CN101018859A - 粘蛋白3egf样结构域 - Google Patents

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Abstract

本发明提供粘蛋白3多肽，含有粘蛋白3EGF样结构域的多肽和编码这种多肽的核酸。发明还提供使用这些多肽或核酸治疗患有或存在发生消化道疾病或病症风险的个体的方法。

Description

粘蛋白3EGF样结构域
联邦资助研究或开发
美国政府依照退役军人事务功绩评价奖(Veterans Affairs Merit ReviewAward)具有本发明中的某些权利。
技术领域
本发明涉及表皮生长因子(EGF)结构域，更具体的涉及粘蛋白多肽中的EGF结构域。
背景技术
粘蛋白(mucin)是由大部分上皮组织表达的分泌的和细胞表面糖蛋白的家族。粘蛋白指向上皮组织的表面，并被认为具有保护功能。已经在诸如胃炎和消化性溃疡病(peptic ulcer disease)、克罗恩氏病(Crohn’sdisease)、溃疡性结肠炎和肠癌的病症中发现了粘蛋白的变异。粘蛋白可以分为两类，分泌的粘蛋白蛋白质或膜结合粘蛋白蛋白质。分泌粘蛋白的特征在于被称为“Von Willebrand D型”(Von Willebrand-type D)结构域的羧基和氨基末端结构域，所述结构域在被严重糖基化的大的富含丝氨酸和苏氨酸结构域的侧面。这些粘蛋白能够首尾相连形成长聚合物，这使得它们在溶液中具有高粘性。膜结合粘蛋白的特征在于含有小胞质结构域、疏水跨膜结构域和胞外结构域的羧基末端结构域，所述羧基末端结构域在某些情况下的特征在于富含半胱氨酸的结构域和大的富含丝氨酸和苏氨酸的糖基化结构域。已有这些基因的信使RNA剪接变体的描述，所述变体编码没有跨膜结构域的蛋白质，这使得它们如分泌的单体粘蛋白一样行使功能。在这点上，可以认为跨膜粘蛋白具有两种功能，既作为膜相关蛋白也作为分泌蛋白存在。
许多不同的蛋白质含有EGF样结构域，其被称为G-模块(G-modules)。在几种生长因子以及大量涉及胞外基质形成、细胞粘着、趋化现象和伤口愈合的胞外蛋白中发现存在EGF样结构域。在EGF样结构域中发现的六个半胱氨酸构成产生结构性结构域的三个分子内二硫键，其在保持蛋白质-蛋白质相互作用或者也许在蛋白质-膜相互作用中是重要的。该结构域或G-元件由两个通过二硫键结合的小双链β折叠组成。一些但不是所有的EGF样结构域能够结合EGF受体。
概述
在一方面，本发明提供分离的核酸，其包括编码粘蛋白3EGF样结构域的核酸分子。典型的序列包括SEQ ID No：3，4，5，6，9，11，12和14。本发明提供含有这种核酸的构建体。构建体可以含有多个粘蛋白3EGF样结构域(例如2，3，4，5，6个或更多)。当存在多个粘蛋白3EGF样结构域时，结构域通常通过接头区(linker region)分隔。接头区的长度上可以为至少100个氨基酸。典型接头区的序列如SEQ ID NO：10或13中所示。粘蛋白3EGF样结构域可以为小鼠粘蛋白3EGF样结构域或人粘蛋白3EGF样结构域。可选的，小鼠和人粘蛋白3EGF样结构域可以共同存在于一个构建体中。
在另一方面，本发明提供治疗患有或存在发生消化道疾病或病症风险的个体的方法。这种方法典型地包括施用有效量的包含粘蛋白3EGF样结构域的多肽。代表性的粘蛋白3EGF样结构域具有SEQ ID No：3，4，5，6，9，11，12和14中所示的序列。代表性的消化道疾病包括，但不限于，胃炎、消化性溃疡病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和肠癌。通常，有效量是在消化道中有效刺激细胞迁移或伤口愈合的量。
在另一方面，本发明提供治疗或预防个体中上皮损害的方法。这种方法典型地包括施用有效量的包含粘蛋白3EGF样结构域的多肽。典型的粘蛋白3EGF样结构域具有SEQ ID No：3，4，5，6，9，11，12和14所示的序列。代表性的上皮损害(lesion)包括，例如上消化道、食道、真皮、表皮、阴道、子宫颈、子宫、胃肠道、远端肠道(distal bowl)、呼吸道上皮(respiratoryepithelium)和/或角膜上皮的损害。
粘蛋白3EGF样结构域通常不直接激活EGF受体。另外，粘蛋白3EGF样结构域能够刺激蛋白质的磷酸化；通常是约160到约200kDa大小的蛋白质。
除非另外说明，本文中所用的所有技术和科技术语的含义都与本发明所属技术领域的普通技术人员所通常理解的相一致。尽管类似于或等同于本文所述的方法和材料也可以被用于本发明的实施或测试，下文描述了合适的方法和材料。此外，材料、方法和实施例仅起说明作用，并不用于进行限定。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利或其它参考文献都通过参考全文引入。如果出现抵触，以本说明书，包括定义为准。
本发明的一个或多个实施方式的详情在附图和其下说明书中被阐明。本发明的其它特征、目的和优点可以从附图和详细说明，以及从权利要求中显而易见。
附图说明
图1.(A)小鼠Muc3和人MUC3和MUC17的富含半胱氨酸区域中半胱氨酸的间隔(spacing)。显示EGF和三叶形(trefoil)基序的半胱氨酸间隔以用于比较。(B)小鼠Muc3和人MUC3的EGF1结构域、糖基化连接结构域和EGF2结构域的氨基酸序列。C.于E.coli中表达和纯化的重组小鼠GST-Muc3融合蛋白的图示。数字对应于前述原始Muc3 cDNA序列中的碱基对(bp)(Shekels等人，1998，Biochem.J.，330：1301-1308)。
图2.(A)24小时后重组GST肽、m3EGF1，2和重组EGF对A431细胞数量的影响，表示为无血清培养基中对照细胞数量的百分比。(B)24小时后通过MTT测量的Lovo结肠癌细胞的增殖。阴性对照由Tris缓冲液中的无血清培养基组成，阳性对照为生长于10％胎牛血清(FBS)中的细胞。
图3.总伤口闭合的百分比。在年轻的(Young)成年小鼠结肠(YAMC)单细胞层中制造创伤，并在24小时进行测量。使用EGF(1ng/ml)作为阳性对照，其在24小时后导致100％的伤口闭合。
图4.(A)18-24小时内响应m3EGF1，2，m3EGF1，m3EGF2的A431细胞迁移，其被表示为在对照无血清(SF)培养基中迁移的对照细胞数量的百分比。(B)用不同浓度的肽处理的Lovo细胞的迁移，其被表示为24小时后在无血清培养基中迁移的对照细胞的百分比。对于每种情况N＝6孔。
图5.(A)响应于m3EGF1，2(10μg/ml)或EGF(1ng/ml)的24小时内迁移的cA431细胞的平均数量，所述m3EGF1，2或EGF含有和不含有特异性EGF/ErbB1受体抑制剂tyrphostin，AG1478(150nm)的。(B)响应于m3EGF1，2(10μg/ml)或EGF(1ng/ml)的24小时内迁移的cA431细胞的平均数量，所述m3EGF1，2或EGF含有和不含有酪氨酸磷酸化的一般性抑制剂，染料木黄酮(genistein)(Gen，15μg/ml)。SF＝无血清培养基，对于每种处理N＝6孔。
图6.(A)将YAMC细胞暴露于EGF(1ng/ml)中5分钟，或者无血清培养基(SF)，mEGF1，2(10μg/ml)，或GST(10μg/ml)中30分钟。
图7.(A)用(+)或不用(-)TNF-α(100ng/ml)处理48小时后凋亡的百分比变化。细胞系包括亲代Lovo、LhM3c14、Lmock以及在加入TNF-α前用m3EGF1，2(10μg/ml)或GST(5μg/ml)预处理1小时的亲代Lovo细胞。(B)用(+)或不用(-)连续的干扰素γ和抗fas抗体处理72小时后凋亡的百分比变化。细胞系包括LhM3c14和LMock。
图8.(A)在小鼠中施用乙酸后30小时的隐窝损伤分值(Crypt damagescore，CDS)，所述小鼠在乙酸后12和24小时经直肠接受PBS中的m3EGF1，2(100μg)或对照肽BSA(100μg)的治疗。(B)小鼠施用乙酸后30小时每个样本中具有完全III级溃疡的低倍(10×)区域的平均数量，所述小鼠用PBS中的100μg m3EGF1，2或对照肽100μg BSA处理。(C)在小鼠中施用乙酸后30小时的隐窝损伤分值(CDS)，所述小鼠在乙酸后12和24小时经直肠接受GST，m3EGF1(EGF1)，m3EGF2(EGF2)，或m3EGF1，2的治疗。(D)在小鼠中施用乙酸后30小时每个样本中具有完全III级溃疡形成的低倍(10×)区域的平均数量，所述小鼠在乙酸后12和24小时经直肠接受GST，m3EGF1，m3EGF2，或m3EGF1，2的治疗。
图9.显示从中段到远端小鼠结肠(A，B)和近端结肠(C，D)样本隐窝损伤分值和具有III级溃疡形成的区域平均数量/样本。来自用GST和BSA处理的对照小鼠的分值加到“所有对照”下。
图10.人和小鼠粘蛋白3的核苷酸和氨基酸序列。
各种图中类似的参考符号表示类似的元件。
发明详述
肠膜结合粘蛋白基因，Muc3，编码大的、膜结合粘蛋白，其具有胞外结构域，所述胞外结构域由一个大的糖基化串联重复结构域和一个含有两个富含半胱氨酸结构域的结构域组成，所述富含半胱氨酸结构域有些类似于表皮生长因子(EGF)样基序或结构域。Muc3在肠道中高表达。核酸
本发明部分基于对Muc3核酸分子和Muc3核酸分子中EGF样结构域的鉴定。本发明的核酸分子包括，例如，SEQ ID NO：17或19中显示的序列。其它的粘蛋白3核酸可以在例如GenBank保藏号BC058768，AF450241，AF450242和AF450243中找到。本文中，术语“核酸分子”可以包括DNA分子和RNA分子以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA分子类似物。本发明的核酸分子可以是单链或双链，是单链还是双链取决于其用途。
本发明进一步包括不同于SEQ ID NO：17或19，或GenBank保藏号BC058768，AF450241，AF450242或AF450243中所示核苷酸序列的核酸分子。本发明的核酸分子包括至少10个核苷酸长且与SEQ ID NO：17或19或GenBank保藏号BC058768，AF450241，AF450242和AF450243中所示任一序列具有至少75％序列同一性(例如，至少80％，85％，90％，95％或99％的序列同一性)的分子。与SEQ ID NO：17或19或GenBank保藏号BC058768，AF450241，AF450242和AF450243所示核酸序列在序列上不同的核酸分子可以通过标准技术产生，例如定点诱变或PCR介导的诱变。另外，核苷酸改变可以通过，例如饱和诱变，随机地沿整个或部分编码EGF样结构域的核酸分子被导入。可选的，可以通过化学合成具有这种改变的核酸分子而将核苷酸改变导入到序列中。通常，人粘蛋白基因和蛋白质用大写字母表示，而小鼠粘蛋白基因和蛋白质用小写字母表示。
计算序列同一性百分数时，比对两条序列，测定两序列间核苷酸或氨基酸残基相同匹配的数目。相同匹配的数目除以比对区域的长度(即比对核苷酸或氨基酸残基的数目)，乘以100以得出序列同一性百分数值。可意识到比对区域的长度可以是一个或全部两个序列的一部分，直至最短序列的全长大小。可意识到单个序列可以与其它序列进行不同的比对，并因此在每个比对区域具有不同的序列同一性百分数值。注意同一性百分数值通常被四舍五入为最接近的整数。例如，78.1％，78.2％，78.3％和78.4％被四舍五入为78％，而78.5％，78.6％，78.7％，78.8％和78.9％被四舍五入为79％。还要注意比对区域的长度总是整数。
可以通过使用整合到BLAST(基础局部比对检索工具)程序中的Altschul等人(1997，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402)所述的算法进行两个或多个序列的比对以测定序列同一性百分数值，该程序可以从互联网上的ncbi.nlm.nih.gov获得。进行BLAST检索可以用Altschul等人的算法测定编码Muc3 EGF样结构域的核酸分子和任何其它进行比对的序列或其部分之间的序列同一性百分数。BLASTN是用于比对和比较核苷酸序列之间同一性的程序，而BLASTP是用于比对和比较氨基酸序列之间同一性的程序。当应用BLAST程序计算本发明序列和另一序列之间的同一性百分数时，使用各程序的默认参数。
本文中，“分离的”核酸分子是这样一种核酸分子，所述核酸分子从通常与该分离的核酸分子相连的其它核酸分子上分离。因此，“分离的”核酸分子包括，但不限于，不具有在该分离的核酸分子来源的生物体的基因组中天然位于该核酸一端或两端侧面的序列的核酸分子(例如，通过PCR或限制性内切核酸酶消化产生的cDNA或基因组DNA片段)。这种分离的核酸分子通常被导入载体(例如，克隆载体或表达载体)中以便于处理或产生融合核酸分子。此外，分离的核酸分子可以包括工程化的核酸分子，例如重组的或合成的核酸分子。在诸如核酸库(例如cDNA或基因组文库)或含有被限制性消化的基因组DNA的凝胶(例如琼脂糖或聚丙烯酰胺)的一部分中存在于数百到数百万其它核酸分子中的核酸分子不被认为是分离的核酸。
可以通过使用本领域常规的技术获得本发明的分离的核酸分子。例如，可以通过使用包括，但不限于重组核酸技术和/或聚合酶链反应(PCR)的任意方法获得本发明范围内的分离的核酸。一般的PCR技术描述于，例如PCR Primer：ALaboratory Manual，Dieffenbach & Dveksler，Eds.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1995中。重组核酸技术包括，例如限制性酶消化和连接，其可以被用于分离本发明的核酸分子。本发明的分离的核酸也可以作为单个核酸分子或作为一连串寡核苷酸通过化学合成。此外，本发明的分离的核酸分子也可以通过诱变获得。例如，与本领域已知的序列具有同一性的分离的核酸可以通过使用普通的分子克隆技术(例如定点诱变)进行突变。可能的突变包括，但不限于，删除、插入、取代及其组合。
核酸分子也能够含有多个粘蛋白3EGF样结构域。例如，核酸分子可以含有两个粘蛋白3EGF样结构域、三个粘蛋白3EGF样结构域、四个粘蛋白3EGF样结构域，或更多。典型地，每个粘蛋白3EGF样结构域通过接头区与另一个粘蛋白3EGF样结构域分隔。接头区可以包括氨基酸(例如，从5到150个氨基酸)、化学连接或其组合。
本发明还提供含有编码一个或多个Muc3 EGF样结构域的核酸分子的构建体。包括表达载体在内的适于在本发明中使用的构建体可以通过商业途径购得和/或通过本领域常规的重组DNA技术方法产生。含有Muc3核酸分子的构建体可以具有可操作地连接于该Muc3核酸分子的表达所需的元件，并进一步可以包括诸如编码选择性标记的序列(例如抗生素抗性基因)和/或在纯化含有EGF样结构域的多肽中使用的序列(例如6×His标签)。
表达所需的元件包括指导和调控核酸编码序列的表达的核酸序列。表达所需的元件的一个实例是启动子序列。表达所需的元件也可以包括内含子、增强子序列、应答元件或调控核酸表达的可诱导元件。表达所需的元件可以来源于细菌、酵母、昆虫、哺乳动物或病毒，载体可以含有来自不同来源的元件的组合。在例如Goeddel，1990，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology，185，Academic Press，San Diego，CA中描述了表达所需的元件。本文中，可操作地连接表示启动子和/或其它一个或多个调控元件相对于核酸以指导或调控核酸表达的方式置于载体中。许多将核酸导入细胞的方法，无论是体内还是体外，都是本领域技术人员所公知的，其包括，但不限于，磷酸钙沉淀、电穿孔、热休克、脂质转染法、显微注射和病毒介导的核酸转移。
本发明的另一方面涉及宿主细胞，所述宿主细胞导入本发明的载体，例如表达载体，或本发明的分离的核酸分子。术语“宿主细胞”不仅指特定的细胞，也指这种细胞的后代或潜在的后代。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，编码Muc3 EGF样结构域的核酸可以在细菌细胞，例如E.coli，或在昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)中表达。其它合适的宿主细胞是本领域技术人员所公知的。
含有Muc3核酸分子的载体于____________保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Boulevard Manassas，VA20110，，保藏号为_____和_____。根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的规定保存每个保藏物。生成该保藏物仅仅是为了方便本领域技术人员，并非承认该保藏物是35U.S.C.§112所要求的。
多肽
本发明的一方面涉及纯化的粘蛋白3EGF样结构域多肽，以及粘蛋白3EGF样结构域多肽片段。代表性的粘蛋白3EGF样结构域显示于SEQ IDNo：3，4，5和6中，其中每个显示唯一的半胱氨酸模式。第一个小鼠粘蛋白3和人粘蛋白3EGF样结构域的氨基酸序列分别显示于SEQ ID No：12和9中；小鼠粘蛋白3和人粘蛋白3接头区的氨基酸序列分别显示于SEQ IDNo：13和10中；第二个小鼠粘蛋白3和人粘蛋白3EGF样结构域的氨基酸序列分别显示于SEQ ID No：14和11中；人和小鼠粘蛋白3的氨基酸序列显示于SEQ ID No：18和20中。粘蛋白17EGF样结构域也显示于SEQ ID No：7和8中，并且也示范了一种唯一的半胱氨酸模式。
本文中使用的术语“纯化的”多肽指已经从天然与其伴随的细胞组分中分离或纯化的多肽。典型地，当它占干重的至少70％(如至少75％，80％，85％，90％，95％或99％)，没有蛋白质和与其天然相关的天然出现的分子时，多肽被认为是“纯化的”。由于化学合成的多肽生来就与天然与其相伴的组分分离，因而合成的多肽是“纯化的”。可以通过已知的方法，例如DEAE离子交换、凝胶过滤和羟磷灰石色谱法从天然来源(例如生物样品)中纯化多肽。也可以通过例如表达表达载体中的核酸获得纯化的多肽。此外，可以通过化学合成获得纯化的多肽。多肽的纯度可以通过使用任何合适的方法，例如柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析进行测量。
除了天然存在的多肽，技术人员可进一步意识到可以将改变导入到本文所讨论的核酸分子(例如，具有SEQ ID NO：17或19或GenBank保藏号BC058768，AF450241，AF450242和AF450243中所示序列的核酸分子)中，从而导致所编码的多肽的氨基酸序列的改变。例如，可以将改变导入Muc3核酸编码序列中，导致一个或多个氨基酸残基上保守的和/或非保守的氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是指一个氨基酸残基被具有类似侧链的不同氨基酸残基替代。氨基酸残基之间的相似性在本领域中进行评定。例如，Dayhoff等人(1978，在Atlas of Protein Sequence and Structure，Vol.5，Suppl.3，pp 345-352中)提供了氨基酸取代的频率表，其能够用于评定氨基酸的相似性。非保守取代是指其中氨基酸残基被不具有类似侧链的氨基酸残基替代。
发明还提供了嵌合或融合多肽。在本文中，“嵌合”或“融合”多肽包括一个或多个可操作地连接于异源多肽的Muc3多肽。异源多肽可以位于Muc3多肽的N端或C端。在嵌合或融合多肽中，术语“可操作地连接”用于表示两个多肽相对于彼此在读码框中被编码。在融合多肽中，异源多肽通常具有预期的性质，例如纯化融合多肽的能力(例如通过亲和纯化)。本发明的嵌合或融合多肽可以通过标准重组DNA技术制备，并且可以使用商业上可购得的构建体。
一般在用于纯化的融合蛋白中使用的多肽是谷胱甘肽S-转移酶(GST)，虽然大量其它的多肽也是可获得的并且可以被使用。另外，蛋白质水解裂解位点可以导入Muc3多肽和非Muc3多肽的连接处，以使得在纯化融合多肽后能够分离两个多肽。裂解该蛋白质水解位点的酶包括因子Xa，凝血酶或肠激酶。编码可用于亲和纯化Muc3多肽的异源多肽的代表性表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith&Johnson，1988，Gene，67：31-40)，pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)。
使用粘蛋白3EGF样结构域的方法
本发明提供预防或治疗患有或存在发生消化道疾病风险的个体中消化道疾病的方法。本发明还提供治疗个体中上皮损害的方法。通过施用含有EGF样结构域的多肽或编码该结构域的核酸治疗个体。在显示消化道疾病或病症的特征性症状之前向具有消化道疾病风险的个体施用所述多肽或核酸，从而在疾病或病症的发展过程中对其进行预防或延缓。
消化道疾病包括，但不限于，胃炎、消化性溃疡病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎或肠癌。在本文中，上皮损害指，但不限于，上消化道、食道、真皮、表皮、阴道、子宫颈、子宫、胃肠道、远端肠道、呼吸道上皮或角膜上皮的损害。具体地，上皮损害可以是口炎、粘膜炎(mucositits)、龈炎、胃食管返流疾病导致的损害、创伤性损害、烧伤、压迫性溃疡(pressureulcer)、湿疹、接触性皮炎、牛皮癣、疱疹性损害、痤疮、肠炎、直肠炎、由克罗恩氏病或溃疡性结肠炎导致的损害、角膜炎、角膜溃疡、角膜结膜炎、圆锥形角膜、结膜、眼睛炎症或瘢痕性类天疱疮(cicatricial pemhigoid)。作为范例，本文所述的损害可以是由细菌、病毒、原生动物或真菌感染所导致的；由过敏反应、哮喘、慢性梗阻性肺病所导致的；由吸入烟尘、颗粒物质或化学物所导致的；由抗肿瘤化学治疗或抗肿瘤放射性治疗所导致的。
在一个实施例中，施用至个体的化合物可以是Muc3多肽，或含有Muc3 EGF样结构域的多肽(例如Muc3 EGF1或Muc3EGF2；例如SEQ ID No：3，4，5，6，9，11，12或14)。用于施用的化合物可以是融合多肽。在另一个实施例中，施用至个体的化合物可以是编码Muc3多肽或一个或多个Muc3EGF样结构域的核酸分子。核酸编码序列(例如全长或不是全长)可以被导入合适的表达载体中，从而Muc3或Muc3 EGF样结构域或融合多肽可以通过表达载体的适当表达产生。
可以用于本发明组合物的化合物(例如，编码Muc3多肽或Muc3 EGF样结构域的核酸分子，或Muc3多肽或含有Muc3 EGF样结构域的多肽)可以被掺入适于施用的药物组合物中。这种组合物典型地包含核酸分子或多肽，和可药用的载体。在本文中，“可药用的载体”意欲包括任何和所有的适宜药学施用的溶剂、分散剂、涂层、抗菌和抗真菌剂、等渗和延缓吸收试剂等。这种对药学活性物质的介质和试剂的使用是本领域公知的。除了任何不适于活性化合物的常规介质或试剂之外，其在组合物中的使用是被考虑的。补充的活性化合物也可以被掺入组合物中。
本发明的药物组合物被配制以适合其意欲施用的途径。施用途径的示例包括非肠道的，例如静脉内的，皮内的，皮下的，口服的(如咽下或吸入)，经过皮肤的(局部的)，经粘膜的和直肠施用。用于非肠道的、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括下列组分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液(如磷酸盐缓冲液(PBS))、不挥发性油、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、丙三醇或其它合成溶剂；抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合试剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲液，例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调节浸透压的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。例如通过使用涂层如卵磷脂，通过在分散的情况下保持所需颗粒大小和通过使用表面活性剂能够保持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗试剂，例如糖、多元醇如甘露醇或山梨醇，和氯化钠。可以通过包含延缓吸收的试剂导致可注射组合物的延长施用。这种试剂包括例如单硬脂酸铝和明胶。非肠道制剂可以封装在安瓿、一次性注射器或者玻璃或塑料制成的多剂量小瓶(multiple dose vials)中。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。口服组合物可以是液体或可以封装在胶囊中或压缩成片剂。药学上适宜的粘合剂和/或佐剂材料可以被包括为口服组合物的部分。片剂、丸剂、胶囊、含片等可以含有任何下列成分或类似性质的化合物：粘合剂，例如微晶纤维素、西黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉；滑润剂，例如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂(glidant)，例如胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或调味剂，例如薄荷油、水杨酸甲酯或橙子调味剂。经粘膜施用可以通过使用鼻喷雾或栓剂完成。为经皮肤施用，活性化合物如本领域所公知的配制到油膏、药膏、凝胶或乳液中。
配制剂量单位形式的口服或非肠道组合物对于方便施用和剂量均一特别有利。本文中的剂量单位形式指适合为治疗个体的单一剂量的物理离散单位；每个单位含有预定量的与所需的药物载体联合的活性化合物，所述活性化合物被计算以产生预期的治疗效果。本发明的剂量单位形式取决于治疗性治疗个体所需的化合物的量。所需的化合物的量可以以单一剂量配制，或可以以多剂量单位配制。个体的治疗可能需要一次性剂量，或可能需要重复性剂量。
对于治疗性多肽，剂量典型地为体重的约0.1mg/kg到约100mg/kg(通常为约0.5mg/kg到约5mg/kg)。修饰例如脂化(lipidation)(Cruikshank等人，1997，J.Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology，14：193)可以被用于稳定多肽和增强吸收与组织渗透。对于核酸，施用的剂量取决于表达载体的表达水平。优选的，产生为体重的约0.1mg/kg到约100mg/kg的Muc3多肽或Muc3 EGF样结构域的载体的量被施用给个体。
下列实施例将进一步描述本发明，但并不限制在权利要求中所表述的本发明的范围。
实施例
实施例1-GST-融合蛋白
从小鼠肠cDNA中扩增包含全部两个EGF样结构域(m3EGF1，2)的小鼠Muc3胞外区域。另外，也扩增仅对应于第一个EGF样结构域(m3EGF1)或仅对应于第二个EGF样结构域(m3EGF2)的产物。如前所述的进行扩增(Shekels等人，1998，Biochem.J.，330：1301-1308)。将获得的片段克隆入pGEX-2TK载体(Amersham，Piscataway，NJ)，测序，并导入E-coli菌株BL21(Invitrogen，Carlsbad，CA)。随后通过用0.5mM IPTG(Fisher，Pittsburgh，PA)诱导，在E-coli中表达GST-融合蛋白，并通过使用谷胱甘肽琼脂糖(SigmaChemical Co，St.Louis，MO)的亲和层析进行纯化。合成含有全部两个muc3EGF样结构域(m3EGF1，2)或仅含有第一个EGF样结构域(m3EGF1)或仅含有第二个EGF样结构域(m3EGF2)的融合肽(图1C)。
实施例2-细胞培养
使用已知含有EGF家族受体的小鼠和人细胞。从美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)获得A431细胞，一种永生的人表皮样癌细胞系。A431细胞表达高水平的EGF(ErbB1)受体，并响应EGF而迁移。Lovo细胞是人结肠腺癌细胞系，并表达ErbB1和低水平的ErbB2受体。先前已显示Lovo细胞表达截短形式的人MUC3，所述截短形式的人MUC3缺少部分EGF2结构域和整个跨膜结构域。
细胞生长于24孔平皿中以进行细胞迁移和增殖试验，或生长在T-25烧瓶中以进行免疫印迹试验，使用补充有10％胎牛血清+50U青霉素/m1和0.05μg链霉素/ml的DMEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)。细胞于37℃、5％CO2、10％FCS中培养直至达到预期的满板。试验前24小时，用PBS洗单细胞层，细胞转到无血清培养基中以进行细胞迁移或免疫印迹试验，或转到含有0.5％血清的培养基中以进行细胞增殖试验。年轻成年小鼠的结肠细胞(YAMC)是条件化永生的小鼠结肠细胞，在补充有5％FCS+50U青霉素/ml和0.05μg链霉素/ml的RPMI 1640中生长。
实施例3-细胞迁移试验
A431或Lovo细胞的满板24孔平皿在无血清培养基中培养过夜，用PBS替代培养基，如先前所记载的使用单刃剃刀刀片机械性创伤单细胞层(Burk等人，1973，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，70：369-372)。在抑制试验中，细胞用150nM tyrphostinAG1478(Sigma，St.Louis，MO)或15μg/ml染料木黄酮(Sigma，St.Louis，MO)于37℃预培养30分钟，然后在创伤前用PBS洗涤。创伤后，细胞用PBS漂洗两次，进一步与感兴趣的肽在DMEM中培养18至24h(37℃，5％CO2，0％FCS)。在抑制试验中，细胞用抑制剂和感兴趣的肽处理18小时。固定和染色后，通过使用倒置光学显微镜在100X下计数从创伤的边缘迁移的那些细胞。在一个孔中对连续两个区域进行计数并平均，在每个试验中，对于每种情况，对3至12个孔进行平均。YAMC细胞生长至满板，然后使用旋转盘(rotating disc)刮擦24孔平皿中的区域的细胞。20小时后，如先前所记载的测量残余的创伤的区域(Frey等人，2004，J.Biol.Chem.，279：44513-21)。
实施例4-细胞增殖试验
细胞在24孔平皿中培养直到它们60％满板，然后将细胞转到含有0.5％血清的培养基中24小时。单细胞层用PBS洗涤后，单细胞层与感兴趣的肽在DMEM中培养24小时。通过台盼蓝染色定量细胞(Kaiser等人，1997，Gastroenterology，112：1231-40)。从每个孔中对两个计数进行平均；每个处理对6个孔进行平均。每个处理的扩增表示为相对于无血清对照的百分比。细胞也生长在96孔平皿中，细胞数量如先前所记载的通过基于四唑的比色测定使用溴化二甲基噻唑联苯四唑(MTT，Sigma，St.Louis，MO)进行估算(Shekels等人，1995，J.Clin.Lab.Med.，127：57-66)。
实施例5-细胞溶解产物和膜的制备
单细胞层用PBS洗涤，随后在含有0.5M Tris pH7.4，0.25M NaCl，0.1％NP40，0.05M EDTA，2.9M NaF的细胞溶解缓冲液中溶解。从烧瓶上刮下细胞，溶胞产物在冰上培育10-15分钟。旋涡20秒后，溶胞产物于14,000rpm离心10分钟。通过加入含有20mM Tris HCl pH8.0，2mM EDTA，1mM B-巯基乙醇的膜溶解缓冲液从生长于T-75烧瓶中的细胞制备膜。在使用前加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂。将单细胞层刮到溶解缓冲液中，放入冰冷离心管中，使用28口径的针剪切单细胞层。溶胞产物于1000rpm离心5分钟，随后将上清液于15,000rpm离心30分钟。含有膜的沉淀重新悬浮于100μl的RIPA溶胞缓冲液中，使用28口径的针剪切。试剂从Sigma，St.Louis，MO购得。
实施例6-免疫沉淀和免疫印迹
为进行免疫沉淀反应，将细胞溶胞产物或膜制品与抗EGF受体抗体、抗ErbB2受体抗体或抗ErbB3受体抗体(全部来自于Cell Signaling，Beverly，MA)以1∶100稀释度在4℃下培养过夜；随后加入蛋白质A珠(30μl/300ul溶胞产物)2小时。通过离心回收免疫沉淀物，在溶解缓冲液中洗3次。沉淀重新悬浮于2X SDS样本缓冲液中，旋涡30秒。免疫沉淀物在100℃下变性5分钟，在转移到硝化纤维膜前通过SDS-PAGE分离。在用在TBS中的5％无脂干牛奶封闭2小时，并用在TBS中的0.05％Tween洗2×5分钟之后，使用的抗磷酸酪氨酸单克隆抗体(Cell Signaling)以1∶2000稀释度于4℃下过夜进行蛋白质印迹。在TBS中用0.05％Tween洗膜两次，然后与1∶2000稀释的过氧化物酶结合的第二抗体(Sigma)培养1小时。洗4次，每次5分钟之后，通过使用Pierce Supersignal West Pico化学发光底物(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)的化学发光检测显示蛋白质。以类似的方式对没有预先免疫沉淀的细胞溶胞产物或膜制品的样品进行免疫印迹，其中使用抗磷酸酪氨酸单克隆抗体(Cell Signaling)。
实施例7-重组肽中的硫醇量
使用从Singh等人(Singh等人，1995，Methods Enzymol.，251：229-37)改进的方法检测重组粘蛋白蛋白质中的游离半胱氨酸。使用来自MolecularProbes(Eugene，OR)的硫醇和硫化物定量试剂盒。简要的，重组粘蛋白蛋白质或对照肽与无活性的木瓜蛋白酶-SSCH3一起培育。蛋白质中的游离硫醇将木瓜蛋白酶-SSCH3还原为活性形式。使用生色的木瓜蛋白酶底物，L-BAPNA(N-苯甲酰基-L-精氨酸，对-硝基苯胺)测量还原的木瓜蛋白酶的活性。使用同样的方法，使用L-半胱氨酸的已知浓度制备标准曲线。这个标准曲线被用于计算重组蛋白质中的游离硫醇。对应于小鼠Muc5AC(MGMtr)的串联重复序列的肽被用作不含半胱氨酸的对照肽(KQTSSPNTGKTSTISTT)(SEQ ID NO：1)。EGF也被用作对照肽。EGF没有游离的硫醇，但是有6个全部包括在二硫键中的半胱氨酸。对应于小鼠Muc5AC(MGMnr)非重复部分的肽被用作含有两个游离硫醇的对照肽(CKNELCNWTNWLDGSYPGSGRNSGD)(SEQ ID NO：2)。
实施例8-人MUC3富含半胱氨酸结构域构建体的稳定转染
合成相应于人MUC3 EGF1，2结构域的引物，用于扩增人结肠cDNA。936 bp人MUC3 EGF 1，2 PCR产物编码两个人MUC3 EGF样结构域，MUC3跨膜区域和MUC3胞质结构域的20个氨基酸。MUC3 PCR片段被连接到pFLAG-CMV-3(Sigma)。这个载体编码用于将表达的蛋白质加以分泌的前胰岛素原(preprotrypsin)前导序列。前胰岛素原(preprotrypsin)前导序列之后为位于所表达的目的蛋白氨基末端的FLAG标签。MUC3跨膜序列靶向蛋白质以插入到细胞膜中。通过DNA测序确认插入的序列和方向。
使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)用人MUC3跨膜-EGF1，2构建体转染Lovo细胞。转染开始后48小时，在存在800μg/mL G418(Invitrogen)的条件下培养细胞。使用无菌克隆环分离G418抗性克隆。克隆LhM3c14被用于凋亡试验。也用空载体转染Lovo细胞以产生稳定的假转染克隆(Lmock)。转染物保持含有800μg/ml G418的选择性培养基中。通过使用兔抗flag抗体(Sigma)的Western印迹分析测定人MUC3 EGF1，2构建体的表达。
实施例9-凋亡试验
通过向Lovo细胞的亚满板培养物中加入100ng/ml TNFα(Sigma)48小时诱导凋亡，所述培养物培养于35mm无菌培养皿中，培养在具有10％血清的DMEM中。也可以通过用1000U/ml干扰素γ培养细胞24小时，随后除去干扰素并加入100-500ng/ml的抗fas抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN)72小时诱导凋亡。细胞在含4％多聚甲醛的PBS(pH7.4)中固定5分钟，然后在PBS中洗2次。细胞用PBS中的浓度为5μg/ml的细胞核染料，Hoechst 33258(Polysciences Inc.，Warrington，PA)染色30分钟，漂洗，用盖玻片Slowfade Antifade(Molecular Probes，Eugene，OR)盖上，随后立即用紫外显微镜显象。通过形态学确定凋亡的细胞核。计数每个平皿中三个40×镜头区域中正常和凋亡细胞核的总数(每个平皿显示＞200个细胞核)。每个试验条件使用三个或更多的平皿。
实施例10-实验性结肠炎模型
所有的试验程序都由明尼阿波利斯退役军人事务医疗中心(Minneapolis Veterans Affairs Medical Center)的公共机构动物保护和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准。
乙酸结肠炎：雌性CD-1小鼠(20-30gm，Harlan Sprague Dawley，Indianapolis，IN)被禁食过夜，通过吸入3％的异氟烷进行麻醉。随后用0.2ml的正常盐水灌洗直肠。通过直肠内施用0.1ml 5％的乙酸诱导结肠炎。溶液通过接近肛门约3cm的套管针施用。随后在稍后的12和24小时通过直肠内施用0.1ml在磷酸盐缓冲盐水中的重组肽或0.1ml在同样缓冲液中的类似浓度的对照肽处理小鼠，其使用异氟烷麻醉。诱导结肠炎后30小时(最后的灌肠法治疗后6-12小时)收集所有的小鼠，移除远端结肠，检查总的溃疡形成并进行显微镜检查。这个模型先前已有记载(McCafferty等人，1997，Gastroenterology，112：1022-1027；和Tomita等人，1995，Biochem J.，311：293-297)。
葡聚糖硫酸钠(DSS)结肠炎：如先前所记载的，通过施用在饮用水中的5％葡聚糖硫酸钠(分子量40,000-50,000，USB，Cleveland，OH)的在雌性CD-1小鼠(20-30gm)中诱导急性结肠炎(Okayasu et al.，1993，Gastroenterology，98：694-702；Cooper et al.，1993，Lab.Invest.，69：238-49；Murthy et al.，1993，Dig.Dis.Sci.，38：1722-34)。7天后，从饮用水中除去DSS。除去DSS后通过直肠内施用0.1ml磷酸盐缓冲盐水中的重组肽或0.1ml同样缓冲液中的对照肽处理小鼠24和48小时，使用异氟烷麻醉。在移除DSS后72小时收集所有的小鼠，结肠进行组织学检测。
实施例11-组织学粘膜损伤分值
切除的结肠在10％经缓冲的甲醛溶液中固定，包埋于石蜡中，切片，并用苏木精和曙红染色。类似于先前所记载的对粘膜损伤的严重性进行分级(Okayasu等人，1990，Gastroenterology，98：694-702；Murthy et al.，1993，Dig.Dis.Sci.，38：1722-34)。损伤度被分为0到III级，如下：0级＝正常；I级＝底部三分之一的腺体被扭曲和/或破坏及局部性炎症浸润；II级＝所有的腺体或底部三分之二的腺体被侵蚀/破坏及炎症浸润，表面上皮保留；和III级＝丧失整个腺和表面上皮。在实验组不知情的情况下检测样本。
检测每个样本中显示III级结肠炎的低倍(10x)区域的总数。还通过分别设定I、II和III级分值为1、2和3计算总的隐窝损伤分值。对每个低倍区域分级，计算每个样本具有每个分值的百分比，相加得到最终的隐窝损伤分值(0-3.00范围)。例如，检测每个样本中同样长度的结肠，10％的区域具有分值1，25％的区域具有分值2，25％的区域具有分值3的样本将具有(0.1)1+(.25)2+(.25)3＝1.35的隐窝损伤分值。
实施例12-统计分析
在每个试验组中计算变量的平均值±SEM，用Student’s t-检验(双侧)和Fishers确切检验进行分析。认为＜0.05的p值为显著的。
实施例13-重组muc3蛋白的设计
构建相应于全部两个小鼠Muc3 EGF样结构域(m3EGF1，2)，第一个EGF样结构域(m3EGF1)或第二个EGF样结构域(m3EGF2)的重组GST融合蛋白，在E.coli中表达，用谷胱甘肽琼脂糖柱纯化。图1A显示小鼠Muc3和人MUC3和MUC17的EGF样结构域中半胱氨酸的间隔。显示EGF和三叶形结构域的半胱氨酸间隔以用于比较。注意到小鼠Muc3和人MUC3的EGF样结构域中高度保守的半胱氨酸排列。Muc3的第一个和第二个EGF样结构域分别具有8和10个半胱氨酸。发现每个EGF样结构域的最后6个半胱氨酸在空间排列上类似于EGF，第二个EGF样结构域显示较少的间隔保守性。在Muc3 EGF样结构域和EGF之间没有发现其它明显的序列类似性。
表1显示来自小鼠Muc3和人MUC3的EGF1结构域、糖基化连接结构域和EGF2结构域的半胱氨酸排列和氨基酸序列。人和小鼠Muc3在它们的第一和第二EGF样结构域之间具有60％和44％的总序列相似性。小鼠Muc3和人MUC17的半胱氨酸间隔的比较显示较少的相似性，虽然小鼠Muc3和人MUC17的总氨基酸相似性与和人MUC3的相似性之间具有可比性(在第一和第二EGF样结构域中分别有52％和64％的序列相似性)。
表1.EGF样结构域
EGF样结构域1 接头区     EGF样结构域2
C-x10-C-x-C-x8-C-x8-C-x10-C-x-C-x8-C(SEQ ID NO：3) x120 C-x4-C-x2 1-C-x22-C-x3-C-x9-C-x4-C-x8-C-x-C-x12-C-X4(SEQ ID NO：4)
CMNGGFWTGDKCICPNGFGGDRCENIVNVVNCENGGTWDGLKCQCTSLFYGPRCN(SEQ ID NO：12)  EELVESVEIEPTVAASVGVSVTVTSQEY SEKLQDRKSEEFSNFNKTFTKQMALGVIIKNLSKGSIVVDYDVILKAKYTPGFENTLDTVVKNLETKIIYAGIPEYEKNATEVQVQDVNNNCSALLCFNSTATKVQNSATVSVNPEET(SEQ ID NO：13) CKKEAGEDFAKFVTLGQKGDKWFCITPCSAGYSTSKNCSYGKCQLQRSGPQCLCLITDTHWYSGENCDWGIQKS(SEQ IDNO：14)
C-x10-C-x-C-x8-C-x5-C-x10-C-x-C-x8-C(SEQ ID NO：5) x114 C-x6-C-x21-C-x22-C-x3-C-x9-C-x4-C-x8-C-x-C-x12-C-x7(SEQ ID NO：6)
CDNGGTWEQGQCACLPGFSGDRCQLQTRCQNGGQWDGLKCQCPSTFYGSSC(SEQ ID NO：9)  EFAVEQVDLDVVETEVGMEVSVDQQFSPDLNDNTSQAYRDFNKTFWNQMQKIFADMQGFTFKGVEILSLRNGSIVVDYLVLLEMPFSPQLESEYEQVKTTLKEGLQNASQDVNSCQDSQTLCFKPDSIKVNNNSKTELTPAAI(SEQ ID NO：10) CRRAAPTGYEEFYFPLVEATRLRCVTKCTSGVDNAIDCHQGQCVLETSGPTCRCYSTDTHWFSGPRCEVAVHWR(SEQ ID NO：11)
C-x4-C-x6-C-x10-C-x-C-x8-C(SEQ ID NO：7) x120  C-x4-C-x21-C-x21-C-x3-C-x9-C-x4-C-x8-C-x-C-x12-C(SEQ ID NO：8)
已显示大鼠Muc3在SEA模块和位于两个EGF样结构域之间的第二位点被翻译后切割。获得的两个亚单位通过非共价键重新结合，所述非共价键可以通过2％SDS和煮沸断开。重组的m3EGF1，2在还原性考马斯染色的凝胶中于预期分子量54kDa处显示为明显的单一带。通过在2％SDS中煮沸5分钟处理m3EGF1，2没有导致分子量的改变，表明在重组GST融合蛋白中不发生这种类型的切割。类似的，重组m3EGF1和m3EGF2分别在还原的考马斯染色凝胶中显示为34kDa和40kDa的单一带。
为确保在重组粘蛋白蛋白质中形成二硫键，测定蛋白质的游离硫醇含量。在被预期缺乏游离硫醇的对照肽(小鼠胃粘蛋白串联重复肽(MGMtr)和EGF)中检测到硫醇含量接近于零。含有两个游离硫醇的阳性对照肽，小鼠胃粘蛋白非重复肽MGMnr，被测定每个肽含有1.6个游离半胱氨酸(表2)。单独的GST也具有可以忽略不计的游离硫醇。m3EGF1，2和m3EGF1具有非常少的可测量的硫醇，这表明所有的半胱氨酸都在二硫键中。有趣的是，m3EGF2显示具有游离的半胱氨酸。
表2，  重组肽中的硫醇测量
肽     序列中预测的半胱氨酸数目   每条肽中测量的游离半胱氨酸数目
    GST     4     0.05
    GST-79(m3EGF1，2) 22 0.34
    GST-EGF1(m3EGF1) 12 0.12
    GST-EGF2(m3EGF2) 14 1.37
    EGF     6     0.01
    MGMtr串联重复序列 0 0.00
    MGMnr非重复肽 2 1.57
实施例14-muc3重组肽对细胞增殖的影响
检测Lovo和A431细胞中24小时内muc3重组肽对细胞增殖的影响。如图2A中所显示的，用m3EGF1，m3EGF2，m3EGF1，2处理Lovo细胞在24小时后不会导致细胞数量的任何明显变化。类似的，用10-50μg/ml的m3EGF1，2处理YAMC和A431细胞后也没有明显影响细胞数量(图2B)。在用10-50μg/ml的m3EGF1，2处理的YAMC细胞中没有观察到对细胞增殖的影响。
实施例15-重组m3EGF1，2刺激细胞迁移
检测已知含有ErbB受体的小鼠结肠细胞(YAMC)、人上皮细胞系A431和Lovo人结肠癌细胞以确定是否重组Muc3 EGF结构域蛋白质刺激细胞迁移。
用m3EGF1，2处理的YAMC细胞与对照处理相比在20小时中表现出明显增加的伤口闭合(p＜0.05)，并表现出剂量响应(图3)。用10μg/mlm3EGF1，2处理18-24小时的人A431细胞在细胞迁移方面显示出超出对照215％的增加(p＜0.05)。
在A431细胞中，1ng/ml的重组EGF刺激细胞迁移至近乎对照的300％。相反，截短的Muc3富含半胱氨酸重组蛋白质m3EGF1和m3EGF2不改变细胞迁移(图4A)。
用1μg/ml的m3EGF1，2处理的Lovo人结肠癌细胞在24小时内在细胞迁移方面与对照相比表现出2倍的增加，其类似于由1ng/ml重组EGF诱导的迁移(图4B)。用10μg/ml的m3EGF1，2显示出剂量响应，细胞迁移进一步增加2.6倍。用20μg/ml或更多剂量没有观察到随后的细胞迁移增加。为了确定重组Muc3 EGF结构域蛋白质是否是通过EGF受体的刺激起作用，这个受体的抑制剂，AG1478，被用于预处理A431细胞。抑制剂抑制EGF诱导的细胞迁移，但不抑制由m3EGF1，2诱导的细胞迁移，所述抑制剂为150nm的AG1478，(图5A)。为确定m3EGF1，2诱导的细胞迁移是否需要酪氨酸磷酸化，用15μg/ml染料木黄酮预处理A431细胞。这导致对EGF诱导的细胞迁移的明显抑制和对由m3EGF1，2诱导的细胞迁移的完全抑制(图5B)。
实施例16-重组m3EGF1，2不激活EGF受体
为进一步分析m3EGF1，2是否导致EGF(ErbB1)受体的激活或磷酸化，用重组蛋白质处理A431细胞，检测细胞溶胞产物的总磷酸酪氨酸含量。免疫沉淀EGF受体，通过使用抗磷酸酪氨酸抗体的免疫印记进行分析以评估EGF受体的磷酸化。与对照处理相比，用1ng/ml的重组EGF处理细胞1，30和60分钟导致175kD电泳带的磷酸酪氨酸含量的明显增加。相反，在用m3EGF1，2或对照GST肽处理1，30和60分钟的A431细胞中没有观察到175kD带中175kd磷酸酪氨酸反应性的改变。这通过EGF(ErbB1)受体免疫沉淀，然后进行磷酸酪氨酸印迹进行确认。一式三份的试验显示在60分钟时，重组EGF导致EGF受体磷酸化显著增加，但是m3EGF1，2或对照肽则不会(图6A)。类似地用10μg/ml的m3EGF1，2和类似浓度的GST处理YAMC细胞亚满板培养物30分钟，或用1ng/ml的重组EGF处理5分钟。细胞溶胞产物用针对EGF受体、ErbB2和ErbB3的抗体免疫沉淀。响应于EGF发生EGFr和ErbB2的磷酸化，但是m3EGF1，2处理不导致EGFr，ErbB2或ErbB3的磷酸化(图6A)。
实施例17-内源性MUC3和外源性muc3肽抑制凋亡
人MUC3A跨膜EGF1，2结构域构建体被稳定转染入Lovo人结肠癌细胞中。Lovo细胞克隆LhM3c14在细胞膜级分中表达高水平的带flag标签的人MUC3A EGF1，2；这不存在于LhM3c14胞质级分、假转染的Lovo细胞(Lmock)和亲代Lovo细胞中。使用TNF-α在亲代Lovo人结肠细胞和Lmock细胞中诱导凋亡。稳定的转染子克隆LhM3c14明显对TNF-α诱导的凋亡具有抗性(图7A)。类似地，用100μg/ml m3EGF1，2预处理亲代Lovo细胞降低TNFα诱导的凋亡，但是用对照GST肽预处理则不会(图7B)。与假转染Lmock相比，在稳定的转染子克隆LhM3cl4中通过连续的干扰素γ和抗fas抗体处理所诱导的凋亡明显降低(图7B)。
实施例18-重组m3EGF1，2加速实验性结肠炎的愈合
为确定重组肽是否能够影响肠粘膜的愈合或再生，使用急性结肠炎的两种不同的小鼠模型。在第一个模型中，通过5％乙酸灌肠剂在小鼠中诱导急性结肠损伤，随后在12和24小时施用重组蛋白质或对照灌肠剂。在30小时处死动物以确定粘膜损伤的程度。在乙酸之后12和24小时经直肠采用100μg m3EGF1，2处理小鼠，与含有PBS缓冲液中的100μg BSA的灌肠剂相比，总隐窝损伤分值减少了45％(p＝0.05)(图8A)。这很大程度上是由于总的或III级粘膜溃疡形成的显著降低，从对照处理小鼠中8.2±1.6低倍区域/样本，降低到用100μg m3EGF1，2肽灌肠剂处理的小鼠中的3.5±1.4低倍区域/样本(p＝0.038)(图8B)。
观察正常小鼠结肠粘膜与I级，II级和III级损伤之间的组织学差异。使用含有具有100μg重组GST的PBS缓冲液的对照灌肠剂重复实验，并与灌肠剂相比，所述灌肠剂含有1μg，50μg或100μg的重组m3EGF1，2、100μg m3EGF1、和100μg m3EGF2。在12和24小时用含有100μg m3EGF1，2的灌肠剂处理的小鼠，与用含有100μg GST对照蛋白质的灌肠剂处理的小鼠相比，隐窝损伤分值显示出显著减少62％(图8C)，而且III级粘膜溃疡形成显示出减少79％(图8D)。用含有1μg m3EGF1，2和50μg m3EGF1，2的灌肠剂处理的小鼠与对照灌肠剂处理相比隐窝损伤分值不显著地减少29-40％，并且III级溃疡不显著地减少38-40％。相反，含有100μg m3EGF1或100μg m3EGF2的灌肠剂对隐窝损伤分值或总粘膜溃疡形成没有影响(图8C，D)。
在饮用水中施用5％DSS 7天导致主要在远端结肠的急性结肠炎，通过停用DSS治愈。停用DSS后12和24小时用100μg m3EGF1，2经直肠处理小鼠，停用DSS后72小时检测显示，与用具有GST或BSA的对照灌肠剂处理的小鼠相比，末端结肠的隐窝损伤分值减少38％(p＜0.005)(图9A)。这主要是由于具有总III级粘膜溃疡形成的区域/样本的平均数目减少53％；从所有对照中的平均8.5±1.1区域/样本，减少到用m3EGF1，2处理的小鼠中的4.0±0.8区域/样本(p＜0.005)(图9B)。粘膜损伤在近端结肠中较少，治疗和对照小鼠中隐窝损伤分值或具有III级溃疡形成的区域的数量没有观察到显著差异(图9C，D)。
其它实施方式
应理解虽然本发明是结合其详细描述进行记述的，前述的描述是用于举例说明，并不限制通过附加的权利要求的范围限定的本发明的范围。其它方面、优点和修改都在下述权利要求的范围内。

Claims (24)

1.分离的核酸，其含有编码粘蛋白3 EGF样结构域的核酸分子。
2.权利要求1的核酸分子，其中所述粘蛋白3 EGF样结构域具有选自SEQ ID No：3，4，5和6中一个或多个的序列。
3.权利要求1的核酸分子，其中所述粘蛋白3 EGF样结构域具有SEQ ID NO：3所示的序列。
4.权利要求3的核酸分子，其中所述粘蛋白3 EGF样结构域具有SEQ ID NO：12所示的序列。
5.权利要求1的核酸分子，其中所述粘蛋白3 EGF样结构域具有SEQ ID NO：4所示的序列。
6.权利要求5的核酸分子，其中所述粘蛋白3 EGF样结构域具有SEQ ID NO：14所示的序列。
7.权利要求1的核酸分子，其中所述粘蛋白3 EGF样结构域具有SEQ ID NO：5所示的序列。
8.权利要求7的核酸分子，其中所述粘蛋白3 EGF样结构域具有SEQ ID NO：9所示的序列。
9.权利要求1的核酸分子，其中所述粘蛋白3 EGF样结构域具有SEQ ID NO：6所示的序列。
10.权利要求9的核酸分子，其中所述粘蛋白3 EGF样结构域具有SEQ ID NO：11所示的序列。
11.含有权利要求1的核酸的构建体。
12.权利要求11的构建体，其中所述构建体含有两个粘蛋白3 EGF样结构域。
13.权利要求12的构建体，其中编码接头区的核酸序列位于所述两个粘蛋白3 EGF样结构域之间。
14.权利要求13的构建体，其中所述接头区长度为至少100个氨基酸。
15.权利要求14的构建体，其中所述接头区具有SEQ ID NO：10或13所示的序列。
16.权利要求1的核酸分子，其中所述粘蛋白3 EGF样结构域为小鼠粘蛋白3 EGF样结构域。
17.权利要求1的核酸分子，其中所述粘蛋白3 EGF样结构域为人粘蛋白3 EGF样结构域。
18.治疗患有或存在发生消化道疾病或病症风险的个体的方法，包括：
施用有效量的含有粘蛋白3 EGF样结构域的多肽。
19.权利要求18的方法，其中所述粘蛋白3 EGF样结构域具有SEQID No：3，4，5或6所示的序列。
20.权利要求18的方法，其中所述消化道疾病选自胃炎、消化性溃疡病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和肠癌中的一种或多种。
21.权利要求18的方法，其中所述有效量为在消化道中有效刺激细胞迁移或伤口愈合的量。
22.治疗或预防个体中上皮损害的方法，其包括：
施用有效量的含有粘蛋白3 EGF样结构域的多肽。
23.权利要求22的方法，其中所述粘蛋白3 EGF样结构域具有SEQID No：3，4，5或6所示的序列。
24.权利要求22的方法，其中所述上皮损害为上消化道、食道、真皮、表皮、阴道、子宫颈、子宫、胃肠道、远端肠道、呼吸道上皮或角膜上皮的损害。
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