃表面是以共价方式结合的，无法剥离下来。
发明内容
本发明的目的在于提出光定向微阵列DNA合成的链接基质物，其利用MENPOC或NPPOC作为光敏基团。
本发明还提出光定向微阵列DNA合成的方法，其通过步骤(1)-(7)合成出可带有目标碱基序列且可剥离的寡核苷酸。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
光定向微阵列DNA合成的链接基质物，所述链接基质物的结构式如下：
Figure BDA0002283299310000021
其中：-R为紫外光脱保护基团。
更进一步说明，所述R为MENPOC或NPPOC；
所述链接基质物为MENPOC链接基质物时，其结构式如下：
Figure BDA0002283299310000022
所述链接基质物为NPPOC链接基质物时，其结构式如下：
Figure BDA0002283299310000023
光定向微阵列DNA合成的方法，包括以下步骤：
(1)将链接基质物附到玻璃载体的表面；链接基质物为上述的链接基质物；
(2)使用DNA合成仪，该合成仪使用360-370nm的二极管激光作为光源，照射需要添加目标碱基的寡核苷酸，去除寡核苷酸的保护组基团R1，使带有目标碱基的单体与链接基质物结合；
单体的结构式为：
Figure BDA0002283299310000031
B1’为带有目标碱基；R1为保护基团；R2为保护基团；
对于加入的第一个单体，只需要照射链接基质物，去除链接基质物的保护组基团R，使目标碱基结合于链接基质物；
(3)洗涤后，使用Cap试剂封闭未反应的寡核苷酸，再洗涤；
(4)对获得目标碱基的寡核苷酸氧化，并洗涤；
(5)使用短Cap，并进行长洗，获得中间寡核苷酸；
(6)重复上述步骤(2)-(5)；
(7)合成完成后，将玻璃载体置于氨水中，在60℃下至少浸泡4小时，使寡核苷酸脱离玻璃载体，获得最终寡核苷酸。
更进一步说明，所述R1为保护组基团为MENPOC或NPPOC。
更进一步说明，所述步骤1中，将链接基质物附于玻璃载体表面的方法为：按质量份数，将APTS试剂稀释成3-5％的溶液，制得溶液A；利用磷酸盐缓冲液稀释链接基质物，制得溶液B；将溶液A和溶液B混合于玻璃载体，在60℃下反应至少2小时。
更进一步说明，所述步骤(2)中，使用360-370nm的二极管照射数字微镜器，该数字微镜器将光线定向到玻璃表面选择的区域，可选择性地照射区域内的阵列点，使被照射阵列点上的寡核苷酸去保护组基团并进行延长合成。
更进一步说明，所述Cap试剂包括：无水醋酸和NMI试剂。
更进一步说明，所述步骤(4)中，使用碘氧化获得目标碱基的寡核苷酸。
更进一步说明，所述碘的量为0.02摩尔。
更进一步说明，步骤(7)中获得的最终寡核苷酸置于Tris-EDTA缓冲液中保存。
本发明的有益效果：
本发明提出的光定向微阵列DNA合成的链接基质物，其无需提前连接起始碱基，减少了起始碱基对后续使用的干扰，解决了现有技术中起始碱基与目标碱基不清楚明确的问题。同时，该特征结构，能在合成最终的寡核苷酸后可自玻片载体剥离开，从而使合成的最终寡核苷酸可自玻璃表面释放出，用于其他下游的基因组学应用中。
附图说明
图1为实施例3毛细管电泳分析图；
图2是实施例4毛细管电泳分析图；
图3是MENPOC的氯化物；
图4是NPPOC-dA(tac)酰胺；
图5是带MENPOC保护基团的链接基质物接入玻璃表面后的分子链变化图；
图6是带NPPOC保护基团的链接基质物接入玻璃表面后的分子链变化图。
图7是链接基质物附到玻璃载体前，该玻璃载体表面的结构示意图；
图8是链接基质物连接于玻璃载体表面的结构示意图；
图9是链接基质物去保护基团的结构示意图；
图10是第一个带目标碱基的单体连接于链接基质物的示意图；
图11是同步剥离和去保护合成的寡核苷酸的示意图。
具体实施方式
下面结合附图通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
光定向微阵列DNA合成的链接基质物，所述链接基质物的结构式如下：
Figure BDA0002283299310000051
其中：-R为紫外光脱保护基团。
该链接基质物连接到玻璃表面，用于光定向微阵列DNA合成，该链接基物质分子中的硅元素为玻璃上的，玻璃优选为石英玻璃。本链接基质物，其特征结构能直接连接第一个碱基，在合成DNA之前无需使用多余或未使用的碱基，即无需提前连接起始碱基，减少了起始碱基对后续使用的干扰，解决了现有技术中起始碱基与目标碱基不清楚明确的问题。同时，该特征结构，能在合成最终的寡核苷酸后可自玻片载体剥离开，从而使合成的最终寡核苷酸可自玻璃表面释放出，用于其他下游的基因组学应用中。
在这里我们采用了这些广泛使用的通用合成链接基质，并将其附着在玻璃表面。此外，我们修改了保护组，以便它们可用于光定向DNA合成。通过这样做，我们解决了使用微阵列合成法进行基因组学应用遇到的两个主要问题。解决的两个关键问题如下：
1、免除了使用没有必要的起始碱基；传统上在微阵列合成中，合成的DNA一般是固定在玻璃片表面的。因此通常会有一到六个起始碱基被预附在玻璃表面。这样使合成的DNA更加稳固。然后，另一终端的5'端是被MENPOC或NPPOC组保护。光定向DNA合成就从这个5'端延伸出出去。问题是，这些起始的碱基干扰了许多实验，因为你不知道你的目标对象是结合到了这些起始的碱基还是你需要的目标碱基。使用我们提出的通用链接基质可以解决此问题。我们第一个碱基直接连接到通用链接基质上，序列中的所有碱基都是合成的目标碱基。
2、可剥离性；当今的高通量基因组应用，尤其是下一代测序，需要大量的寡核苷酸。许多目标测序应用需要数十万个探针来捕获所需的基因组序列。传统上，这些探针是使用传统的DNA合成仪一次一条地合成出来的。合成速度太慢且非常昂贵，不能满足此应用的需要。微阵列法能大批量的合成DNA但目前尚未使用在这个用途上。因为目前合成的寡聚物DNA与玻璃表面是以共价方式结合的，无法剥离下来。而本发明的链接物包含碱基和玻璃表面之间的琥珀酸链接基质。在寡核苷酸脱保护过程中，完成了合成之后，这种链接基质很容易被自玻璃表面切裂剥离下来。就像传统合成中一样，从玻璃表面释放出合成的寡核苷酸，能将其用于其它下游高通量基因组的应用。
光定向微阵列DNA合成的成像方法有两种：其中一种是将紫外光通过一个微阵列多孔光遮挡膜将光投射到玻片上形成需要的微阵列，另一种是采用数字微镜反射装置Digital Micromirror Device(DMD)也就是无光遮挡膜微阵列DNA合成仪(Maskless ArraySynthesizer)，而本方案可用于上述两种中，但此处仅用DMD作演示。
更进一步说明，所述R为MENPOC或NPPOC；
所述链接基质物为MENPOC链接基质物时，其结构式如下：
Figure BDA0002283299310000071
所述链接基质物为NPPOC链接基质物时，其结构式如下：
Figure BDA0002283299310000072
更进一步说明，本方案使用MENPOC基团或NPPOC基团作为保护基团，其来源广泛，如图3中的MENPOC氯化物和图4中的NPPOC-dA(tac)酰胺。
如图5和图6，光定向微阵列DNA合成的方法，包括以下步骤：
(1)将链接基质物附到玻璃载体的表面；链接基质物为上述的链接基质物；如图7，初始状态下，玻璃载体表面的分子结构图；
(2)使用DNA合成仪，该合成仪使用360-370nm的二极管激光作为光源，照射需要添加目标碱基的寡核苷酸，去除寡核苷酸的保护组基团R1，使带有目标碱基的单体与链接基质物结合；
单体的结构式为：
Figure BDA0002283299310000081
B1’为带有目标碱基；R1为保护基团；R2为保护基团；
对于加入的第一个单体，只需要照射链接基质物，去除链接基质物的保护组基团R，如图8脱保护后变成如图9，使目标碱基结合于链接基质物；
更进一步说明，B1’为带有目标碱基，根据碱基的不同，核苷酸有腺嘌呤核苷酸(腺苷酸，AMP)、鸟嘌呤核苷酸(鸟苷酸，GMP)、胞嘧啶核苷酸(胞苷酸，CMP)、尿嘧啶核苷酸(尿苷酸，UMP)、胸腺嘧啶核苷酸(胸苷酸，TMP)等；光定向微阵列合成DNA过程中：需要加A碱基时，只照射需要加A碱基的阵列点，除去保护基团，激活这个阵列点上的DNA，将A碱基加进去。需要加G碱基时，只照射需要加G碱基的阵列点，除去保护基团，激活这个阵列点上的DNA，将G加进去。需要加C碱基时，只照射需要加C碱基的阵列点，除去保护基团，激活这个阵列点上DNA，将C加进去。需要加T碱基时，只照射需要加T碱基的阵列点，除去保护基团，激活这个阵列点上的DNA，将T加进去。R2为保护基团，其可为腈乙基，在步骤(7)时会去除，并由氢原子取代。
(3)洗涤后，使用Cap试剂封闭未反应的寡核苷酸，再洗涤；
(4)对获得目标碱基的寡核苷酸氧化，并洗涤；
连接反应后新加上的核苷酸，通过亚磷酯键与链接基质物相连的寡核苷酸连接，此时的磷为三价，亚磷酯键不稳定，容易被酸或碱水解，氧化后可将磷上升为五价，提高寡核苷酸稳定性。
(5)使用短Cap，并进行长洗，获得中间寡核苷酸，如图10；短cap是常用的cap；
上述洗涤会将未反应物或分解物通过过滤或洗涤除去；
(6)重复上述步骤(2)-(5)；
(7)合成完成后，将玻璃载体置于氨水中，在60℃下至少浸泡4小时，使寡核苷酸脱离玻璃载体，获得最终寡核苷酸。可同步剥离和去保护合成的寡核苷酸，如图11。
更进一步说明，所述R1为保护组基团为MENPOC或NPPOC。
更进一步说明，所述步骤1中，如图7，将链接基质物附于玻璃载体表面的方法为：按质量份数，将APTS试剂稀释成3-5％的溶液，制得溶液A；利用磷酸盐缓冲液稀释链接基质物，制得溶液B；将溶液A和溶液B混合于玻璃载体，在60℃下反应至少2小时。
更进一步说明，所述步骤(2)中，使用360-370nm的二极管照射数字微镜器，该数字微镜器将光线定向到玻璃表面选择的区域，可选择性地照射区域内的阵列点，使被照射阵列点上的寡核苷酸去保护组基团并进行延长合成。
更进一步说明，所述Cap试剂包括：无水醋酸和NMI试剂。
更进一步说明，所述步骤(4)中，使用碘氧化获得目标碱基的寡核苷酸。
更进一步说明，所述碘的量为0.02摩尔。
更进一步说明，步骤(7)中获得的最终寡核苷酸置于Tris-EDTA缓冲液中保存。
实施例1：
光定向微阵列DNA合成的方法，包括以下步骤：
(1)将链接基质物附到玻璃载体的表面；链接基质物为MENPOC链接基质物时，其结构式如下：
Figure BDA0002283299310000101
(1-2)加入的带有碱基为腺嘌呤的第一个单体，照射链接基质物，去除链接基质物的保护组基团MENPOC，使带有腺嘌呤的第一个单体结合于链接基质物；
洗涤后，使用Cap试剂封闭未反应的寡核苷酸，再洗涤；Cap试剂包括：无水醋酸和NMI试剂；
对获得目标碱基的寡核苷酸利用0.02摩尔的碘氧化，并洗涤；
使用短Cap，并进行长洗，获得第一寡核苷酸；
(2)使用DNA合成仪，该合成仪使用360-370nm的二极管激光作为光源，照射需要添加目标碱基的寡核苷酸，去除寡核苷酸的保护组基团-MENPOC，使带有目标碱基的单体与链接基质物结合；
单体的结构式为：
Figure BDA0002283299310000111
B1’为带有目标碱基的核苷酸(此处举DNA为例子)，其可从腺嘌呤核苷酸(腺苷酸，AMP)、鸟嘌呤核苷酸(鸟苷酸，GMP)、胞嘧啶核苷酸(胞苷酸，CMP)、胸腺嘧啶核苷酸(胸苷酸，TMP)选择；R1为保护基团；R2为保护基团；
(3)洗涤后，使用Cap试剂封闭未反应的寡核苷酸，再洗涤；Cap试剂包括：无水醋酸和NMI试剂
(4)对获得目标碱基的寡核苷酸利用0.02摩尔的碘氧化，并洗涤；
(5)使用短Cap，并进行长洗，获得中间寡核苷酸；
(6)重复上述步骤(2)-(5)；需要加A碱基时，只照射需要加A的DNA，除去保护基团，激活这个DNA，将A加进去。需要加G碱基时，只照射需要加G的DNA，除去保护基团，激活这个DNA，将G加进去。需要加C碱基时，只照射需要加C的DNA，除去保护基团，激活这个DNA，将C加进去。需要加T碱基时，只照射需要加T的DNA，除去保护基团，激活这个DNA，将T加进去。
(7)合成完成后，将玻璃载体置于6N氨水中，60℃，至少4小时，获得最终寡核苷酸，将最终寡核苷酸置于Tris-EDTA缓冲液中保存。如图5为链接基质物接入玻璃表面后的分子链变化图。
实施例2：
光定向微阵列DNA合成的方法，包括以下步骤：
(1)将链接基质物粘附到玻璃载体的表面；链接基质物为NPPOC链接基质物时，其结构式如下：
Figure BDA0002283299310000121
(1-2)加入的带有碱基为腺嘌呤的第一个单体，照射链接基质物，去除链接基质物的保护组基团NPPOC，使带有腺嘌呤的第一个单体结合于链接基质物；
洗涤后，使用Cap试剂封闭未反应的寡核苷酸，再洗涤；Cap试剂包括：无水醋酸和NMI试剂；
对获得目标碱基的寡核苷酸利用0.02摩尔的碘氧化，并洗涤；
使用短Cap，并进行长洗，获得第一寡核苷酸；
(2)使用DNA合成仪，该合成仪使用360-370nm的二极管激光作为光源，照射需要添加目标碱基的寡核苷酸，去除寡核苷酸的保护组基团-NPPOC，使带有目标碱基的单体与链接基质物结合；
单体的结构式为：
Figure BDA0002283299310000131
B1’为带有目标碱基的核苷酸(此处举DNA为例子)，其可从腺嘌呤核苷酸(腺苷酸，AMP)、鸟嘌呤核苷酸(鸟苷酸，GMP)、胞嘧啶核苷酸(胞苷酸，CMP)、胸腺嘧啶核苷酸(胸苷酸，TMP)选择；R1为NPPOC保护基团；R2为保护基团；
(3)洗涤后，使用Cap试剂封闭未反应的寡核苷酸，再洗涤；Cap试剂包括：无水醋酸和NMI试剂；
(4)对获得目标碱基的寡核苷酸利用0.02摩尔的碘氧化，并洗涤；
(5)使用短Cap，并进行长洗，获得中间寡核苷酸；
(6)重复上述步骤(2)-(5)；需要加A碱基时，只照射需要加A的DNA，除去保护基团，激活这个DNA，将A加进去。需要加G碱基时，只照射需要加G的DNA，除去保护基团，激活这个DNA，将G加进去。需要加C碱基时，只照射需要加C的DNA，除去保护基团，激活这个DNA，将C加进去。需要加T碱基时，只照射需要加T的DNA，除去保护基团，激活这个DNA，将T加进去。
(7)合成完成后，将玻璃载体置于6N氨水中，60℃，至少4小时，获得最终寡核苷酸，将最终寡核苷酸置于Tris-EDTA缓冲液中保存。
实施例3：
光定向微阵列DNA合成的方法，包括以下步骤：
(1)将APTS试剂(氨基丙基三乙氧硅烷，下同)稀释成3-5％的溶液，制得溶液A；利用磷酸盐缓冲液稀释链接基质物，制得溶液B；将溶液A和溶液B混合，在60℃下反应至少2小时，将链接基质物粘附到玻璃载体的表面；链接基质物为MENPOC链接基质物时，其结构式如下：
Figure BDA0002283299310000141
(1-2)加入的带有碱基为腺嘌呤的第一个单体，照射链接基质物，去除链接基质物的保护组基团MENPOC，使带有腺嘌呤的第一个单体结合于链接基质物；
洗涤后，使用Cap试剂封闭未反应的寡核苷酸，再洗涤；Cap试剂包括：无水醋酸和NMI试剂；
对获得目标碱基的寡核苷酸利用0.02摩尔的碘氧化，并洗涤；
使用短Cap，并进行长洗，获得第一寡核苷酸；
(2)使用DNA合成仪，该合成仪使用360-370nm的二极管照射数字微镜器，该数字微镜器将光线定向到玻璃表面选择的区域，可选择性地照射区域内的寡核苷酸，使被照射的寡核苷酸去保护组基团并进行延长合成，照射需要添加目标碱基的寡核苷酸，去除寡核苷酸的保护组基团-MENPOC，使带有目标碱基的单体与链接基质物结合；该激光器的输出光束被扩展，以覆盖DLP 7000放射芯片上的所有像素，DLP芯片使用DLP 4100发现型开发控制器进行控制；试剂的输送使用公知的阀门和管线。
单体的结构式为：
Figure BDA0002283299310000151
B1’为带有目标碱基的核苷酸(此处举DNA为例子)，其可从腺嘌呤核苷酸(腺苷酸，AMP)、鸟嘌呤核苷酸(鸟苷酸，GMP)、胞嘧啶核苷酸(胞苷酸，CMP)、胸腺嘧啶核苷酸(胸苷酸，TMP)选择；R1为保护基团；R2为保护基团；
(3)洗涤后，使用Cap试剂封闭未反应的寡核苷酸，再洗涤；Cap试剂包括：无水醋酸和NMI试剂
(4)对获得目标碱基的寡核苷酸利用0.02摩尔的碘氧化，并洗涤；
(5)使用短Cap，并进行长洗，获得中间寡核苷酸；
(6)重复上述步骤(2)-(5)；需要加A碱基时，只照射需要加A的DNA，除去保护基团，激活这个DNA，将A加进去。需要加G碱基时，只照射需要加G的DNA，除去保护基团，激活这个DNA，将G加进去。需要加C碱基时，只照射需要加C的DNA，除去保护基团，激活这个DNA，将C加进去。需要加T碱基时，只照射需要加T的DNA，除去保护基团，激活这个DNA，将T加进去。
(7)合成完成后，将玻璃载体置于6氨水中，60℃，至少4小时，获得最终寡核苷酸，将最终寡核苷酸置于Tris-EDTA缓冲液中保存。如图5为链接基质物接入玻璃表面后的分子链变化图。
实施例4：
光定向微阵列DNA合成的方法，包括以下步骤：
(1)将APTS试剂稀释成3-5％的溶液，制得溶液A；利用磷酸盐缓冲液稀释链接基质物，制得溶液B；将溶液A和溶液B混合，在60℃下反应至少2小时，将链接基质物粘附到玻璃载体的表面；链接基质物为NPPOC链接基质物时，其结构式如下：
Figure BDA0002283299310000161
(1-2)加入的带有碱基为腺嘌呤的第一个单体，照射链接基质物，去除链接基质物的保护组基团NPPOC，使带有腺嘌呤的第一个单体结合于链接基质物；
洗涤后，使用Cap试剂封闭未反应的寡核苷酸，再洗涤；Cap试剂包括：无水醋酸和NMI试剂；
对获得目标碱基的寡核苷酸利用0.02摩尔的碘氧化，并洗涤；
使用短Cap，并进行长洗，获得第一寡核苷酸；
(2)使用DNA合成仪，该合成仪使用360-370nm的二极管照射数字微镜器，该数字微镜器将光线定向到玻璃表面选择的区域，可选择性地照射区域内的寡核苷酸，使被照射的寡核苷酸去保护组基团并进行延长合成，照射需要添加目标碱基的寡核苷酸，去除寡核苷酸的保护组基团-NPPOC，使带有目标碱基的单体与链接基质物结合；
单体的结构式为：
Figure BDA0002283299310000171
B1’为带有目标碱基的核苷酸(此处举DNA为例子)，其可从腺嘌呤核苷酸(腺苷酸，AMP)、鸟嘌呤核苷酸(鸟苷酸，GMP)、胞嘧啶核苷酸(胞苷酸，CMP)、胸腺嘧啶核苷酸(胸苷酸，TMP)选择；R1为NPPOC保护基团；
(3)洗涤后，使用Cap试剂封闭未反应的寡核苷酸，再洗涤；Cap试剂包括：无水醋酸和NMI试剂；
(4)对获得目标碱基的寡核苷酸利用0.02摩尔的碘氧化，并洗涤；
(5)使用短Cap，并进行长洗，获得中间寡核苷酸；
(6)重复上述步骤(2)-(5)；需要加A碱基时，只照射需要加A的DNA，除去保护基团，激活这个DNA，将A加进去。需要加G碱基时，只照射需要加G的DNA，除去保护基团，激活这个DNA，将G加进去。需要加C碱基时，只照射需要加C的DNA，除去保护基团，激活这个DNA，将C加进去。需要加T碱基时，只照射需要加T的DNA，除去保护基团，激活这个DNA，将T加进去。
(7)合成完成后，将玻璃载体置于6N氨水中，60℃，至少4小时，获得最终寡核苷酸，将最终寡核苷酸置于Tris-EDTA缓冲液中保存。
将实施例3和实施例4合成的样品浓缩后使用紫外分光光度计进行表征分析及毛细管电泳分析结果如表1；图1为实施例3毛细管电泳分析图；图2是实施例4毛细管电泳分析图。
表1-实施例3和4的检测结果
Figure BDA0002283299310000181
结果发现，这些链接基质物在微阵列玻片表面进行固相DNA合成效果良好。而且合成后，最终寡核苷酸很容易被切裂剥离下来，用于下游的高通量基因组应用。
以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理。这些描述只是为了解释本发明的原理，而不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处的解释，本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.链接基质物在光定向微阵列DNA合成的应用，其特征在于，所述链接基质物的结构式如下：
Figure QLYQS_1
；
其中：-R为紫外光脱保护基团，所述紫外光脱保护基团为MENPOC或NPPOC；
所述链接基质物为MENPOC链接基质物时，其结构式如下：
Figure QLYQS_2
；
所述链接基质物为NPPOC链接基质物时，其结构式如下：
Figure QLYQS_3
。
2.光定向微阵列DNA合成的方法，用于实现权利要求1所述的链接基质物在光定向微阵列DNA合成的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将链接基质物附到玻璃载体的表面；链接基质物为权利要求1的链接基质物；将链接基质物附于玻璃载体表面的方法为：按质量份数，将APTS试剂稀释成3-5%的溶液，制得溶液A；利用磷酸盐缓冲液稀释链接基质物，制得溶液B；将溶液A和溶液B混合于玻璃载体，在60℃下反应至少2小时；
（2）使用DNA合成仪，该合成仪使用360-370nm的二极管激光作为光源，照射需要添加目标碱基的寡核苷酸，去除寡核苷酸的保护组基团R1，使带有目标碱基的单体与链接基质物结合；
单体的结构式为：
Figure QLYQS_4
或/>
Figure QLYQS_5
；
B1’为带有目标碱基；R1为MENPOC或NPPOC； R2为腈乙基；
对于加入的第一个单体，只需要照射链接基质物，去除链接基质物的保护组基团R，使目标碱基结合于链接基质物；
（3）洗涤后，使用Cap试剂封闭未反应的寡核苷酸，再洗涤；
（4）对获得目标碱基的寡核苷酸氧化，并洗涤；
（5）使用短Cap，并进行长洗，获得中间寡核苷酸；
（6）重复上述步骤（2）-（5）；
（7）合成完成后，将玻璃载体置于氨水中，在60℃下至少浸泡4小时，使寡核苷酸脱离玻璃载体，获得最终寡核苷酸。
3.根据权利要求2所述的光定向微阵列DNA合成的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，使用360-370nm的二极管照射数字微镜器，该数字微镜器将光线定向到玻璃表面选择的区域，可选择性地照射区域内的阵列点，使被照射阵列点上的寡核苷酸去保护组基团并进行延长合成。
4.根据权利要求2所述的光定向微阵列DNA合成的方法，其特征在于，所述Cap试剂包括：无水醋酸和NMI试剂。
5.根据权利要求2所述的光定向微阵列DNA合成的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，使用碘氧化获得目标碱基的寡核苷酸。
6.根据权利要求5所述的光定向微阵列DNA合成的方法，其特征在于，所述碘的量为0.02摩尔。
7.根据权利要求2所述的光定向微阵列DNA合成的方法，其特征在于， 步骤（7）中获得的最终寡核苷酸置于Tris-EDTA缓冲液中保存。
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