MX2007000473A - Variantes mejoradas de la aprotinina. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona con el campo de las proteinas que inhiben la actividad de la serma proteasa. La invencion tambien se relaciona con el campo de las construcciones de acidos nucleicos, vectores celulas hospederas para producir proteinas inhibidoras de la serma proteasa, las composiciones farmaceuticas que contienen tales proteinas y los metodos para su uso.

Description

VARIANTES MEJORADAS DE LA APROTININA Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud provisional de EE. UU. Serie n.° 60/587655 presentada el 13 de julio de 2004, cuyo contenido se incorpora en este documento en su totalidad como referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se encuadra dentro del campo de proteínas que inhiben la actividad de la serina proteasa. La invención se relaciona asimismo con el campo de construcciones de ácidos nucleicos, vectores y células hospedadoras para la producción de proteínas inhibidoras de la serina proteasa, composiciones farmacéuticas que contienen dichas proteínas y métodos para su uso.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA RELACIONADA La hemorragia es una complicación grave de las intervenciones quirúrgicas mayores tales como la cirugía a corazón abierto y otros procedimientos complicados. Los pacientes operados del corazón constituyen una proporción considerable de los receptores de transfusiones de sangre de donante; sin embargo, las transfusiones acarrean riesgos de transmisión de enfermedades y reacciones adversas. Además, la sangre de donante es costosa y su demanda suele superar su oferta. La aprotinina (Trasylol®) se administra para reducir la hemorragia perioperatoria (Dietrich y col., Thorac. Cardiovasc. Surg. 37:92-98, 1989). En general se considera que la aprotinina, que es un inhibidor de serina proteasa de origen bovino perteneciente a la familia Kunitz, reduce la hemorragia in vivo mediante la inhibición de proteasas como la plasmina. Sin embargo, se ha asociado a efectos adversos como hipotensión y rubor (Bohrer y col., Anesthesia 45:853-854, 1990) y reacciones alérgicas (Dietrich y col., 1989). Además, no se recomienda la administración reiterada de aprotinina a pacientes con inmunogiobulinas conocidas (Dietrich y col., 1989).

La aprotinina se administra para reducir la hemorragia durante cirugías cardiovasculares (p. ej., en procedimientos de revascularización coronaria, sin circulación extracorpórea, valvulares, vasculares, de reducción de volumen pulmonar y Cox-Maze), intervenciones ortopédicas (p. ej., de columna vertebral, artroplastia y reparación de cadera, artroplastia de rodilla y resección de tumores), neurocirugía y cirugía reconstructiva (plástica) mayor. Además, la aprotinina está indicada en el tratamiento de traumatismos (incluida la disfunción multiorgánica y lesiones cerebrales), lesiones de isquemia-reperfusión (p. ej., accidente cerebrovascular, hemorragia intracerebral, infarto de miocardio, conservación de trasplante y ligamento cruzado anterior), cáncer (p. ej., supresión de metástasis y de tumores primarios), funciones de los cilios pulmonares (p. ej., asma, fibrosis quística, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y deficiencia de antitripsina) y procedimientos relacionados con el trasplante de órganos (p. ej., conservación de órganos de cadáver y cirugía de trasplante). Asimismo, la aprotinina se utiliza en aplicaciones como adhesivos de fibrina (p. ej., los empleados durante punciones lumbares, tratamiento de heridas quirúrgicas y cirugía dental). Ya que la aprotinina es de origen bovino, la reexposición al fármaco conlleva un riesgo apreciable de inducir anafilaxia en pacientes humanos. Además, la aprotinina es nefrotóxica en roedores y perros cuando se administra repetidamente en dosis elevadas (Glasser y col., "Verhandlungen der Deutschen Gesellschaft fur Innere Medizin, 78. Kongress," Bergmann, Munchen, págs. 1612-1614, 1972). Una de las hipótesis atribuye este efecto a la acumulación de aprotinina, a causa de su elevada carga positiva neta, en la zona cargada negativamente proximal a los túbulos renales (WO 93/14120). En diversos casos se ha demostrado que la PEGilación puede reducir fa inmunogenicidad de las proteínas. Sin embargo, la PEGilación suele estar acompañada de una reducción de la actividad funcional de la proteína modificada, lo cual es un efecto indeseable en el caso de un antagonista como la aprotinina. El estado actual de la técnica para la aprotinina PEGilada es la PEGilación no específica de grupos amino con una o dos modificaciones PEG de 5 kDa de una variante de aprotinina (T11 D, K15R, R17L, I18H, I19L, V34Y, R39L, K46E). Aunque esta modificación mejoró el perfil farmacológico, no aumentó la eficacia in vivo (Stassen, Thromb. Haemost. 74:655-659, 1995). En otro ejemplo de aprotinina PEGilada, que contenía un estimado de 17 moléculas PEG de 5 kDa unidas a la proteína, la actividad inhibitoria de la tripsina resultó unas 29 veces menor (Shin, Pharm. Pharmacol. Commun. 4:57-260, 1998). Por lo tanto, uno de los objetivos de la presente invención consiste en crear variantes novedosas de la aprotinina cuya actividad funcional sea similar a la de ésta (especialmente en lo que respecta a la potencia de la inhibición de la plasmina), que presenten mejores perfiles farmacocinéticos y de seguridad, y que conserven la eficacia in vivo.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Esta invención presenta novedosas variantes modificadas de la aprotinina que actúan como inhibidores de la proteasa con mejores propiedades farmacocinéticas e inmunogénicas. Las proteínas de la presente invención pueden ser utilizadas, por ejemplo, para reducir la hemorragia en intervenciones quirúrgicas, en la prevención y/o el tratamiento de traumatismos, lesiones de isquemia-reperfusión, cáncer, funciones de los cilios pulmonares y procedimientos de trasplante de órganos, así como en aplicaciones tales como los adhesivos de fibrina. En particular, un aspecto de la invención es una aprotinina PEGilada seleccionada entre el grupo integrado por las secuencias SEQ ID NO: 3 a 15, y fragmentos, derivados y variantes de las mismas que demuestren poseer al menos una función biológica esencialmente igual a la de los péptidos de la tabla 1 (denominadas colectivamente "proteínas de esta invención"), incluidos los equivalentes funcionales de éstas. Otra realización de la invención comprende modificaciones de aminoácidos que reemplazan residuos de la secuencia bovina por aminoácidos hallados en homólogos humanos de la aprotinina, a fin de reducir o anular el reconocimiento inmunológico de la aprotinina. Otra realización de la invención es un polinucleótido que codifica los péptidos de la presente invención, junto con los correspondientes vectores y células hospedadoras necesarios para expresar de forma recombinante los péptidos de esta invención. Otra realización de la invención consta de anticuerpos y fragmentos de éstos que se unen selectivamente a los péptidos de esta invención. Dichos anticuerpos resultan útiles para detectar los péptidos de esta invención, y pueden ser identificados y sintetizados mediante procedimientos ampliamente conocidos en la técnica. DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS ILUSTRACIONES Figura 1. Alineaciones de secuencias de los dominios dei tipo Kunitz y aprotinina.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta invención proporciona variantes de la aprotinina, junto con fragmentos, derivados y variantes de éstos que demuestren poseer al menos una función biológica esencialmente equivalente a la de las proteínas mencionadas en la tabla 1 (llamadas colectivamente "proteínas de esta invención"). La aprotinina bovina natural (SEQ ID NO: 1), las variantes de aprotinina (tales como la secuencia SEQ ID NO: 2) y equivalentes farmacológicos humanos tales como la bikunina placentaria (SEQ ID NO: 3) son inhibidores de la proteasa que actúan, por ejemplo, sobre la tripsina, la plasmina y la kalikreína. Ya que la administración de aprotinina conlleva efectos secundarios como la inmunogenicidad, es deseable desarrollar inhibidores de proteasa de acción prolongada que no induzcan una respuesta inmunitaria y, como tal, faciliten la posibilidad del uso reiterado del fármaco.

La presente invención proporciona combinaciones de modificaciones, que no han sido descritas en la técnica, para sintetizar variantes de la aprotinina que sean más susceptibles de replegamiento y ofrezcan un punto específico para la PEGilación en una posición benigna de la aprotinina {véase, p. ej., tabla 1 , SEQ ID NO: 4-15). Los péptidos de esta invención ofrecen una mejora respecto a la aprotinina natural en cuanto a los perfiles farmacocinéticos e ¡nmunogénicos, y potencialmente ofrecen beneficios terapéuticos sin inducir otros efectos que atenían contra la seguridad tales como la ¡nmunogenicidad, la autogenicidad, la anafilaxia o la acumulación renal. Un posible enfoque para mejorar las propiedades in vivo de las proteínas es por medio de la PEGilación (Greenwald, Adv. Drug. Del. Rev. 55:217-250, 2003). Hasta la fecha, la PEGilación no ha mejorado la eficacia in vitro o in vivo de la aprotinina. Por lo tanto, se conseguiría una mejora considerable respecto al estado actual de la técnica si se diseñara una variante de la aprotinina que (i) pueda obtenerse de una fuente sintética o recombinante, por ejemplo, por síntesis peptídica en fase sólida o mediante expresión en un organismo procariótico o eucariótico como Escherichia coli, levaduras, baculovirus o plantas; (¡i) esté modificada para fomentar el replegamiento eficiente; (iii) contenga un punto único de PEGilación que sea benigno en cuando a moderar la inhibición de la proteasa; y (iv) ofrezca una modificación de PEG que mejore las propiedades farmacocinéticas (p. ej., reduciendo los requisitos posológicos) y la inmunogenicidad. La aprotinina puede obtenerse por expresión en Escherichia coli (p. ej., Auerswald, Biol. Chem. Hoppe Seyler 368:1413-1425, 1987; Staley, Proc. Nati. Acad. Sci. 89:1519-1523, 1992) o en plantas transgénicas (Azzoni, Biotechnol. Bioeng. 80:268-276, 2002), así como en otros sistemas de expresión tales como el baculovirus y las levaduras. Asimismo, la aprotinina puede obtenerse por síntesis peptídica en fase sólida mediante métodos conocidos a las personas versadas en la técnica (p. ej., Ferrer, Int. J. Pept. Protein Res. 40:194-207, 1992).

Además, pueden generarse variantes de la aprotinina mediante los métodos recombinantes descritos anteriormente, en los que se reemplazan uno o dos de los tres enlaces disulfuro de la proteína natural sustituyendo los residuos Cys por otro aminoácido como Ala aplicando la técnica de mutagénesis dirigida (p. ej., Staley, Proc. Nati. Acad. Sci. 89:1519-1523, 1992). Un ejemplo de estas secuencias son las SEQ ID NO: 4 a 6, entre otras. Las modificaciones de los aminoácidos no requieren necesariamente limitarse a Ala. Dichas sustituciones simplifican el plegamiento de la variante de la aprotinina y aumentan su rendimiento (p. ej. Staley, 1992). Además, puede también emplearse la proteína sulfuro isomerasa para aumentar el rendimiento del replegamiento (p. ej., Weissman, Nature 365:185-188, 1993). Otro enfoque para aumentar el rendimiento de la aprotinina plegada consiste en incorporar un residuo Cys adicional que actúe como un catalizador intramolecular en la formación de enlaces disulfuro, ya sea tal como se encuentra en la prosecuencia natural de la aprotinina (SEQ ID NO: 7) o en forma de secuencia aminoacídica no natural (SEQ ID NO: 8) (p. ej., Weissman, Cell 71 :841-851 , 1992). La secuencia anexa puede ser variada (p. ej., SEQ ID NO: 8 y 10) e incorporarse en las variantes de la aprotinina (p. ej., SEQ ID NO: 11-14). Este método tiene la ventaja no reconocida anteriormente de proporcionar un residuo Cys libre para la modificación específica del sitio con grupos que mejoran las propiedades farmacocinéticas, tales como el polietilenglicol (PEG). El uso de una fuente recombinante de aprotinina (ya sea con o sin una reducción en el número de enlaces disulfuro, como lo ejemplifican las combinaciones de SEQ ID NO: 4 a 6 con SEQ ID NO: 7 a 14) y la incorporación de una secuencia N- o C-terminal para aportar una Cys libre, que tenga el efecto de mejorar el rendimiento del plegamiento y actuar como sitio exclusivo para la PEGilación, ofrece mejores propiedades de elaboración y farmacocinética que la aprotinina natural aislada del pulmón bovino. La PEGilación puede realizarse por cualquier método conocido a las personas versadas en la técnica. Por ejemplo, puede introducirse el PEG en una proteína uniéndolo directamente al grupo amino (N-terminal), al grupo carboxilato (C-terminal) o a un aminoácido interno que contenga una cadena lateral reactiva como Cys, Lys, Asp o Glu, o a un aminoácido no natural que contenga grupos similares de cadenas laterales reactivas. Hay numerosos ejemplos de agentes entrecruzadores adecuados que son conocidos a las personas versadas en la técnica, como los que ilustran (entre otros) derivados comerciales de PEG que contienen aminas, aldehidos, acétales, maleimida, succinimidas y grupos tio (p. ej., Nektar Therapeutics, San Carlos, CA, EE. UU. y NOF, Tokio, Japón). A modo de ejemplo, podría lograrse la PEGilación introduciendo una Cys singular en el péptido mediante una secuencia aminoacídica modificadora N-terminal o C-terminal que no forme un enlace disulfuro con ninguno de los seis residuos Cys naturales presentes en la aprotinina después de su replegamiento. A continuación, esta Cys singular se somete a PEGilación a través de un enlace tioéter estable entre el grupo mercapto y el grupo maleimida de los reactivos metoxi-PEG-maleimida (p. ej., Nektar Therapeutics, San Carlos, CA, EE. UU. y/o NOF, Tokio, Japón). Además de la maleimida, las personas versadas en la técnica de entrecruzamiento de proteínas conocerán numerosos grupos reactivos a la Cys tales como los haluros alquílicos y las vinilsulfonas. Pueden utilizarse grupos PEG de diversos tamaños, como los que ejemplifican (entre otros) polímeros PEG de 5 kDa a 43 kDa aproximadamente. La modificación PEG puede incluir un grupo PEG lineal único, como los grupos PEG lineales de 5, 20 ó 30 kDa unidos a la maleimida u otros grupos entrecruzadores (véase, p. ej., la tabla 2). Además, la modificación podría incluir PEG ramificados que contienen dos o más cadenas poliméricas PEG unidas a la maleimida u otros grupos entrecruzadores (véase, p. ej., la tabla 2). Es menos probable que la PEGilación con un PEG más pequeño (p. ej., un PEG lineal de 5 kDa) reduzca la actividad del péptido, mientras que un PEG más grande (p. ej., un PEG ramificado de 40 kDa) tiene mayores probabilidades de disminuir dicha actividad. Sin embargo, un PEG más grande aumenta la semivida en plasma, posibilitando la administración de una dosis reducida.

El enlazador entre el PEG y el grupo entrecruzador del reactivo de PEG puede ser variado. Por ejemplo, el PEG de 40 kDa (mPEG2-MAL) reactivo a la Cys de Nektar Therapeutics (San Carlos, CA, EE. UU.), a la venta en el comercio, emplea para la conjugación con la Cys un grupo maleimida unido al PEG mediante un enlazador basado en lisina (tabla 2). Como segundo ejemplo, el PEG de 43 kDa (GL2-400MA) reactivo a la Cys de NOF (Tokio, Japón), disponible en el comercio, emplea para la conjugación con la Cys un grupo maleimida unido al PEG mediante un enlazador alcano bisustituido (tabla 2). Además, el polímero PEG puede unirse directamente a la maleimida, tal como lo ejemplifican los reactivos PEG con peso molecular de 5 y 20 kDa disponibles de Nektar Therapeutics (San Carlos, CA, EE. UU.) (tabla 2). Además de la PEGilación, otro enfoque para mejorar la farmacocinética, la inmunogenética y otras propiedades de seguridad de una proteína consiste en el uso de sustituciones de aminoácidos. Ya que el sistema inmunitario normalmente no reconoce las secuencias de proteínas endógenas, las variantes de la aprotinina incluyen aquellas en que los residuos que se diferencian de los homólogos humanos son sustituidos por el correspondiente aminoácido de la proteína humana. Dichas variantes de preferencia estarían dirigidas a aminoácidos expuestos a la superficie, los cuales se identifican a partir de las estructuras de resolución atómica de la aprotinina, e implicarían sustituir el aminoácido de la proteína bovina por el homólogo humano como lo sería un dominio de Kunitz de bikunina placentaria humana (figura 1). Dichas variantes también podrían incluir modificaciones aminoacídicas de los residuos enterrados o parcialmente enterrados. Pueden realizarse una o varias sustituciones de aminoácidos o intercambios de dominio completo en la aprotinina para producir una secuencia similar a los homólogos humanos, tal como lo ejemplifican (entre otras) las secuencias SEQ ID NO: 10 a 13 (tabla 1 ). Los cambios se basan en alineaciones de secuencias entre la aprotinina y los homólogos humanos. Por ejemplo, la Arg 1 de la aprotinina puede sustituirse por lie 7 o Tyr 102 de la bikunina placentaria humana; la Pro 3 de la aprotinina puede sustituirse por His 8 o Glu 103 de ¡a bikunina placentaria humana (figura 1 ). Una persona versada en la técnica puede identificar fácilmente dichas modificaciones a partir de alineaciones de secuencias como las que se ejemplifican (entre otras) en la figura 1 , y una o más de estas modificaciones pueden ser incorporadas en una misma variante de la aprotinina. Las variaciones de la aprotinina que se describen más arriba se ejemplifican en la secuencia indicada a continuación: RPDFC5LEPPY TGPC14KARIIR YFYNAKAGLC30 QTFVYGGC38RA KRNNFKSAED C51MRTC55GG en donde A-i a A20 pueden ser aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales, o eliminados, y en donde al menos uno de los residuos (Ai a A2o) es cisteína (Cys). A modo de ejemplo, Ai a A20 pueden ser lisina, glutamina, asparagina, serina, treonina, glicina, alanina o cisteína. Además, para reducir el número de enlaces disulfuro necesarios para el plegamiento, los siguientes pares de cisteínas: C5 y C55. C14 y C38 o C30 y C51, pueden sustituirse por alanina, y en donde un par de cisteínas se deja sin sustituir. Además, tal como se ejemplifica en SEQ ID NO: 15, las adiciones N- y C-terminales (A-i a A10 y A-n a A2o, respectivamente) pueden ser mayores de diez residuos. Además de la PEGilación, pueden emplearse otros polímeros derivatizados con grupos reactivos a la Cys para mejorar las propiedades farmacocinéticas o inmunogénicas de las variantes de la aprotinina. Por ejemplo, a título enunciativo pero no limitativo, las variantes de la aprotinina pueden modificarse con hidroxietilalmidón (p. ej., WO 2004/024761 ).

Se reconocerá que la invención aquí descrita en relación con las variantes de la aprotihina proporciona un método para sintetizar otras proteínas PEGiladas que contienen enlaces disulfuro, tales como los inhibidores de la proteasa humana que contienen dominios de Kunitz.

Ciertos términos utilizados a lo largo de esta especificación se definirán en este momento, mientras que otros se definirán conforme vayan introduciéndose. A continuación se indica la abreviatura de una letra para designar a un aminoácido particular, su nombre completo y la abreviatura de tres letras: A, alanina (Ala); C, cisteína (Cys); D, ácido aspártico (Asp); E, ácido glutámico (Glu); F, fenilalanina (Phe); G, glicina (Gly); H, histidina (His); I, ¡soleucina (lie); K, lisina (Lys); L, leucina (Leu); M, metionina (Met); N, asparagina (Asn); P, prolina (Pro); Q, glutamina (Gln); R, arginina (Arg); S, serina (Ser); T, treonina (Thr); V, valina (Val); W, triptófano (Trp); e Y, tirosina (Tyr). El término "polinucleótido codificante de un péptido" engloba los polinucleótidos que incluyen sólo la secuencia codificante del péptido, así como los polinucleótidos que incluyen secuencias adicionales de codificación y/o no codificantes. La presente invención se refiere además a polinucleótidos que se híbridan a las secuencias descritas anteriormente en este documento, si hay al menos un 70 %, un 90 % y un 95 % de identidad entre las secuencias. La presente invención se refiere en particular a polinucleótidos codificantes de péptidos que se hibridan, en condiciones rigurosas, a los polinucleótidos descritos anteriormente. Tal como se lo utiliza en este documento, el término "condiciones rigurosas" significa "condiciones de hibridación rigurosas". Puede producirse la hibridación únicamente si hay al menos un 90 % o alrededor de 95 a 97 % de identidad entre las secuencias. En una realización, los polinucleótidos que se hibridan a los polinucleótidos descritos anteriormente codifican péptidos que conservan esencialmente la misma función o actividad biológicas que el péptido maduro codificado por los ADNc.

"Equivalente funcional" y "esencialmente la misma función o actividad biológicas" significan ambos que el grado de actividad biológica se encuentra entre el 30 % hasta alrededor del 100 % o más de la actividad biológica demostrada por el péptido al cual se está comparando, cuando la actividad biológica de cada péptido se determina por el mismo procedimiento.

Los términos "fragmento", "derivado" y "variante", cuando hacen referencia a los péptidos de la presente invención, significan fragmentos, derivados y variantes de los péptidos que conservan esencialmente la misma función o actividad biológica que dichos péptidos, tal como se describe más adelante. Un fragmento es una parte del péptido que conserva esencialmente una actividad funcional similar, tal como se describe en los modelos in vivo divulgados en este documento. Un derivado comprende todas las modificaciones al péptido que conservan esencialmente las funciones divulgadas en este documento, e incluye estructuras adicionales y las funciones correspondientes (p. ej., péptidos N-terminales modificados, péptidos PEGilados), péptidos fusionados que confieren especificidad dirigida o una actividad adicional como la toxicidad a un objetivo previsto, tal como se describe más adelante. Los péptidos de la presente invención pueden ser de origen recombinante, sintéticos o purificados naturalmente. El fragmento, derivado o variante de los péptidos de la presente invención puede ser (i) uno en el que uno o varios de los residuos aminoacídicos están sustituidos por un residuo aminoacídico conservado o no conservado, y dicho residuo aminoacídico sustituido puede o no ser uno de los codificados por el código genético, o (¡i) uno en el que uno o varios de los residuos aminoacídicos incluyen un grupo sustituyente, o (iii) uno en el que el péptido maduro está fusionado con otro compuesto, como por ejemplo un compuesto que aumente la semivida del péptido, o (iv) uno en el que los aminoácidos adicionales están fusionados al péptido maduro, tal como una secuencia líder o secretoria, o una secuencia empleada para la purificación del péptido maduro, o (v) uno en el que la secuencia peptídica está fusionada con un péptido más grande (p. ej., albúmina humana, un anticuerpo o región Fc, con fines de prolongar la duración del efecto). A partir de las enseñanzas del presente documento, se considera que dichos fragmentos, derivados, variantes y análogos se encuentran dentro del alcance de las personas versadas en la técnica. Los derivados de la presente invención pueden contener sustituciones aminoacídicas conservativas (definidas más adelante) realizadas en uno o varios residuos aminoacídicos no esenciales. Un residuo aminoacídico "no esencial" es aquél que puede ser modificado de la secuencia natural de una proteína sin alterar la actividad biológica; en cambio, un residuo aminoacídico "esencial" es necesario para la actividad biológica. Una "sustitución aminoacídica conservativa" es aquélla en que el residuo aminoacídico se reemplaza por un residuo aminoacídico que posee una cadena iateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos aminoacídicos que poseen cadenas laterales similares. Entre estas familias se encuentran aminoácidos con cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (p. ej., asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales apolares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales con ramificaciones beta (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Los fragmentos o las partes con actividad biológica comprenden fragmentos peptídicos adecuados para ser utilizados como medicamentos, para la generación de anticuerpos, como reactivo experimental, y semejantes. Los fragmentos pueden ser péptidos que comprenden secuencias aminoacídicas lo suficientemente similares a las secuencias aminoacídicas de un péptido de esta invención (o derivadas de las mismas) que presenten al menos una de las actividades de dicho péptido, pero que contengan un menor número de aminoácidos que los péptidos de longitud completa divulgados en el presente documento. Típicamente, las partes con actividad biológica comprenden un dominio o un motivo que posee al menos una de las actividades del péptido. La parte de un péptido con actividad biológica puede ser un péptido que tenga, por ejemplo, cinco o más aminoácidos de longitud. Dichas partes con actividad biológica pueden sintetizarse o bien prepararse mediante métodos recombinantes, y ser evaluadas respecto a una o más de las actividades funcionales de un péptido de esta invención por medios divulgados en este documento y/o ampliamente conocidos en la técnica. Además, los derivados de la presente invención pueden comprender péptidos que se han fusionado con otro compuesto, como por ejemplo un compuesto que prolongue la semivida del péptido y/o disminuya el potencial inmunogénico del péptido (p. ej., polietilenglicol, "PEG"). En el caso de la PEGilación, la fusión del péptido con el PEG puede lograrse mediante cualquier método conocido a las personas versadas en la técnica. Por ejemplo, puede lograrse la PEGilación introduciendo primero una mutación de cisteína en el péptido, para proporcionar un conector al cual fijar el PEG, y luego, efectuando la derivatización específica del sitio con PEG-maleimida. Por ejemplo, puede agregarse la cisteína al extremo C de los péptidos (véase, p. ej., Tsutsumi y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97(15):8548-53, 2000; Veronese, Biomaterials 22:405-417, 2001 ; Goodsoon y Katre, Bio/Technology 8:343-346, 1990). Las variantes de los péptidos de esta invención comprenden péptidos que poseen una secuencia aminoacídica lo suficientemente similar a la secuencia aminoacídica de los péptidos de esta invención o uno de sus dominios. El término "suficientemente similar" significa una primera secuencia aminoacídica que contiene un número mínimo o suficiente de residuos aminoacídicos idénticos o equivalentes a los de una segunda secuencia aminoacídica, de modo que la primera y la segunda secuencias aminoacídicas tengan en común un dominio estructural y/o actividad funcional. Por ejemplo, se definen en este documento como suficientemente similares las secuencias aminoacídicas que tienen en común un dominio estructural idéntico en al menos un 45 %, un 75 % hasta un 98 %. Las variantes serán suficientemente similares a la secuencia aminoacídica de los péptidos de esta invención. Las variantes comprenden variantes de péptidos codificados por un polinucleótido que se hibrida a un polinucleótido de esta invención o un complemento del mismo en condiciones rigurosas. Dichas variantes suelen conservar la actividad funcional de los péptidos de esta invención. Pueden utilizarse bibliotecas de fragmentos de los polinucleótidos a fin de generar una población variada de fragmentos para pesquisaje y posterior selección. Por ejemplo, puede generarse una biblioteca de fragmentos tratando un fragmento de PCR bicatenario de un polinucleótido con una nucleasa en condiciones en donde se produce el mellado (nicking) únicamente una vez por molécula, desnaturalizando el ADN bicatenario, renaturalizando el ADN para formar ADN bicatenario que puede incorporar pares codificantes/no codificantes (sense/antisense) de distintos productos mellados, eliminando las partes unicatenarias de las partes bicatenarias reformadas mediante tratamiento con S1 nucleasa y ligando la biblioteca de fragmentos resultantes en un vector de expresión. Mediante este método, es posible derivar una biblioteca de expresión que codifica fragmentos internos y N-terminales de distintos tamaños del péptido de esta invención. Las variantes incluyen péptidos que difieren en la secuencia aminoacídica debido a la mutagénesis. Las variantes que funcionan como la aprotinina pueden identificarse efectuando pesquisajes de bibliotecas combinatorias en busca de mutantes, por ejemplo, mutantes de truncamiento, de los péptidos de esta invención para ver si muestran la actividad de la aprotinina. En una realización, mediante mutagénesis combinatoria se genera una biblioteca variada de análogos a escala de ácido nucleico ia cual es codificada por una genoteca variada. Puede producirse una biblioteca variada de variantes, por ejemplo, ligando por vía enzimática una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias de genes de modo que un grupo redundante de secuencias aminoacídicas de posibles variantes sea expresable como péptidos individuales o, como alternativa, como un grupo de proteínas de fusión más grandes (por ejemplo, para expresión en fagos o phage display) que contengan el grupo de secuencias. Hay una diversidad' ele métodos que pueden emplearse para generar bibliotecas de posibles variantes a partir de una secuencia de oligonucleótidos redundantes. La síntesis química de una secuencia de genes redundantes puede realizarse en un sintetizador automático de ADN, luego puede ligarse el gen sintético en un vector de expresión apropiado. El uso de un grupo redundante de genes permite proporcionar, en una sola mezcla, todas las secuencias que codifican el grupo deseado de secuencias de posibles variantes. Los métodos para sintetizar oligonucleótidos redundantes son conocidos en la técnica (véase, p. ej. , Narang, Tetrahedron 39:3, 1983; Itakura y col., Annu. Rev. Biochem. 53:323, 1984; Itakura y col., Science 198:1056, 1984; Ike y col., Nucleic Acid Res. 1 1 :477, 1983). En la técnica se conocen varios métodos para pesquisar productos genéticos de bibliotecas combinatorias generadas a partir de mutaciones puntuales o truncamiento, así como para pesquisar bibliotecas de ADNc en busca de productos genéticos que tengan una propiedad seleccionada. Dichos métodos son adaptables para el pesquisaje rápido de las genotecas generadas por la mutagénesis combinatoria de péptidos R-agonistas. Los métodos empleados con más frecuencia, que se prestan al análisis de alto rendimiento para el pesquisaje de genotecas grandes, suelen incluir la clonación de la genoteca en vectores de expresión replicables, transformando las células apropiadas con la biblioteca de vectores resultante y expresando los genes combinatorios en condiciones en las que la detección de una actividad deseada facilite el aislamiento del vector codificante del gen cuyo producto fue detectado. Para identificar las variantes deseadas, los ensayos de pesquisaje pueden combinarse con ia técnica de mutagénesis de conjunto recursivo (Recursive Ensemble Mutagenesis, o REM), un algoritmo que mejora la frecuencia de los mutantes funcionales en las bibliotecas.

Los péptidos de esta invención pueden estar compuestos de aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados (es decir, isósteros peptídicos), y pueden contener aminoácidos diferentes de los 20 aminoácidos codificados por genes. Los péptidos pueden ser modificados ya sea por procesos naturales, tales como el procesamiento postraduccional, o bien mediante métodos de modificación química que son ampliamente conocidos en la técnica. Dichas modificaciones aparecen ampliamente descritas en textos básicos y en monografías más detalladas, así como en una voluminosa literatura de investigación. Las modificaciones pueden producirse en cualquier parte del péptido, incluso en la cadena principal del péptido, en las cadenas laterales de aminoácidos y en los extremos amino o carboxilo. Se observará que ei mismo tipo de modificación puede estar presente, en el mismo o en diversos grados, en varios sitios de determinado péptido. Además, determinado péptido puede contener muchos tipos de modificaciones. Los péptidos pueden ser ramificados, por ejemplo, como resultado de la ubiquitinación, y pueden ser cíclicos con o sin ramificaciones. Pueden producirse' péptidos cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados como resultado de procesos naturales postraducción, o bien por métodos sintéticos. Entre las modificaciones se encuentran: acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un grupo hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un iípido o derivado de lípido, unión covalente del fosfotidilinositol, formación de enlaces cruzados, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de enlaces cruzados covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formulación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de anclajes de glicosilfosfatidilinositol (GFI), hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenilación, sulfación, adición de aminoácidos a proteínas mediada por ARN de transferencia, como la arginilación, y ubiquitinación (véanse, p. ej., Proteins, Structure and Molecular Properties, 2.a ed., T. E. Creighton, W.H. Freeman and Company, Nueva York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins. B. C. Johnson, ed., Academic Press, Nueva York, págs. 1-12 (1983); Seifter y col., Meth. Enzymol 182:626-646, 1990; Rattan y col., Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62, 1992). Los péptidos de la presente invención comprenden los péptidos de las secuencias SEQ ID NO: 3 a 15, así como aquellas secuencias que tengan variaciones insustanciales en las secuencias respecto a éstas. Una "variación insustancial" incluiría cualquier variación de adición, sustitución o eliminación en la secuencia que mantenga sustancialmente af menos una función biológica de los péptidos de esta invención; por ejemplo, la actividad de la aprotinina. Estos equivalentes funcionales pueden incluir péptidos que poseen al menos un 70 % de identidad respecto a los péptidos de la presente invención, al menos un 90 % de identidad respecto a los péptidos de la presente invención y al menos un 95 % de identidad respecto a los péptidos de la presente invención, y que además incluyan partes de dichos péptidos que tengan sustancialmente la misma actividad biológica. Sin embargo, se incluye en la descripción de la presente invención a cualquier péptido que tenga una variación insustancial en la secuencia aminoacídica respecto a los péptidos de la presente invención, que demuestre poseer equivalencia funcional tal como se describe más adelante en este documento. Como ya se sabe en la técnica, el grado de "similitud" entre dos péptidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos y los sustitutos aminoacídicos conservados de un péptido con la secuencia de un segundo péptido. Dichas sustituciones conservativas incluyen las indicadas más arriba y las descritas por Dayhoff (The Atlas of Protein Sequence and Structure 5, 1978), y por Argos (EMBO J. 8:779-785, 1989). Por ejemplo, los aminoácidos que pertenecen a uno de los siguientes grupos representan cambios conservativos: - Ala, Pro, Gly, Gln, Asn, Ser, Thr; - Cys, Ser, Tyr, Thr; - Val, He, Leu, Met, Ala, Phe; - Lys, Arg, His; - Phe, Tyr, Trp, His; y - Asp, Glu. La presente invención se refiere también a polinucleótidos codificantes de los péptidos de esta invención, así como a los vectores que incluyen estos polinucleótidos, células hospedadoras producidas por ingeniería genética con vectores de la invención, y la producción de péptidos de la invención mediante técnicas recombinantes. Las células hospedadoras pueden producirse por ingeniería genética (mediante métodos de transducción, transformación o transfección) con los vectores de esta invención, que pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede ser, por ejemplo, un plásmido, partícula viral, fago, etc. Las células hospedadoras producidas por ingeniería genética pueden cultivarse en medios nutritivos convencionales, modificados según corresponda para activar promotores o seleccionar transformantes. Las condiciones del cultivo, tales como la temperatura, el pH y semejantes, son las que se utilizaron previamente con la célula hospedadora seleccionada para la expresión, y que resultarán obvios al profesional con habilidades normales en la técnica. El polinucleótido de la presente invención puede emplearse para producir un péptido aplicando técnicas recombinantes. Así, por ejemplo, la secuencia polinucleotídica puede incluirse en cualquiera de diversos vehículos de expresión, en particular, vectores o plásmidos para expresar un péptido. Dichos vectores comprenden: secuencias cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas de ADN (p. ej., derivados del virus SV40); plásmidos bacterianos; ADN de fagos; piásmidos de levaduras; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos; y ADN viral como vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar y pseudorrabia. Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro vector o plásmido siempre y cuando sea replicable y viable en el hospedador. Puede aplicarse una diversidad de procedimientos para insertar la secuencia apropiada de ADN en el vector. En general, la secuencia de ADN se inserta en una endonucleasa de restricción apropiada mediante procedimientos conocidos en la técnica. Se considera que éstos y otros procedimientos se encuentran dentro del alcance de las personas versadas-en la técnica. La secuencia de ADN en el vector de expresión está vinculada funcionalmente a una o varias secuencias de control de expresión (promotor) para dirigir la síntesis del ARNm. Algunos ejemplos representativos de dichos promotores son, entre otros: promotor de LTR o SV40, lactosa (lac), T7 o triptófano (trp) de E. coli, el promotor PL del fago lambda y otros promotores que han demostrado controlar la expresión de genes en células procarióticas o eucarióticas o sus virus. Ef vector de expresión puede asimismo contener un sitio de unión a ribosomas para iniciación de la traducción y un terminador de transcripción. Además, el vector puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión. Adicionalmente, los vectores de expresión pueden contener un gen que proporcione un rasgo fenotípico para selección de las células hospedadoras transformadas tales como la dihidrofolato-reductasa o resistencia a la neomicina en el caso de cultivos de células eucarióticas, o tales como resistencia a la tetraciclina o la ampicilina en E. coli. Puede emplearse el vector que contiene la secuencia de ADN apropiada tal como se describió anteriormente en este documento, así como un promotor o secuencia de control apropiados, para transformar un hospedador apropiado a fin de permitir que dicho hospedador exprese la proteína. Algunos ejemplos representativos de hospedadores apropiados son, entre otros: células bacterianas tales como E. coli, Salmonella typhimurium, Streptomyces; células fúngicas tales como levaduras; células de insecto tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células de animal tales como CHO, COS o melanoma de Bowes; adenovirus; células de plantas, etc. Se considera que la selección de un hospedador apropiado está dentro del alcance de las personas versadas en la técnica a partir de las enseñanzas del presente documento. La presente invención incluye además construcciones obtenidas por técnicas recombinantes que comprenden una o más de las secuencias ampliamente descritas con anterioridad. Las construcciones comprenden un vector, tal como un vector plasmídico o viral, en el cual se ha insertado una de las secuencias de la inversión, en orientación directa o inversa. En un aspecto de esta realización, la construcción comprende además secuencias reguladoras que incluyen, por ejemplo, un promotor, vinculado funcionalmente a la secuencia. Las personas versadas en la técnica estarán familiarizadas con numerosos vectores y promotores adecuados, que pueden conseguirse en el mercado. Se ofrecen los siguientes vectores a modo de ejemplo. Bacterianos: vectores pET, pQE70, pQE60, pQE-9, pBS, phagescript, psiX174, pBluescript SK, pBsKS, pNHda, pNH16a, pNH18a, pNH46a, pTRC99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 y PRIT5. Eucarióticos: pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXT1 , pSG, pSVK3, pBPV, pMSG y PSVL. Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro vector o plásmido siempre y cuando sea replicable y viable en el hospedador. Pueden seleccionarse regiones de promotores a partir de cualquier gen deseado recurriendo a vectores CAT (cloranfenicol-transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables. Dos vectores apropiados son pKK232-8 y pCM7. Entre los promotores bacterianos nombrados en particular figuran: laci, lacZ, T3, T7, gpt, PR lambda, PL y trp. Los promotores eucarióticos se encuentran CMV de acción inmediata o temprana, timidina-cinasa del VHS, SV40 temprano y tardío, LTR de retrovirus y metalotioneína-l de ratón. La selección del vector y promotor apropiados se encuentra bien dentro del alcance de habilidades corrientes en la técnica. La presente invención se relaciona con las células hospedadoras que contienen la construcción antes descrita. La célula hospedadora puede ser una célula eucariótica superior como una célula de mamífero, o una célula eucariótica • inferior como una célula de levadura; o bien, la célula hospedadora puede ser una célula procariótica como una célula bacteriana. La construcción puede introducirse en la célula hospedadora mediante transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-Dextran o electroporación (Davis y col., Basic Methods in Molecular Biology, 1986). Las construcciones en las células hospedadoras se pueden utilizar de un modo convencional para producir el producto genético codificado por la secuencia recombinante. Como alternativa, los péptidos de ia invención se pueden producir de forma sintética mediante sintetizadores peptídicos convencionales. Las proteínas maduras se pueden "expresar en células de mamíferos, levaduras, bacterias u otras células bajo el control de promotores apropiados. También pueden emplearse sistemas acelulares de traducción para producir dichas proteínas, recurriendo a ARN derivados de las construcciones de ADN de la presente invención. Algunos vectores de clonación y expresión apropiados para ser utilizados con hospedadores procarióticos y eucarióticos aparecen descritos en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), cuya divulgación se incorpora en el siguiente documento como referencia. La transcripción de un ADN codificante de los péptidos de la presente invención por organismos eucarióticos superiores aumenta insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores (enhancers) son elementos de ADN de acción cis, generalmente de 10 a cerca de 300 pb, que tienen el efecto de aumentar la transcripción de un promotor. Algunos ejemplos son: el potenciador SV40 de la región tardía del origen de la replicación (pb 100 a 270), un potenciador de promotor temprano de citomegalovirus, un potenciador de polioma de la región tardía del origen de replicación, y potenciadores de adenovirus. Generalmente, los vectores de expresión recombinantes incluyen orígenes de replicación y marcadores seleccionables que permiten la transformación de la célula hospedadora (p. ej., el gen de resistencia a la ampicilina de E. coli o el gen TRP1 de S. cerevisiae) y un promotor obtenido de un gen altamente expresado a la transcripción directa de una secuencia estructural en dirección 3' (downstream). Dichos promotores pueden obtenerse a partir de operones codificantes de enzimas glicolíticas como la 3-fosfoglicerato-cinasa (PGK), el factor a, la fosfatasa acida o proteínas de choque térmico, entre otros. La secuencia heteróloga estructural se ensambla en la fase apropiada con secuencias de traducción, iniciación y terminación, y opcionalmente una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida hacia el espacio periplásmico o el medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación N-termínal que confiere las características -deseadas (p. ej., estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado).

Pueden construirse vectores de expresión útiles para ser utilizados con bacterias, insertando una secuencia estructural de ADN que codifica una proteína deseada junto con señales adecuadas de traducción, iniciación y terminación en una fase de lectura operable con un promotor funcional. El vector puede comprender uno o varios marcadores fenotípicos seleccionables y un origen de replicación para garantizar la conservación del vector y para, si fuera apropiado, proporcionar la amplificación dentro del hospedador. Algunos hospedadores procarióticos adecuados para la transformación son, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, aunque también pueden emplearse otros según las preferencias. Los vectores de expresión útiles para ser utilizados con bacterias pueden comprender un marcador seleccionable y un origen de replicación bacteriano obtenidos de plásmidos comerciales que contienen elementos genéticos del ampliamente conocido vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). Dichos vectores comerciales son, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y GEM1 (Promega, Madison, Wis., EE. UU.). Estas secciones de "esqueleto" (backbone) de pBR322 pueden combinarse con un promotor apropiado y la secuencia estructural que se desea expresar. Después de la transformación de una cepa hospedadora adecuada y su multiplicación hasta alcanzar una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado se somete a desrepresión por medios apropiados (p. ej., cambio de temperatura o inducción química) y las células se cultivan por un período adicional. Normalmente, las células se cosechan por centrifugación y se rompen por medios físicos o químicos; el extracto impuro resultante se conserva para su ulterior purificación. Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas pueden romperse por cualquier método conveniente, como ciclos de congelación-descongelación, homogeneización por ultrasonido, fragmentación mecánica o uso de usantes celulares.

También pueden emplearse diversos sistemas de cultivo de células de mamíferos para expresar la proteína recombinante. Algunos ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos son las líneas COS-7 de fibroblastos renales de mono descritas por Gluzman (Cell 23:175, 1981 ), y otras líneas celulares con capacidad para expresar un vector compatible, por ejemplo, las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de la expresión en células de mamíferos pueden comprender un origen de replicación, un promotor y un potenciador adecuados y también cualquier sitio de unión del ribosoma, sitio de poliadenilación, sitios de corte y empalme (splicing) de donante y aceptor, secuencias de terminación de la transcripción y secuencias no transcritas adyacentes al extremo 5'. Para proporcionar los elementos genéticos no transcritos pueden emplearse secuencias de ADN obtenidas del genoma viral SV40, por ejemplo, sitios de origen de SV40, de promotor temprano, de potenciador, de corte y empalme y de poliadenilación.

Los péptidos de la presente invención pueden ser recuperados y purificados a partir de los cultivos de células recombinantes por métodos empleados con anterioridad, tales como: precipitación con sulfato de amonio o etanol; extracción acida; cromatografía de intercambio aniónico o catiónico; cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía en hidroxiapatita y cromatografía de afinidad a lectina. Puede recurrirse a pasos de replegamiento proteico, según sea necesario, para completar la configuración de la proteína madura. Por último, puede emplearse la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para los pasos finales de purificación. Los péptidos de esta invención pueden ser un producto de procedimientos de síntesis química, o bien de técnicas recombinantes con un hospedador procariótico o eucariótico (p. ej., células de bacterias, levaduras, plantas superiores, insectos y mamíferos). Según el tipo de hospedador empleado en un procedimiento de producción recombinante, los péptidos de esta invención pueden estar glicosilados con carbohidratos de mamíferos u otros organismos eucarióticos, o bien no estar glicosilados. Los péptidos de esta invención también pueden incluir un residuo aminoacídico de metionina inicial. Después del aislamiento o purificación, un péptido de esta invención o una parte con actividad biológica del mismo está sustancialmente exento de otro material celular, o de medio de cultivo si se ha producido por técnicas recombinantes, o sustancialmente exento de precursores químicos y otros compuestos si se ha sintetizado químicamente. Un péptido aislado de esta invención está sustancialmente exento de material celular y tiene menos de un 30 % (en peso seco) de material no peptídico o contaminante. Cuando el péptido de esta invención o una parte con actividad biológica del mismo se produce por métodos recombínantes, el medio de cultivo puede representar menos del 30 % del volumen del preparado peptídico. Cuando esta invención se produce por síntesis química, los preparados pueden contener menos del 30 % en peso seco de precursores químicos o compuestos ajenos a la invención. Los péptidos de esta invención pueden aislarse con facilidad según se describe más adelante en los ejemplos concretos. Un preparado de péptido purificado tiene una pureza mínima del 70 %, o del .85 % al 99 % . La pureza de los preparados puede determinarse por cualquier método conocido en la técnica, como por ejemplo por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y espectrometría de masas/cromatografía líquida. Las secuencias polinucleotídicas que codifican los péptidos de esta invención pueden sintetizarse, totalmente o en parte, mediante métodos químicos ampliamente conocidos en la técnica (véanse, p. ej., Caruthers y col., Nucí. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, 1980; Horn y col., Nucí. Acids Res. Symp. Ser. 225-232, 1980). El polinucleótido codificante del péptido puede clonarse en un vector de expresión con el objeto de expresar dicho péptido. Como les resultará conocido a las personas versadas en la técnica, quizás sea ventajoso producir secuencias nucleotídicas codificantes del péptido que posean codones de origen no natural. Por ejemplo, pueden seleccionarse codones preferidos por determinado hospedador procariótico o eucariótico con el fin de aumentar la velocidad de expresión peptídica o producir una transcripción de ARN que tenga propiedades deseables, tales como una semivida más larga que la de una transcripción generada a partir de la secuencia de origen natural. Las secuencias nucleotídicas divulgadas en este documento se pueden diseñar mediante métodos conocidos generalmente en la técnica, a fin de alterar las secuencias codificantes de péptidos por diversas razones, incluidas, entre otras, alteraciones que modifican el cierre, procesamiento y/o expresión del producto de péptido o ARNm. Para diseñar las secuencias de nucleótidos puede recurrirse al intercambio (shuffling) de ADN por fragmentación aleatoria y reensamblaje por PCR de fragmentos de genes y oligonucleótidos sintéticos. Por ejemplo, puede emplearse la mutagénesis dirigida para insertar nuevos sitios de restricción, alterar patrones de glicosilación, cambiar preferencias de codones, producir variantes de corte y empalme, introducir mutaciones, y así sucesivamente. Se proporcionan asimismo péptidos afines que estarán dentro de la comprensión de las personas versadas en la técnica, tales como miméticos químicos, miméticos orgánicos o miméticos peptídicos. Tal como se los utiliza en este documento, los términos "mimético", "mimético peptídico", "peptidomimético", "mimético orgánico" y "mimético químico" están destinados a englobar derivados peptídicos, análogos de péptidos y compuestos químicos que tienen una disposición de átomos en una orientación tridimensional equivalente a la de uno de los péptidos de la presente invención. Se comprenderá que la frase "equivalente a" tal como se la utiliza en este documento está destinada a englobar péptidos con una o varias sustituciones de ciertos átomos, o grupos químicos presentes en dicho péptido, que posean longitudes de enlace, ángulos de enlace y disposiciones en el péptido mimético que produzcan una disposición u orientación iguales de dichos átomos y grupos o lo suficientemente similares como para tener la misma función biológica de los péptidos de la invención. En los miméticos peptídicos de la invención, la disposición tridimensional de los constituyentes químicos es estructuralmente y/o funcionalmente equivalente a la disposición tridimensional de la cadena principal del péptido y las cadenas laterales de aminoácidos componentes del péptido, formando miméticos peptídicos, orgánicos y químicos de los péptidos de la invención que poseen actividad biológica considerable. Estos términos se utilizan según el conocimiento de la técnica, tal como lo ilustran, por ejemplo, Fauchere, (Adv. Drug Res. 15:29, 1986); Veber y Freidinger, (TINS p.392, 1985); y Evans y col., (J. Med. Chem. 30:1229, 1987), incorporados en este documento como referencia. Se sobreentiende que existe un farmacóforo para la actividad biológica de cada péptido de la invención. En la técnica se entiende que un farmacóforo comprende una definición tridimensional idealizada de los requisitos estructurales para la actividad biológica. Pueden diseñarse miméticos peptídicos, orgánicos y químicos para ajustar cada farmacóforo con software de modelado informático actual (diseño farmacológico asistido por computadora). Dichos productos miméticos pueden producirse por análisis de estructura-función, sobre la base de información posicional de los átomos sustituyentes en los péptidos de la invención. Los péptidos proporcionados por la invención pueden sintetizarse ventajosamente por cualquiera de los métodos de síntesis química conocidos en la técnica, en particular por métodos de síntesis en fase sólida, por ejemplo, utilizando sintetizadores peptídicos automatizados a la venta en el comercio. Los miméticos de la presente invención pueden sintetizarse por métodos de fase sólida o fase líquida empleados convencionalmente para la síntesis de péptidos (véase, p. ej., Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54, 1963; Carpino, Acc. Chem. Res. 6:191-98, 1973; Birr, Aspects of the Merrifield Peptide Synthesis, Springer-Verlag: Heidelberg, 1978; The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1 , 2, 3 y 5, (Gross y Meinhofer, ed.), Academic Press: Nueva York, 1979; Stewart y col., Solid Phase Peptide Synthesis, 2.a ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, lll., 1984; Kent, Ann. Rev. Biochem. 57:957-89, 1988; y Gregg y col., Int. J. Peptide Protein Res. 55:161-214, 1990, que se incorporan en este documento en su totalidad como referencia). Los péptidos de la presente invención se pueden preparar por métodos de fase sólida. De forma resumida: un residuo aminoacídico C-terminal N-protegido se une a un soporte insoluble como poliestireno entrecruzado con divinilbenceno, resina de poliacrilamida, Kieselguhr/poliamida (pepsina K), vidrio de porosidad controlada, celulosa, membranas de polipropileno, varillas de polietileno recubiertas de ácido acrílico o semejantes. Se emplean ciclos de desprotección, neutralización y acoplamiento de derivados aminoacídicos protegidos sucesivos para enlazar los aminoácidos del extremo C-terminal conforme a la secuencia aminoacídica. En el caso de algunos péptidos sintéticos, puede emplearse una estrategia con FMOC utilizando una resina sensible al ácido. Los soportes sólidos útiles para este fin pueden ser: resinas de poliestireno entrecruzadas con divinilbenceno, que se consiguen en el comercio en una diversidad de formas funcionalizadas como resina de clorometilo, resina de hidroximetilo, resina de paraacetamidometilo, resina de benzhidrilamina (BHA), resina de 4-metilbenzhidrilamina (MBHA), resinas de oxima, resina de alcohol 4-alcoxibencílico (resina de Wang), resina de 4-(2,,4,-dimetoxifenilaminomet¡l)-fenoximetilo, resina de 2,4-dimetoxibenzhidrilamina, y resina de 4-(2',4'-dimetoxifenil-FMOC-aminometil)-fenoxiacetamidonorleuc¡l-MBHA (resina Rink a ida-MBHA). Un ejemplo de grupo protector de aminoácidos alfa es el 9-fluorenilmetoxi-carbonilo (FMOC) lábil a condiciones básicas. Algunos grupos protectores adecuados para las funcionalidades de cadena lateral de aminoácidos químicamente compatibles con grupos BOC (t-butiloxicarbonilo) y FMOC son ampliamente conocidos en la técnica. Los residuos aminoacídicos pueden acoplarse mediante una diversidad de agentes acopladores y reacciones químicas conocidas en la técnica, como por ejemplo por acoplamiento directo con DIC (diisopropilcarbodiimida), DCC (diciciohexilcarbodiimida), BOP (hexafluorofosfato de benzotriazolil-N-oxitrisdimetilaminofosfonio), PyBOP (hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidinofosfonio), PyBrOP (hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidinofosfonio); mediante anhídridos simétricos preformados; mediante esteres activos como los esteres pentafluorofenílicos; o mediante esteres activos de HOBt (1- hidroxibenzotriazol) preformados o utilizando fluoruro y cloruros de FMOC- aminoácido o anhídridos de FMOC-N-carboxiaminoácidos. Se prefiere realizar la activación con HBTU (hexafluorofosfato de 2-(1 H-benzotriazol-1-il),1 ,1 ,3,3-tetrametiluronio) o HATU (hexafluorofosfato de 2-(1 H-7-aza-benzotriazol-1-il),1 ,1 ,3,3-tetrametiluronio) en presencia de HOBt o HOAt (7-azahidroxibenzotriazol). El método de fase sólida puede llevarse a cabo manualmente; también puede realizarse la síntesis automatizada en un sintetizador de péptidos comercial (p. ej., el de Applied Biosystems 433A o uno semejante; Applied Biosystems, Foster City, CA). En una síntesis típica, el primer aminoácido (C-terminal) se carga sobre la resina de clorotritilo. Puede emplearse ciclos sucesivos de desprotección (con piperidina al 20 % en NMP [N-metilpirrolidona]) y acoplamiento según los protocolos ABl FastMoc (Applied Biosystems) para generar la secuencia peptídica. También puede realizarse el acoplamiento doble y triple, mediante "encapuchado" con anhídrido acético en el extremo 5' (capping). El péptido mimético sintético puede escindirse de la resina y desprotegerse mediante tratamiento con TFA (ácido trifluoroacético) que contenga los depuradores (scavengers) apropiados. Pueden utilizarse muchos reactivos de escisión para este fin, tales como el Reactivo K (0,75 g de fenol cristalino, 0,25 mi de etanoditiol, 0,5 ml de tioanisol, 0,5 ml de agua desionizada, 10 ml de TFA) y otros. El péptido se separa de la resina por filtración y se aisla por precipitación en éter. Puede lograrse una purificación ulterior por métodos convencionales, tales como filtración en gel y HPLC (cromatografía líquida de alta resolución) en fase inversa. Los miméticos sintéticos según la presente invención pueden ser sales farmacéuticamente aceptables, especialmente las sales de adición básica que incluyen las sales de bases orgánicas y bases inorgánicas. Las sales de adición básica de los residuos aminoacídicos ácidos se preparan mediante el tratamiento del péptido con la base orgánica o la base inorgánica correspondiente, siguiendo procedimientos bien conocidos a las personas versadas en la técnica; o bien, la sal deseada puede obtenerse directamente por liofilización de la base correspondiente.

Generalmente, las personas versadas en la técnica reconocerán que los péptidos aquí descritos pueden ser modificados por una variedad de métodos químicos, para producir péptidos que tienen sustancialmente la misma actividad que el péptido no modificado, y que opcionalmente tienen otras propiedades deseables. Por ejemplo, los grupos de ácido carboxílico del péptido pueden proporcionarse en forma de sal de un catión farmacéuticamente aceptable. Los grupos aminos dentro del péptido pueden ser una sal de adición de ácido farmacéuticamente estable, como las sales del ácido clorhídrico, bromhídrico, acético, benzoico, toluensulfónico, maleico, tartárico y otras sales orgánicas, o bien pueden convertirse a una amida. Las personas versadas en la técnica reconocerán también métodos para introducir estructuras cíclicas en los péptidos de esta invención, para que puedan aproximarse más exactamente a la configuración de unión de la molécula natural. Se dispone de una diversidad de técnicas para construir derivados y análogos peptídicos con una actividad biológica igual o similar a la del correspondiente péptido, pero con actividad más favorable que el péptido respecto a solubilidad, estabilidad y susceptibilidad de hidrólisis y proteólisis. Dichos derivados y análogos comprenden péptidos modificados en el grupo amino N-terminal o el grupo carboxilo C-terminal, y/o la modificación de una o varias de las uniones amídicas del péptido a una unión no amídica. Se sobreentiende que pueden acoplarse dos o más de estas modificaciones en una estructura mimética del péptido (p. ej., por modificación del grupo carboxilo C-terminal e inclusión de una unión -CH2-carbamato entre dos aminoácidos del péptido). El extremo amino puede modificarse por alquilación, acetilación, adición de un grupo carbobenzoílo y formación de un grupo succinimida. Concretamente, el grupo amino N-terminal puede hacerse reaccionar para formar un grupo amido con fórmula RC(0)NH- donde R es alquilo, y se somete a adición mediante una reacción con haluro ácido, RC(0)CI o anhídrido ácido. Normalmente, la reacción puede llevarse a cabo poniendo en contacto cantidades aproximadamente equimolares o excesivas (p. ej., unos 5 equivalentes) de un haluro ácido y el péptido en un diluyente inerte (p. ej., diclorometano) que contenga un exceso (p. ej., cerca de 10 equivalentes) de una amina terciaria, tal como la diisopropiletilamina, para neutralizar el ácido generado durante la reacción. Del resto, las condiciones de reacción son convencionales (p. ej., temperatura ambiente durante 30 minutos). La alquilación del amino-terminal para obtener una N-sustitución con alquilo de cadena corta seguida de la reacción con un haluro ácido tal como se lo describe más arriba proporcionará un grupo amida N-alquilado de fórmula RC(0)NR- Como alternativa, el extremo amino puede unirse covalentemente al grupo succinimida mediante reacción con anhídrido succínico. Se utiliza una cantidad aproximadamente equimolar o excesiva de anhídrido succínico (p. ej., unos 5 equivalentes) y el grupo amino terminal se convierte a la succinimida por métodos ampliamente conocidos en la técnica, como el uso de un exceso (p. ej., 10 equivalentes) de una amina terciaria como la diisopropiletilamina en un solvente inerte adecuado (p. ej., diclorometano), tal como se describe en Wollenberg y col. (patente estadounidense 4.612.132), que se incorpora aquí en su totalidad como referencia. También estará entendido que el grupo succínico puede sustituirse con, por ejemplo, un alquilo C2 a Ce o grupos -SR, que se preparan de manera convencional para formar succinimidas sustituidas en el extremo N-terminal del péptido. Dichos sustituyentes alquilo pueden prepararse haciendo reaccionar olefinas de cadena corta (alquilos C2 a C6) con anhídrido maleico de la forma descrita por Wollenberg y col., supra; los sustituyentes -SR pueden prepararse haciendo reaccionar un RSH con anhídrido maleico, donde R corresponde a la definición anterior. En otra realización ventajosa, el extremo amino terminal puede derivatizarse para formar un grupo benciloxicarbonil-NH- o un grupo benciloxicarbonil-NH — sustituido. Este derivado puede producirse haciendo reaccionar una cantidad aproximadamente equivalente o excesiva de cloruro de benciloxicarbonilo (CBZ-CI) o un CBZ-CI sustituido en un difuyente inerte adecuado (p. ej., diclorometano) que contenga una amina terciaria para neutralizar el ácido generado durante la reacción. En otro derivado adicional, el extremo N-terminal comprende un grupo sulfonamida por reacción con una cantidad equivalente o excesiva (p. ej., 5 equivalentes) de R-S(0)2CI en un diluyente inerte adecuado (diclorometano) para convertir la amina terminal en una sulfonamida, donde R es un alquilo (p. ej., un alquilo de cadena corta). El diluyente inerte contiene un exceso de amina terciaria (p. ej., 10 equivalentes) tal como la diisopropiletilamina, para neutralizar el ácido generado durante la reacción. Del resto, las condiciones de reacción son convencionales (p. ej., temperatura ambiente durante 30 minutos). Pueden producirse grupos carbamato en el extremo amino-terminal por reacción con una cantidad equivalente o excesiva (p. ej., 5 equivalentes) de R-OC(0)CI o R-OC(0)OC6H4-p-N02 en un diluyente inerte adecuado (p. ej., diclorometano) para convertir la amina terminal en un carbamato, donde R es un alquilo (p. ej., un alquilo de cadena corta). El diluyente inerte puede contener un exceso (p. ej., unos 10 equivalentes) de una amina terciaria como la diisopropiletilamina, para neutralizar el ácido que se genere durante la reacción. Del resto, las condiciones de reacción son convencionales (p. ej., temperatura ambiente durante 30 minutos). Pueden formarse los grupos urea en el extremo amino-terminal por reacción de una cantidad equivalente o un exceso (p. ej., 5 equivalentes) de R-N=C=0 en un diluyente inerte adecuado (p. ej., diclorometano) para convertir la amina terminal en una urea' (es decir, un grupo RNHC(O)NH-) donde R responde a la definición anterior. El diluyente inerte puede contener un exceso (p. ej., unos 10 equivalentes) de una amina terciaria como la diisopropiletilamina. Del resto, las condiciones de reacción son convencionales (p. ej., temperatura ambiente durante unos 30 minutos). En la preparación de miméticos de péptidos en los que el grupo carboxilo C-terminal puede ser reemplazado por un éster (p. ej., -C(0)OR, en donde R es alquilo), pueden emplearse las resinas utilizadas para preparar los ácidos peptídicos; el péptido protegido en la cadena lateral pueden escindirse con una base y el alcohol correspondiente (p. ej., metanol). Los grupos protectores de la cadena lateral pueden eliminarse de la manera habitual medíante tratamiento con fluoruro de hidrógeno para obtener el éster deseado. En la preparación de miméticos de péptidos en lo que el grupo carboxilo C-terminal se sustituye por la amida -C(0)NR3R4, se emplea una resina de benzhidrilamina como el soporte sólido para la síntesis de péptidos. Una vez finalizada la síntesis, el tratamiento con fluoruro de hidrógeno para liberar el péptido del soporte produce directamente la amida peptídica libre (es decir, el extremo C-terminal es -C(0)NH2). Como alternativa, el uso de la resina clorometilada durante la síntesis peptídica acoplado a la reacción con amonio para escindir el péptido protegido en la cadena lateral del soporte produce la amida peptídica libre, y la reacción con una alquilamina o dialquilamina produce una alquilamida o dialquilamida protegida en la cadena lateral (es decir, el extremo C-terminal es ~C(0)NRR-?, en donde R y R-j son alquilos de cadena corta). La protección en la cadena lateral se elimina posteriormente de la manera habitual mediante tratamiento con fluoruro de hidrógeno para producir las amidas, alquilamidas o dialquilamidas libres. Los miméticos peptídicos tal como se los entiende en la técnica y que proporciona la invención tienen una estructura similar al péptido de la invención, pero poseen uno o varios enlaces peptídicos sustituidos opcionalmente por uno de los enlaces seleccionados del grupo integrado por: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH- (tanto en los confórmeros cis como trans), ~COCH2-, -CH(OH)CH2 - y -CH2SO-, por métodos conocidos en la técnica y descritos más detalladamente en las siguientes referencias: Spatola, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, (Weinstein, ed.), Marcel Dekker: Nueva York, p. 267, 1983; Spatola, Peptide Backbone Modifications 1 :3, 1983; Morley, Trends Pharm. Sci. pág. 463-468, 1980; Hudson y col., Int. J. Pept. Prot. Res. 14:177-185, 1979; Spatola y col., Life Sci. 38:1243-1249, 1986; Hann, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I 307-314, 1982; Almquist y col., J. Med. Chem. 23:1392-1398, 1980; Jennings-White y col., Tetrahedron Lett. 23:2533, 1982; Szelke y col., EP045665A; Holladay y col., Tetrahedron Lett. 24:4401-4404, 1983; y Hruby, Life Sci. 31 :189-199, 1982; cada uno de los cuales se incorpora en este documento como referencia. Dichos miméticos peptídicos pueden ofrecer considerables ventajas sobre las realizaciones de péptidos, como por ejemplo, ser. más económicos de producir, tener mayor estabilidad química o presentar mejores propiedades farmacológicas (tales como semivida, absorción, potencia, eficacia, etc.), menor antigenicidad y otras propiedades. También pueden obtenerse análogos miméticos de los péptidos de la invención aplicando los principios de diseño farmacológico convencional o racional (véanse, p. ej., Andrews y col., Proc. Alfred Benzon Symp. 28:145-165, 1990; McPherson, Eur. J. Biochem. 189:1-24, 1990; Hol y col., ¡n Molecular Recognition: Chemical and Biochemical Problems, (Roberts, ed.); Royal Society of Chemistry; págs. 84-93, 1989a; Hol, Arzneim-Forsch. 39:1016-1018, 1989b; Hol, Agnew Chem. Int. Ed. Engl. 25:767-778, 1986; las divulgaciones de los cuales se incorporan en este documento como referencia). De conformidad con los métodos del diseño convencional de fármacos, pueden obtenerse las moléculas miméticas deseadas probando al azar con moléculas cuyas estructuras tengan un atributo en común con la estructura de un péptido natural. La contribución cuantitativa que resulte de una modificación en determinado grupo de una molécula de unión puede determinarse midiendo la actividad biológica del mimético putativo en comparación con la actividad del péptido. En una realización del diseño racional de fármacos, el mimético se diseña para que tenga en común un atributo de la conformación tridimensional más estable del péptido. Así, por ejemplo, puede diseñarse un mimético para que posea grupos químicos que estén orientados de un modo tal que cause interacciones iónicas, hidrofóbicas o de van der Waals similares a las presentadas por los péptidos de la invención, tal como se divulga en este documento. Un método para llevar a cabo el diseño racional de miméticos emplea software de gráficos moleculares capaz de formar una representación de la estructura tridimensional del péptido. Las estructuras moleculares de los miméticos peptídicos, orgánicos y químicos de los péptidos de la invención pueden producirse mediante el uso de programas de diseño asistidos por computadora adquiribles en el comercio. Algunos ejemplos de dichos programas son: SYBYL 6.5®, HQSAR™ y ALCHEMY 2000™ (Tripos); GALAXY™ y AM2000™ (AM Technologies, Inc., San Antonio, TX, EE. UU.); CATALYST™ y CERIUS™ (Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA, EE. UU.); CACHE PRODUCTS™, TSAR™, AMBER™ y CHEM-X™ (Oxford Molecular Products, Oxford, CA, EE. UU.) y CHEMBUILDER3D™ (Interactive Simulations, Inc., San Diego, CA, EE. UU.). Los miméticos peptídicos, orgánicos y químicos producidos a partir de los péptidos divulgados en este documento empleando, por ejemplo, programas de modelado molecular reconocidos en la técnica, pueden elaborarse a partir de técnicas convencionales de síntesis química, por ejemplo, diseñadas para aceptar el pesquisaje de alto' rendimiento, incluidos los métodos de química combinatoria. Los métodos combinatorios que resultan útiles en la producción de miméticos peptídicos, orgánicos y químicos de la invención son matrices de expresión de fagos, síntesis en fase sólida y matrices de química combinatoria, como los que proporcionan, por ejemplo, SIDDCO (Tucson, Arizona, EE. UU.); Tripos, Inc.; Calbiochem/Novabiochem (San Diego, CA, EE. UU.); Symyx Technologies, Inc. (Santa Clara, CA, EE. UU.); Medichem Research, Inc. (Lemont, IL, EE. UU.); Pharm-Eco Laboratories, Inc. (Bethlehem, PA, EE. UU.); o N.V. Organon (Oss, Países Bajos). La producción química combinatoria de miméticos peptídicos, orgánicos y químicos de la invención puede efectuarse según métodos conocidos en la técnica, incluidos, entre otros, métodos divulgados en Terrett, (Combinatorial Chemistry, Oxford University Press, Londres, 1998); Galíop y col., J. Med. Chem. 37:1233-51 , 1994; Gordon y col., J. Med. Chem. 37:1385-1401 , 1994; Look y col., Bioorg. Med. Chem. Lett. 6:707-12, 1996; Ruhland y col., J. Amer. Chem. Soc. 118: 253-4, 1996; Gordon y col., Acc. Chem. Res. 29:144-54, 1996; Thompson y Ellman, Chem. Rev. 96:555-600, 1996; Fruchtel y Jung, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35:17-42, 1996; Pavia, "The Chemical Generation of Molecular Diversity", Network Science Center, www.netsci.org, 1995; Adnan y col., "Solíd Support Combinatorial Chemistry in Lead Discovery and SAR Optimization," Id., 1995; Davies and Briant, "Combinatorial Chemistry Library Design using Pharmacophore Diversity,'" Id., 1995; Pavia, "Chemically Generated Screening Libraries: Present and Future," Id., 1996; y las patentes estadounidenses 5.880.972; 5.463.564; 5.331.573 y 5.573.905. Los péptidos recién sintetizados se pueden purificar sustancialmente por cromatografía líquida preparativa de alta resolución (véase, p. ej., Creighton, Proteins: Structures And Molecular Principies, WH Freeman and Co., Nueva York, N.Y., 1983). La composición de un péptido sintético de la presente invención puede confirmarse por análisis de aminoácidos o secuenciamiento con, por ejemplo, el procedimiento de degradación de Edman (Creighton, supra). Además, cualquier parte de la secuencia aminoacídica del péptido puede alterarse durante la síntesis directa y/o combinarse aplicando métodos químicos con secuencias de otras proteínas, a fin de producir una variante peptídica o un péptido fusionado.

También se incluyen en esta invención anticuerpos y fragmentos de los anticuerpos que se unen selectivamente a los péptidos de esta invención. Puede generarse cualquier tipo de anticuerpo conocido en la técnica utilizando métodos ampliamente conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede generarse un anticuerpo que se enlace específicamente a un epítopo de un péptido de esta invención. "Anticuerpo" tal como se lo utiliza en este documento incluye moléculas de inmunoglobulina intactas, así como fragmentos de las mismas, como Fab, F(ab')2 y Fv, que son capaces de unirse a un epítopo de uno de los péptidos de esta invención. Típicamente, para formar un epítopo se requieren al menos 6, 8, 10 ó 12 aminoácidos adyacentes. Sin embargo, los epítopos que contienen aminoácidos no adyacentes podrían requerir un mayor número de aminoácidos, por ejemplo, al menos 15, 25 ó 50 aminoácidos. Un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo de uno de los péptidos de esta invención puede emplearse con fines terapéuticos, así como en ensayos inmunoquímicos como el "Western blot", el ELISA, radioinmunoensayos, ensayos inmunohistoquímicos, inmunoprecipitaciones, u otros ensayos inmunoquímicos conocidos en la técnica. Pueden emplearse diversos inmunoensayos para identificar anticuerpos que tengan la especificidad deseada. Hay numerosos protocolos de unión competitiva o ensayos inmunorradiométricos ampliamente conocidos en la técnica. Típicamente, dichos inmunoensayos requieren la determinación de la formación de complejos entre un inmunógeno y un anticuerpo que se une específicamente al inmunógeno. Normalmente, un anticuerpo que se une específicamente a uno delos-péptidos de esta invención ofrece una señal de detección al menos 5, 10 ó 20 veces superior a la señal de detección proporcionada por otras proteínas utilizadas en un ensayo inmunoquímico. De preferencia, los anticuerpos que se unen específicamente a uno de los péptidos de esta invención no detectan otras proteínas en ensayos inmunoquímicos y pueden inducir la inmunoprecipitación del péptido de esta invención de la solución. Pueden utilizarse péptidos de esta invención para inmunizar a un mamífero, como un ratón, una rata, un conejo, un conejillo de Indias, un mono o un ser humano, a fin de que produzca anticuerpos policlonales. Si se desea, uno de los péptidos de esta invención puede conjugarse a una proteína transportadora, como la albúmina de suero bovino, la tiroglobulina y la hemocianina de lapa califomiana. Según la especie hospedadora, pueden utilizarse diversos coadyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica. Algunos de estos coadyuvantes son, entre otros: er coadyuvante de Freund, geles minerales (p. ej., hidróxido de aluminio) y sustancias tensoactivas (p. ej., lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa califomiana y dinitrofenol). Entre los coadyuvantes empleados en humanos, resultan particularmente útiles el BCG (bacilo Calmette-Guérin) y Corynebacterium parvum. Los anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a un péptido de esta invención pueden prepararse por cualquier técnica que permita la producción de moléculas de anticuerpos mediante líneas celulares continuas en cultivos. Algunas de estas técnicas son, entre otras: la técnica del hibridoma, la técnica del hibridoma de células B humanas y la técnica del hibridoma del EBV (virus de Epstein-Barr) (Kohier y col., Nature 256:495-97, 1985; Kozbor y col., J. Immunol. Methods 81:3142, 1985; Cote y coi., Proc. Nati. Acad. Sci. 80:2026-30, 1983; Colé y col., Mol. Cell Biol. 62:109-20, 1984).

Además, pueden emplearse técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos", el corte de genes de anticuerpos de ratón y empalme a genes de anticuerpos humanos para obtener una molécula con especificidad antigénica y actividad biológica apropiadas (Morrison y col., Proc. Nati. Acad. Sci. 81 :6851-55, 1984; Neuberger y col., Nature 312:604-08, 1984; Takeda y col., Nature 314:452-54, 1985). Los anticuerpos monoclonales y otros pueden también "humanizarse" para impedir que un paciente genere una respuesta inmune frente al anticuerpo cuando se lo utiliza con fines terapéuticos. Dichos anticuerpos podrían tener secuencias lo suficientemente similares a las de los anticuerpos humanos como para ser administrados directamente en tratamientos, o bien requerir la modificación de unos cuantos residuos clave. Las diferencias entre las secuencias de anticuerpos de roedores y las secuencias humanas pueden reducirse a un mínimo reemplazando los residuos que difieren de los que están presentes en las secuencias humanas mediante mutagénesis dirigida de residuos individuales, o injertando (grafting) en su totalidad regiones determinantes de complementariedad. Como alternativa, pueden producirse anticuerpos humanizados utilizando métodos recombinantes (véase, p. ej., GB2188638B). Los anticuerpos que se unen específicamente a un péptido de esta invención pueden contener sitios de unión de antígenos que están humanizados parcial o totalmente, tal como se los divulga en la patente estadounidense 5.565.332. Como alternativa, los métodos descritos para la producción de anticuerpos de cadena simple pueden adaptarse utilizando métodos conocidos en la técnica para producir anticuerpos de cadena simple que se unen específicamente a uno de los péptidos de esta invención. Pueden generarse anticuerpos con especificidad relacionada, pero de composición idiotípica bien diferenciada, por intercambio de cadenas a partir de bibliotecas combinatorias y aleatorias de inmunoglobulinas (Burton, Proc. Nati. Acad. Sci. 88:11120-23, 1991). También pueden construirse anticuerpos de cadena simple mediante métodos de amplificación de ADN como la PCR, utilizando ADNc de hibridoma como plantilla (Thirion y col., Eur. J. Cáncer Prev. 5:507-11 , 1996). Los anticuerpos de cadena simple pueden ser mono- o biespecíficos, y ser bivalentes o tetravalentes. La construcción de anticuerpos tetravalentes biespecíficos de cadena simple se describe, por ejemplo, en Coloma y Morrison (Nat. Biotechnol. 15:159-63, 1997). La construcción de anticuerpos bivalentes biespecíficos de cadena sencilla se describe en Mallender y Voss (J. Biol. Chem. 269:199-206, 1994). Una secuencia nucleotídica codificante de un anticuerpo de cadena simple puede construirse mediante síntesis manual o automatizada de nucleótídos, clonarse en una construcción de expresión mediante métodos de ADN recombinante e introducirse en una célula para expresar la secuencia codificante, tal como se describe más adelante. Como alternativa, pueden producirse anticuerpos de cadena simple directamente, empleando, por ejemplo, tecnología de fagos filamentosos (Verhaar y col., Int. J. Cáncer 61 :497-501 , 1995; Nicholls y col., J. Immunol. Meth. 165:81-91 , 1993). También pueden producirse anticuerpos que se unen específicamente a uno de los péptidos de esta invención induciendo la producción in vivo en la población de linfocitos o pesquisando bibliotecas o paneles de inmunoglobulinas de reactivos de unión altamente específicos, tal como se divulga en la literatura (Orlandi y col., Proc. Nati. Acad. Sci. 86:38333-37, 1989; Winter y col., Nature 349:293-99, 1991).

Pueden construirse y utilizarse con fines terapéuticos otros tipos de anticuerpos en los métodos de la invención. Por ejemplo, pueden construirse anticuerpos quiméricos tal como se divulga en WO 93/03151. También pueden prepararse las proteínas de unión que se derivan de inmunoglobulinas y que son multivalentes y multiespecíficas, tales como los anticuerpos biespecíficos "diabodies" (véase, p. ej., WO 94/13804).

También pueden identificarse anticuerpos humanos con la capacidad de unirse a los péptidos de esta invención a partir de la biblioteca MorphoSys HuCAL®, de la manera siguiente. Uno de los péptidos de esta invención puede colocarse en una placa de microtitulación e incubarse con la biblioteca de fagos Fab MorphoSys HuCAL®. Los Fab conectados a fagos que no están unidos al péptido de la invención pueden eliminarse de la placa mediante lavado, lo cual deja sólo fagos que están fuertemente unidos al péptido de esta invención. El fago unido puede eluirse, por ejemplo, mediante cambios de pH o la adición de E. coli y luego amplificarse por infección de E. coli hospedadoras. Este proceso de cribado (panning) puede repetirse una o dos veces para enriquecer la población de anticuerpos que se unen fuertemente al péptido de esta invención. Los Fab del conjunto enriquecido posteriormente se expresan, purifican y examinan en un ensayo ELISA. Los anticuerpos descritos por la invención pueden ser purificados por métodos ampliamente conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden purificar por afinidad haciéndolos pasar sobre una columna a la cual se ha ligado uno de los péptidos de esta invención. Los anticuerpos unidos pueden posteriormente eluirse de la columna utilizando una solución tampón con alta concentración de sales. Métodos de uso A continuación se describen diversos términos tal como se los utiliza en este documento. Cuando introducen elementos de la presente invención o sus realizaciones, los artículos "un", "una", "el", "la", "dicho(s)" y "di.cha(s)" tienen la finalidad de significar que hay uno o varios de los elementos. Los términos "comprende(n)," "¡ncluye(n)" y "posee(n)" tienen la finalidad de ser inclusivos y significar que podría haber elementos adicionales además de los elementos enumerados. El término "sujeto" tal como se lo utiliza en este documento se refiere a mamíferos (p. ej., seres humanos y animales). El término "tratamiento" se refiere a cualquier proceso, acción, aplicación, terapia o semejantes en los que un sujeto, incluido un ser humano, recibe ayuda médica que tiene la finalidad de mejorar el estado del sujeto, de forma directa o indirecta, o retardar la evolución de una afección o trastorno en el sujeto.

El término "politerapia" o "coadministración" significa la administración de dos o más agentes terapéuticos. Dicha administración engloba la coadministración de dos o más compuestos terapéuticos en un modo esencialmente simultáneo, como por ejemplo en una única cápsula que tenga una proporción fija de principios activos o en varias cápsulas individuales de cada inhibidor. Además, dicha administración engloba el uso consecutivo de cada tipo de agente terapéutico. La frase "terapéuticamente eficaz" significa la cantidad de cada fármaco administrado que logrará el objetivo de mejorar la enfermedad, al tiempo que evita o reduce a un mínimo efectos secundarios adversos asociados con el tratamiento terapéutico determinado. El término "farmacéuticamente aceptable" significa que el artículo en cuestión es apropiado para ser utilizado en un producto farmacéutico. Los péptidos de la presente invención se pueden utilizar para reducir la respuesta inflamatoria sistémica que da lugar a una multitud de alteraciones homeostáticas tales como lesión de isquemia-reperfusión y aumento de la hemorragia. Estos péptidos se pueden utilizar también para reducir la hemorragia perioperatoria, por ejemplo, durante cirugías cardiovasculares (p. ej., en procedimientos de revascularización coronaria, sin circulación extracorpórea, valvulares, vasculares, de reducción de volumen pulmonar y Csx-Maze), intervenciones ortopédicas (p. ej., de columna vertebral, artroplastia y reparación de cadera, artroplastia de rodilla y resección de tumores), neurocirugía, cirugía reconstructiva (plástica) mayor y cirugías oncológicas. Los péptidos de la presente invención pueden utilizarse también en el tratamiento de traumatismos (incluida la disfunción multiorgánica y lesiones cerebrales), lesiones de isquemia-reperfusión (p. ej., accidente cerebrovascular, hemorragia intracerebral, infarto de miocardio, conservación de trasplante y ligamento cruzado anterior), cáncer (p. ej., supresión de metástasis y de tumores primarios), funciones de los cilios pulmonares (p. ej., asma, fibrosis quística, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y deficiencia de antitripsina) y procedimientos relacionados con el trasplante de órganos (p. ej., conservación de órganos de cadáver y cirugía de trasplante). Los péptidos de la presente invención puede utilizarse también en aplicaciones como adhesivos de fibrina (p. ej., los empleados durante punciones lumbares, tratamiento de heridas quirúrgicas y cirugía dental). Los péptidos de la presente invención se pueden utilizar por sí solos o en asociación con tratamientos y/o compuestos adicionales conocidos a las personas versadas en la técnica. Como alternativa, los métodos y los péptidos aquí descritos se pueden utilizar, de manera parcial o total, en politerapias. Dichas politerapias se pueden administrar en cualquier combinación de dos o más fármacos. Asimismo, dichas politerapias se pueden administrar en forma de composiciones farmacéuticas, tal como se las describe más arriba. A partir de ensayos ampliamente conocidos que se utilizan con objeto de determinar la eficacia para el tratamiento de afecciones identificadas anteriormente en mamíferos, y por comparación de estos resultados con los de medicamentos conocidos que se utilizan para tratar dichas afecciones, puede determinarse fácilmente la dosis eficaz de los péptidos de esta invención para el tratamiento de cada indicación deseada. La cantidad de principio activo (p. ej., péptidos) que debe administrarse en el tratamiento de una de estas afecciones puede variar ampliamente en función de consideraciones como el péptido particular y la dosis unitaria empleada, el modo de administración, el período de tratamiento, la edad y el sexo del paciente tratado y la naturaleza y el grado de la afección tratada. La cantidad total del principio activo a ser administrado puede variar en general de aproximadamente 0,0001 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg, o de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg de peso corporal al día. Una dosis unitaria puede contener de aproximadamente 0,05 mg a aproximadamente 1500 mg de principio activo, y puede ser administrada una o varias veces al día. La dosis diaria para administración por inyección, sea ésta por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea y parenteral, y el uso de técnica de infusión puede variar de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 200 mg/kg. El esquema posológico rectal diario puede variar de 0,01 a 200 mg/kg de peso corporal total. La concentración transdérmica puede ser la que se requiera para mantener una dosis diaria de 0,01 a 200 mg/kg. Por supuesto, el esquema posofógico específico inicial y continuado para cada paciente variará en función de la naturaleza y la gravedad de la afección según lo determine el médico que realiza el diagnóstico, la actividad del péptido concreto utilizado, la edad del paciente, la dieta del paciente, el tiempo de administración, la vía de administración, la velocidad de excreción del fármaco, las combinaciones farmacológicas y semejantes. El modo de tratamiento deseado y el número de dosis de uno de los péptidos de la presente invención pueden comprobarlos las personas versadas en la técnica utilizando análisis convencionales de tratamiento. Los péptidos de esta invención se pueden utilizar para lograr el efecto farmacológico deseado administrándolos a un paciente que los necesite en una composición farmacéutica formulada adecuadamente. Para los fines de esta invención, un paciente es un mamífero, incluidos los seres humanos, que necesita tratamiento para determinada afección o enfermedad. Por lo tanto, la presente invención incluye composiciones farmacéuticas compuestas de un vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido. Un vehículo farmacéuticamente aceptable es cualquier vehículo que sea relativamente no tóxico e inocuo para un paciente a concentraciones concordantes con la actividad eficaz del principio activo, de modo que los posibles efectos secundarios atribuibles al vehículo no interfieran adversamente en los efectos beneficiosos del principio activo. Una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido es la cantidad que produzca un resultado o ejerza una influencia en la afección particular que se está tratando. Los péptidos descritos en este documento pueden ser administrados con un vehículo farmacéuticamente aceptable utilizando cualquier unidad de forma farmacéutica convencional, incluidos, por ejemplo, preparados de liberación inmediata o controlada, orales, parenterales, tópicos o semejantes. Para la administración oral, los péptidos pueden formularse en preparados sólidos o líquidos tales como, por ejemplo, cápsulas, pastillas, comprimidos, trociscos, grageas, tabletas de disolución rápida, polvos, soluciones, suspensiones o emulsiones, y pueden prepararse según los métodos conocidos en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas. Las formas farmacéuticas unitarias sólidas pueden ser una cápsula, hecha de gelatina con cascara dura o blanda, que contenga, por ejemplo, surfactantes, lubricantes y rellenos inertes como lactosa, sacarosa, fosfato de calcio y almidón de maíz. Los péptidos de esta invención también se pueden administrar por vía parenteral, es decir, subcutánea, intravenosa, intramuscular o intraperitoneal, en forma de dosis inyectables del péptido en un diluyente fisiológicamente aceptable con un vehículo farmacéutico que puede ser un líquido o mezcla de líquidos estériles con o sin la adición de un surfactante o agente emulsionante farmacéuticamente aceptables u otros coadyuvantes farmacéuticos. Las composiciones parenterales de esta invención típicamente pueden contener de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 25 % en peso del principio activo en solución. También pueden utilizarse conservantes y soluciones tampón de manera ventajosa. Para reducir a un mínimo o eliminar la irritación en el lugar de la inyección, dichas composiciones pueden contener un surfactante no iónico que posea un equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB por sus iniciales en inglés) entre aproximadamente 12 y aproximadamente 17. La cantidad de surfactante presente en dicha formulación varía de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 15 % en peso. El surfactante puede ser un componente único que posea el HLB anterior o bien ser una mezcla de dos o más componentes que tengan el HLB deseado. Las composiciones farmacéuticas pueden ser suspensiones inyectables estériles. Dichas suspensiones pueden formularse según métodos conocidos utilizando agentes de dispersión o humectantes, así como agentes de suspensión. Una composición de la invención también se puede administrar en forma de supositorios para administración del fármaco por vía rectal. Estas composiciones se pueden preparar mezclando el fármaco (p. ej., el péptido) con un excipiente adecuado no irritante que sea sólido a temperaturas normales pero líquido a la temperatura rectal y que por lo tanto se derrita en el recto para liberar el fármaco. Son ejemplo de dichos materiales la manteca de cacao y el polietilenglicol. Otra formulación empleada en los métodos de la presente invención utiliza dispositivos de administración transdérmica ("parches"). Dichos dispositivos transdérmicos se pueden utilizar para proporcionar infusión continua o intermitente de los péptidos de la presente invención en cantidades controladas. La construcción y el uso de parches transdérmicos para administración de agentes farmacéuticos es ampliamente conocida en la técnica (véase, p. ej., la patente estadounidense n.° 5.023.252, incorporada aquí como referencia). Dichos parches pueden elaborarse para administración continua, pulsada o a demanda de agentes farmacéuticos. Podría ser deseable o necesario introducir la composición farmacéutica en el paciente mediante un dispositivo de administración mecánica. La elaboración y el uso de dispositivos mecánicos para administración de agentes farmacéuticos es ampliamente conocida en la técnica. Por ejemplo, los métodos- directos para administrar un fármaco directamente en el cerebro generalmente implican implantar una sonda o catéter de administración de fármacos en el sistema ventricular del paciente a fin de pasar por alto la barrera hematoencefálica. Uno de estos sistemas implantables de administración utilizado para el transporte de agentes a regiones anatómicas específicas del cuerpo se describe en la patente estadounidense 5.011.472, que se incorpora a este documento como referencia.

Las composiciones de la invención también pueden contener otros ingredientes de formulación farmacéuticamente aceptables, que generalmente reciben el nombre de vehículos o diluyentes, según sea necesario o deseable. Cualquiera de las composiciones de esta invención puede conservarse agregándole un antioxidante como el ácido ascórbico o con otros conservantes adecuados. Pueden utilizarse procedimientos convencionales para preparar dichas composiciones en formas farmacéuticas adecuadas. Los péptidos descritos en este documento se pueden administrar como único agente farmacéutico o en politerapia con uno o varios otros agentes farmacéuticos, en donde la combinación no produce ningún efecto adverso' inaceptable. Los péptidos descritos en este documento también pueden ser utilizados en composiciones, en investigaciones y para fines diagnósticos, o como patrones de referencia analítica, y semejantes. Por lo tanto, la presente invención incluye composiciones que comprenden un vehículo inerte y una cantidad eficaz de un péptido identificado por los métodos descritos en este documento, o una sal o éster del mismo. Un vehículo inerte es cualquier material que no interactúa con el péptido al que va a transportar y que brinda apoyo, medio de transmisión, volumen, material rastreable y semejantes al péptido que transporta. Una cantidad eficaz del péptido es la cantidad que produzca un resultado o ejerza una influencia en el procedimiento particular que se está realizando. Se sabe que los péptidos sufren hidrólisis, desamidación, oxidación, racemización e isomerización en medios acuosos y no acuosos. La degradación como la hidrólisis, la desamidación o la oxidación pueden detectarse fácilmente por electroforesis capilar. Aparte de la degradación enzimática, los péptidos que poseen una larga semivida plasmática o tiempo en el residente biológico deben, por lo menos, ser estables en solución acuosa. Es esencial que el péptido presente una degradación menor del 10 % a lo largo de un período de un día a temperatura corporal. Es todavía más preferible que el péptido presente una degradación menor del 5 % a lo largo de un período de un día a temperatura corporal. La estabilidad (es decir, menos de un pequeño porcentaje de degradación) a lo largo de un período de semanas a la temperatura corporal permitirá una administración menos frecuente. La estabilidad en una magnitud de años a temperaturas de refrigeración permitirá al fabricante presentar una formulación líquida, evitando de esta forma la incomodidad de la reconstitución. Además, la estabilidad en un solvente orgánico permitiría formular el péptido en novedosas formas farmacéuticas tales como implantes. Pueden prepararse formulaciones adecuadas para administración por vía subcutánea, intravenosa, intramuscular y semejantes; vehículos farmacéuticos adecuados; y procedimientos para la formulación y administración por cualquiera de los métodos ampliamente conocidos en la técnica (véase, p. ej., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 20.a edición, 2000).

Los siguientes ejemplos se presentan a fin de ilustrar la invención descrita en este documento, pero no deben ser interpretados de ninguna forma como limitantes del alcance de la invención. EJEMPLOS Para que pueda comprenderse mejor esta invención, se exponen los siguientes ejemplos. Estos ejemplos tienen la finalidad de servir como ilustración únicamente, y no deben ser interpretados como limitantes del alcance de la invención. Todas las publicaciones mencionadas en este documento se incorporan en su totalidad como referencia. Ejemplo 1. Producción y replegamiento de la aprotinina La aprotinina puede producirse por expresión en E. coli, levaduras, células de insecto o mamífero, o en plantas transgénicas, utilizando métodos conocidos a las personas versadas en la técnica (p. ej., Staley, Proc. Nati. Acad. Sci. 89:1519- 1523, 1992; Azzoni, Biotechnol. Bioeng. 80:268-276, 2002; Auerswald, Biol. Chem., Hoppe-Seyler 368:1413-1425, 1987) o bien prepararse por síntesis peptídica en fase sólida (p. ej., Ferrer, int. J. Pept. Protein Res. 40:194-207, 1992). Si se expresa en la forma de disulfuro reducido, la aprotinina puede replegarse utilizando métodos conocidos a las personas versadas en la técnica (p. ej., Ferrer, 1992; Staley, 1992; Azzoni, 2002).

Para ia expresión en E. coli, se prepara un vector de expresión ligando un gen sintético codificante de la secuencia SEQ ID NO: 15 que emplea codones elegidos para uso óptimo de E. coli en pET-3A o cualquier otro vector de expresión de E. coli adecuado. El plásmido se transforma en la cepa de E. coli BL21 (DE3) pLysS y la expresión se induce con IPTG. Las células se cosechan por centrifugación y se lisan con ultrasonido. La fracción insoluble del lisado celular se vuelve a suspender en urea 8 M y se dializa con ácido acético 10 %. Seguidamente se purifica la variante de la aprotinina mediante HPLC C-is de fase inversa. La variante de la aprotinina se somete a replegamiento en una solución amortiguadora de oxidorreducción que contiene glutationa reducida y oxidada, luego se purifica mediante HPLC C?8 de fase inversa. Las variantes de la aprotinina se producen también mediante síntesis peptídica en fase sólida. Los péptidos se elaboran con un sintetizador de péptidos 433A de Applied Biosystems utilizando reacciones químicas de Fmoc o Boc con activación HBTU en resina de amida Wang Rink o cualquier otra resina adecuada. Los péptidos se escinden con TFA al 84,6 %, fenol al 4,4 %, agua al 4,4 %, tioanisol al 4,4 % y etanodiol al 2,2%; posteriormente se precipitan los péptídos de la mezcla de escisión utilizando éter ter-butilmetílico frío. El precipitado se lava con éter frío y se seca bajo argón. Los péptidos se purifican por HPLC Cía de fase inversa con gradientes lineales de agua/acetonitrilo que contienen TFA al 0,1 %. Las variantes de la aprotinina se repliegan posteriormente utilizando métodos conocidos a las personas versadas en la técnica (p. ej., Ferrer, Int. J. Pept. Protein Res. 40:194-207, 1992; Staley, 1992; Azzoni, 2002). Ejemplo 2. PEGilación de las variantes de la aprotinina Los derivados de PEG se preparan incubando glicoles de metoxipolietileno derivatizados con maleimida para su acoplamiento con el grupo mercapto del grupo modificador N-terminal. Pueden emplearse productos mPEG-MAL o mPEG2-MAL suministrados por Nektar Therapeutics (Huntsville, Al, EE. UU.) o productos GLE-200MA o GLE-400MA suministrados por NOF (Tokio, Japón). Las reacciones de acoplamiento se realizan incubando la aprotinina y un exceso molar del doble de maleimida-PEG en Tris 50 mM, pH 7 a temperatura ambiente durante 2-12 horas. La concentración preferida de aprotinina es 1 mg/ml o menos. Las variantes no derivatizadas de la aprotinina y el PEG se separan de la variante PEGilada de la aprotinina por cromatografía de intercambio iónico y diálisis o por HPCL C?8 en fase inversa. Ejemplo 3. Determinación de la actividad inhibitoria de la proteasa in vitro La inhibición de proteasas como la tripsina, la kalikreína plasmática y la plasmina por parte de las variantes de la aprotinina divulgadas en este documento puede examinarse mediante ensayos espectroscópicos conocidos a las personas versadas en la técnica. En el caso de ia inhibición de la kalikreína, se diluye 1 unidad de proteasa en 16 ml de Tris 50 mM, NaCI 0,1 M y Tween 20 al 0,05 %, pH 8,2. Esta solución enzimática (200 µ\) se mezcla con volúmenes cada vez menores de solución amortiguadora de prueba (p. ej., 250, 240, 230, 220, 200, 180, 170, 150, 100 y 50 µ\) mientras se agregan cantidades cada vez mayores de inhibidor (p. ej., 10, 20, 30, 50, 70, 80, 100, 150, 200 y 250 µ\ a 0,7 mg/ml). Las soluciones de kalikreína/inhibidor se incuban a temperatura ambiente durante 4 horas. Se agrega una alícuota (180 µl) de cada solución a 20 µl de solución de sustrato, y se monitorea la reacción en función del cambio de absorción. Algunos sustratos adecuados son: S-2302 para la kalikreína; Chromozym PL para la plasmina; HD- Pro-Phe-Arg-pNA para el factor XI, S-2444 para la tripsina, y Suc-Phe-Leu-Phe- pNA para la quimotripsina. Ejemplo 4. Determinación de las propiedades farmacocinéticas de las variantes de la aprotinina Pueden determinarse las concentraciones plasmáticas de las variantes de la aprotinina de la presente invención en modelos de animales como ratones, ratas, perros y monos, después de la infusión IV de la variante de la aprotinina. Las concentraciones de las variantes de la aprotinina se determinan utilizando un método ELISA tipo sandwich que captura los anticuerpos frente a la aprotinina (producidos tal como se describe en el ejemplo 6) y un anticuerpo indicador frente al PEG (p. ej., AGP3 de Académica Sinica). También pueden determinarse las concentraciones de la variante de la aprotinina en plasma utilizando variantes radiomarcadas de la aprotinina (p. ej., Shin, Pharm. Pharmcol. Commun. 4:257-260, 1998). Ejemplo 5. Determinación de los efectos in vivo de las variantes de la aprotinina en animales Los efectos de las variantes de la aprotinina en la pérdida de sangre se determinan después de la transección de las colas de ratas anestesiadas. Las ratas son tratadas con Plavix (3 mg/kg). Dos horas más tarde, se anestesia a las ratas con pentobarbital (80 mg/kg, i.p.) y se las trata con aprotinina (10 mg/kg, i.v.). Diez minutos más tarde, se extirpan los 2 mm dístales de la cola y se colocan en solución salina, y se mide el tiempo hasta la interrupción del sangrado. La aprotinina y sus variantes activas acortan el tiempo de sangrado del grupo tratado con Plavix. Ejemplo 6. Producción de anticuerpos frente a la aprotinina La síntesis de péptidos derivados de la secuencia de la aprotinina con un residuo Cys N- o C-terminal se realizan tal como se describe en el ejemplo 1. La identidad del péptido se confirma mediante espectrometría de masas MALDI utilizando un espectrómetro de masas Voyager DE Pro MALDI de PerSeptive Biosystems. El residuo de cisteína se acopla a KLH mediante el kit y protocolo Pierce Imject Maleimide Activated mcKLH (Pierce, Rockford, IL). Se inmunizan los conejos y se aislan los anticuerpos mediante procedimientos conocidos a las personas versadas en la técnica. Los anticuerpos producidos en conejos frente al péptido de aprotinina se confirman mediante un ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) utilizando métodos conocidos a las personas versadas en la técnica.

Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la antedicha especificación se incorporan en este documento como referencia. Las diversas modificaciones y variaciones de las composiciones y métodos de la invención que se describen resultarán evidentes a las personas versadas en la técnica, sin alejarse del alcance y el espíritu de la invención. Aunque la invención se ha descrito en relación con realizaciones concretas, debe sobreentenderse que la invención tal como se la reivindica no debe limitarse indebidamente a dichas realizaciones concretas. De hecho, diversas modificaciones de las maneras antedichas de llevar a cabo la invención que son evidentes a las personas versadas en el campo de la biología molecular y áreas afines tienen la finalidad de estar dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones. Las personas versadas en la técnica reconocerán, o estarán en capacidad de comprobar limitándose a aplicar métodos habituales de experimentación, muchos equivalentes de las realizaciones concretas de la invención descrita en este documento. Se pretende que dichos equivalentes estén englobados por las siguientes reivindicaciones.

TABLA 1 TABLA 2

Claims (1)

1. Reivindicaciones Se reivindica lo siguiente: 1 . Un péptido seleccionado del grupo integrado por SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, y fragmentos, derivados y variantes funcionalmente equivalentes de éstos. 2. El péptido de la reivindicación 1 , en donde el péptido está PEGilado. 3. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de uno de los péptidos de la reivindicación 1 ó 2 administrada en conjunción con un vehículo farmacéuticamente aceptable. 4. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de uno de los péptidos de la reivindicación 1 ó 2 administrada en conjunción con un vehículo farmacéuticamente aceptable y uno o más productos farmacéuticos. 5. Un método para reducir la hemorragia perioperatoria que comprende el paso de administrar, a un sujeto que la requiera, una cantidad terapéuticamente eficaz de uno de los péptidos de la reivindicación 1 o la reivindicación 2. 6. El método de la reivindicación 5, en donde el péptido se administra para reducir la hemorragia perioperatoria durante cirugía cardiovascular, cirugía ortopédica, neurocirugía, cirugía reconstructiva o cirugía oncológica. Un método para reducir la respuesta inflamatoria sistémica que comprende el paso de administrar, a un sujeto que la requiera, una cantidad terapéuticamente eficaz de uno de los péptidos de la reivindicación 1 o la reivindicación 2. 8. Un método para el tratamiento de lesión de isquemia-reperfusión que comprende el paso de administrar, a un sujeto que la requiera, una cantidad terapéuticamente eficaz de uno de los péptidos de la reivindicación 1 o la reivindicación 2. 5 9. Un método para el tratamiento del cáncer que comprende el paso de administrar, a un sujeto que la requiera, una cantidad terapéuticamente eficaz de uno de los péptidos de la reivindicación 1 o la reivindicación 2. o 10. Un método para el tratamiento de accidente cerebrovascular o hemorragia intracerebral que comprende el paso de administrar, a un sujeto que la requiera, una cantidad terapéuticamente eficaz de uno de los péptidos de la reivindicación 1 o la reivindicación 2. 15 11. Un método para el tratamiento de infarto de miocardio que comprende el paso de administrar, a un sujeto que la requiera, una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido de la reivindicación 1 o la reivindicación 2. 20 12. Un método para el tratamiento de asma, fibrosis quística y enfermedad pulmonar obstructiva crónica que comprende el paso de administrar, a un sujeto que la requiera, una cantidad terapéuticamente eficaz de uno de los péptidos de la reivindicación 1 o la reivindicación 2. 25 13. Un adhesivo de fibrina que comprende un péptido de la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 14. Un polinucleótido codificante de uno de los péptidos de la reivindicación 1 , o una variante redundante del mismo. J o 15. Un vector que comprende uno de los polinucleótidos de la reivindicación 14. 16. Una célula hospedadora que comprende uno de los vectores de la reivindicación 15. 17. Un método para producir un péptido, que comprende: a) cultivo de la célula hospedadora de la reivindicación 16 en condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido; y b) recuperación del polipéptido del cultivo de la célula hospedadora. 18. Un anticuerpo purificado que se une específicamente al polipéptido de la reivindicación 1 . 19. Péptidos según la reivindicación 1 para reducir la hemorragia perioperatoria. 20. Medicamento que contenga al menos uno de los péptidos según la reivindicación 1 con al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptables y farmacéuticamente inocuos. 21 . Uso de péptidos según la reivindicación 1 para elaborar un medicamento capaz de reducir la hemorragia perioperatoria. 22. Medicamentos según la reivindicación 20 para reducir la hemorragia perioperatoria.