CN101015543A - 苯丙烯酸苯丙烯酯类化合物抗氧化保肝及保护脑损伤用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及苯丙烯酸苯丙烯酯型姜黄素类似物的抗氧化、保护肝脏和脑损伤活性的用途。试验发现该类化合物具有保护大鼠乳鼠原代肝细胞损伤、促进肝细胞修复、体外清除超氧阴离子和二苯基苦基苯肼自由基、抑制脂质过氧化物生成的活性，对模拟脑神经细胞的大鼠肾上嗜铬细胞瘤(PC12)细胞有抗氧化损伤保护作用，对铁离子有强效螯合作用。因而可以预期用于制备防治急慢性肝或脑损伤类疾病、防治中风和中风后遗症、帕金森氏症、老年性痴呆症以及炎症、自身免疫性疾病、肿瘤、心肌缺血、心肌肥厚、衰老、变态反应、动脉粥样硬化等疾病的药物。
Description
技术领域
本发明属于药物化学和药理学领域，具体而言，本发明涉及苯丙烯酸苯丙烯酯类化合物的抗氧化、保护肝明和脑损伤活性，以及它们作为相关药物的用途。该类化合物通过全合成和半合成的方法得到。本发明将该系列化合物对过氧化氢致大鼠乳鼠原代肝细胞损体外模型进行了肝细胞损伤保护活性筛选，该类化合物被发现具有保护肝细胞和促进肝细胞修复的作用。本发明又对该类化合物抗氧自由基活性进行了测试，发现其具有体外清除超氧阴离子自由基、清除二苯基苦基苯肼自由基、抑制自由基诱导之脂质过氧化物生成的活性。以上活性表明该类化合物可以预期用于制备预防或治疗急、慢性肝损伤类疾病以及由氧自由基引起或与氧自由基有关的其他生理改变或疾病的药物。该类化合物还表现出很强的对抗自由基引起的大鼠肾上嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)损伤作用，即对模拟脑神经细胞的PC12细胞有抗氧化损伤保护作用。而且在与阳性对照药物槲皮素同一浓度下，其清除自由基保护细胞的能力比槲皮素还高。此外，该类化合物还表现为对铁离子具有强效螯合作用，从而预期其可以延缓或阻断Aβ蛋白堆积以及脑部神经纤维纠结。说明其对保护脑神经、抗氧化、防治老年性痴呆症有积极作用。以上活性表明该类苯丙烯酸苯丙烯酯类化合物可以预期用于制备预防或治疗急、慢性肝损伤或脑损伤类疾病，以及由氧自由基引起或与氧自由基有关的其他生理改变或疾病的药物。
背景技术
氧压是由机体细胞产生和清除自由基之间的失调所引起的，可诱发多种疾病。氧压可引起神经系统疾病，如中风，帕金森氏病，阿尔茨海默病。另外它还跟其它疾病的病理途径有关，如心脏病、自身免疫性疾病、肿瘤、病毒性疾病(如AIDS、肝炎)。因此寻找新的高效抗氧化剂成为治疗由氧压引起的各种疾病的有效途径。
姜科姜黄属植物姜黄(Curcuma longa L.)是一种常用的中药，姜黄素(Curcumin，简称Cur)是从姜黄中提取的有效成分，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、降血脂等广泛的药理作用。近年来有关姜黄素各种药理作用的研究已越来越受到医药工作者的重视。
姜黄素除上述药理作用外，尚有对肝脏保护作用的广泛报道，Nanji等研究发现姜黄素通过抑制NF-κB基因的表达对酒精性肝疾病起到保到作用[Nanji等，Curcumin prevents alcohol-induced liver disease in rats by inhibiting the expression ofNF-kappa B-dependent genes，American Journal Physiology，Castrointes LiverPhysiology，2003，284(2)，G321-327]。Park等研究姜黄素对四氯化碳造成的大鼠急性或亚急性肝损伤的保护作用时发现其能显著降低血清中丙氨酸转氨酶和天门冬氨酸转氨酶含量[Park 等，Protective effect of curcumin in rat liver injuryinduced by carbon tetrachloride，Journal ofPhamacy and Pharmacology，2000，52(4)，437-440]。提示姜黄素具有保肝、抗肝纤维化的作用。维生素A、C、E是体内主要的非酶类抗氧化剂，可作为供氢体与自由基反应而使其灭活。Kaul等发现给大鼠饲喂姜黄素或姜黄能够抑制因维生素A缺乏所致的大鼠肝、肾、脾、大脑脂质过氧化水平升高[Kaul等，Influence of retinol deficiency and curcumin/turmeric feeding on tissue microsomal membrane lipid peroxidation and fatty acids inrats，Molecularand Cellular Biochemistry，1997，175(1&2)，43-48]。
此外，1985年Kuttan等报道了姜黄素的细胞毒作用[Kuttan等，Potentialanticancer activity of turmeric(Curcuma longa)，Cancer Letters(Shannon，Ireland)，1985，29(2)，197-202]，发现姜黄素在1.2μM可明显抑制中国仓鼠卵巢细胞(CHO)的生长。同样浓度的姜黄素对淋巴细胞和Dalton淋巴廇细胞也产生明显的细胞毒作用。后来，相继有报道证明姜黄素在体外对许多肿瘤细胞株均有明显的细胞毒作用，且一般的浓度范围在0.03～0.3μM [Bhaumik等，Curcumin-mediatedapoptosis in AK-5 tumor cells involves the Production ofreactive oxygen intermediates，FEBS Letters，1999，456(2)，311-314；Fujisawa等，Cytotoxicity，ROS-generationactivity and radical-scavenging activity of curcumin and related compounds，Anticancer Research，2004，24(2B)，563-569]。
姜黄素除了存在潜在的细胞毒性之外，还有光毒性和皮肤毒性。Tonnesen研究发现低浓度(0.68-13.5μM)姜黄素即对伤寒沙门菌(S.typhimurium)和大肠埃希菌(E.coli)有光毒性作用[Tonnesen等，Studies on curcumin andcurcuminoids，IX：Investigation of the photobiological activity of curcumin usingbacterial indicator systems，Journal of pharmaceutical sciences，1987，76(5)，371-373]。姜黄素的光毒性：在有氧的条件下，革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌更敏感；其机制可能是产生了过氧化氢。Goh等早在1987年就报道了1例职业性接触姜黄素引起的皮肤过敏。随后陆续有报道接触含姜黄素成分的药物、手术前皮肤消毒用的洗必泰和职业性暴露引起急性接触性皮炎，往往表现为边界清晰的水肿性红斑、丘疹和/或水疱，常伴有瘙痒症状[Goh等，Allergic contact dermatitis to Curcumalonga(turmeric)，Contact dermatitis，1987，17(3)，186]。
由以上活性及不足，我们看到对姜黄素深入的合成改造，以期发现更高效抗氧化、低毒性、有新活性的的姜黄素类似物，对开发该类抗氧化天然产物衍性物新药进入保护肝损伤和脑损伤医药领域是十分必要的。因比我们根据以往的合成经验，以从莲叶橐吾醇启发得到的二聚体进行比对，发现此类化合物与姜黄素有着极其相似的结构组成，并且用酯基代替了姜黄素中的亚甲基，可能会给分子带来新的活性。同时，在苯环上取代基的变化也能给我们更多机会找到新的抗氧化构效关系，为开发此类新药提供积累。有鉴于此，我们重新合成了一批如下图所示类姜素结构的莲叶橐吾二聚体，并对其进行了一系列活性测试。该类化合物及其制备方法已经在本发明人的相关发明中予以公开[赵昱等，发明专利《苯丙烯酸苯丙烯酯和苯丙酸苯丙酯类化合物及其制备方法和用途》申请号：200410102894.1；公开号：CN1796363A]，本发明中各化合物的制备方法与上述公开的内容基本相同，在此不再赘述。
本发明用体外抑制黄嘌呤氧化酶作用、体外清除阴离子超氧化自由基的活性、体外清除二苯基苦基苯肼自由基(1，1-dupheny1-2-picrylhydrazyl，DPPH)的活性、自由基诱导之脂过氧化物生成的抑制等试验说明本发明权利要求中化合物的抗氧化活性；本发明还测定了化合物对双氧水(H2O2)所致PC12(大鼠肾上嗜铬细胞瘤)细胞损伤的保护作用、化合物对铁离子的螯合作用试验以预测其延缓或阻断Aβ蛋白堆积以及脑部神经纤维纠结能力。
发明内容
本发明的目的是提供一种苯丙烯酸苯丙烯酯和其类似物及其可药用盐或其溶剂化物的新用途。具体而言，本发明提供了一种式(1)所示的苯丙烯酸苯丙烯酯和其类似物及其药用盐或其溶剂化物抑制黄嘌呤氧化酶、清除自由基活性、保护肝脏细胞及肝脏器质性损伤、保护和治疗脑损伤以及防治早老性痴呆症的活性。
其中：
取代基R6，R7，R8，R6，R7和R8可以相同或不同，分别独立地选自氢，巯基，硝基，氰基，含1-8个碳的烷基，含1-8个碳的烷氧基，含1～8个碳的烷胺基，1～15碳的不饱和烃基，1-15碳的不饱和烃氧基，含1-8个碳的烷氧基烷氧基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳氧基，取代或未取代的芳烷氧基，含1～8个碳的酰氧基，其条件是取代基R6，R7，R8，R6，R7和R8，不能同时是氢；取代基X可以是氢(H)2，羟基(OH)2，氧，硫；基团R可以是氧，硫，氮，含1～8个碳的亚烷基，含1～8个碳的亚烷胺基，含1～8个碳的亚烷氧基，含1～8个碳的亚烷硫基；其中用于取代的取代基可以是含1～8个碳的烷基，含1～8个碳的烷氧基，卤素，羟基，氨基，硝基，氰基，含1～8个碳的烷胺基，或苯基。
本发明优选的式(1)化合物及其可药用盐或溶剂化物是，其中：
当式(1)中的取代基X为氧，取代基R为氧肘，为式(I)所示的苯丙烯酸苯丙烯酯类化合物：
其中：
取代基R6，R7，R8，R6，R7和R8可以相同或不同，分别独立地选自氢，巯基，硝基，氰基，含1～8个碳的烷基，含1～8个碳的烷氧基，含1～8个碳的烷胺基，1～15碳的不饱和烃基，1～15碳的不饱和烃氧基，含1～8个碳的烷氧基烷氧基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳氧基，取代或未取代的芳烷氧基，含1～8个碳的酰氧基，其条件是取代基R6，R7，R8，R6，R7，和R8，不能同时是是氢；其中用于取代的取代基可以是含1～8个碳的烷基，含1～8个碳的烷氧基，卤素，羟基，氨基，硝基，氰基，含1～8个碳的烷胺基，或苯基。
本发明优选的式(I)化合物及其可药用盐或溶剂化物是，其中：
R6，R7，R8，R6′R7′或R8′可以相同或不同，分别独立的选自氢，硝基，含1～8个碳的烷基，含1～8个碳的烷胺基，含1～8个碳的烷氧基，含1～15个碳的不饱和烯氧基，取代或未取代的芳烷氧基，含1～8个碳的烷氧基烷氧基，其条件是取代基R6，R7，R8，R6′，R7′和R8′不能同时是氢；
其中用于取代的取代基可以是含1～8个碳的烷基，含1～8个碳的烷氧基，卤素，羟基，氨基，硝基，氰基，含1～8个碳的烷胺基，或苯基。
本发明进一步优选的式(I)化合物及其可药用盐或溶剂化物是，其中：
R6，R7，R8，R6′，R7′或R8′可以相同或不同，分别独立地选自氢，硝基，含1～8个碳的烷氧基，含1～15个碳的不饱和烯氧基，取代或未取代的芳烷氧基，含1～8个碳的烷氧基烷氧基，其条件是取代基R6，R7，R8，R6′，R7′和R8′不能同时是氢；
其中用于取代的取代基可以是含1～8个碳的烷基，含1～8个碳的烷氧基，卤素，羟基，氨基，硝基。
本发明优选的式(I)化合物包括：
I-a.(E)-7-甲氧基-苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基)苯丙烯酯；
I-b.(E)-(6，7，8-三甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基)苯丙烯酯；
I-c.(E)-(7-硝基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7′-二甲氧基)苯丙烯酯；
I-d.(E)-(6，7，8-三甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7′，8′-三甲氧基)苯丙烯酯；
I-e.(E)-(7-甲氧基)苯丙烯酸-)-(6′，7′-二甲氧基)苯丙烯酯；
I-f.(E)-(6，7-二甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7′-二甲氧基)苯丙烯酯；
I-g.(E)-(6，7，8-三甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7′-二甲氧基)苯丙烯酯；
I-h.(E)-(7-甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7′-二甲氧基甲氧基)苯丙烯酯；
I-i.(E)-(7-甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基甲氧基)苯丙烯酯；
I-j.(E)-(7-羟基)苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基)苯丙烯酯；
I-k.(E)-(7-甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-苯丙烯酯；
I-l.(E)-(6，7-二甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-苯丙烯酯；
I-m.(E)-(6，7-二甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基甲氧基)-苯丙烯酯；
I-n.(E)-(7-甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基)苯丙烯酯；
I-o.(E)-(6，8-二甲氧基-7-O-(3″，4″-二氯)苄基)-苯丙烯酸-(E)-(6′，8′-二甲氧基-7′-O-(3_，4_-二氯)苄基)-苯丙烯酯；
I-p.(E)-(6，8-二甲氧基-7-O-(4″-溴)苄基)-苯丙烯酸-(E)-(6′，8′-二甲氧基-7′-O-(4_-溴)苄基)-苯丙烯酯；
I-q.(E)-(6，8-二甲氧基-7-O-(3″-溴)苄基)-苯丙烯酸-(E)-(6′，8′-二甲氧基-7′-O-(3_-溴)苄基)-苯丙烯酯；
I-r.(E)-(6，8-二甲氧基-7-O-(2″-碘，4″-溴)苄基)-苯丙烯酸-(E)-(6′，8′-二甲氧基-7′-O-(2_-碘，4_-溴)苄基)-苯丙稀酯；
I-s.(E)-(6，8-二甲氧基-7-O-香叶基)-苯丙烯酸-(E)-(6′，8′-二甲氧基-7-O-香叶基)-苯丙烯酯；
I-t.(E)-(6，7-二羟基)苯丙烯酸-(E)-苯丙烯酯。
本发明的另一个目的是提供了式(1)化合物用于制备防治肝脏细胞及肝脏器质性损伤的药物用途。
本发明的另一个目的是提供了一种含有式(1)化合物的用于制备基于抗氧化自由基、抑制Aβ蛋白生成和抑制脑部神经纠结机制的抗衰老、防治早老性痴呆症的药物用途。
本发明的再一个目的是提供了一种含有式(1)化合物的用于制备基于抗氧化自由基、抑制Aβ蛋白生成和抑制脑部神经纠结机制的抗衰老、防治早老性痴呆症的药物组合物。
本发明的又一目的是提供了式(I)化合物的用于制备防治由氧自由基引起或与氧自由基有关的生理改变或疾病特别是心血管及脑血管病变药物的用途。
本发明的再一个目的是提供了一种含有式(I)化合物的用于制备防治由氧自由基引起或与氧自由基有关的生理改变或疾病特别是心血管及脑血管病变药物的药物组合物。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的实质，下面分别用药理实施例的形式说明化合物活性测试的过程，药理实施例给出了代表性化合物的部分生物活性数据。必须说明，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进和药理活性上的简单扩展和外延都属于本发明要求保护的范围。式(1)化合物具有多种重要的生物活性，本发明将该系列化合物对过氧化氢致大鼠乳鼠原代肝细胞损伤体外模型进行了肝细胞损伤保护活性筛选，发现该类化合物具有保护肝细胞和促进肝细胞修复的作用。本发明又对该类化合物抗氧自由基活性进行了测试，发现其具有体外清除超氧阴离子自由基、清除二苯基苦基苯肼自由基、抑制自由基诱导之脂质过氧化物生成的活性。以上活性表明该类化合物可以预期用于制备预防或治疗急性慢性肝损伤类疾病以及由氧自由基引起或与氧自由基有关的其他生理改变或疾病的药物。该类化合物还表现出很强的对抗自由基引起的PC12细胞损伤作用，即对模拟脑神经细胞的PC12细胞有抗氧化损伤保护作用。而且在与阳性对照药物同一浓度下，其清除自由基保护细胞的能力比阳性对照槲皮素还高。该类化合物还表现为对铁离子强效螯合作用，从而预期其可以延缓或阻断Aβ蛋白堆积以及脑部神经纤维纠结。说明其对保护脑神经、抗氧化、抑制Aβ蛋白生成和抑制脑部神经纠结、防治老年性痴呆症有积极作用。
本发明的式(1)化合物或其可药用盐及其溶剂化物可以与药学上常用的辐料或载体结合，制备得到具有保护肝细胞急性和慢性伤活性、从而可以用于预防以及治疗肝脏疾病的药物组合物或者保健品。上述各类药物组合物或者保健品可以采用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂、软膏剂等剂型药物。
本发明的式(1)化合物或其可药用盐及其溶剂化物还以与现已上市的肝脏保护及肝病治疗药物药物如联苯双酯、水飞蓟素、水飞蓟宾葡甲胺、双环醇、齐墩果酸、二氯乙酸二异丙胺、原卟啉钠(protoporphyrin disodium)、马洛替酯(malotilate)、熊去氧胆酸、还原型谷胱甘肽、辅酶Q10、维丙肝、左旋肉碱及其复方制剂、肝泰乐(葡萄糖醛酸内酯)、促肝细胞生长因子、山豆根及其有效成分注射液、苦参素(氧化苦参碱)、五味子及其制剂、糖皮质激素、促皮质激素等联合使用，制备得到具有保护肝脏活性的组合物，也可以与核苷类及非核苷类抑制乙肝病毒如拉米呋啶(lamivudine)、利巴韦林(ribavirin)、阿昔络韦(acyclovir)、泛昔络韦(pancyclovir)、更昔络韦(gamcyclovir)、阿德福韦(adevovir)、特诺福韦(tenofovir)、恩替卡韦(entecavir)等原料药物或其制剂联合或交叉使用，均可用于治疗急慢性病毒性肝炎、慢性肝炎、早期肝硬化、脂肪肝极中毒性肝损伤疾病药品或者保健品。上述各类药物合物或者保健品可以采用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂、软膏剂等剂型药物。
本发明的式(1)化合物或其可药用盐及其熔剂化物可以与现已上市的抗自由基氧化剂药物如超氧化物歧化酶(SOD)、白黎芦醇、天然Vitamin E、槲皮素、茶多酚、地塞米松、巴比妥类、维生素C、氯丙嗪、甘露醇等联合使用，制备得到具有防御自由基引起的损害活性的抗氧化药物合物或者保健品，用于治疗上述肝部损伤疾病和治疗伤类疾病如脑中风和中风后遗症、帕金森氏病、脑神经退化以及防治老年性痴呆症阿尔茨海默病。本发明的式(1)化合物或其可药用盐及其溶剂化物还可以与其他保护脑损伤药物和防治老年性痴呆症药物如石杉碱甲、他可林(tacrine)、多奈哌齐(donepezil)、加当他敏、美曲磷脂、更斯的明、美金刚烷胺等联合使用或交叉使用，用于治疗上述疾病。上述各类药物组合物或者保健品可以采用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂、软膏剂等剂型药物。
药理实施例1：苯丙烯酸苯丙烯酯类化合物I-t抑制黄嘌呤氧化酶(XO)活性试验
取SD大鼠，断头处死，迅速取出肝脏至预冷的磷酸缓冲液(100mM，pH8.75)中，去除血管，剪碎后用磷酸缓冲液1∶1(w/v)稀释后匀浆，用磷酸酸缓冲液(1∶4)稀释，离心(12000rpm/10分钟，4℃)，取上清作为酶原。化合物I-t对XO的抑制作用测定采用酶联免疫ELISA法。样品孔中加入底物黄嘌呤(540μM，600微升)，酶(30微升)，化合物I-t用二甲亚砜溶解，用磷酸缓冲液稀释，每孔30微升，使其终浓度为0.050毫克/毫升，加入硝基兰四氮唑(NBT，100μM，30微升)和吩嗪甲硫酸酯(PMS，100μM，30微升，最后加入TritonX-100(0.4％，10微升L)，在37℃中水浴保温2小时，于550nm波长下比色测定。空白孔中用相同体积的磷酸缓冲液代替底物。溶剂对照孔中加入与化合物等浓度的二甲亚砜。化合物I-t抑制率由样品OD值对于空白和对照OD值计算。其中化合物I-t对XOD的半抑制浓度(IC50)由剂量效应曲线得到。姜黄素和别嘌醇为阳性对照。三次测试结果(平均值±标准差)见表一。
表一
| 样品 | 测试浓度(微克/毫升) | 黄嘌呤氧化酶百分抑制率 |
| 化合物I-t姜黄素别嘌醇a) | 505050 | 49.9％±3.0％56.1％±6.8％73.3±7.2％ |
a)别嘌醇对XO半数抑制浓度为3.9微克/毫升。
试验结果表明，化合物I-t具有较强黄嘌呤氧化酶抑制作用，但是在同一浓度下，其清除能力和姜黄素相似而没有别嘌醇对XO抑制活性高。结论：该类苯丙烯酸苯丙烯酯类化合物属于具有一定黄嘌呤氧化酶抑制能力的抗氧化物质。
药理实施例2：苯丙烯酸苯丙烯酯类化合物I-t体外清除超氧阴离子自由基的活性试验
化合物I-t清除超氧阴离子自由基能力的检测乃使用吩嗪-N甲硫酸盐-NADH(phenazine methosulfate-NADH)系统，用四唑氮蓝(nitroblue tetrazolium)还原方法检定。用3毫升含有78μM的NADH、50μM四唑氮蓝和10μM吩嗪-N甲硫酸盐在pH值为8.0的16mM Tris-HCl缓冲液中中产生出超氧阴离子自由基，对不同浓度的化合物I-t检测其活性。超氧阴离子自由基和四唑氮蓝反应生成物的颜色用分光光度计在560nm波长下监测，姜黄素和槲皮素被用作阳性对照药物。三次测试结果(平均值±标准差)见表二。
表二
| 样品 | 测试浓度(微克/毫升) | 对超氧阴离子自由基清除率 |
| 化合物I-t姜黄素槲皮素 | 505050 | 44.0％61.3％士4.7％91.4％土2.8％ |
试验结果表明，化合物I-t具有有一定的超氧阴离子自由基清除作用，但是在同一浓度下，其清除能力没有姜黄素和槲皮素对超氧阴离子自由基清除活性高。
结论：该类苯丙烯酸苯丙烯酯类化合物属于具有一定超氧阴离子自由基清除活性的抗氧化物质。
药理实施例3：苯丙烯酸苯丙烯酯类化合物I-t体外清除二苯基苦基苯肼自由基(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)的活性试验
DPPH的甲醇溶液在517nm有强吸收值，其被抗氧化物还原时，吸收值下降，吸光度越低，其抗氧化作用越强。在250微升反应体系中含有各种不同浓度的化合物I-t25微升，DPPH(0.4毫克/毫升)的甲醇溶腋40微升及甲醇溶液185微升，37℃水浴反应30分钟后，在517nm处测定吸光度。姜黄素和槲皮素作为阳性对照，三次测试结果(平均值±标准差)见表三。
表三
| 样品 | 对超氧阴离子自由基半数清除浓度(IC50)(微克/毫升) |
| 化合物I-t姜黄素槲皮素 | 10.6±1.611.6±1.83.6±0.13 |
试验结果表明，化合物I-t具有一定的二苯基苦基苯肼自由基清除作用，其清除能力略高于姜黄素但低于槲皮素。结论：该类苯丙烯酸苯丙烯酯类化合物属于具有较强二苯基苦基苯肼自由基清除活性的抗氧化物质。
药理实施例4：苯丙烯酸苯丙烯酪类化合物I-t对双氧水H2O2所致PC12细胞损伤的保护作用活性试验
H2O2是一种主要的活性自由基的前体，它可引起中枢神经系统细胞的凋亡，PC12细胞(大鼠肾上嗜铬细胞瘤)可模拟脑神经细胞，因此常用它来作为研究药物与神经细胞之间关系的模型，用MTT测细胞的存活率，如果待测化合物有清除由H2O2引起的自由基，保护神经细胞的作用，OD值高，细胞存活率就高，反之就低。对唐希灿所报道的方去(Xiaoqiu Xiao等，Neurosci Letter，1999，275：73-76)加以改进测定化合物的保护作用。PC12细胞用DMEM培养基培养，培养基中含10％胎牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升链霉素。细胞以每孔8000个的密度加到96孔板中，在37℃，50％CO2潮湿空气的培养箱中培养36小时。细胞存活率用倒置显微镜观察和改良的MTT法。细胞经48小时的孵育后，分别加新配的化合物I-t的二甲亚砜溶液以浓度梯度加入到各孔中。作用2小时后加入新配的H2O2(终浓度为600μmol/L)作用3小时，显微镜观察记录，弃去原培养液，加入新的培养液100微升，然后加入MTT10微升，3小时后，小心吸去培养液，加入150微升DMSO溶解甲臜，于570nm处读数。用槲皮素作阳性对照，三次测试结果(平均值±标准差)见表四。
试验结果表明，化合物I-t具有很强的对抗自由基引起的PC12细胞损伤作用，即对模拟脑神经细胞的PC12细胞有抗氧化损伤保护作用。而且在同一浓度下，其清除自由基保护细胞的能力比阳性对照槲皮素还高。结论：该类苯丙烯酸苯丙烯酯类化合物属于具有强效保护模拟脑神经细胞的PC12细胞作用的抗氧化物质。
表四 化合物I-t及阳性对照槲皮素对双氧水损伤PC12细胞保护率
| 样品 | 测试浓度(微克/毫升) | 加药前后细胞存活率变化 |
| 化合物I-t | 2083.2 | 89.45±8.05％80.03±7.45％65.32±1.66％ |
| 槲皮素 | 2083.2 | 64.78±7.94％44.69±5.74％36.27±5.98％ |
测定化合物对H2O2所致PC12细胞损伤的保护作用可作为初步探讨其保护中枢脑神经细胞的作用机理。故该类化合物表现出对双氧水损伤所致PC12细胞的保护作用，说明其对老年性痴呆证的治疗有积极作用。
药理实施例5：化合物I-t抑制自由基诱导之脂质过氧化物生成的活性试验
5.1.实验原理：脂质过氧化是自由基作用于多不饱和脂肪酸的产物，含量与自由基的生成正相关，由于机体有抗氧化的酶系及非酶系的保护作用，使自由基不断产生又不断被清除。随着年龄的增长，体内的抗氧化剂不断下降，清除自由基的能力逐渐减弱，脂质过氧化作用则增强，脂质过氧化产物增多。因此，测定样品抗脂质过氧化作用，是筛选抗氧化，抗衰老药物的重要指标之一。
5.2化合物I-t抑制自由基诱导之脂过氧化物生成乃通过鼠肝微粒体检测。(1)肝微粒体的制备：实验大鼠断头处死，迅速取出脑，用超速离心法制备脑微粒体。(2)样品对鼠脑脂质过氧化的抑制作用：在含硫酸亚铁(4μmol/L)与维生素Vc(50μmol/L)的1毫升缓冲液中加入200μg/mL微粒体中，以诱导产生脂质过氧化，同时加入不同浓度的I-t样品，37℃孵育30分钟后加入1微升三氯醋酸(20％)中止反应加入1.5微升硫代巴比妥酸(0.76％)，100℃沸水浴20分钟，离心去除蛋白沉淀，在532nm波长下测定上消吸光度。脂质过氧化以反应中生成的丙二醛表示，实验以槲皮素作为阳性对照。三次测试结果(平均值±标准差)试验结果见表五。
表五.样品对大鼠脑微粒体脂质过氧化的抑制作用
| 样品编号 | IC50(微克/毫升) |
| I-t姜黄素槲皮素 | 25.7±2.425.5±3.947.6±5.9 |
5.3试验结果表明，化合物I-t具有很强的抑制自由基诱导之脂过氧化物生成能力，即对细胞有抗氧化损伤保护作用。而且在同一浓度下，其对细胞抗氧化损伤能力比阳性对照槲皮素还高。结论：该类苯丙烯酸苯丙烯酯类化合物属于具有强效保护细胞抗氧化物质。提示其具有保护脑细胞组织损伤以及预期用于制备预防或治疗中风后遗症、早老性痴呆，还可用于治疗急性慢性肝损伤类疾病的作用。
药理实施例6：化合物I-t对SD新生大鼠原代肝细胞双氧水损伤模型的保护作用试验
无菌取出SD大鼠新生乳鼠(5日龄内)肝脏，剪碎，用025％的胰蛋白酶消化，制成肝细胞悬液。将肝细胞悬液收集在锥形瓶中，用200目双层尼龙过滤，再用清洗液清洗，离心3次，以培养液重悬，即可得到大部分为肝实质细胞的悬液。用1640培养液(内含10％小牛血清，105U/升青霉素，100毫克/克链霉素10毫克/克胰岛素)稀释纯化的肝细胞悬液，每毫升含1.0×106个肝细胞。将上述肝细胞悬液加入96孔(每孔0.1毫升)培养板中，置5％CO2培养箱中，在37℃下培养12小时后，吸弃上清，加入0.6mmol/L的H2O2。作用1小时后，分别加入高、中、低3种不同浓度的I-t样品试验药液，每一浓度至少设3个复孔，同时设溶剂和阳性对照组。继续培养48小时后，吸弃上清，收集干细胞样品，570nm波长下用酶标仪计算保护率和增生指数，三次测试结果(平均值±标准差)试验结果见表六。
试验结果表明：化合物I-t具有较强的保护SD新生大鼠原代肝细胞免受双氧水损伤模型的能力，即对SD新生大鼠原代肝细胞有抗氧化损伤保护作用。但在同一浓度下，其对细胞抗氧化损伤能力比阳性对照槲皮素略低。结论：该类苯丙烯酸苯丙烯酯类化合物属于具有有效保护细胞抗氧化物质。提示其具有保肝护肝以及预期用于制备预防或治疗急性慢性肝损伤类疾病的作用。
表六 SD新生大鼠原代肝细胞双氧水损伤模型的保护作用
| 样品编号 | 浓度(微克/毫升) | 保护率(％) | 增生指数 |
| 槲皮素 | 10050101 | 35.515.65.22.2 | 4.412391.421.21 |
| I-t | 10050101 | 30.211.83.62.4 | 4-112.221.231.17 |
药理实施例7：化合物I-t对铁离子的螯合作用试验
据报道在AD病人脑中铁元素显著升高，很可能铁离子参与催化神经纠结形成和Aβ蛋白堆积，从而加速早老性痴呆症状。对铁离子的螯合清除作用也是抗氧化、防治早老性痴呆的作用机制之一。样品以20～100微克/毫升的浓度加入含有2mM硫酸亚铁(5微升)and80％二甲亚砜(200微升)的溶液中，向溶液中加入10微升浓度为5mM的ferrozine 室温下剧烈摇动10分钟。在562nm波长下测溶液吸收OD值，计算百分抑制率。三次测试结果(平均值±标准差)试验结果见表七。
表七化合物对铁离子螯合作用的试验结果
| 样品编号 | 110微克/毫升时的百分抑制率 |
| I-t姜黄素槲皮素 | 75.1±4.946.80±5.731.20±3.6 |
试验结果表明：化合物I-t具有非常强的螯合铁离子活性，可预期具有保护脑细胞免受铁离子催化神经纠结形成和Aβ蛋白堆积的能力，从而可以减缓或预防早老性痴呆症状。其对铁离子螯合能力比阳性对照姜黄素和槲皮素都要高出许多。结论：该类苯丙烯酸苯丙烯酯类化合物属于具有强效铁离子螯合剂。
Claims (7)
1.一种式(1)所示的化合物及其可药用盐或溶剂化物的抗氧化、清除自由基、保护肝及脑细胞氧化损伤的活性：
式(1)
其中：
取代R6，R7，R8，R6′，R7′和R8′可以相同或不同，分别独立地选自氢，巯基，硝基，氰基，含1～8个碳的烷基，含1～8个碳的烷氧基，含1～8个碳的烷胺基，1～15碳的不饱和烃基，1～15碳的不饱和烃氧基，含1～8个碳的烷氧基烷氧基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳氧基，取代或未取代的芳烷氧基，含1～8个碳的酰氧基，其条件是取代基R6，R7，R8，R6′，R7′和R8’不能同时是氢；取代基X可以是氢(H)2，羟基(OH)2，氧，硫；基团R可以是氧，硫，氮，含1～8个碳的亚烷基，含1～8个碳的亚烷胺基，含1～8个碳的亚烷氧基，含1～8个碳的亚烷硫基；其中用于取代的取代基可以是含1～8个碳的烷基，含1～8个碳的烷氧基，卤素，羟基，氨基，硝基，氰基，含1～8个碳的烷胺基，或苯基。
2.式(I)所示的苯丙烯酸苯丙烯酯类化合物的抗氧化、清除自由基、保护肝及脑细胞氧化损伤的活性，式(1)中的取代基X为氧，取代基R为氧时即为式(I)所示的苯丙烯酸苯丙烯酯类化合物，
其中：
取代基R6，R7，R8，R6′，R7′和R8′可以相同或不同，分别独立地选自氢，巯基，硝基，氰基，含1～8个碳的烷基，含1～8个碳的烷氧基，含1～8个碳的烷胺基，1～15碳的不饱和烃基，1～15碳的不饱和烃氧基，含1～8个碳的烷氧基烷氧基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳氧基，取代或未取代的芳烷氧基，含1～8个碳的酰氧基，其条件是取代基R6，R7，R8，R6′，R7′和R8’不能同时是氢；其中用于取代的取代基可以是含1～8个碳的烷基，含1～8个碳的烷氧基，卤素，羟基，氨基，硝基，氰基，含1～8个碳的烷胺基，或苯基。
3.根据权利要求2的生物活性，其特征为式(I)化合物是：
I-a.(E)-7-甲氧基-苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基)苯丙烯酯；
I-b.(E)-(6，7，8-三甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基)苯丙烯酯；
I-c.(E)-(7-硝基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7′-二甲氧基)苯丙烯酯；
I-d.(E)-(6，7，8-三甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7，8′-三甲氧基)苯丙烯酯；
I-e.(E)-(7-甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7′-二甲氧基)苯丙烯脂；
I-f.(E)-(6，7-二甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7′-二甲氧基)苯丙烯酯；
I-g.(E)-(6，7，8-三甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7′二甲氧基)苯丙烯酯；
I-h.(E)-(7-甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7′-二甲氧基甲氧基)苯丙烯酯；
I-i.(E)-(7-甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基甲氧基)苯丙烯酯；
I-j.(E)-(7-羟基)苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基)苯丙烯酯；
I-k.(E)-(7-甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-苯丙烯酯；
I-l.(E)-(6，7-二甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-苯丙烯酯；
I-m.(E)-(6，7-二甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基甲氧基)-苯丙烯酯；
I-n.(E)-(7-甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基)苯丙烯酯；
I-o.(E)-(6，8-二甲氧基-7-O-(3″，4″-二氯)苄基)-苯丙烯酸-(E)-(6′，8′-二甲氧基-7′-O-(3_，4_-二氯)苄基)-丙烯酯；
I-p.(E)-(6，8-二甲氧基-7-O-(4″-溴)苄基)-苯丙烯酸-(E)-(6′，8′-二甲氧基-7′-O-(4_-溴)苄基)-苯丙烯酯；
I-q.(E)-(6，8-二甲氧基-7-O-(3″-溴)苄基)-苯丙烯酸-(E)-(6′，8′-二甲氧基-7′-O-(3_-溴)苄基)-苯丙烯酯；
I-r.(E)-(6，8-二甲氧基-7-O-(2″-碘，4″-溴)苄基)-苯丙烯酸-(E)-(6′，8′-二甲氧基-7′-O-(2_-碘，4_-溴)苄基)-苯丙烯酯；
I-s.(E)-(6，8-二甲氧基-7-O-香叶基)-苯丙烯酸-(E)-(6′，8′-二甲氧基-7′-O-香叶基)-苯丙烯酯；
I-t.(E)-(6，7-二羟基)苯丙烯酸-(E)-苯丙烯酯。
4.根据权利要求1～3所述之生物活性，其用于制备预防或治疗急慢性肝损伤类疾病、保肝护肝类药物的用途；以及该类化合物用于制备防治由自由基引起或与自由基相关的其他生理改变或疾病、保护脑神经包括抗氧化、防治中风和中风后遗症、帕金森氏症、防治老年性痴呆症以及炎症、自身免疫性疾病、肿瘤、心肌缺血、心肌肥厚、衰老、变态反应、动脉粥样硬化等疾病药物的用途。
5.根据权利要求4的用途所制备得到的保肝护肝药、中风和中风后遗症药物、帕金森氏症药物、防治老年性痴呆症以及炎症药物、抗自身免疫性疾病药物、治疗心肌缺血、心肌肥厚、衰老、变态反应和动脉粥样硬化药物、治疗心血管及脑血管病变药物、抗衰老药物、和/或抗肿瘤药物或药物组合物。
6.一种用于制备清除自由基、防治中风和中风后遗症、帕金森氏症、防治老年性痴呆症以及炎症、抗自身免疫性疾病、治疗心肌缺血、心肌肥厚、衰老、变态反应和动脉粥样硬化、治疗心血管及脑血管病变、抗衰老、和/或抗肿瘤、保护肝细胞损伤及急慢性肝损伤的药物组合物，其含有作为活性成分的治疗有效量的权利要求1～3所述之化合物或其可药用盐或溶剂化物或者它们的混合物和可药用辅料。
7.根据权利要求6的药物组合物，其可以是片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂、口服液或软膏剂，还可以采用现代制药界所公知的控释或缓释剂型。
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