CN101023096B - 调节植物叶片寿命的蛋白质，其基因和它们的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种负责调节植物叶片寿命的新型蛋白质，ORE15。此外，还公开了一种编码所述蛋白质ORE15的基因。所述蛋白质和基因可用于调节植物叶片寿命，包括延迟的衰老、生长促进、叶片重量和尺寸的增加。

Description

调节植物叶片寿命的蛋白质,其基因和它们的用途
技术领域
本发明涉及负责调节植物叶片寿命的蛋白质、编码该蛋白质的基因，及它们的用途。更具体地，本发明涉及能调节植物叶片寿命的新型蛋白质ORE15、编码该蛋白质的新型基因ORE15，及其出于各种目的的使用。
背景技术
植物的衰老是发生在植物胚后的最后阶段的一系列的生物化学的和生理学的现象，其限制个体植物的寿命。植物衰老的启动是一个拐点，在该点上细胞内发生显著的变化，正在衰老的植株在合成能力上下降且细胞结构和大分子物质降解以至于丧失细胞的动态平衡，导致细胞死亡(Matile P.等人，Elservier，413-440，1992；Nooden L.D.等人，Academicpress，1988；Thiman K.V.等人，CRC press，85-115，1980；Thomas H.等人，Annu.Rev.Plant Physiol.123：193-219，1993)。植物的衰老不是植物器官简单的被动降解过程，而是作为在细胞、组织和器官中进行的高度精确和主动的过程由基因程序化控制。
除了生物学的重要性，因为其与农作物产量的增加和收获后的耐储存性有关，植物的衰老具有工业上的重要性。相应地，在植物衰老上已积极地进行了基因的、分子生物学的，生理学的，以及生物化学的研究。然而，大部分的报告是从对植物激素的研究中获得，而衰老的调节，如衰老调节基因的使用，还未被充分研究。
通过反基因方法，迄今为止在鼠耳水芹(mouse-ear cress)、番茄、玉米、水稻、烟草和马铃薯植物中已找到在叶片衰老期间表达增加的约100个基因(Buchanan-Wallaston，J. Exp.Bot.48：181-199，1997；Quirini等人，Trends Plant Sci.5：278-282，2000)。然而，仅仅少量的衰老相关基因的功能已被研究，而大多数的性质仍然未知。近来，延迟衰老的突变体已被分离出且被研究以尝试找到负责调节叶片衰老的基因(Woo H.R.等人，Plant Cell 13：1779-1790，2001；Woo H.R.等人，Plant J.(待出版))。然而，实验上的困难阻止了从衰老促进(senescence-promoting)的突变体中分离出衰老调节基因。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供一种调节叶片寿命的蛋白质，被命名为ORE15。
本发明的另一个目的是提供一种编码所述蛋白质ORE15的调节植物叶片寿命的基因，被命名为ORE15。
本发明的进一步的目的是提供一种携带ORE15基因的重组载体。
本发明的又进一步的目的是提供一种调节植物寿命的方法。
本发明的再进一步的目的是提供一种促进植物生长的方法。
本发明的又一个目的是提供一种增加植物生物量的方法。
本发明的再一个目的是提供一种表现出延长的寿命的转基因植物。
本发明的再一个目的是提供一种表现出生长促进的转基因植物。
本发明的更为进一步的目的是提供一种筛选植物衰老调节基因的方法。
本发明的另外的目的是提供一种筛选植物寿命调节相关的材料的方法。
技术方案
根据本发明的一个方面，一种包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列，被命名为ORE15的蛋白质，被发现具有调节植物叶片寿命的功能。
根据本发明的另一个方面，提供一种编码所述叶片寿命调节蛋白质ORE15，被命名为ORE15的基因。
在本发明中，采用拟南芥(Arabidopsis thaliana)来筛选与植物寿命相关的基因，其中拟南芥(Arabidopsis thaliana)是一种用于基因和分子生物学研究的模式植物。以前，本发明人鉴定了一种衰老相关的基因，被命名为ORE9(Woo H.R.等人，Plant Cell 13：1779-1790，2001)。在本发明中，发现了位于ORE9下游的负责衰老的因子突变体和新的衰老延迟突变体。在这点上，新的激活标记方法被应用于ore9-1，一衰老延迟变异体，以筛选衰老延迟性的表现更甚于ore9-1的突变体。结果，一新的基因被发现与衰老相关且被命名为“ORE15”。
此处使用的术语“寿命调节”和“衰老调节”相互间意义相同且可被互换地使用而没有本质上的区别。例如，植株中生命延长与衰老延迟是基本相同的。在这点上，本发明的基因或蛋白质可被具体地称为“生命延长”或“衰老延迟”的基因或蛋白质。
此外，必须注意的是，术语“叶片寿命”，正如在此处应用与本发明基因或蛋白质相关，其适合于更确切地表达本发明的目的，并不能解释为是对本发明范围的限制。尽管被表达为叶片寿命调节基因或蛋白质，本发明的基因或蛋白质可涉及对植物的其他器官的寿命的调节，如根、种子、茎、花，以及更进一步的，涉及对植物本身的寿命的调节。
根据本发明的植物叶片寿命调节蛋白质ORE15为(i)，具有与SEQID NO：2序列100％一致的氨基酸序列多肽。考虑到本领域的技术，(ii)，含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的实质部分的多肽，以及(iii)，与(i)或(ii)的基本相似的多肽都被充分地认为落入植物叶片寿命调节蛋白质ORE15的范围内。
此处使用的术语“含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的实质部分的多肽”是指含SEQ ID NO：2的一部分氨基酸序列的多肽，相比于由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的多肽，其仍然具有叶片寿命延长(即，衰老延迟)的功能，并且保留锌指基序。因为在本发明中衰老延迟功能和锌指结构域足以使用，所述多肽的长度和活性不是重要的(“不可能(out of thequestion)”是指“拒绝许可(permission denied)”)。即使与含SEQ ID NO：2的氨基酸的多肽相比活性较低，任何具有延长叶片寿命功能的多肽可被包括在“含SEQ ID NO：2的氨基酸的实质部分的多肽”的范围内，而与长度无关。
本领域的普通技术人员，即理解与本发明有关的现有技术的那些人认为即使含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽被部分地删除，将仍然具有使寿命延长的功能。同样的，还有含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其N-或C-末端被删除的多肽。通常地，本领域中可接受的是即使其N-或C-末端部分被删除，突变的多肽保持所述完整多肽的功能。此外，即使除了N-或C-末端部分的其他部分被删除，突变的多肽可仍然保持完整的ORE15蛋白质的功能。
相应地，在本发明中必须理解的是含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的实质部分的多肽是指本领域普通技术人员可在本发明公开内容的基础上制备的同时保持叶片寿命延长功能和锌指结构域的任何删除的突变体。
短语“与(i)或(ii)的基本相似的多肽”是指具有至少一个被取代的氨基酸残基但仍保持SEQ ID NO：2的氨基酸序列的生理和结构功能，即叶片寿命延长和锌指结构域的突变体。如果其中至少一个氨基酸残基被取代的突变体仍然表现出叶片寿命延长功能，以及保留一锌指结构域，其活性或取代百分比是不重要的。相应地，无论突变的多肽与含完整的SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽相比，在活性上如何低，或者无论突变的多肽与含完整的SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽相比，被如何大量取代，如果其表现出叶片寿命延长功能并具有锌指结构域，所述突变的多肽被包括在本发明的范围内。
即使至少一个氨基酸残基取代了所述完整的多肽的相应的残基，如果所述取代的氨基酸残基与相应的残基在化学上等效，突变的多肽仍然保留所述完整的多肽的功能。例如，当丙氨酸，一疏水性氨基酸，被取代为类似的疏水性氨基酸如甘氨酸，或更加疏水性的氨基酸，如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，含有这些取代氨基酸残基的多肽仍然保留所述完整的多肽的功能，即使活性更低。同样地，由带负电的氨基酸，如谷氨酸和天冬氨酸之间的取代造成的含取代的氨基酸残基的多肽仍然保留所述完整多肽的功能，即使其具有更低的活性。此外，带正电的氨基酸之间的取代的突变多肽也是这样。例如，含取代精氨酸的赖氨酸的取代突变多肽仍然表现出所述完整多肽的功能，即使其活性更低。此外，在其N-或C-末端部分含取代氨基酸的多肽仍然保留所述完整的多肽的功能。
本领域的通用技术使得可以制备保留锌指结构域且表现出与完整的多肽相同的功能的取代突变多肽。
如前所述，“与(i)或(ii)的基本相似的多肽”被理解为包括尽管其中存在至少一个取代氨基酸，其与所述完整的多肽一样表现出寿命延长功能，以及保留锌指区域的任何多肽。然而，从活性的角度出发，具有与SEQ ID NO：2的氨基酸序列更高同源性的多肽更为优选。表现出与野生型多肽60％或更高同源性的多肽是有益的，100％同源为最佳的选择。
更详细的，以上升的优选顺序，更优选的为60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％以及99％。
根据本发明，植物叶片寿命调节基因ORE15包括不仅仅编码SEQ IDNO：2的ORE15蛋白质的多聚核苷酸序列，而且包括编码其变异体的多聚核苷酸序列。具体地，不但编码SEQ ID NO：2的ORE15蛋白质的多聚核苷酸序列，而且编码表现出叶片寿命延长活性且具有锌指结构域的蛋白质的任何多聚核苷酸序列都将落入本发明的范围内。更加优选地，本发明的ORE15基因包括列于SEQ ID NO：1的碱基序列。
根据本发明的另一个实施例，提供了携带有所述ORE15基因的重组载体。
在一个优选的实施例中，本发明的载体包含(a)编码负责植物寿命延长的蛋白质ORE15的核苷酸序列，以及(b)可操作地与所述核苷酸序列连接的启动子。
此处使用的术语“可操作地与......连接”是指调节序列(也就是，启动子、信号序列或转录因子结合位点的排列)被功能性地与其他核苷酸序列连接，由此调节这个核苷酸序列的转录和/或翻译。
根据本发明的载体系统可通过本领域中公知的各种方法构建，所述方法被详细地记载于Sambrook等人，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)，其公开的内容通过在此处引用而成为说明书的一部分。
因为其从植物中分离且功能为延长植物的寿命，本发明的基因更加适用于植物。相应地，本发明提供一种植物表达载体，包括(i)编码所述植物寿命延长蛋白质ORE15的核苷酸序列；(ii)可操作地与(i)的核苷酸序列连接的启动子，其使得在植物细胞中形成相应的RNA分子；以及(iii)3′端非翻译区，其引起在植物细胞中的RNA分子的3′端的多聚腺苷酸化。
在一个优选的实施例中，在本发明中有益的启动子可为在用于向植物中导入基因的技术领域中通常使用的任何启动子。例如，在本发明中可使用从玉米中获得的泛素启动子、花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、胭脂碱合成酶(nos)启动子、玄参花叶病毒35S启动子、甘蔗杆状病毒启动子、鸭跖草黄化斑驳病毒启动子、核酮糖-1，5-双-磷酸羧化酶的小亚基(ssRUBISCO)的光诱导启动子、水稻细胞质的磷酸丙糖异构酶(TPI)启动子、拟南芥(Arabidopsis thaliana)的腺嘌呤磷酸核糖转移酶(adenine phosphoribosyltransferase，APRT)启动子，以及章鱼碱合成酶启动子。
在一个优选的实施例中，引起在本发明中有益的多聚腺苷酸化作用的3′端非翻译区可以包括来自根瘤土壤杆菌(Acrobacterium tumefaciens)的胭脂碱合成酶基因(nos 3′端)的衍生物(Bevan等人，Nucleic AcidsResearch，11(2)：369-385(1983))、来自根瘤土壤杆菌(Acrobacteriumtumefaciens)的章鱼碱合成酶基因的衍生物、番茄或马铃薯的蛋白酶抑制剂I或II的3′端，或者CaMV 35S的终止子。
可选择地，所述载体还可携带编码报导分子(荧光素酶或β-葡萄糖苷酸酶)的基因。此外，本发明所述的载体可包含，如筛选标记、抗生素(例如，新霉素、羧苄青霉素、卡那霉素、奇霉素、匀霉素等等)抗性基因(例如，新霉素磷酸转移酶(nptII)、匀霉素磷酸转移酶(hpt)，等等)。
根据进一步的实施方案，本发明提供一种用于调节植物寿命的方法，包括将所述ORE15基因导入植株中。
根据更进一步的实施方案，本发明提供一种将ORE15基因导入其中的，表现出延长的寿命的转基因植物。
根据再进一步的实施方案，本发明提供一种促进植物生长的方法，包括将ORE15基因导入植物中。
根据又一个的实施方案，本发明提供一种带有被导入其中的ORE15基因的，表现出生长促进的转基因植物。
根据再一个的实施方案，本发明提供一种增加植物产量的方法，包括将ORE15基因导入植物中。
转化了相关基因的植物表现出寿命的延长性或在生长/产量上的增加。携带了ORE15基因的转化体可通过各种表示寿命延长的指标(例如，叶绿素含量的延迟减少、光合能力的延迟丧失、衰老相关基因的表达)或表示生长增加(例如，叶片重量和大小增量的增加)的指标进行鉴定。
此处使用的术语“植物”应当理解为不仅包括成熟的植物，还包括将长成成熟植物的植物细胞、组织以及种子。
在本发明中有用的植物的例子包括粮食作物如水稻、小麦、大麦、玉米、豆类、马铃薯、红豆、燕麦、粟米等等，蔬菜作物如拟南芥、甘蓝、瓜类、南瓜、绿葱、洋葱、胡萝卜等等，经济作物，如人参、烟草、棉花、芝麻、甘蔗、甜菜、紫苏、花生、油菜等等，果树如苹果树、梨树、枣树、猕猴桃树、葡萄树、柑橘树、柿树、李树、杏树、香蕉树等等，花卉如玫瑰、剑兰、非洲菊、康乃馨、百合、郁金香等等，以及饲料作物如黑麦草、红三叶草、果树草、苜蓿、高牛毛草、多年生黑麦草等等。
应到注意到的是术语“增加植物的产量”或“产量增加”是指在植物生物量上的增加，包括植物器官的重量和/或大小的增加，如叶片、茎等等。
将外源的多聚核苷酸，即ORE15基因，导入植物中可通过本领域公知的方法达到(Methods of Enzymology，Vol.153，1987，Wu和GrossmanED，Academic Press；其中公开的内容通过引用成为说明书的一部分)。植物可由载体例如质粒或病毒转化，采用介导体，如土壤杆菌(Agrobacterium sp.)，(Chilton等人，1977，Cell 11：263：271；其中所公开的内容通过引用成为本说明书的一部分)，在所述载体上锚定外源多聚核苷酸，或者通过直接地将所述外源多聚核苷酸导入植物细胞中(Lorz等人，1985，Mol Genet.199：178-182；其中所公开的内容通过此处引用而成为说明书的一部分)，。例如，电穿孔、微粒轰击法，或聚乙烯乙二醇介导的吸收可被用于导入不含T-DNA区域的载体。
广泛使用的是一种植物转化方法，其中携带外源多聚核苷酸的根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)被转染至植物细胞或种子内(见：美国专利5,004,863，5,349,124和5,416,011)。本领域普通技术人员能将所述转染后的植物细胞或种子培养和种植为成熟的生物个体。
转基因植物的产生优选地通过将负责衰老延迟的所述ORE15基因插入至含调节序列的表达载体中以构建重组表达载体，且将所述重组载体导入至开花植物中而完成。
更加优选地，通过将负责衰老延迟的所述ORE15基因插入至含有调节核苷酸序列的表达载体中以构建重组表达载体、以所述重组表达载体转化土壤杆菌(Agrobacterium sp.)，以及将转化后的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)转染至植物中，而产生所述转基因植物。更加具体地，所述被转化的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)为被转化的根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。
术语“调节核苷酸序列”应当理解为包括对相关基因的表达有影响的所有序列。所述调节核苷酸序列的例子包括引导序列、增强子、启动子等等，优选地为启动子。
转基因植物的筛选可通过将转染后的生物曝露至筛选试剂(例如，代谢抑制剂、抗生素以及除草剂)中而完成。携带了筛选标记基因的被转染的植物细胞可在这些筛选试剂的存在下生长和分裂。可应用至本发明的筛选标记的例子包括匀霉素磷酸转移酶基因、磷酸糖酯(glycophosphate)抗性基因，以及新霉素磷酸转移酶(nptII)系统，但不限于此。
源自植物的原生质或各种外植体的发育和再分化在本领域中是公知。转染了携带外源基因的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)的植物细胞可根据本领域公知的方法被培育或再分化(见：美国专利5,004,863，5,349,124以及5,416,011).
根据另一个实施方案，本发明提供了一种筛选植物衰老调节基因的方法，包括(a)在植物细胞中表达或激活所述ORE15基因；以及(b)检测在植物细胞中表达发生变化的基因。
本发明的ORE15基因被发现在本发明中对衰老相关基因的表达具有影响(见：实施例4)。也就是说，相比于野生型植株，所述ORE15基因被激活或过量表达的突变植物允许衰老诱导基因更加活跃地表达。
基于这个发现，当在植物细胞中表达或激活所述ORE15基因时，可通过检测在表达谱中表现出变化的基因来筛选衰老调节基因。
改变其表达谱的基因的检测在本领域中是公知的。例如，在表达谱上发生变化的基因可通过在随机引物的存在下放大转录而被筛选(见：美国专利5,599,672)。在这种情况下，比较ORE15基因被激活的突变体植物和ORE15基因未被激活的对照植株之间的RT-PCR的产物。
根据另一个实施方案，本发明提供一种筛选植物寿命调节相关的材料的方法，包括(a)用有关材料处理植物；以及(b)分析所述ORE15基因在植物中的表达。
经材料处理后，所述ORE15基因在表达上的增加表示所述材料被认为能够延长植物的寿命(衰老延迟)。
所述ORE15基因的表达可以用本领域已知的各种技术定量地和定性地分析。通常，所述分析可在基因和蛋白质水平进行。对于基因水平的分析，基于本发明所确定的，所述ORE15基因的碱基序列合成的引物可用于PCR或在杂交中作为探针(对于这点，DNA芯片是方便的)。可选地，RNA印迹杂交技术(Northern blotting)(见：Peter B.Kaufma等人，Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine，102-108，CRCpress)有益于基因水平的分析。对于蛋白质水平的分析，采用抗所述ORE15基因编码的蛋白质的抗体(见：Enzyme Immunoassay，E.T.Maggio，ed.，CRC Press，Boca Raton，佛罗里达，1980；以及Gaastra，W，Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)，in Methods in MolecularBiology，Vol.1，Walker，J.M.ed.，Humana Press，NJ，1984)，通过免疫分析(例如，放射免疫分析、放射免疫沉淀分析、酶联免疫吸收分析(ELISA)、斑点杂交分析(dot blot assays)、蛋白质印迹免疫分析(WesternBlot assays)、抑制或竞争的分析以及夹心分析(sandwich assays))被定量或定性地完成。
有益效果
如上所述，所述ore15-D突变体的延迟衰老的表型归因于所述ORE15基因的激活。也就是说，所述ORE15基因的激活可造成植物衰老的延迟。相应地，通过以负责叶片寿命的所述ORE15基因转化植物可调节植物的寿命。此外，所述ORE15基因和其ORE15蛋白质可有益于对衰老机理的研究以及对衰老相关基因和衰老调节材料的研究。
附图说明
图1至3分别表示拟南芥(Arabidopsis thaliana)的野生型(Col-O)和寿命延长突变体ore15-D之间随时间的衰老比较(a)、叶绿素含量上的变化(b)，以及光合活性上的变化(c)。
□：Col    ■：ore15-D
Fv：最大可变荧光
Fm：最大荧光量
图4至7表示暗处理后拟南芥(Arabidopsis thaliana)的野生型(Col-O)和寿命延长突变体ore15-D之间随时间衰老的比较(a)、叶绿素含量上的变化(b)、光合活性上的变化(c)，以及通过Northern blotting分析的衰老相关基因的表达谱(d)。
SEN1：衰老相关基因1
SEN4：衰老相关基因4
图8以示意图的形式表示将激活标记载体pSKI015插入至衰老突变体ore15-D的基因组中，以及对野生型(Col-O)和表达了ORE15基因的ore15-D突变体的Northern blotting分析结果。
E：增强子
BAR：除草剂抗性基因
pBS：E.coli复制起始区和氨苄青霉素抗性基因坐落的位点
图9是推知的所述ORE15蛋白质的氨基酸序列。
图10和11表示野生型(Col-D)和所述ore15-D突变体在新鲜叶片重量和叶片面积上的变化。
图12是表示来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的野生型(Col-D)、ore15-D突变体和敲除的突变体(ore12-2KO)之间叶片大小区别的照片。
图13是表示拟南芥(Arabidopsis thaliana)的野生型(Col-D)、过量表达突变体ore15-D和敲除的突变体(ore12-2KO)的叶片的纵切面的解剖学照片(条形尺寸相应于100μm)。
图14是一张总结了拟南芥(Arabidopsis thaliana)的野生型(Col-D)、过量表达突变体ore15-D和敲除的突变体(ore12-2KO)的栅栏薄壁组织的第一层中长度方向和宽度方向上细胞数量的平均值的表格。
具体实施方式
通过下面的实施例可获得对本发明更好的理解，所述实施例用以说明，而并非构成对本发明的限制。
实施例1：从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中筛选延迟衰老的突变体
首先，在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中诱导突变。为此，使用电穿孔方法，将含有位于T-DNA的右边附近的4个CaMV35S增强子，以及赋予Basta除草剂抗性的bar基因(草铵膦乙酰转移酶基因)的激活标记载体pSKI015(Weigel等人，Plant Physiology 122：1003-1014，2000)(由美国Weigel实验室提供)导入根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefacience)ABI菌株(由美国Amasino实验室提供)中，随后在含有卡那霉素和羧苄青霉素的培养基中进行筛选。此后，使用floral dip方法(Clough等人，Plant J.，16(6)：735-743，1998)，带有pSKI015载体的根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefacience)菌株被转染至拟南芥(Arabidopsis thaliana)延迟衰老突变体ore9-1中(Woo H.R.等人，Plantcell 13：1779-1790，2001)。被转染的拟南芥(Arabidopsis thaliana)的种子在Basta除草剂的存在下被选择。在保持23℃的温室中，栽种10,000株T1系的植株，用肉眼观察由于衰老而导致的叶绿素流失的黄化。选择较ore9-1叶黄化更弱的突变系，并命名为ore15-D。图1示出在拟南芥(Arabidopsis thaliana)哥伦比亚野生型(Col-O)和突变体Ore15-D中随时间的叶片衰老图。从图1中可明显看出，相比于野生型，本发明的突变体ore15-D表现了更佳的延迟衰老性能。
实施例2：衰老延迟突变体ore15-D的表达的检测
为了检测ore15-D突变体的衰老延迟特性，比较了突变体ore15-D和野生型(Col-D)的叶片叶绿素含量和光合作用活性。
2-1)叶绿素含量的测定
各样品的叶片在80℃、95％的乙醇中煮沸以萃取叶绿素。叶绿素含量通过在648nm和664nm的光吸收进行测定，并且表示为相对于叶片材料的鲜重的百分比(Vermon等人，Anal.Chem.32：1142-1150，1960)。
在野生型(Col-O)中，测得的叶绿素含量在28DAE(出苗后天数)时为50％，如图2所示，其在24DAE时开始褪色。相反，ore15-D的叶绿素含量在28DAE时保持100％且甚至直到36DAE为约25％。
2-2)光合作用的活性
使用Oh的方法(Oh S.A.等，Plant Mol.Biol.30：939，1996)来测定光合作用活性。一开始，各DAE的叶片在暗处放置15min并使用植物光合作用效率分析仪(plant efficiency analyzer)(Hansatech Instruments，Morfolk，英国)测量叶绿素的荧光。利用叶绿素的荧光，光合作用活性被表示为由最大可变荧光(Fv)与最大荧光值(Fm)的比率(Fv/Fm)给出的PSII(光系统II)的光化学效率。该值越高，光合作用效率就越佳。
光合作用活性也表现出类似于叶绿素含量的变化模式。当在野生型(Col-O)中24DAE之后光合作用活性开始显著下降时，ore15-D在28DAE之后表现缓慢的光合作用衰退(见图3)。
综合来看，上面获得的数据意味着由于ORE15的突变，相比于野生型，ore15-D突变类型表现出延迟衰老的表型，以及意味着由于在叶绿素含量和光合作用活性上延迟的生物衰退导致了衰老延迟。
实施例3：根据暗处理的ore15-D突变体的叶片寿命的变化
根据暗处理，一种衰老加速因素，以在光合作用活性和叶绿素含量方面的变化来测定ore15-D突变体的叶片寿命。
使来自野生型(Col-O)和ore15-D突变体的各24叶片(12DAE)漂浮在3mM 2-[N-吗啉基]-乙磺酸(pH5.8)(在下文被称作′MES缓冲液′)上。当被放置于22℃完全黑暗的箱体中时，所述叶片每隔一天被单独地分析光合作用活性和叶绿素含量，如实施例2中那样。图4是暗处理之后拟南芥(Arabidopsis thaliana)的野生型(Col-O)和ore15-D突变体的叶片中随时间显示衰退进程的照片。如在照片中所示，本发明的野突变体ore15-D相比于野生型在衰老上极大的延迟。此外，暗处理5天后，如图5和6所示，与暗处理之前的测定相比，在突变体ore15-D中，叶绿素含量和光合作用活性分别地被测量为多达99.5％和99％，然而在野生型(Col-O)中，分别被大为降低至75％和74％。
实施例4：在ORE15突变体中衰老相关基因的表达
为检测ORE15对衰老相关的基因(SAGs)的影响，采用Northernblots，对在暗处理期间随时间的各SAG表达谱进行分析。样品为在第0，2，4和6DAT分离的总RNA。将10μg制备好的总RNA装载在各泳道上，且SEN1(GenBank，登记号：NM 119743)和SEN4(GenBank，登记号：NM 119173)基因被用作探针。
在图7中给出了Northern blotting的结果。如图7中所示，随着衰老的进行，在第8DAT，Col-O确实增加了衰老相关的基因SEN1和SEN4的表达。然而，在相同的时间内，直至第12DAT，在ore15-D突变体中SAGs的表达才增加。这个现象表示ORE15突变体在分子水平以及在生理水平影响叶片的寿命。
实施例5：ORE15基因的克隆和碱基测序
为了在ore15-D突变体中搜寻在T-DNA附近，由增强子激活的基因，质粒拯救方法(Weigel等人，Plant Physiology 122：1003-1014，2000)被用于基因的分离。在图8中，显示了带有激活标记载体pSKI015插入其中的部分ore15-D突变体的基因组的示意图。从ore15-D突变体中分离出染色体的DNA(Dellaporta等人，Plant Mol.Biol.Rep.1：19-21，1983)。随后，5μg的染色体DNA以EcoRI消化，在乙醇中沉淀，并被干燥。该DNA消化物被自连接并被导入至E.coli DH5α，随后E.coli DH5α在氨苄青霉素存在下进行培养以选择转化体。
对转化了含E.coli复制区域、选择标记，二者都存在于T-DNA中，以及T-DNA的右边缘附近的7.0kb的植物染色体DNA片段的质粒的E.coli进行培养以在选择平板上形成菌落。在从所述菌落中制备质粒之后，测定T-DNA右边缘附近的碱基序列。在这点上，基于用于质粒拯救方法的EcoRI位点下游的碱基序列合成一寡聚链，并用于碱基测序。参考拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组数据库，基于所确定的碱基序列发现最接近增强子的开放阅读框。由OREl5基因表达的蛋白质由243个氨基酸构成，如SEQ ID NO：2和图9中所示。
使用ORE15基因作为探针，进行Northern blotting分析。使用TRI-试剂(Sigma)从野生型(Col-O)和突变体ore15-D中分离出总RNA。将10μg总RNA装载于1.2％琼脂糖/甲醛凝胶上的各泳道内，分离并转移至尼龙膜上。用2X SSC冲洗尼龙膜5min以除去琼脂糖残余之后，使用UV光(254nm，0.18J/Sq.cm2)，使该RNA固定至所述尼龙膜。根据Park’s方法(Park等人，Plant Mol.Biol.26：1725-1735，1994)使被转移至尼龙膜之上的印记接受预杂交和杂交。
结果显示在图8中。尽管在野生型(Col-O)中观察到ORE15基因没有表达，发现在ore15-D突变体中基因被过量表达。
实施例6：将ORE15基因导入至野生型(Col-O)
为检测ore15-D突变体的延迟衰老表型是否是由于激活ORE15基因的结果，将含ORE15基因的2.5kb的DNA片段导入至野生型(Col-D)内以诱导过量表达。为该目的，采用RT-PCR分离ORE15的全长cDNA。其中含ORE15基因的DNA片段被插入至pGEM-T Easy载体内(PromegaCorporation Madison，WI.美国)，且该重组体被称为pORE15/GTE。以BglII和BstEII对pORE15/GTE进行双酶切以切除随后被插入至pCAMBIA3301内(Caberra，澳大利亚)的ORE15基因片段。所形成的重组载体，被称为pORE15/3301，Agrobacterium tumefacience AGL1菌株被转化。根据floral dip方法(Clough等人，Plant J.，16(6)：735-743，1998)，被转化的Agrobacterium tumefacience AGL1菌株，称为pAT-ORE15，被转染至野生型(Col-O)。转基因的拟南芥(Arabidopsis thaliana)的延迟衰老表型证明了ORE15基因负责调节拟南芥(Arabidopsis thaliana)的叶片寿命。
实施例7：ore15-D突变体在生长中的叶片重量和大小的变化
根据生长的时间检测出本发明的特点是，伴随叶片寿命的延长，ore15-D突变体的叶片重量和大小较之野生型也有较大的增加。
在从叶片的DAE(出苗后天数)开始的4-天间隔下，测量来自野生型(Col-O)和ore15-D突变体的叶片的重量和大小。关于叶片大小，使用软件Scion image(NIH，美国)，根据叶片的扫描数据而测定。结果在图10中给出。野生型(Col-O)和ore15-D突变体之间叶片重量的不同从8DAE开始显著，且在之后增大。此外，如图11所示，从8DAE开始，在叶片的大小上ore15-D突变体也超过野生型(Col-O)。
在12DAE时，在野生型(Col-O)、过量表达的突变体ore15-D，以及敲除的突变体ore15-2KO之中证实了这些表型的不同。观察到ore15-D在叶片大小上与野生型相比有较大地增加(图12)，且这种大小的增加在包括叶片在内的ore15-D的几乎所有器官中被发现。为检测何种因素诱导了在器官大小上的变化，对叶片的纵向切面进行解剖学观察(图13)，且对第三叶丛叶片(the third rosette leaf)进行解剖学分析(图14)。在栅栏薄壁组织内，ore15-D突变体具有稍微较小的细胞尺寸，但具有比野生型更多的细胞数量。同时，敲除的突变体ore15-2KO表现出的表型与过量表达的突变体ore15-D的正好相反。相应地，在ore15-D叶片器官中的表型特征可归因于栅栏薄壁组织的细胞数量而不是细胞尺寸的增加，意味着ore15-D通过调节细胞的数量在延迟植物衰老中起重要的作用。
尽管需要另外的实施例以检查是否这种现象是衰老调控的直接影响或间接影响的因素，在叶片大小和重量上的增长可应用于各种农作物，造成产量的极大增加。
序列表
<110>基诺麦因有限公司(GENOMINE INC.)
     波斯泰克基金会(POSTECH FOUNDATION)
<120>调节植物叶片寿命的蛋白质，其基因和它们的用途
<150>KR/10-2004-0069454
<151>2004-09-01
<160>2
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>732
<212>DNA
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>1
atggttagag aaggtgaaga agaagaagag atgatgatga tgatggcaac gaaacctgca     60
tggcttgaag gtttaatggc ggagactttc ttctcaagct gtggaatcca cgaaactcgc    120
cgtaaaagtg aaaagaacgt tttttgctta ctctgttgtc tcagtgtttg tcctcactgt    180
ctcccttctc atcgctctca tcctcttctt caggtgagac gatacgtata ccacgacgtc    240
gttcggttga gtgatcttga gaagctcata gattgttcat atgttcagcc atatacaatt    300
aatggagcca aagtgatatt cttaaaccaa agacaacaat cacgagctaa ggtttcttca    360
aatgtttgct tcacttgtga tagaatcctt caagaaccat tccacttttg ttccctctct    420
tgcaaggtgg attatttatc atatcaagga gatgatttat caagcattct ctatagaatt    480
gatgaatcag attttacgtt cgagggtttg agaatggacg gacatgatca gctcggagag    540
atatcgacga tggaggatgg ggaggatata ctggtaattt cagatgaatc tgagcaaggt    600
aacaatagtc ataagaaaga gaagaagaag agcaagaaga agaagccaga gagcaattac    660
ttgcctggga tggttctttc atcacttggt aatagaagaa aaggtgctcc tcatagggct    720
cctttttcat aa                                                        732
<210>2
<211>243
<212>PRT
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>2
Met Val Arg Glu Gly Glu Glu Glu Glu Glu Met Met Met Met Met Ala
  1               5                  10                  15
Thr Lys Pro Ala Trp Leu Glu Gly Leu Met Ala Glu Thr Phe Phe Ser
             20                  25                  30
Ser Cys Gly Ile His Glu Thr Arg Arg Lys Ser Glu Lys Asn Val Phe
         35                  40                  45
Cys Leu Leu Cys Cys Leu Ser Val Cys Pro His Cys Leu Pro Ser His
     50                  55                  60
Arg Ser His Pro Leu Leu Gln Val Arg Arg Tyr Val Tyr His Asp Val
 65                  70                  75                  80
Val Arg Leu Ser Asp Leu Glu Lys Leu Ile Asp Cys Ser Tyr Val Gln
                 85                  90                  95
Pro Tyr Thr Ile Asn Gly Ala Lys Val Ile Phe Leu Asn Gln Arg Gln
            100                 105                 110
Gln Ser Arg Ala Lys Val Ser Ser Asn Val Cys Phe Thr Cys Asp Arg
        115                 120                 125
Ile Leu Gln Glu Pro Phe His Phe Cys Ser Leu Ser Cys Lys Val Asp
    130                 135                 140
Tyr Leu Ser Tyr Gln Gly Asp Asp Leu Ser Ser Ile Leu Tyr Arg Ile
145                 150                 155                 160
Asp Glu Ser Asp Phe Thr Phe Glu Gly Leu Arg Met Asp Gly His Asp
                165                 170                 175
Gln Leu Gly Glu Ile Ser Thr Met Glu Asp Gly Glu Asp Ile Leu Val
            180                 185                 190
Ile Ser Asp Glu Ser Glu Gln Gly Asn Asn Ser His Lys Lys Glu Lys
        195                 200                 205
Lys Lys Ser Lys Lys Lys Lys Pro Glu Ser Asn Tyr Leu Pro Gly Met
    210                 215                 220
Val Leu Ser Ser Leu Gly Asn Arg Arg Lys Gly Ala Pro His Arg Ala
225                 230                 235                 240
Pro Phe Ser

Claims (7)

1.一种叶片寿命调节蛋白质，由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成。
2.一种编码权利要求1所述的蛋白质的植物叶片寿命调节基因。
3.根据权利要求2所述的植物叶片寿命调节基因，其特征在于，其由SEQ ID NO：1的核苷酸序列构成。
4.一种携带权利要求2所述的基因的重组载体。
5.一种调节植物寿命的方法，包括将权利要求2所述的基因导入植物中。
6.一种促进植物生长的方法，包括将权利要求2所述的基因导入植物中。
7.一种增加植物产量的方法，包括将权利要求2所述的基因导入植物中。
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