CN101014611A

CN101014611A - 改良的抑酶肽变体

Info

Publication number: CN101014611A
Application number: CNA2005800302602A
Authority: CN
Inventors: K·伦布; S·霍尔顿
Original assignee: Bayer Pharmaceuticals Corp
Current assignee: Bayer Pharmaceuticals Corp
Priority date: 2004-07-13
Filing date: 2005-07-13
Publication date: 2007-08-08
Also published as: CA2573368A1; WO2006017355A3; EP1771464A4; WO2006017355A2; ECSP077240A; IL180370A0; AU2005271708A1; MX2007000473A; KR20070041749A; EP1771464A2; US20090005297A1; JP2008506391A; BRPI0513267A; RU2007105137A; NO20070640L; MA28779B1

Abstract

本发明涉及抑制丝氨酸蛋白酶活性的蛋白的领域。本发明还涉及以下领域：用于生产丝氨酸蛋白酶抑制性蛋白的核酸构建物、载体和宿主细胞，含这种蛋白的药物组合物和它们的使用方法。

Description

改良的抑酶肽变体

本申请要求2004年7月13日提交的美国临时专利申请第60/587,655号的权益，该临时申请的内容通过引用整体结合到本文中。

发明领域

本发明涉及抑制丝氨酸蛋白酶活性的蛋白的领域。本发明还涉及以下领域：用于生产丝氨酸蛋白酶抑制性蛋白的核酸构建物、载体和宿主细胞，含这种蛋白的药物组合物及其使用方法。

相关技术背景

失血是大部分手术(例如心内直视手术和其它复杂程序)的严重并发症。心脏手术患者在输入供体血中占显著比例，但是输血带有疾病传染和副反应的风险。另外，供体血昂贵，经常需要过量提供。

抑酶肽(Trasylol)用于降低围术期失血(Dietrich等，Thorac.Cardiovasc.Surg.37：92-98，1989)。抑酶肽是Kunitz家族的一种牛丝氨酸蛋白酶抑制剂，一般认为其通过抑制蛋白酶如纤溶酶降低体内失血。但是，业已报道了副作用，包括低血压和潮红(Bohrer等，Anesthesia 45：853-854，1990)以及变态反应(Dietrich等，1989)。而且，不建议在具有已知免疫球蛋白的患者中重复使用抑酶肽(Dietrich等，1989)。

抑酶肽用于降低心血管外科(例如冠状动脉旁路术、非体外循环、瓣膜、血管、肺活量减少和Cox-Maze法)、矫形外科(例如脊柱、髋部置换和修复、膝盖置换和肿瘤切除)、神经外科和大部分再造(整形)外科当中的失血。

抑酶肽还用于治疗外伤(包括多器官机能障碍和脑损伤)、局部缺血再灌注损伤(例如中风、脑内出血、心肌梗塞、移植物保存损伤和前十字韧带损伤)、癌症(例如转移性和原发性肿瘤抑制)、肺纤毛功能(例如哮喘、囊性纤维化、慢性阻塞性肺病和抗胰蛋白酶缺陷)和器官移植步骤(例如死亡后器官保存和移植手术)。抑酶肽还用于例如纤维蛋白胶的用途(例如在脊椎穿剌、手术伤口治疗和口腔外科当中使用)。

因为抑酶肽是牛源的，所以人患者在再接触该药物时存在诱发过敏反应的有限风险。在啮齿动物和狗中当以高剂量重复给予时抑酶肽还具有肾毒性(Glasser等，“Verhandlungen der DeutschenGesellschaft fur Innere Medizin，78.Kongress，”Bergmann，Munchen，1612-1614页，1972)。一种假说将该作用归因于抑酶肽由于其高净正电荷而在肾脏的负电荷近端小管中的累积(WO93/14120)。

在许多情况下，已经表明PEG化可降低蛋白的免疫原性。但是，PEG化经常降低所修饰蛋白的功能活性，这对抑酶肽之类的拮抗剂而言不合需要。PEG化抑酶肽的现有技术状态是变体抑酶肽(T11D、K15R、R17L、I18H、I19L、V34Y、R39L、K46E)在胺基具有1或2个5kDa PEG修饰的非特异性PEG化。尽管这种修饰提高了药理学特性，但体内有效性没有得到提高(Stassen，Thromb.Haemost.74：655-659，1995)。在其中连接了待评价的17个5kDa PEG分子的PEG化抑酶肽的另一个实例中，胰蛋白酶抑制活性降低约29倍(Shin，Pharm.Pharmacol.Commun.4：57-260，1998)。

因此，本发明的目标是建立功能活性(尤其是就纤溶酶抑制效力而言)类似于抑酶肽的新抑酶肽变体，其具有改良的药代动力学和安全特性，并保持体内效力。

发明概述

本发明提供新型抑酶肽修饰变体，其起具有改良的药代动力学和免疫原性特性的蛋白酶抑制剂的作用。本发明蛋白例如可用于降低手术过程中的失血，预防和/或治疗外伤、局部缺血再灌注损伤、癌症、肺纤毛功能和器官移植步骤，以及例如纤维蛋白胶的用途。

具体地说，本发明的一个方面是选自SEQ ID NO：3-15的PEG化抑酶肽，及其表现出至少一种和表1的肽基本相同的生物学功能的片段、衍生物和变体(统称为“本发明蛋白”)，包括其功能等同物。

本发明的另一个实施方案包括为了降低或消除抑酶肽的免疫识别而用人抑酶肽同源物中发现的氨基酸置换牛序列残基的氨基酸变化。

本发明的另一个实施方案是编码本发明肽的多核苷酸，以及重组表达本发明肽必需的伴随载体(attendant vector)和宿主细胞。

本发明的另一个实施方案是选择性结合本发明肽的抗体和抗体片段。这种载体用于检测本发明的肽，并可利用本领域众所周知的方法进行鉴别和制备。

附图简述

图1.抑酶肽和人Kunitz结构域的序列比对。

发明详述

本发明提供抑酶肽变体，以及表现出至少一种和表1的蛋白(统称为本发明蛋白)基本相同的生物学功能的其片段、衍生物和变体。天然牛抑酶肽(SEQ ID NO：1)、抑酶肽变体(例如SEQ ID NO：2)和人药理学等同物如胎盘Bikunin(SEQ ID NO：3)是对例如胰蛋白酶、纤溶酶和激肽释放酶起作用的蛋白酶抑制剂。因为抑酶肽使用具有相关的副作用，例如免疫原性，所以需要开发不诱发免疫反应并因而有可能允许重复使用治疗剂的长效蛋白酶抑制剂。

本发明提供先前在本领域没有描述的修饰组合，以生产更适于重折叠并在抑酶肽的有利位置提供特异性PEG化位点的抑酶肽变体(参见例如表1，SEQ ID NO：4-15)。本发明的肽在药代动力学和免疫原性特性方面提供超越野生型抑酶肽的改良，潜在提供有益的治疗作用，不诱发其它不当的安全作用，例如免疫原性、自身免疫原性(autogenicity)、过敏性或肾累积。

一种改良蛋白体内特性的方法是PEG化(Greenwald，Adv.Drug.Del.Rev.55：217-250，2003)。迄今为止，PEG化还没有提高抑酶肽的体外或体内效力。因此，通过设计以下的抑酶肽变体应获得超越现有技术水平的显著改良：(i)例如通过固相肽合成或在原核或真核源(例如大肠杆菌、酵母、杆状病毒或植物)中表达，由合成或重组来源获得的抑酶肽变体；(ii)经修饰以促进有效重折叠的抑酶肽变体；(iii)含就缓和蛋白酶抑制而言有利的单个PEG化位点的抑酶肽变体；和(iv)提供改良药代动力学特性(例如通过降低剂量需求)和免疫原性的PEG修饰的抑酶肽变体。

可通过在大肠杆菌(例如Auerswald，Biol.Chem.Hoppe Seyler368：1413-1425，1987；Staley，Proc.Natl.Acad.Sci.89：1519-1523，1992)或在转基因植物(Azzoni，Biotechnol.Bioeng.80：268-276，2002)或在其它表达系统如杆状病毒和酵母中表达获得抑酶肽。还可使用本领域技术人员已知的方法(例如Ferrer，Int.J.Pept.Protein Res.40：194-207，1992)，通过固相肽合成获得抑酶肽。

另外，可用上述重组方法生产抑酶肽变体，其中使用定点诱变(例如Staley，Proc.Natl.Acad.Sci.89：1519-1523，1992)，通过用另一个氨基酸如Ala置换Cys残基，取代天然蛋白的3个二硫键中的一个或两个。序列例如但不限于SEQ ID No：4-6。氨基酸变化未必一定限于Ala。这种置换简化了抑酶肽变体的折叠，导致收率增加(例如Staley，1992)。另外，蛋白二硫键异构酶可用于增加重折叠收率(例如Weissman，Nature365：185-188，1993)。

另一种增加折叠的抑酶肽收率的方法是掺入起分子内催化二硫键形成作用的另外Cys残基，其或者存在于抑酶肽的天然前原序列(SEQ ID NO：7)中，或者为非天然氨基酸序列(SEQ ID NO：8)(例如Weissman，Cell 71：841-851，1992)。可改变附加序列(例如SEQ ID NO：8和10)，以及可掺入到抑酶肽变体(例如SEQ ID NO：11-14)中。该方法具有先前未认识到的优势：提供游离Cys残基，用于用改良药代动力学特性的基团(例如聚乙二醇(PEG))进行位点特异性修饰。

使用重组来源的抑酶肽(二硫键数目有或没有减少，以SEQ IDNO：4-6和SEQ ID NO：7-14的组合为例)，以及掺入N或C末端序列以提供既提高折叠收率又提供单一PEG化位点的游离Cys，这提供了超越分离自牛肺的天然抑酶肽的优良生产和药代动力学特性。

可利用本领域技术人员已知的任何方法进行PEG化。例如，可通过将PEG直接连接至N-末端胺基、C-末端羧基或含例如Cys、Lys、Asp或Glu的反应性侧链的内部氨基酸或含相似反应性侧链部分的非天然氨基酸，将PEG导入蛋白中。本领域技术人员知晓众多的适宜交联剂实例，例如但不限于含胺、醛、乙缩醛、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺和硫醇的市售可得的PEG衍生物(例如Nektar Therapeutics，SanCarlos，CA，USA和NOF，Toyko，Japan)。

作为实例，通过将单个Cys经N-末端或C-末端修饰氨基酸序列导入到肽中实现PEG化，其中所述N-末端或C-末端修饰氨基酸序列在重折叠后不与抑酶肽的6个天然Cys残基中的一个形成二硫键。然后经甲氧基-PEG-马来酰亚胺试剂(例如Nektar Therapeutics，SanCarlos，CA，USA和/或NOF，Tokyo，Japan)的巯基和马来酰亚胺基之间的稳定硫醚键PEG化该单个Cys。除了马来酰亚胺以外，蛋白交联领域技术人员知晓众多的Cys反应基，例如使用烷基卤和乙烯砜。

可使用各种大小的PEG基团，例如但不限于约5kDa至约43kDa的PEG聚合物。PEG修饰可包括单个、线性的PEG，例如连接至马来酰亚胺或其它交联基团的线性5、20或30kDa PEG(参见例如表2)。另外，修饰可包括含两个或多个连接至马来酰亚胺或其它交联基团的PEG聚合物链的分支PEG(参见例如表2)。

用较小PEG(例如线性5kDa PEG)PEG化不大可能降低肽活性，而较大PEG(例如分支的40kDa PEG)更有可能降低活性。但是，较大PEG增加血浆半寿期，使得有可能降低剂量。

PEG和PEG试剂的交联基团之间的接头可变化。例如，可由Nektar Therapeutics(San Carlos，CA，USA)市售获得的Cys-反应性40kDa PEG(mPEG2-MAL)使用马来酰亚胺基团连接Cys，马来酰亚胺基团经基于赖氨酸的接头连接至PEG(表2)。作为第二个实例，可由NOF(Toyko，Japan)市售获得的Cys-反应性43kDa PEG(GL2-400MA)使用马来酰亚胺基团连接Cys，马来酰亚胺基经双置换烷烃接头连接至PEG(表2)。另外，PEG聚合物可直接连接至马来酰亚胺，实例是可由Nektar Therapeutics(San Carlos，CA，USA)获得的分子量5和20kDa的PEG试剂(表2)。

除了PEG化以外，另一种提高蛋白的药代动力学、免疫原性或其它安全特性的方法是使用氨基酸置换。因为免疫系统一般不识别内源蛋白序列，所以抑酶肽变体包括其中不同于人同源物的残基被对应的人蛋白氨基酸置换的变体。这种变体优选应靶向使用抑酶肽的已知原子分辨结构鉴别的表面暴露氨基酸，应包括用存在于人同源物(例如人胎盘Bikunin的Kunitz结构域)中的氨基酸置换牛蛋白的氨基酸(图1)。这种变体还可包括嵌入的或部分嵌入的残基的氨基酸变化。可在抑酶肽中产生一个或多个氨基酸置换或全结构域交换，以产生类似于人同源物的序列，例如但不限于SEQ ID NO：10-13(表1)。变化基于抑酶肽和人同源物之间的序列比对。例如，可用人胎盘Bikunin的Ile7或Tyr102置换抑酶肽的Arg1，或用人胎盘Bikunin的His8或Glu103置换抑酶肽的Pro3(图1)。本领域技术人员可由序列比对容易地鉴别这种变化，例如但不限于图1的变化，可将一个或多个这种变化加入到单个抑酶肽变体中。

以下序列为上述抑酶肽变体的实例：

A₁A₂A₃A₄A₅A₆A₇A₈A₉A₁₀ RPDFC₅LEPPY TGPC₁₄KARIIR YFYNAKAGLC₃₀

QTFVYGGC₃₈RA KRNNFKSAED C₅₁MRTC₅₅GG A₁₁A₁₂A₁₃A₁₄A₁₅A₁₆A₁₇A₁₈A₁₉A₂₀

(SEQ ID NO：15)

其中A₁至A₂₀可为天然氨基酸、非天然氨基酸，或缺失，其中至少一个残基(A₁至A₂₀)为半胱氨酸(Cys)。作为实例，A₁至A₂₀可为赖氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸或半胱氨酸。另外，为减少折叠所需的二硫键数，可将以下的半胱氨酸对置换为丙氨酸：C₅和C₅₅、C₁₄和C₃₈或C₃₀和C₅₁，其中1对半胱氨酸未被置换。此外，以SEQ ID NO：15为例，N末端和C末端添加(分别为A₁至A₁₀和A₁₁至A₂₀)可超过10个残基。

除了PEG化以外，用Cys-反应基团衍化的其它聚合物可用于提高抑酶肽变体的药代动力学或免疫原性特性。例如但非限制性地，抑酶肽变体可用羟乙基淀粉修饰(例如WO2004/024761)。

应当认识到，本文描述的涉及抑酶肽变体的本发明提供了一种生产含二硫键的其它PEG化蛋白(例如含Kunitz结构域的人蛋白酶抑制剂)的方法。

现在定义在整个本说明书中使用的某些术语，其它术语将随着介绍定义。具体氨基酸的单字母缩写、其对应的氨基酸和3字母缩写如下：A、丙氨酸(Ala)；C、半胱氨酸(Cys)；D、天冬氨酸(Asp)；E、谷氨酸(Glu)；F、苯丙氨酸(Phe)；G、甘氨酸(Gly)；H、组氨酸(His)；I、异亮氨酸(Ile)；K、赖氨酸(Lys)；L、亮氨酸(Leu)；M、甲硫氨酸(Met)；N、天冬酰胺(Asn)；P、脯氨酸(Pro)；Q、谷氨酰胺(Gln)；R、精氨酸(Arg)；S、丝氨酸(Ser)；T、苏氨酸(Thr)；V、缬氨酸(Val)；W、色氨酸(Trp)；和Y、酪氨酸(Tyr)。

术语“编码肽的多核苷酸”包括仅含肽编码序列的多核苷酸，以及含另外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。如果序列之间具有至少约70％、至少约90％和至少约95％的同一性，则本发明进一步涉及与上文所述序列杂交的多核苷酸。具体地说，本发明涉及在严格条件下与上文所述多核苷酸杂交的肽编码多核苷酸。本文使用的术语“严格条件”指“严格杂交条件”。只有在序列之间具有至少约90％或约95％-97％同一性的情况下才可发生杂交。在一个实施方案中，与上文所述多核苷酸杂交的多核苷酸编码的肽保留了与cDNA编码的成熟肽基本相同的生物学功能或活性。

“功能等同物”和“基本相同的生物学功能或活性”各自均指当通过相同的方法测定各肽的生物学活性时，生物学活性水平在与其相比的肽表现出的生物学活性的约30％至约100％之内或以上。

术语“片段”、“衍生物”和“变体”当用于本发明肽时，指保留了和这种肽基本相同的生物学功能或活性的肽片段、肽衍生物和肽变体，如下文的进一步描述。

片段是保留了基本相似的功能活性的一部分肽，如在本文公开的体内模型中的描述。

衍生物包括对肽的所有修饰，其基本保留了本文公开的功能并包含其它结构和附加功能(例如修饰的N-末端肽、PEG化肽)，赋予靶向特异性或另外的活性(例如对目标靶的毒性)的融合肽如下文进一步的描述。

本发明的肽可为重组肽、天然纯化的肽或合成肽。

本发明肽的片段、衍生物或变体可为(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基置换的片段、衍生物或变体，这种置换氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的氨基酸残基，或(ii)其中一个或多个氨基酸残基含取代基的片段、衍生物或变体，或(iii)其中成熟肽与另一种化合物(例如增加肽半寿期的化合物)融合的片段、衍生物或变体，或(iv)其中另外的氨基酸(例如前导序列或分泌序列或用于纯化成熟肽的序列)融合至成熟肽的片段、衍生物或变体，或(v)其中肽序列与较大肽(例如用于增加作用时程的人白蛋白、抗体或Fc)融合的片段、衍生物或变体。这种片段、衍生物和变体以及类似物被认为根据本文教导在所属领域的技术人员的知识范围内。

本发明的衍生物可包含在一个或多个非必需氨基酸残基产生的保守氨基酸置换(下文进一步定义)。“非必需”氨基酸残基是可由蛋白的野生型序列改变而不改变生物学活性的残基，而“必需”氨基酸残基是生物学活性必需的。“保守氨基酸置换”是其中用具有相似侧链的氨基酸残基置换氨基酸残基的置换。本领域业已明确了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。片段或生物学活性部分包括适用作药物的肽片段、适于产生抗体的肽片段、适用作研究试剂的肽片段等。片段包括这种肽：其含有的氨基酸序列与本发明肽的氨基酸序列足够相似或由其产生，具有本发明肽的至少一种活性，但其包含的氨基酸少于本文公开的全长肽。通常，生物活性部分包括具有该肽的至少一种活性的结构域或基序。肽的生物活性部分可为例如长5个或更多个氨基酸的肽。这种生物活性部分可合成或通过重组技术制备，并可利用本文公开的方法和/或本领域众所周知的方法评价其本发明肽的一种或多种功能活性。

而且，本发明的衍生物可包括已与另一种化合物融合的肽，所述化合物例如为增加肽半寿期和/或降低肽的潜在免疫原性的化合物(例如聚乙二醇“PEG”)。就PEG化而言，肽与PEG的融合可通过本领域技术人员已知的任意方法实现。例如，首先通过将半胱氨酸突变引入到肽中，以在其连接PEG时提供接头，接着用PEG-马来酰亚胺位点特异性衍化，可实现PEG化。例如，可将半胱氨酸加入到肽的C末端。(参见例如Tsutsumi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97(15)：8548-53，2000；Veronese，Biomaterials 22：405-417，2001；Goodsoon &Katre，Bio/Technology8：343-346，1990)。本发明的肽变体包括其具有的氨基酸序列与本发明肽或其结构域的氨基酸序列足够相似的肽。术语“足够相似的”指第一个氨基酸序列相比于第二个氨基酸序列含有足够数量或最低数量的相同或等同氨基酸残基，使得第一个和第二个氨基酸序列具有相同的结构域和/或相同的功能活性。例如，含至少约45％、约75％-98％相同的共同结构域的氨基酸序列在本文被定义为足够相似的。变体与本发明肽的氨基酸序列足够相似。变体包括由在严格条件下与本发明的多核苷酸或其互补物杂交的多核苷酸编码的肽变体。这种变体一般保留了本发明肽的功能活性。多核苷酸片段文库可用于产生用于筛选和随后选择的多样化片段群。例如，通过在其中每个分子仅发生约一次切口的条件下用核酸酶处理多核苷酸的双链PCR片段，变性双链DNA，复性DNA，以由不同切口产物形成可包含有义/反义对的双链DNA，通过用S1核酸酶处理去除再形成双链体的单链部分，并将产生的片段文库连接入表达载体中，可产生片段文库。利用此方法，人们可得到编码各种大小的本发明肽N末端和内部片段的表达文库。

变体包括由于诱变而在氨基酸序列方面有差异的肽。可通过筛选本发明肽的突变体(例如截短突变体)的组合文库的抑酶肽活性，鉴别起抑酶肽作用的变体。

在一个实施方案中，可在核酸水平上通过组合诱变产生类似物的多样化文库，其由多样化基因文库编码。通过例如将合成寡核苷酸的混合物酶促连接入基因序列中，使得一组简并的潜在变体氨基酸序列作为单个肽表达，或者作为一组其中含序列组的较大融合蛋白(例如用于噬菌体展示)表达，可产生变体的多样化文库。有多种方法可用于由简并寡核苷酸序列产生潜在变体的文库。可在自动化DNA合成仪中实施简并基因序列的化学合成，然后将合成基因连接入合适的表达载体中。使用一组简并基因使得可以在一个混合物中提供编码目标潜在变体序列组的全部序列。合成简并寡核苷酸的方法是本领域已知的(参见例如Narang，Tetrahedron 39：3，1983；Itakura等，Annu.Rev.Biochem.53：323，1984；Itakura等，Science198：1056，1984；Ike等，Nucleic Acid Res.11：477，1983)。

本领域已知有几种技术可用于筛选通过点突变或截短产生的组合文库基因产物和筛选cDNA文库中具有选定特性的基因产物。这种技术适于快速筛选通过组合诱变R-激动剂肽产生的基因文库。适合于筛选大基因文库的高通量分析的最广泛使用技术通常包括将基因文库克隆入可复制载体中，用获得的载体文库转化合适的细胞，并在其中目标活性检测有利于要检测其产物的基因编码载体分离的条件下表达组合基因。递推整体诱变(Recursive ensemble mutagenesis)(REM)是一种增强文库中的功能突变体频率的技术，可与筛选实验组合用于鉴别目的变体。

本发明的肽可由通过肽键或修饰的肽键(即肽等排物)彼此连接的氨基酸组成，并可包含20个基因编码氨基酸以外的氨基酸。可通过天然处理如翻译后加工或通过本领域众所周知的化学修饰技术修饰肽。这种修饰在基础教科书和更详细的专论以及海量研究文献中广为描述。修饰可在肽中的任意位置发生，包括肽主链、氨基酸侧链以及氨基或羧基末端。应当认识到，在给定肽中的几个位置可存在相同或不同程度的相同类型修饰。另外，给定肽可包含许多类型的修饰。肽例如可由于泛素化而分支，其可为有或没有分支的环状。环状、分支和分支环状肽可由翻译后天然加工产生，或者可通过合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、配制、γ-羧化、糖基化、GPI锚定形成、羟化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、PEG化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋、硒化、硫酸化、转移RNA介导的氨基酸加入蛋白如精氨酰化以及泛素化(参见例如 Proteins，Structure and Molecular Properties，第2版，T.E.Creighton，W.H.Freeman andCompany，New York(1993)； Posttranslational Covalent Modification of Proteins，B.C.Johnson编辑，Academic Press，New York，1-12页(1983)；Seifter等，Meth.Enzymol182：626-646，1990；Rattan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.663：48-62，1992)。

本发明的肽包括SEQ ID NO：3-15的肽，以及在由其产生的序列中具有非实质性变异的序列。“非实质性变异”应包括基本保留了本发明肽的至少一种生物学功能(例如抑酶肽活性)的任意序列添加、置换或缺失变体。这些功能等同物可包括与本发明肽具有至少70％同一性、与本发明肽具有至少90％同一性以及与本发明肽具有至少95％同一性的肽，还包括具有基本相同的生物学活性的这种肽的部分。但是，在来源于本发明肽的氨基酸序列中具有非实质性变异、表现出如本文进一步描述的功能等效性的任意肽，都包括在本发明的描述中。

正如本领域所知，通过将一个肽的氨基酸序列和保守氨基酸置换与第二个肽的序列对比确定两个肽之间的“相似性”。这种保守置换包括上述置换，并如Dayhoff( The Atlas of Protein Sequence and Structure5，1978)和Argos(EMBO J.8：779-785，1989)所述。例如，属于以下类别之一的氨基酸代表保守改变：

-Ala、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Thr；

-Cys、Ser、Tyr、Thr；

-Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe；

-Lys、Arg、His；

-Phe、Tyr、Trp、His；和

-Asp、Glu。

本发明还涉及编码本发明肽的多核苷酸，以及含这些多核苷酸的载体、用本发明载体遗传工程改造的宿主细胞和通过重组技术生产本发明肽。可用本发明载体遗传工程改造(转导、转化或转染)宿主细胞，本发明载体例如可为克隆载体或表达载体。载体可为例如质粒、病毒颗粒、噬菌体等形式。工程改造过的宿主细胞可在为适于活化启动子或选择转化子而改良的常规营养培养基中培养。培养条件，例如温度、pH等，是选定用于表达的宿主细胞先前使用的条件，对一般技术人员而言显而易见。可通过重组技术使用本发明的多核苷酸生产肽。因此，例如，多核苷酸序列可包括在各种表达载体的任一种中，具体地说是用于表达肽的载体或质粒。这种载体包括染色体、非染色体和合成DNA序列(例如SV40衍生物)；细菌质粒；噬菌体DNA；酵母质粒；来源于质粒和噬菌体DNA组合的载体；病毒DNA，例如痘苗、腺病毒、禽痘病毒和假狂犬病病毒。但是，可使用任意其它的载体或质粒，只要其可在宿主中复制和有活性。

可通过各种方法将合适的DNA序列插入到载体中。一般来说，可通过本领域已知的方法将DNA序列插入到合适的限制性核酸内切酶位点中。这种方法和其它方法被认为属于本领域技术人员的知识范围。表达载体中的DNA序列与合适的表达控制序列(启动子)有效连接，以引导mRNA合成。这种启动子的代表性实例包括但不限于LTR或SV40启动子、大肠杆菌lac、T7或trp、噬菌体λP_L启动子和已知在原核或真核细胞或其病毒中控制基因表达的其它启动子。表达载体还可包含用于翻译启始的核糖体结合位点和转录终止子。载体还可包含用于增强表达的序列。另外，表达载体可包含提供表型特性的基因，用于选择转化宿主细胞，例如用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或例如大肠杆菌中的四环素或氨苄青霉素抗性。可使用含上文所述的合适DNA序列以及合适启动子或控制序列的载体转化合适的宿主，以允许宿主表达蛋白。适宜宿主的代表性实例包括但不限于细菌细胞，例如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、链霉菌；真菌细胞，例如酵母；昆虫细胞，例如果蝇S2和夜蛾Sf9；动物细胞，例如CHO、COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物细胞等。适宜宿主的选择被认为在本文教导内容所属领域技术人员的知识范围内。

本发明还包括含一个或多个如上文广泛描述的序列的重组构建物。构建物含本发明序列已以正向或反向插入其中的载体，例如质粒或病毒载体。在该实施方案的一个方面，构建物进一步包含有效连接至序列的调节序列，包括例如启动子。大量的合适载体和启动子是本领域技术人员知晓的，可由商业渠道购买获得。提供以下的载体作为实例。细菌：pET载体、pQE70、pQE60、pQE-9、pBS、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a、pTRC99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540和PRIT5。真核生物：pWLneo、pSV2cat、pOG44、pXT1、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG和PSVL。但是，可使用任意其它的质粒或载体，只要其在宿主中可复制和有活性。可使用CAT(氯霉素转移酶)载体或其它具有选择标记的载体由任意目标基因中选择启动子区。两种合适的载体是pKK232-8和pCM7。特别有名的细菌启动子包括laci、lacZ、T3、T7、gpt、λP_R、P_L和trp。真核生物启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆转录病毒的LTR和小鼠金属硫蛋白-I。合适载体和启动子的选择完全在本领域一般技术人员知识水平之内。

本发明还涉及含上述构建物的宿主细胞。宿主细胞可为高等真核生物细胞(例如哺乳动物细胞)或低等真核生物细胞(例如酵母细胞)，或者宿主细胞可为原核生物细胞，例如细菌细胞。可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔(Davis等，Basic Methods inMolecular Biology，1986)，实现构建物导入宿主细胞中。可以常规方式使用宿主细胞中的构建物生产由重组序列编码的基因产物。或者，可通过常规肽合成仪合成生产本发明的肽。

成熟蛋白可在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞中于合适的启动子控制下表达。还可使用无细胞翻译系统，使用来源于本发明的DNA构建物的RNA，生产这种蛋白。适用于原核和真核宿主的克隆和表达载体描述于Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，(Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)，其公开内容通过引用结合到本文中。

通过将增强子序列插入到载体中，增加高等真核生物对编码本发明肽的DNA的转录。增强子是DNA顺式作用元件，通常约10至约300bp，作用于启动子，以增加其转录。实例包括复制起点后侧的SV40启动子(bp100-270)，巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。一般来说，重组表达载体包含复制起点和允许转化宿主细胞的选择标记(例如大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因或酿酒酵母TRP1基因)，以及来源于高度表达基因的启动子，其引导下游结构序列的转录。这种启动子可来源于编码糖酵解酶的操作子，糖酵解酶例如为3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、α因子、酸性磷酸酶或热休克蛋白等。在合适的阶段用翻译、启动和终止序列以及可选的能够引导翻译蛋白分泌入壁膜间隙或胞外培养基中的前导序列，组装异源结构序列。任选，异源序列可编码融合蛋白，其含赋予目标特征的N-末端识别肽(例如稳定或简化所表达的重组产物的纯化)。

可通过将编码目标蛋白连同合适的翻译、起始和终止信号的结构DNA序列按照功能启动子的有效读框插入，构建细菌使用的有效表达载体。载体可包含一个或多个表型选择标记和复制起点，以确保载体的保持，需要的话，提供在宿主中的扩增。适于转化的原核宿主包括例如大肠杆菌、枯草杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和各种不特指种的假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属，尽管也可使用其它原核生物作为选择。细菌使用的有用表达载体可包含来源于市售质粒的选择标记和细菌复制起点，其包括众所周知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)的遗传元件。这种市售载体包括例如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEM1(Promega，Madison，Wis.，USA)。这些pBR322“主链”部分可与合适的启动子和待表达的结构序列组合。

在转化合适的宿主菌株并培养宿主菌株至合适的细胞密度后，利用合适的方法(例如温度变化或化学诱导)去阻遏选定的启动子，并将细胞延长培养一段时间。通过离心收集细胞，通过物理或化学方法破碎，保留所获得的粗提物，用于进一步的纯化。可利用任意常规方法破碎用于表达蛋白的微生物细胞，包括冻融循环、超声波、机械破碎或使用细胞裂解剂。

还可使用各种哺乳动物细胞培养系统表达重组蛋白。哺乳动物表达系统的实例包括描述于Gluzman，(Cell23：175，1981)的COS-7猴肾成纤维细胞系和能够表达相容载体的其它细胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体可包含复制起点、合适的启动子和增强子，还可包含任意必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5′侧翼非转录序列。来源于SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40起点、早期启动子、增强子、剪接位点和聚腺苷酸化位点，可用于提供必需的非转录遗传元件。

可利用此前使用过的方法由重组细胞培养物回收和纯化本发明的肽，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析和凝集素层析。视需要可使用蛋白重折叠步骤完成成熟蛋白构型。最后，可使用高效液相层析(HPLC)作为最终纯化步骤。

本发明的肽可为化学合成方法的产物，或通过重组技术由原核或真核宿主(例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)生产。根据在重组生产步骤中使用的宿主，本发明的肽可用哺乳动物或其它真核生物糖类糖基化，或者可为非糖基化的。本发明的肽还可包括起始的甲硫氨酸氨基酸残基。本发明的分离或纯化的肽或其生物活性部分基本无其它细胞物质，或者在通过重组技术产生时基本无培养基，或者在化学合成时基本无化学前体或其它化学物质。本发明的分离肽基本无细胞物质，具有低于30％(干重)的非肽物质或杂质。当本发明的肽或其生物活性部分重组产生时，培养基可占肽制品体积的约30％以下。当本发明的肽通过化学合成生产时，制品可包含低于约30％干重的化学前体或非本发明化学物质。

可如下文的具体实施例所述常规分离本发明的肽。纯化肽制品为至少约70％纯，或约85％至约99％纯。可通过本领域已知的任意方法评价制品纯度，如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和质谱/液相层析。

可使用本领域众所周知的化学方法全部或部分地合成编码本发明肽的多核苷酸序列(参见例如Caruthers等，Nucl.Acids Res.Symp.Ser.215-223，1980；Horn等，Nucl.Acids Res.Symp.Ser.225-232，1980)。然后可将编码该肽的多核苷酸克隆入表达载体中，以表达肽。

本领域技术人员会理解，生产具有非天然密码子的肽编码核苷酸序列可能有利。例如，可选择特定原核或真核宿主偏好的密码子，以增加肽表达率或生产具有目标特性(例如比由天然序列产生的转录本的半寿期长的半寿期)的RNA转录本。

由于各种各样的理由，可使用本领域一般已知的方法工程改造本文公开的核苷酸序列，以改变肽编码序列，这些改变包括但不限于修改肽或mRNA产物的封闭、加工和/或表达的改变。可使用借助于随机片段化的DNA重排以及基因片段和合成寡核苷酸的PCR再组装工程改造核苷酸序列。例如，可使用定点诱变插入新限制位点、改变糖基化模式、改变密码子选择、产生剪接变体、导入突变等等。

本发明还提供本领域技术人员所理解的相关肽，例如化学模拟物、有机模拟物或肽模拟物。本文使用的术语“模拟物”、“肽模拟物”、“有机模拟物”和“化学模拟物”意欲包括在三维方向具有的原子排列等同于本发明肽的肽衍生物、肽类似物和化合物。要理解的是，本文使用的表述“等同于”意在包括在所述肽中具有某些原子置换或化学部分的肽，模拟肽中具有的键长、键角和排列产生相同或足够相似的所述原子和部分的排列或方向，以具有本发明肽的生物学功能的肽。在本发明的肽模拟物中，化学组分的三维排列在结构和/或功能上等同于肽主链和肽中组成氨基酸侧链的三维排列，导致本发明肽的这种肽模拟物、有机模拟物和化学模拟物具有实质生物活性。这些术语按照本领域的理解使用，例如阐述于Fauchere，(Adv.Drug Res.15：29，1986)；Veber & Freidinger，(TINS392页，1985)和Evans等，(J.Med.Chem.30：1229，1987)，其通过引用结合到本文中。

要理解的是，存在本领域各种肽的生物活性的药效团。本领域理解的药效团包含生物活性所需结构的理想化三维限定。可用现有的计算机建模软件(计算机辅助药物设计)设计肽、有机和化学模拟物，以拟合各个药效团。可基于本发明肽中的置换原子的位置信息，利用结构-功能分析生产所述模拟物。

有利地，可通过本领域已知的任意化学合成技术，具体地说是例如使用市售可得的自动化肽合成仪的固相合成技术，合成本发明提供的肽。可通过常规用于肽合成的固相或液相方法合成本发明的模拟物(参见例如Merrifield，J.Amer.Chem.Soc.85：2149-54，1963；Carpino，Acc.Chem.Res.6：191-98，1973；Birr，Aspects of the MerrifieldPeptide Synthesis，Springer-Verlag：Heidelberg，1978；The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology，1、2、3和5卷，(Gross & Meinhofer编辑)，Academic Press：New York，1979；Stewart等，Solid Phase PeptideSynthesis，第2版，Pierce Chem.Co.：Rockford，III.，1984；Kent，Ann.Rev.Biochem.57：957-89，1988；和Gregg等，Int.J.Peptide Protein Res.55：161-214，1990，其通过引用整体结合到本文中)。

可通过固相方法学制备本发明的肽。简单地讲，将N-保护的C-末端氨基酸残基连接至不溶性支持体，例如二乙烯苯交联的聚苯乙烯、聚丙烯酰胺树脂、Kieselguhr/聚酰胺(pepsyn K)、可控孔玻璃、纤维素、聚丙烯膜、丙烯酸包被的聚乙烯棒等。使用保护氨基酸衍生物的去保护、中和和偶联的连续循环，按照氨基酸序列由C末端连接氨基酸。对于某些合成肽，可使用采用酸敏树脂的FMOC策略。就此而言，固体支持体可为二乙烯苯交联的聚苯乙烯树脂，其可以各种功能化形式由市场上购买，包括氯甲基树脂、羟甲基树脂、对乙酰氨基甲基树脂、二苯甲胺(BHA)树脂、4-甲基二苯甲胺(MBHA)树脂、肟树脂、4-烷氧基苄基醇树脂(Wang树脂)、4-(2′，4′-二甲氧基苯氨基甲基)-苯氧基甲基树脂、2，4-二甲氧基二苯甲胺树脂和4-(2′，4′-二甲氧基苯基-FMOC-氨基-甲基)-苯氧基对乙酰氨基正亮氨酰基-MBHA树脂(Rink酰胺MBHA树脂)。α氨基酸的保护基是碱不稳定的9-芴基甲氧基-羰基(FMOC)。

用于与BOC(叔丁氧基羰基)和FMOC基团化学相容的氨基酸侧链官能化的合适保护基在本领域众所周知。可使用本领域已知的各种偶联剂和化学物质偶联氨基酸残基，例如将氨基酸残基直接与DIC(二异丙基碳二亚胺)、DCC(二环己基碳二亚胺)、BOP(六氟磷酸苯并三唑基-N-氧基-三-二甲氨基膦)、PyBOP(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷基膦)、PyBrOP(六氟磷酸溴-三-吡咯烷并膦)偶联；经预对称酐偶联氨基酸残基；经活性酯如五氟苯基酯偶联氨基酸残基；或经预HOBt(1-羟基苯并三唑)活性酯偶联氨基酸残基；或通过使用FMOC-氨基酸氟化物和氯化物偶联氨基酸残基；或使用FMOC-氨基酸-N-羧基酐偶联氨基酸残基。优选在HOBt或HOAt(7-氮杂羟基苯并三唑)存在下用HBTU(六氟磷酸2-(1H-苯并三唑-1-基)，1，1，3，3-四甲基脲)或HATU(六氟磷酸2-(1H-7-氮杂-苯并三唑-1-基)，1，1，3，3-四甲基脲)活化。

可手动实施固相方法，还可利用在市售肽合成仪(例如AppliedBiosystems433A等；Applied Biosystems，Foster City，CA)上进行的自动化合成。在典型合成中，将第一个(C-末端)氨基酸装载在氯三苯甲基树脂上。可使用遵循ABI FastMoc方案(Applied Biosystems)的连续去保护(用20％哌啶/NMP(N-甲基吡咯烷酮))和偶联循环，产生肽序列。还可使用通过乙酸酐加帽的双重和三重偶联。

可由树脂上切下合成的模拟肽，并通过用含合适清除剂的TFA(三氟乙酸)处理去保护。可使用许多这种分裂剂，例如Reagent K(0.75g结晶苯酚、0.25mL乙二硫醇、0.5mL苯硫基甲烷、0.5mL去离子水、10mL TFA)等。通过用乙醚沉淀过滤和分离将肽与树脂分离。可利用常规方法，例如凝胶过滤和反相HPLC(高效液相层析)，实现进一步的纯化。本发明的合成模拟物可为药物可接受盐的形式，尤其是碱加成盐，包括有机碱和无机碱的盐。按照本领域技术人员众所周知的方法，通过用合适的碱或无机碱处理肽，制备酸性氨基酸残基的碱加成盐，或者可通过冻干合适的碱直接获得需要的盐。

一般来说，本领域技术人员会认识到，可利用各种化学技术修饰本文描述的肽，以生产具有和未修饰肽基本相同的活性并任选具有其它需要特性的肽。例如，可以药物可接受的阳离子盐的形式提供肽的羧酸基团。肽中的氨基可为药物可接受的酸加成盐的形式，例如HCl盐、HBr盐、乙酸盐、苯甲酸盐、磺酸甲苯盐、马来酸盐、酒石酸盐和其它有机盐，或者可转变为酰胺。本领域技术人员还应知晓将环状结构导入到本发明肽中的方法，以便更紧密地近似于天然结合构型。

可利用各种技术构建肽衍生物和类似物，其与对应肽具有相同或相似的目的生物学活性，但在溶解性、稳定性以及对水解和蛋白水解的敏感性方面具有比该肽更有利的活性。这种衍生物和类似物包括在N-末端氨基、C-末端氨基修饰的肽和/或将肽中的一个或多个酰胺键改变为非酰胺键的肽。要理解的是，两个或多个这种修饰可一起处于一个肽模拟结构中(例如在C末端羧基中的修饰和肽中的两个氨基酸之间包含-CH₂-氨基甲酸酯键)。

氨基末端修饰包括烷基化、乙酰化、加入羧苯甲酰基和形成琥珀酰亚胺基。具体地说，N-末端氨基可反应形成式RC(O)NH-的酰胺基团，其中R是烷基，通过与酰卤RC(O)Cl或酸酐反应而加入。通常，可通过使约等摩尔或过量(例如约5当量)的酰卤接触惰性稀释液(例如二氯甲烷)中的肽进行反应，该稀释液含过量(例如约10当量)叔胺(例如二异丙基乙胺)以清除反应过程中产生的酸。其它反应条件都是常规的(例如室温30分钟)。末端氨基的烷基化提供低级烷基N取代，接着如上所述与酰卤反应，提供式RC(O)NR-的N-烷基酰胺基团。或者，氨基末端可通过与琥珀酸酐反应共价连接至琥珀酰亚胺基。使用约等摩尔量或过量的琥珀酸酐(例如约5当量)，通过本领域众所周知的方法，包括如Wollenberg等(美国专利第4,612,132号)(其通过引用整体结合到本文中)所述使用在合适惰性溶剂(例如二氯甲烷)中的过量(例如10当量)叔胺(例如二异丙基乙胺)，将末端氨基转变为琥珀酰亚胺。还要理解的是，可用例如以常规方式制备的C₂-C₆烷基或-SR取代基取代琥珀酰胺基，以在肽的N末端提供取代的琥珀酰亚胺。可通过以Wollenberg等，出处同上所述的方式使低级烯烃(C₂-C₆烷基)与马来酸酐反应，制备这种烷基取代基；可通过使RSH与马来酸酐反应，制备-SR取代基，其中R如上定义。在另一个有利的实施方案中，可衍化氨基末端，以形成苄氧羰基-NH-或取代的苄氧羰基-NH-基团。可通过与合适的惰性稀释液(例如二氯甲烷)中与大约等量或过量的苄氧羰基氯(CBZ-Cl)或取代的CBZ-Cl反应生产该衍生物，该稀释液含叔胺以清除反应过程中产生的酸。在再另一种衍生物中，N-末端含磺酰胺基，其通过与合适的惰性稀释液(二氯甲烷)中的大约等量或过量(例如5当量)的R-S(O)₂Cl反应，将末端胺转变为磺酰胺，其中R是烷基(例如低级烷基)。惰性稀释液包含过量的叔胺(例如10当量)，例如二异丙基乙胺，以去除反应过程中产生的酸。其它反应条件是常规的(例如室温30分钟)。通过与合适的惰性稀释液(例如二氯甲烷)中的等量或过量(例如5当量)的R-OC(O)Cl或R-OC(O)OC₆H₄-p-NO₂反应，将末端氨基转变为氨基甲酸，由此可在氨基末端产生氨基甲酸基团，其中R是烷基(例如低级烷基)。惰性稀释液可包含过量(例如约10当量)叔胺，例如二异丙基乙胺，以清除反应过程中产生的任何酸。其它反应条件是常规的(例如室温30分钟)。可通过与合适的惰性稀释液(例如二氯甲烷)中的等量或过量(例如5当量)的R-N＝C＝O反应，将末端胺转变为脲基(即RNHC(O)NH-)，由此在氨基末端形成脲基，其中R如上定义。惰性稀释液可包含过量(例如约10当量)叔胺，例如二异丙基乙胺。其它反应条件是常规的(例如室温约30分钟)。

在制备其中C末端羧基可被酯(例如-C(O)OR，其中R是烷基)取代的肽模拟物时，可使用用于制备肽酸的树脂，并可用碱和合适的醇(例如甲醇)切割侧链受保护的肽。可以常用的方式，通过用氟化氢处理去除侧链保护基，以获得需要的酯。在制备其中C末端羧基被酰胺-C(O)NR₃R₄取代的肽模拟物时，使用二苯甲胺树脂作为肽合成的固体支持体。当合成完成时，使肽由支持体上释放的氟化氢处理直接产生游离肽酰胺(即C末端是-C(O)NH₂)。或者，在肽合成当中使用氯甲基化树脂和与铵反应以从支持体上切下侧链保护肽的联合产生游离肽酰胺，与烷基胺或二烷基胺的反应产生侧链受保护的烷基酰胺或二烷基酰胺(即C-末端是-C(O)NRR₁，其中R和R₁是烷基，低级烷基)。然后以常用方式通过用氟化氢处理去除侧链保护，以获得游离的酰胺、烷基酰胺或二烷基酰胺。

本领域理解的和本发明提供的肽模拟物在结构上类似于本发明的肽，但具有一个或多个任选被选自以下的键置换的肽键：-CH₂NH-、-CH₂S-、-CH₂CH₂-、-CH＝CH-(顺式和反式的构象异构体)、-COCH₂-、-CH(OH)CH₂-和-CH₂SO-，置换方法是本领域已知的，并在以下参考文献中更深入地描述：Spatola，Chemistry and Biochemistry of AminoAcids，Peptides，and Proteins，(Weinstein编辑)，Marcel Dekker：NewYork，267页，1983；Spatola，Peptide Backbone Modifications 1：3，1983；Morley，Trends Pharm.Sci.463-468页，1980；Hudson等，Int.J.Pept.Prot.Res.14：177-185，1979；Spatola等，Life Sci.38：1243-1249，1986；Hann，J.Chem.Soc.Perkin Trans.I307-314，1982；Almquist等，J.Med.Chem.23：1392-1398，1980；Jennings-White等，Tetrahedron Lett.23：2533，1982；Szelke等，EP045665A；Holladay等，Tetrahedron Lett.24：4401-4404，1983；和Hruby，Life Sci.31：189-199，1982；其每个均通过引用结合到本文中。这种肽模拟物可具有超越肽实施方案的显著优势，包括例如生产更经济，化学稳定性更高或药理学特性(例如半寿期、吸收、效力、有效性等)增强、抗原性降低和其它特性。

还可使用常规或合理的药物设计原则获得本发明肽的模拟类似物(参见例如Andrews等，Proc.Alfred Benzon Symp.28：145-165，1990；McPherson，Eur.J.Biochem.189：1-24，1990；Hol等，载于Molecular Recognition：Chemical and Biochemical Problems，(Roberts编辑)；Royal Society of Chemistry；84-93页，1989a；Hol，Arzneim-Forsch.39：1016-1018，1989b；Hol，Agnew Chem.Int.Ed.Engl.25：767-778，1986；其公开内容通过引用结合到本文中)。

按照常规药物设计方法，可通过随机测试其结构与“天然”肽的结构具有相同特性的分子获得需要的模拟分子。可通过与肽活性相比较检测推定模拟物的生物活性，定量测定由结合分子特定基团的改变产生的影响。在合理药物设计的一个实施方案中，设计具有最稳定的肽三维构象特性的模拟物。因此，例如，可设计具有化学基团的模拟物，该化学基团以足以引起离子、疏水或范德华相互作用的方式定向，其中所述离子、疏水或范德华相互作用类似于本文公开的本发明肽所表现出的离子、疏水或范德华相互作用。

一种实施合理模拟物设计的方法使用能够形成肽三维结构表象的分子制图软件。可使用本领域的市售计算机辅助设计程序产生本发明肽的肽、有机和化学模拟物的分子结构。这些程序的实例包括SYBYL 6.5、HQSAR^TM和ALCHEMY2000^TM(Tripos)；GALAXY^TM和AM2000^TM(AM Technologies，Inc.，San Antonio，TX)；CATALYST^TM和CERIUS^TM(Molecular Simulations，Inc.，San Diego，CA)；CACHE PRODUCTS^TM、TSAR^TM、AMBER^TM和CHEM-X^TM(Oxford Molecular Products，Oxford，CA)以及CHEMBUILDER3D^TM(InteractiVe Simulations，Inc.，San Diego，CA)。

使用本文公开的肽、使用例如本领域认可的分子建模程序产生的肽、有机和化学模拟物可使用常规化学合成技术产生，例如设计用于适合高通量筛选的化学合成技术，包括组合化学方法。用于生产本发明的肽、有机和化学模拟物的组合方法包括噬菌体展示阵列、固相合成和组合化学阵列，其例如由SIDDCO(Tuscon，Arizona)；Tripos，Inc.；Calbiochem/Novabiochem(San Diego，CA)；SymyxTechnologies，Inc.(Santa Clara，CA)；Medichem Research，Inc.(Lemont，IL)；Pharm-Eco Laboratories，Inc.(Bethlehem，PA)或N.V.Organon(Oss，Netherlands)提供。可按照本领域已知的方法生产本发明的肽、有机和化学模拟物的组合化学产物，所述方法包括但不限于公开于以下的技术：Terrett，(Combinatorial Chemistry，Oxford University Press，London，1998)；Gallop等，J.Med.Chem.37：1233-51，1994；Gordon等，J.Med.Chem.37：1385-1401，1994；Look等，Bioorg.Med.Chem.Lett.6：707-12，1996；Ruhland等，J.Amer.Chem.Soc.118：253-4，1996；Gordon等，Acc.Chem.Res.29：144-54，1996；Thompson & Ellman，Chem.Rev.96：555-600，1996；Fruchtel & Jung，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35：17-42，1996；Pavia，“The Chemical Generation of MolecularDiversity”，Network Science Center，www.netsci.org，1995；Adnan等，“Solid Support Combinatorial Chemistry in Lead Discovery and SAROptimization，”出处同上，1995；Davies和Briant，“CombinatorialChemistry Library Design using Pharmacophore Diversity，”出处同上，1995；Pavia，“Chemically Generated Screening Libraries：Present andFuture，”出处同上，1996；和美国专利第5,880,972、5,463,564、5,331573和5,573,905号。

可通过制备型高效液相层析大致纯化新合成的肽(参见例如Creighton，Proteins：Structures And Molecular Principles，WH Freemanand Co.，New York，N.Y.，1983)。可通过氨基酸分析或通过例如Edman降解法(Creighton，出处同上)测序证实本发明的合成肽的组成。另外，可在直接合成当中改变肽的氨基酸序列的任意部分，和/或使用化学方法将肽的氨基酸序列的任意部分与其它蛋白的序列组合，以产生变体肽或融合肽。

本发明还包括选择性结合本发明肽的抗体和抗体片段。可使用本领域众所周知的方法产生本领域已知的任意类型的抗体。例如，可产生特异性结合本发明肽的表位的抗体。本文使用的“抗体”包括完整的免疫球蛋白分子及其能够结合本发明肽的表位的片段，例如Fab、F(ab′)₂和Fv。通常，形成表位需要至少6、8、10或12个连续氨基酸。但是，包含非连续氨基酸的表位可能需要更多的氨基酸，例如至少15、25或50个氨基酸。

特异性结合本发明肽的表位的抗体可治疗性使用，以及在免疫化学实验中使用，所述免疫化学实验例如蛋白质印迹、ELISA、放免实验、免疫组化实验、免疫沉淀或本领域已知的其它免疫化学实验。可使用各种免疫实验鉴别具有目标特异性的抗体。本领域众所周知众多用于竞争结合或免疫放射测量实验的方案。这种免疫实验通常包括检测免疫原和特异性结合免疫原的抗体之间形成的复合物。

通常，当在免疫化学实验中使用时，特异性结合本发明肽的表位的抗体产生的检测信号是其它蛋白产生的检测信号的至少5、10或20倍高。优选地，特异性结合本发明肽的抗体不检测免疫化学实验中的其它蛋白，并可免疫沉淀溶液中的本发明肽。

本发明的肽可用于免疫哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴或人，以生产多克隆抗体。如果有需要，可将本发明的肽缀合至载体蛋白，例如牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白和钥孔嘁血蓝蛋白。根据宿主物种，可使用各种佐剂增加免疫应答。这种佐剂包括但不限于弗氏佐剂、无机凝胶(例如氢氧化铝)和表面活性物质(例如溶血卵磷脂、Pluronic多聚醇、聚阴离子、肽、油乳浊液、钥孔嘁血蓝蛋白和二硝基苯酚)。在用于人的佐剂中，BCG(卡介苗)和小棒杆菌特别有用。

可使用通过培养的连续细胞系提供抗体分子生产的任意技术制备特异性结合本发明肽的单克隆抗体。这些技术包括但不限于杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术和EBV杂交瘤技术(Kohler等，Nature256：495-97，1985；Kozbor等，J.Immunol.Methods81：3142，1985；Cote等，Proc.Natl.Acad.Sci.80：2026-30，1983；Cole等，Mol.Cell Biol.62：109-20，1984)。

另外，可使用开发用于生产“嵌合抗体”的技术，将小鼠抗体基因剪接至人抗体基因，以获得具有合适的抗原特异性和生物活性的分子(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.81：6851-55，1984；Neuberger等，Nature312：604-08，1984；Takeda等，Nature314：452-54，1985)。还可“人源化”单克隆和其它抗体，以在其治疗性使用时防止患者建立针对该抗体的免疫应答。这种抗体在序列上与人序列相似得足以直接用于治疗，或者可能需要改变一些关键残基。可通过定点诱变单个残基或通过嫁接(grating)完整的互补决定区置换与人序列中的残基不同的残基，最小化啮齿动物抗体和人序列之间的序列差异。或者，可使用重组方法(参见例如GB2188638B)生产人源化抗体。如美国专利第5,565,332号中所公开的内容，特异性结合本发明肽的抗体可包含部分或全部人源化的抗原结合位点。

或者，可使用本领域已知的方法，采用描述用于生产单链抗体的技术，生产特异性结合本发明肽的单链抗体。可通过随机组合免疫球蛋白文库的链重排产生具有相关特异性但为不同独特型组成的抗体(Burton，Proc.Natl.Acad.Sci.88：11120-23，1991)。

还可使用DNA扩增方法，例如PCR，使用杂交瘤cDNA作为模板，构建单链抗体(Thirion等，Eur.J.Cancer Prev.5：507-11，1996)。单链抗体可为单或双特异性的，并可为二价或四价的。四价双特异性单链抗体的构建教导于例如Coloma和Morrison(Nat.Biotechnol.15：159-63，1997)。二价双特异性单链抗体的构建教导于Mallender和Voss(J.Biol.Chem.269：199-206，1994)。

如下文所述，可使用手动或自动化核苷酸合成构建编码单链抗体的核苷酸序列，使用标准重组DNA方法将其克隆入表达构建物中，并导入细胞中，以表达编码序列。或者，可使用例如丝状噬菌体技术(Verhaar等，Int.J.Cancer61：497-501，1995；Nicholls等，J.Immunol.Meth.165：81-91，1993)直接生产单链抗体。

还可如文献(Orlandi等，Proc.Natl.Acad.Sci.86：38333-37，1989；Winter等，Nature349：293-99，1991)所公开的，通过诱导淋巴细胞群中的体内生产或通过筛选高度特异性结合试剂的免疫球蛋白文库或组，生产特异性结合本发明肽的抗体。

可构建其它类型的抗体，并治疗性用于本发明方法中。例如，可按照WO93/03151的公开内容构建嵌合抗体。还可制备源自免疫球蛋白并为多价和多特异性的结合蛋白，例如“双功能抗体”(参见例如WO94/13804)。

还可如下由MorphoSys HuCAL文库鉴别能够结合本发明肽的人抗体。本发明的肽可包被在微量滴定板上，并与MorphoSysHuCALFab噬菌体文库温育。不结合本发明肽的噬菌体连接的Fab可由板上洗去，只留下紧密结合本发明肽的噬菌体。例如可通过改变pH或用大肠杆菌洗脱来洗脱结合的噬菌体，并通过感染大肠杆菌宿主扩增。这种淘选方法可重复一次或两次，以富集紧密结合本发明肽的抗体群。然后将富集群中的Fab表达、纯化，并在ELSIA实验中筛选。

可通过本领域众所周知的方法纯化本发明的抗体。例如，可通过穿过结合本发明肽的柱亲和纯化抗体。然后可使用高盐浓度的缓冲液由柱上洗脱结合的抗体。

使用方法

下文定义了本文使用的各种术语。

当介绍本发明的组成部分或其实施方案时，冠词“一个”、“该”和“所述”意指有一个或多个组成部分。规定术语“包含”、“包括”和“具有”为包括在内的意思，指可具有所罗列组成部分之外的其余组成部分。

本文使用的术语“受试者”包括哺乳动物(例如人和动物)。

术语“治疗”包括任意过程、作用、应用、治疗等，其中提供给受试者(包括人)医务救护，其目标在于直接或间接改善受试者的疾病，或减慢受试者中病症或障碍的进展。

术语“联合治疗”或“共同治疗”指给予两种或更多种治疗剂。这种给予包括以基本同时的方式共同给予两种或更多种治疗剂，例如以具有固定比率的活性成分的单个胶囊形式，或以各抑制剂的多个单独胶囊的形式。另外，这种给予包括以序贯方式使用各类型的治疗剂。

表述“治疗有效的”指给予的各种治疗剂的量达到了改善疾病状况的目标，同时避免或最小化与给予的治疗剂治疗相关的副作用。

术语“药物可接受的”指所述物质适用于药品。

本发明的肽可用于降低在许多稳态变化(例如局部缺血再灌注损伤和失血增加)中产生的系统性炎症反应。本发明的肽还可用于降低例如心血管外科(例如冠状动脉旁路术、非体外循环、瓣膜、血管、肺活量减少和Cox-Maze法)、矫形外科(例如脊柱、髋部置换和修复、膝盖置换和肿瘤切除)、神经外科、再造(整形)外科和肿瘤外科当中的围术期失血。

本发明的肽还可用于治疗外伤(包括多器官机能障碍和脑损伤)、局部缺血再灌注损伤(例如中风、脑内出血、心肌梗塞、移植物保存损伤和前十字韧带损伤)、癌症(例如转移性和原发性肿瘤抑制)、肺纤毛功能(例如哮喘、囊性纤维化、慢性阻塞性肺病和抗胰蛋白酶缺陷)和器官移植步骤(例如死亡后器官保存和移植手术)。本发明的肽还用于例如纤维蛋白胶的用途(例如在脊椎穿剌、外科伤口治疗和口腔外科当中使用)。

本发明的肽可单独使用，或与本领域技术人员已知的其它治疗剂和/或化合物组合使用。或者，本文描述的方法和肽可部分地或全部用于联合治疗。这种共同治疗可以两种或更多种药物的任意组合给予。这种共同治疗可如上所述以药物组合物的形式给予。

基于用于在哺乳动物中测定以上确定疾病的治疗效力的众所周知的实验，通过比较这些结果和用于治疗这些疾病的已知药物的结果，可容易地确定用于治疗各种目标适应症的本发明肽的有效剂量。可在这些病症之一的治疗中给予的活性成分(例如肽)的量可根据例如以下考虑因素广泛变化：使用的具体肽和剂量单位、给予方式、治疗周期、所治疗患者的年龄和性别以及所治疗病症的性质和程度。

要给予的活性成分的总量一般可在每天约0.0001mg/kg体重至约200mg/kg体重的范围内，或在每天约0.01mg/kg体重至约200mg/kg体重的范围内。单位剂量可包含约0.05mg至约1500mg活性成分，并可每天给予一次或多次。通过注射(包括静脉内、肌内、皮下和腹膜注射)和使用灌注技术给予的日剂量可为约0.01至约200mg/kg。日直肠给药方案可为0.01-200mg/kg总体重。透皮浓度可为保持0.01-200mg/kg日剂量所需的浓度。

当然，各个患者的具体初始和持续给药方案将根据由主治诊断医师确定的病症性质和严重性、使用的特定肽的活性、患者年龄、患者膳食、给予时间、给予途径、药物排泄速率、药物组合等而有所变化。需要的治疗方式和本发明肽的剂量值可由本领域技术人员使用常规治疗检验确定。

本发明的肽可通过在适当配制的药物组合物中给予有需要的患者而用于实现目标药理学作用。对于本发明目的，患者是需要治疗特定病症或疾病的哺乳动物，包括人。因此，本发明包括由药物可接受的载体和治疗有效量的肽组成的药物组合物。药物可接受的载体是在与活性成分的有效活性相一致的浓度相对无毒并对患者无害的任意载体，使得起因于载体的任何副作用都不损害活性成分的有益作用。治疗有效量的肽是对要治疗的具体病症产生成效或发挥影响的量。可使用任何有效的常规单位剂型给予本文描述的肽和药物可接受的载体，包括例如即时和延时释放制剂、口服、胃肠外、局部等。

对于口服给予，肽可配制为固体或液体制剂，例如胶囊、丸剂、片剂、锭剂、糖锭、溶解剂、粉末剂、溶液剂、悬浮剂或乳浊剂，并可按照本领域已知用于生产药物组合物的方法制备。固体单位剂型可为胶囊，其可为普通的硬壳或软壳明胶类型，含例如表面活性剂、润滑剂和惰性填充剂，例如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉。

本发明的肽还可作为生理学可接受稀释液中的可注射剂量的肽和药用载体一起胃肠外给予，即皮下、静脉内、肌内或腹膜内给予，药用载体可为无菌液体或液体的混合物，有或没有加入药物可接受的表面活性剂或乳化剂或其它药用佐剂。

本发明的胃肠外组合物通常可在溶液中含约0.5％至约25％重量的活性成分。有利地还可使用防腐剂和缓冲剂。为了最小化或消除注射部位的刺激，这种组合物可含非离子性表面活性剂，其具有约12至约17的亲水亲油平衡(HLB)。在此制剂中的表面活性剂的量在约5％至约15％重量的范围内。表面活性剂可为具有以上HLB的单一组分，或者可为具有目标HLB的两种或更多种组分的混合物。

药物组合物可为无菌可注射水悬浮液形式。这种悬浮液可按照已知方法使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。

本发明的组合物还可以用于直肠给予药物的栓剂形式给予。可通过将药物(例如肽)与合适的无刺激性赋形剂混合制备这些组合物，所述赋形剂在常温为固体，但在直肠温度为液体，因此在直肠中溶解，以释放药物。这种物质例如为可可油和聚乙二醇。

用于本发明方法的另一种制剂使用透皮传递装置(“贴片”)。这种透皮贴片可用于提供可控量的本发明肽的连续或不连续输注。用于传递药剂的透皮贴片的制作和使用在本领域众所周知(参见例如美国专利第5,023,252号，其通过引用结合到本文中)。可制作这种贴片，用于连续、脉动或按照要求传递药剂。

可能需要或必须经机械传递装置将药物组合物导入患者中。用于传递药剂的机械传递装置的制作和使用在本领域众所周知。例如，将药物直接给予脑的直接技术通常包括将药物传递导管置于患者的脑室系统，以饶过血脑屏障。一种这样的可植入传递系统用于将药物运输至机体特定解剖区域，其描述于美国专利第5,011,472号，该专利通过引用结合到本文中。

必要时或需要时，本发明的组合物还可包含其它常规药物可接受的配合成分，一般称为载体或稀释剂。可通过加入抗氧化剂(例如抗坏血酸)或其它合适的防腐剂保存任一种本发明组合物。可使用用于制备合适剂型的此组合物的常规方法。

本文描述的肽可作为单一药剂给予，或与一种或多种其它药剂组合给予，其中组合不引起不可接受的副作用。

本文描述的肽还可用于组合物中，用于研究和诊断中，或用作分析参比标准品等。因此，本发明包括由惰性载体和通过本文描述方法鉴别的有效量肽或其盐或酯组成的组合物。惰性载体是不与所运载肽相互作用的任意物质，其为所运载肽提供支持、运输工具、容积、示踪物质等。肽的有效量是对要实施的特定方法产生成效或发挥影响的量。

已知肽在水性和非水性环境中经历水解、去酰胺化、氧化、外消旋和异构化。通过毛细管电泳可容易地检测水解、去酰胺化或氧化之类的降解。尽管酶降解，但具有延长的血浆半寿期或生物保留时间的肽最低程度在水溶液中应当是稳定的。必不可少的是，肽于体温在1天的时间段内具有10％以下的降解。再更优选肽于体温在1天的时间段内具有5％以下的降解。于体温在数周的时间段内的稳定性(即低于一定百分率的降解)将允许较低频率的给药。于冷冻温度数年度量级的稳定性可允许生产商提供液体制剂，因此避免了再制的不便。另外，有机溶剂中的稳定性会提供被配制成新剂型(例如植入剂)的肽。

适于皮下、静脉、肌内等的制剂；合适的药用载体；以及用于配制和给予的装备，都可通过本领域众所周知的任一种方法制备(参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，第20版，2000)。

提供以下的实施例是为了阐述本文描述的本发明，但不应以任何方式解释为限制本发明的范围。

实施例

为了可更好地理解本发明，提供以下的实施例。这些实施例仅用于阐述目的，不应以任何方式解释为限制本发明的范围。本文提及的所有出版物都通过引用整体结合到本文中。

实施例1.抑酶肽的生产和重折叠

可使用本领域技术人员已知的方法(例如Staley，Proc.Natl.Acad.Sci.89：1519-1523，1992；Azzoni，Biotechnol.Bioeng.80：268-276，2002；Auerswald，Biol.Che.，Hoppe-Seyler 368：1413-1425，1987)，通过在大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞或转基因植物中表达生产抑酶肽，或使用固相肽合成(例如Ferrer，Int.J.Pept.Protein Res.40：194-207，1992)来合成抑酶肽。如果以还原二硫键的形式表达，则可使用本领域技术人员已知的方法重折叠抑酶肽(例如Ferrer，1992；Staley，1992；Azzoni，2002)。

为在大肠杆菌中表达，通过将编码SEQ ID NO：15(其使用针对优化的大肠杆菌选择而选择的密码子)的合成基因连接入pET-3a或任意其它合适的大肠杆菌表达载体中，制备表达载体。将质粒转化入大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLysS中，并用IPTG诱导表达。离心收集细胞，超声波裂解。将不溶的细胞裂解物组分重悬浮在8M尿素中，并对10％乙酸透析。然后使用C₁₈反相HPLC纯化抑酶肽变体。在含还原和氧化的谷胱甘肽的氧化还原缓冲液中重折叠抑酶肽变体，并用C₁₈反相HPLC纯化。

还使用固相肽合成生产抑酶肽变体。用Applied Biosystems433A肽合成仪，使用Fmoc或Boc化学法连同HBTU活化，在Wang Rink酰胺树脂上或任意其它合适的树脂上合成肽。用84.6％TFA、4.4％苯酚、4.4％水、4.4％苯硫基甲烷和2.2％乙二硫醇切割肽；使用冷叔丁基甲醚沉淀切割混合物中的肽。用冷醚清洗沉淀物，并在氩气下干燥。以含0.1％TFA的线性水/乙腈梯度通过反相C₁₈HPLC纯化肽。然后使用本领域技术人员已知的方法重折叠抑酶肽变体(例如Ferrer，Int.J.Pept.Protein Res.40：194-207，1992；Staley，1992；Azzoni，2002)。

实施例2.抑酶肽变体的PEG化

通过与用偶联N末端修饰基团巯基部分的马来酰亚胺衍化的甲氧基聚乙二醇温育，制备PEG衍生物。可使用Nektar Therapeutics(Huntsville，Al，USA)提供的mPEG-MAL或mPEG2-MAL产品，或者可使用NOF(Toyko，Japan)提供的GLE-200MA或GLE-400MA产品。通过将抑酶肽和两倍摩尔过量的马来酰亚胺-PEG的50mM Tris溶液pH7于室温温育2-12小时实施偶联反应。优选的抑酶肽浓度是1mg/ml或以下。用离子交换层析和透析或通过反相C₁₈HPLC，将PEG化抑酶肽变体由未衍化的抑酶肽变体和PEG中纯化。

实施例3.测定体外蛋白酶抑制活性

可使用本领域技术人员已知的光谱实验检测本文公开的抑酶肽变体对蛋白酶(例如胰蛋白酶、血浆激肽释放酶和纤溶酶)的抑制。

对于激肽释放酶抑制，将1单位蛋白酶稀释在16ml50mM Tris、0.1M NaCl和0.05％Tween 20，pH8.2中。将该酶溶液(200μl)与体积递减的测试缓冲液(例如250、240、230、220、200、180、170、150、100和50μl)混合，并加入量渐增的抑制剂(例如0.7mg/ml的10、20、30、50、70、80、100、150、200和250μl)。将激肽释放酶/抑制剂溶液于室温温育4小时。将等份(180μl)的各溶液加入到20μl底物溶液中，由吸光度的变化监测反应。合适的底物包括：激肽释放酶的S-2302；纤溶酶的chromozym PL；XI因子的HD-Pro-Phe-Arg-pNA；胰蛋白酶的S-2444和胰凝乳蛋白酶的Suc-Phe-Leu-Phe-pNA。

实施例4.测定抑酶肽变体的药代动力学特性

可在静脉输注抑酶肽变体之后测定本发明的抑酶肽变体在动物模型(例如小鼠、大鼠、狗和猴)中的血浆水平。使用夹心ELSIA检测抑酶肽变体水平，夹心ELISA使用针对抑酶肽的捕获抗体(如实施例6所述生产)和针对PEG的报告抗体(例如Acadmica Sinica的AGP3)。还可使用放射性标记的抑酶肽变体检测抑酶肽变体血浆水平(例如Shin，Pharm.Pharmcol.Commun.4：257-260，1998)。

实施例5.测定抑酶肽变体在动物中的体内作用

在横断麻醉大鼠尾之后测定抑酶肽变体对失血的作用。用Plavix(3mg/kg)治疗大鼠。2小时后用戊巴比妥(80mg/kg，腹膜内注射)麻醉大鼠，并用抑酶肽(10mg/kg，静脉内注射)治疗。10分钟后，去除尾的2mm末端，并放置在盐水中。检测出血终止的时间。抑酶肽和活性变体降低了Plavix治疗组的出血时间。

实施例6.抑酶肽抗体的生产

如实施例1所述进行源自抑酶肽序列、具有添加的N或C末端Cys残基的肽的合成。使用PerSeptiVe V Biosystems Voyager DE ProMALDI质谱仪以MALDI质谱法证实肽的身份。使用Pierce ImjectMaleimide Activated mcKLH试剂盒和方案(Pierce，Rockford，IL)将半胱氨酸残基偶联至KLH。免疫兔，并使用本领域技术人员已知的方法分离抗体。使用本领域技术人员已知的方法，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)证实在兔中产生的针对抑酶肽肽的抗体。

以上说明书中提及的所有出版物和专利都通过引用结合到本文中。本发明所述组合物和方法的各种修饰和变更对本领域技术人员来说是显而易见的，不偏离本发明的范围和精神。尽管已联系具体的实施方案描述了本发明，但应当理解的是，不应当将要求保护的本发明过度不当地限制于这些具体的实施方案。实际上，用于实施本发明的上述方式的各种修改对分子生物学领域或相关领域的技术人员来说是显而易见的，被认为属于以下权利要求的范围。本领域技术人员仅仅使用常规实验就会认识到或能够断定本文描述的本发明具体实施方案的许多等价方案。这种等价方案被认为包含在以下的权利要求中。

表1

SEQ IDNO	序列
SEQ IDNO	序列	1(抑酶肽)	RPDFCLEPPY TGPCKARIIR YFYNAKAGLC QTFVYGGCRAKRNNFKSAED CMRTCGGA
2	RDFCLEPPST GPCRAAIIRY FYDATAGLCE TFVYGGCRANRNNFKSAEDC METCGGA	1(抑酶肽)
2		3Bikunin	MAQLCGLRRS RAFLALLGSL LLSGVLAADR ERSIHDFCLVSKVVGRCRAS MPRWWYNVTD GSCQLFVYGG CDGNSNNYLTKEECLKKCAT VTENATGDLA TSRNAADSSV PSAPRRQDSEDHSSDMFNYE EYCTANAVTG PCRASFPRWY FDVERNSCNNFIYGGCRGNK NSYRSEEACM LRCFRQQENP PLPLGSKVVVLAGLFVMVLI LFLGASMVYL IRVARRNQER ALRTVWSSGDDKEQLVKNTY VL
4	RPDFCLEPPY TGPAKARIIR YFYNAKAGLA QTFVYGGARAKRNNFKSAED AMRTCGGA	3Bikunin
4		5	RPDFCLEPPY TGPCKARIIR YFYNAKAGLA QTFVYGGCRAKRNNFKSAED AMRTCGGA
6	RPDFALEPPY TGPCKARIIR YFYNAKAGLC QTFVYGGCRAKRNNFKSAED CMRTAGGA	5
6		7	TPGCDTSNQAKAQ RPDFCLEPPY TGPCKARIIR YFYNAKAGLCQTFVYGGCRA KRNNFKSAED CMRTCGGA
8	CDTSNQAKAQ RPDFCLEPPY TGPCKARIIR YFYNAKAGLCQTFVYGGCRA KRNNFKSAED CMRTCGGA	7
8		9	RPDFCLEPPY TGPCKARIIR YFYNAKAGLC QTFVYGGCRAKRNNFKSAED CMRTCGGA SGGSGGSGGCSGG
10	RPDFCLEPPY TGPCKARIIR YFYNAKAGLC QTFVYGGCRAKRNNFKSAED CMRTCGGA SGGSGGSGGC	9
10		11	TPG CDTSNQAKAQ RDFCLEPPST GPCRAAIIRY FYDATAGLCETFVYGGCRAN RNNFKSAEDC METCGGA
12	CDTSNQAKAQ RDFCLEPPST GPCRAAIIRY FYDATAGLCETFVYGGCRAN RNNFKSAEDC METCGGA	11
12		13	RDFCLEPPST GPCRAAIIRY FYDATAGLCE TFVYGGCRANRNNFKSAEDC METCGGA SGGSGGSGGC SGG
14	RDFCLEPPST GPCRAAIIRY FYDATAGLCE TFVYGGCRANRNNFKSAEDC METCGGA SGGSGGSGGC	13
14		15	A₁A₂A₃A₄A₅A₆A₇A₈A₉A₁₀ RPDFCLEPPY TGPCKARIIRYFYNAKAGLC QTFVYGGCRA KRNNFKSAED CMRTCGGA₁₁A₁₂A₁₃A₁₄A₁₅A₁₆A₁₇A₁₈A₁₉A₂₀

表2

序列表

<110>Bayer Pharmaceuticals Corporation

Lumb，Kevin

Horton，Stanley

<120>改良的抑酶肽变体

<130>5210

<150>US60/587,655

<151>2004-07-13

<160>24

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>58

<212>PRT

<213>牛(Bos taurus)

<400>1

Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala

1 5 10 15

Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gln Thr

20 25 30

Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala

35 40 45

Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala

50 55

<210>2

<211>57

<212>PRT

<213>牛(Bos taurus)

<400>2

Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Pro Cys Arg Ala Ala

1 5 10 15

Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr Phe

20 25 30

Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu

35 40 45

Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala

50 55

<210>3

<211>252

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>3

Met Ala Gln Leu Cys Gly Leu Arg Arg Ser Arg Ala Phe Leu Ala Leu

1 5 10 15

Leu Gly Ser Leu Leu Leu Ser Gly Val Leu Ala Ala Asp Arg Glu Arg

20 25 30

Ser Ile His Asp Phe Cys Leu Val Ser Lys Val Val Gly Arg Cys Arg

35 40 45

Ala Ser Met Pro Arg Trp Trp Tyr Asn Val Thr Asp Gly Ser Cys Gln

50 55 60

Leu Phe Val Tyr Gly Gly Cys Asp Gly Asn Ser Asn Asn Tyr Leu Thr

65 70 75 80

Lys Glu Glu Cys Leu Lys Lys Cys Ala Thr Val Thr Glu Asn Ala Thr

85 90 95

Gly Asp Leu Ala Thr Ser Arg Asn Ala Ala Asp Ser Ser Val Pro Ser

100 105 110

Ala Pro Arg Arg Gln Asp Ser Glu Asp His Ser Ser Asp Met Phe Asn

115 120 125

Tyr Glu Glu Tyr Cys Thr Ala Asn Ala Val Thr Gly Pro Cys Arg Ala

130 135 140

Ser Phe Pro Arg Trp Tyr Phe Asp Val Glu Arg Asn Ser Cys Asn Asn

145 150 155 160

Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Arg Ser Glu

165 170 175

Glu Ala Cys Met Leu Arg Cys Phe Arg Gln Gln Glu Asn Pro Pro Leu

180 185 190

Pro Leu Gly Ser Lys Val Val Val Leu Ala Gly Leu Phe Val Met Val

195 200 205

Leu Ile Leu Phe Leu Gly Ala Ser Met Val Tyr Leu Ile Arg Val Ala

210 215 220

Arg Arg Asn Gln Glu Arg Ala Leu Arg Thr Val Trp Ser Ser Gly Asp

225 230 235 240

Asp Lys Glu Gln Leu Val Lys Asn Thr Tyr Val Leu

245 250

<210>4

<211>58

<212>PRT

<213>牛(Bos taurus)

<400>4

Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Ala Lys Ala

1 5 10 15

Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Ala Gln Thr

20 25 30

Phe Val Tyr Gly Gly Ala Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala

35 40 45

Glu Asp Ala Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala

50 55

<210>5

<211>58

<212>PRT

<213>牛(Bos taurus)

<400>5

Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala

1 5 10 15

Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Ala Gln Thr

20 25 30

Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala

35 40 45

Glu Asp Ala Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala

50 55

<210>6

<211>58

<212>PRT

<213>牛(Bos taurus)

<400>6

Arg Pro Asp Phe Ala Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala

1 5 10 15

Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gln Thr

20 25 30

Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala

35 40 45

Glu Asp Cys Met Arg Thr Ala Gly Gly Ala

50 55

<210>7

<211>71

<212>PRT

<213>牛(Bos taurus)

<400>7

Thr Pro Gly Cys Asp Thr Ser Asn Gln Ala Lys Ala Gln Arg Pro Asp

1 5 10 15

Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile

20 25 30

Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gln Thr Phe Val Tyr

35 40 45

Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys

50 55 60

Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala

65 70

<210>8

<211>68

<212>PRT

<213>牛(Bos taurus)

<400>8

Cys Asp Thr Ser Asn Gln Ala Lys Ala Gln Arg Pro Asp Phe Cys Leu

1 5 10 15

Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe

20 25 30

Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gln Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys

35 40 45

Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr

50 55 60

Cys Gly Gly Ala

65

<210>9

<211>71

<212>PRT

<213>牛(Bos taurus)

<400>9

Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala

1 5 10 15

Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gln Thr

20 25 30

Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala

35 40 45

Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala Ser Gly Gly Ser Gly Gly

50 55 60

Ser Gly Gly Cys Ser Gly Gly

65 70

<210>10

<211>68

<212>PRT

<213>牛(Bos taurus)

<400>10

Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala

1 5 10 15

Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gln Thr

20 25 30

Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala

35 40 45

Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala Ser Gly Gly Ser Gly Gly

50 55 60

Ser Gly Gly Cys

65

<210>11

<211>70

<212>PRT

<213>牛(Bos taurus)

<400>11

Thr Pro Gly Cys Asp Thr Ser Asn Gln Ala Lys Ala Gln Arg Asp Phe

1 5 10 15

Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Pro Cys Arg Ala Ala Ile Ile Arg

20 25 30

Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr Phe Val Tyr Gly

35 40 45

Gly Cys Arg Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met

50 55 60

Glu Thr Cys Gly Gly Ala

65 70

<210>12

<211>67

<212>PRT

<213>牛(Bos taurus)

<400>12

Cys Asp Thr Ser Asn Gln Ala Lys Ala Gln Arg Asp Phe Cys Leu Glu

1 5 10 15

Pro Pro Ser Thr Gly Pro Cys Arg Ala Ala Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr

20 25 30

Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg

35 40 45

Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys

50 55 60

Gly Gly Ala

65

<210>13

<211>70

<212>PRT

<213>牛(Bos taurus)

<400>13

Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Pro Cys Arg Ala Ala

1 5 10 15

Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr Phe

20 25 30

Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu

35 40 45

Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

50 55 60

Gly Gly Cys Ser Gly Gly

65 70

<210>14

<211>67

<212>PRT

<213>牛(Bos taurus)

<400>14

Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Pro Cys Arg Ala Ala

1 5 10 15

Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr Phe

20 25 30

Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu

35 40 45

Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

50 55 60

Gly Gly Cys

65

<210>15

<211>77

<212>PRT

<213>牛(Bos taurus)

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(77)

<223>Xaa可为任意天然氨基酸、任意非天然氨基酸，或缺失

<400>15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Pro Asp Phe Cys Leu

1 5 10 15

Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe

20 25 30

Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gln Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys

35 40 45

Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr

50 55 60

Cys Gly Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

65 70 75

<210>16

<211>58

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>6

Ile His Asp Phe Cys Leu Val Ser Lys Val Val Gly Arg Cys Arg Ala

1 5 10 15

Ser Met Pro Arg Trp Trp Tyr Asn Val Thr Asp Gly Ser Cys Gln Leu

20 25 30

Phe Val Tyr Gly Gly Cys Asp Gly Asn Ser Asn Asn Tyr Leu Thr Lys

35 40 45

Glu Glu Cys Leu Lys Lys Cys Ala Thr Val

50 55

<210>17

<211>58

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>17

Tyr Glu Glu Tyr Cys Thr Ala Asn Ala Val Thr Gly Pro Cys Arg Ala

1 5 10 15

Ser Phe Pro Arg Trp Tyr Phe Asp Val Glu Arg Asn Ser Cys Asn Asn

20 25 30

Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Arg Ser Glu

35 40 45

Glu Ala Cys Met Leu Arg Cys Phe Arg Gln

50 55

<210>18

<211>58

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>18

Asp Lys Gly His Cys Val Asp Leu Pro Asp Thr Gly Leu Cys Lys Glu

1 5 10 15

Ser Ile Pro Arg Trp Tyr Tyr Asn Pro Phe Ser Glu His Cys Ala Arg

20 25 30

Phe Thr Tyr Gly Gly Cys Tyr Gly Asn Lys Asn Asn Phe Glu Glu Glu

35 40 45

Gln Gln Cys Leu Glu Ser Cys Arg Gly Ile

50 55

<210>19

<211>58

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>19

Ile His Asp Phe Cys Leu Val Ser Lys Val Val Gly Arg Cys Arg Ala

1 5 10 15

Ser Met Pro Arg Trp Trp Tyr Asn Val Thr Asp Gly Ser Cys Gln Leu

20 25 30

Phe Val Tyr Gly Gly Cys Asp Gly Asn Ser Asn Asn Tyr Leu Thr Lys

35 40 45

Glu Glu Cys Leu Lys Lys Cys Ala Thr Val

50 55

<210>20

<211>58

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>20

Leu Pro Asn Val Cys Ala Phe Pro Met Glu Lys Gly Pro Cys Gln Thr

1 5 10 15

Tyr Met Thr Arg Trp Phe Phe Asn Phe Glu Thr Gly Glu Cys Glu Leu

20 25 30

Phe Ala Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Ser Asn Asn Phe Leu Arg Lys

35 40 45

Glu Lys Cys Glu Lys Phe Cys Lys Phe Thr

50 55

<210>21

<211>58

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>21

Lys Glu Asp Ser Cys Gln Leu Gly Tyr Ser Ala Gly Pro Cys Met Gly

1 5 10 15

Met Thr Ser Arg Tyr Phe Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Cys Glu Thr

20 25 30

Phe Gln Tyr Gly Gly Cys Met Gly Asn Gly Asn Asn Phe Val Thr Glu

35 40 45

Lys Glu Cys Leu Gln Thr Cys Arg Thr Val

50 55

<210>22

<211>58

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>22

Glu Thr Asp Ile Cys Lys Leu Pro Lys Asp Glu Gly Thr Cys Arg Asp

1 5 10 15

Phe Ile Leu Lys Trp Tyr Tyr Asp Pro Ash Thr Lys Ser Cys Ala Arg

20 25 30

Phe Trp Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Glu Asn Lys Phe Gly Ser Gln

35 40 45

Lys Glu Cys Glu Lys Val Cys Ala Pro Val

50 55

<210>23

<211>58

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>23

Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly

1 5 10 15

Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg

20 25 30

Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu

35 40 45

Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly

50 55

<210>24

<211>60

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>24

Ser Asp Asp Pro Cys Ser Leu Pro Leu Asp Glu Gly Ser Cys Thr Ala

1 5 10 15

Tyr Thr Leu Arg Trp Tyr His Arg Ala Val Thr Gly Ser Thr Glu Ala

20 25 30

Cys His Pro Phe Val Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Ala Asn Arg Phe

35 40 45

Gly Thr Arg Glu Ala Cys Glu Arg Arg Cys Pro Pro

50 55 60

Claims

1.一种肽及其功能等同片段、衍生物和变体，其中所述肽选自SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15。

2.权利要求1的肽，其中所述肽PEG化。

3.一种药物组合物，所述组合物含治疗有效量的权利要求1或2的肽，所述肽与药物可接受的载体组合。

4.一种药物组合物，所述组合物含治疗有效量的权利要求1或2的肽，所述肽与药物可接受的载体和一种或多种药剂组合。

5.一种减少围术期失血的方法，所述方法包括给予有需要的受试者治疗有效量的权利要求1或2的肽的步骤。

6.权利要求5的方法，其中给予所述肽，以降低心血管外科、矫形外科、神经外科、再造外科或肿瘤外科当中的围术期失血。

7.一种降低系统性炎症反应的方法，所述方法包括给予有需要的受试者治疗有效量的权利要求1或2的肽的步骤。

8.一种治疗局部缺血再灌注损伤的方法，所述方法包括给予有需要的受试者治疗有效量的权利要求1或2的肽的步骤。

9.一种治疗癌症的方法，所述方法包括给予有需要的受试者治疗有效量的权利要求1或2的肽的步骤。

10.一种治疗中风或脑内出血的方法，所述方法包括给予有需要的受试者治疗有效量的权利要求1或2的肽的步骤。

11.一种治疗心肌梗塞的方法，其包括给予有需要的受试者治疗有效量的权利要求1或2的肽的步骤。

12.一种治疗哮喘、囊性纤维化和慢性阻塞性肺病的方法，所述方法包括给予有需要的受试者治疗有效量的权利要求1或2的肽的步骤。

13.一种纤维蛋白胶，所述纤维蛋白胶含权利要求1的肽和药物可接受的载体。

14.一种多核苷酸或其简并变体，所述多核苷酸编码权利要求1的肽。

15.一种载体，所述载体含权利要求14的多核苷酸。

16.一种宿主细胞，所述宿主细胞含权利要求15的载体。

17.一种生产肽的方法，所述方法包括：

a)在适合表达所述多肽的条件下培养权利要求16的宿主细胞；和

b)由宿主细胞培养物中回收多肽。

18.一种纯化的抗体，所述抗体特异性结合权利要求1的多肽。

19.权利要求1的肽，所述肽用于减少围术期失血。

20.含权利要求1的至少一种肽的药物，所述肽与至少一种药物可接受的、药物安全的载体或赋形剂组合。

21.权利要求1的肽用于制备药物的用途，所述药物用于减少围术期失血。

22.权利要求20的药物，所述药物用于减少围术期失血。