CN101012282B - 一种人工转录因子及其促进外源基因在cho细胞中的高效表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种编码人工转录因子的核苷酸序列、氨基酸序列及该人工转录因子促进外源基因在CHO细胞中的高效表达方法。涉及人工转录因子的构建、表达、具有不同数量的人工转录因子结合序列的外源基因表达载体的构建、及用表达人工转录因子和外源基因的载体共转染CHO细胞，EGFP和tPA在含不同数量人工转录因子结合位点表达载体pcDNA3.1(+)转染的CHO细胞中的表达水平呈现不同程度的提高。其中，以引入10个人工转录因子结合位点的表达载体的效果最明显，EGFP的混合克隆的表达效率提高2-3倍、t-PA的单克隆表达效率提高2-5倍。结果表明，人工转录因子能有效地促进外源基因在哺乳动物细胞中的表达。

Description

一种人工转录因子及其促进外源基因在CHO细胞中的高效表达方法

技术领域

本发明涉及一种人工转录因子及其促进外源基因在CHO细胞中的高效表达方法，更具体地说是一种编码人工转录因子的核苷酸序列、氨基酸序列及该人工转录因子促进外源基因在CHO细胞中的高效表达方法，是通过分子生物学手段构建一种自然界不存在，文献未曾报道的人工转录因子的核苷酸序列、氨基酸序列，以及用这种人工转录因子促进外源基因在CHO细胞中的高效表达方法，为在CHO细胞中大规模生产治疗性蛋白提供一种技术方法，属于基因工程和细胞工程领域。

背景技术

CHO表达系统是外源真核基因的最佳表达系统之一，在生物制药中被广泛应用。但是，其表达量仍不能满足需要一直是该表达系统的应用瓶颈，特别是临床使用剂量达到数十至数百毫克级乃至克级水平的生物工程药物的应用，提高表达量就成了至关重要的问题。影响外源蛋白在CHO细胞中的表达因素包括：外源基因在染色体上的整合位置、转录效率、mRNA的加工、mRNA的稳定性及翻译效率、目的基因的拷贝数、目的蛋白的折叠效率及稳定性，代谢工程改造细胞以利于细胞的大规模高密度培养等。

在基因结构、表达调控元件已经确定的情况下，外源基因在CHO细胞中的高效表达，很大程度上取决于表达载体整合在CHO细胞基因组的位置和拷贝数。外源基因整合在CHO细胞基因组转录活跃区，能够增加外源基因的转录水平，在该位置基因启动子能够招募更多的转录因子促使外源基因有更强的转录，导致外源基因有较高的表达。但是外源基因整合到基因组转录活跃区的几率很低，细胞内源性转录因子数量也是有限的，它不足以使外源基因的启动子招募到足够的转录因子，所以人为增加细胞的转录因子，并使它结合到外源基因的上游，对增加外源基因的转录是有利的，从而提高外源基因的表达量，但又不影响细胞的生长代谢，构建结合特异序列的人工转录因子将是一种较好的选择。

发明内容

本发明的目的是提供一种编码人工转录因子的核苷酸序列。

本发明的另一个目的是提供这种人工转录因子的氨基酸序列。

本发明的第三个目的是提供人工转录因子促进外源基因在CHO细胞中的高效表达方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种人工转录因子，具有序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

一种编码具有序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的人工转录因子的核苷酸序列。例如，具有序列表SEQ ID No.2所示的碱基序列。根据本领域的公知常识，不同的核苷酸序列可能编码相同的氨基酸序列，因此，所有能够表达序列表SEQ IDNo.1所示氨基酸序列的编码核苷酸序列均属于对本发明的等同替换。

一种人工转录因子促进外源基因在CHO细胞及其它动物细胞中的高效表达方法，在CHO细胞及其它动物细胞中表达具有序列表SEQ ID No.2所示氨基酸序列的人工转录因子。

所述细胞包括但不限于293细胞和BHK细胞，该人工转录因子在动物细胞中具有通用性。

一种人工转录因子促进外源基因在CHO细胞中的高效表达方法，该方法包括如下步骤：

(1)构建编码人工转录因子的核苷酸序列：以酵母转录因子GAL4中1-147位氨基酸序列为构建人工转录因子的DNA结合结构域，单纯疱疹病毒转录激活子VP16中12肽(DALDDFDLDMLG)的4个串联重复作为人工转录因子的功能结构域，用SV40的核定位序列(NLS)将两部分连接起来，构建了人工转录因子GVP4；

(2)构建具有人工转录因子结合位点的载体：将5个、10个、20个不同长度的人工转录因子结合序列构建在外源基因表达载体pcDNA3.1(+)启动子CMV的上游；

(3)构建表达人工转录因子、表达EGFP、表达t-PA的载体：将人工转录因子GVP4克隆进入表达载体pCDNA3.1/Hygro(+)中，EGFP和tPA连入在含不同数量人工转录因子结合位点表达载体pcDNA3.1(+)中；

(4)表达人工转录因子的载体与表达EGFP、表达t-PA的载体的共转染：将表达人工转录因子的载体与表达EGFP、表达t-PA的载体按等摩尔比共转染，用抗生素加压筛选后分别测定EGFP和t-PA的表达。

所述人工转录因子DNA结合结构域的克隆采用PCR的方法从质粒pBind(Premega产品)上扩增GAL4(1-147位氨基酸序列)，人工转录因子的功能结构域采用人工合成方法，分别设计四条引物合成。

所述人工转录因子结合位点序列从质粒PG5luc(Promega产品)上扩增人工转录因子结合位点序列。

本发明构建的人工转录因子是一种基于酵母转录因子GAL4中1-147位氨基酸序列为构建人工转录因子的DNA结合结构域，单纯疱疹病毒转录激活子VP16中12肽(DALDDFDLDMLG)的4个串联重复作为人工转录因子的功能结构域的人工转录因子，是一种未见文献报道的序列。将不同长度的人工转录因子结合序列构建在外源基因表达载体pcDNA3.1(+)启动子CMV的上游，分别连接外源基因EGFP和tPA。用表达人工转录因子和外源基因的载体共转染CHO细胞，EGFP和tPA在含不同数量人工转录因子结合位点表达载体pcDNA3.1(+)转染的CHO细胞中的表达水平呈现不同程度的提高。其中，以引入10个人工转录因子结合位点的表达载体的效果最明显，EGFP的混合克隆的表达效率提高2-3倍、t-PA的单克隆表达效率提高2-5倍。

本发明的方法使用了自行构建的表达载体，并且通过实验初步得到了该表达载体的表达水平数据。该表达载体的构建过程使用的质粒的来源均为商业途径，构建过程的操作为分子生物学领域常规操作，本领域的普通技术人员在本发明的启示之下能够不花费创造性劳动而得到具有相同功能的表达载体。对于该表达载体，我们并没有进行大规模的筛选，因为本发明的目的并非提供具有极高表达促进作用的质粒，而是提供一种从来没有存在过的可促进表达量增加的人工转录因子及其应用。理论上，对于CHO细胞和其他动物细胞，本发明提供的人工转录因子都能够增强其表达能力。而且，如果给予足够长的时间，进行大规模筛选，则能够得到表达效果更加优异的表达载体。无论是何种表达载体，如果含有了本发明所述的人工转录因子的编码序列或者与本发明人工转录因子编码序列同源性高的替换序列，均属于本发明的保护范围。

本发明的优点是：(1)本发明是通过分子生物学手段得到的自然界中不存在、未见文献报道的人工转录因子。(2)所得到的人工转录因子能够促进外源基因在CHO细胞中的高效表达。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为表达人工转录因子的载体结构和酶切鉴定图。

图2为表达EGFP和t-PA的载体结构图。

图3为人工转录因子对转染不同结合位点载体的细胞流式分析图。

图4为人工转录因子对具有不同结合位点数量载体表达EGFP的影响。

图5为人工转图录因子对含10个结合位点载体表达t-PA的影响。

具体实施方式

实施例1、构建编码人工转录因子的核苷酸序列

设计两条引物GAL1、GAL2，为了方便克隆，引物1的5’端设计了EcoRI和NheI酶切位点，并设计了KOZAKA序列GCC GCC ACC ATG，引物2的5’端设计了KpnI酶切位点，为了使人工转录因子能够进入细胞核内发挥功能，在引物2中设计了核定位序列：ATC TAC CTT TCT CTT CTT TTT TGG。用这两条引物从质粒pBind(Premega公司产品)上扩增GAL4序列。用TAKARA高保真的Pybest酶，回收约450bp的片段。通过EcoRI和KpnI连接进PUC19载体(TAKARA公司产品)，测序正确后命名为GAL4/PUC19用于以下实验。

GAL1：5-ATA GAA TTC GCT AGC GCC GCC ACC ATG AAG CTA ATG TCT TCTATC GAA C-3

GAL2：5-ATA GGT ACC ATC TAC CTT TCT CTT CTT TTT TGG CGA TAC AGTCAA CTG TCT TTG-3

本发明采用12肽(DALDDFDLDMLG)的四个串联重复作为人工转录因子激活功能结构域，设计4条引物VP1、VP2、VP3、VP4，用作人工合成4个串联重复的12肽。4个串联重复的12肽序列具有较强的激活效果。

VP1：5-CGA CGC GCT AGA CGA TTT CGA TCT GGA CAT GTT GGG GGA CGCGCT AGA CGA TTT CGA TCT GGA CAT GTT GGG GG-3

VP2：5-GAT CCC CCC AAC ATG TCC AGA TCG AAA TCG TCT AGC GCG TCCCCC AAC ATG TCC AGA TCG AAA TCG TCT AGC GCG TCG GTA C-3

VP3：5-GAT CC GAC GCG CTA GAC GAT TTC GAT CTG GAC ATG TTG GGGGAC GCG CTA GAC GAT TTC GAT CTG GAC ATG TTG GGG TAG A-3

VP4：5-AGC TT CTA CCC CAA CAT GTC CAG ATC GAA ATC ATC GTC TAG CGCGTC CCC CAA CAT GTC CAG ATC GAA ATC GTC TAG CGC GTC G-3

用50μl 1×PCR反应缓冲液(pybest buffer TAKARA产品)将VP1与VP2各50pmol溶于0.5ml离心管中，置于一个盛满沸水的烧杯中，使烧杯中的沸水在室温中自然冷却，使寡核苷酸退火成双链，两末端分别形成BamHI和KpnI酶切位点；用BamHI和KpnI酶切处理GAL4/PUC19回收后与VP1、VP2形成的Linker连接，测序正确命名为GVP2/PUC19。VP3、VP4同样处理后，与用BamHI、HindIII酶切GVP2/PUC19后的载体连接，测序正确命名为GVP4/PUC19。

实施例2、具有人工转录因子结合位点的载体构建

1.在pCDNA3.1(+)(Invitrogen公司产品)上连入多克隆位点

为了方便在pCDNA3.1(+)的CMV启动子前连入调控序列，将AgeI、AscI、BstBI、ClaI、HpaI、NarI、NsiI和PacI酶切位点的序列连入，合成引物MSC1、MSC2和MSC3；利用PCR的方法，第一轮扩增以MSC1和MSC3为引物，pCDNA3.1(+)为模板，扩增产物回收，用作第二轮PCR的模板，第二轮PCR的产物回收用NruI和NheI酶切，与用同样酶切的pCDNA3.1(+)连接。测序结果表明在pCDNA3.1(+)的NruI处连入了AgeI、AscI、BstBI、ClaI、HpaI、NarI、NsiI和PacI酶切位点的序列，正确质粒命名为pCDNA3.1(+)/MCS。

MCS1：5-AAT TAA TTC GAA ACC GGT ATG CAT GTT AAC CGA TGT ACG GGCCAG ATA TAC G-3

MCS2：5-CGA GGC GCG CCT AGG GGC CAT CGA TTT AAT TAA TTC GAA ACCGGT ATG CAT G-3

MCS3：5-AAC GCT AGC CAG CTT GGG TCT C-3

2.人工转录因子结合位点的克隆

为了方便克隆，引物UASPacI、UASAgeI1、UASAgeII、UASHpaI 5’端分别设计了PacI、AgeI、HpaI酶切位点，用这四条引物分别从质粒PG5luc(Promega产品)上扩增人工转录因子结合位点序列，含5个GaL4结合位点。用TAKARA高保真的Pybest酶扩增，回收约150bp的片段。通过PacI、AgeI连接进pCDNA3.1(+)/MCS载体，测序正确后命名为pCDNA3.1(+)/UAS，通过AgeI、HpaI连接进pCDNA3.1(+)/UAS，测序正确后命名为pCDNA3.1(+)/2UAS。

用PacI、HpaI酶切pCDNA3.1(+)/2UAS，回收300bp左右的片段，补平回收，载体pCDNA3.1(+)/2UAS用AscI、PacI酶切补平回收，与300bp左右的片段连接，质粒鉴定正确后命名为pCDNA3.1(+)/4UAS，至此含5个、10个、20个GaL4结合位点的载体构建成功。

UASPacI1：5-GCG TTA ATT AAG AGT TTC TAG ACG GAG TAC TG-3

UASAgeI1：5-ATA ACC GGT TAG CCC CCC GCT AGC GTC TTC-3

UASAgeII：5-ATA ACC GGT GAG TTT CTA GAC GGA GTA CTG-3

UASHpaI：5-ATA GTT AAC TAG CCC CCC GCT AGC GTC TTC-3

实施例3、表达载体的构建

1.表达人工转录因子载体的构建

将实施例1中构建的载体GVP4/PUC19用NheI、HindIII酶切，回收600bp左右的片段GVP4，同样用NheI、HindIII酶切载体pCDNA3.1/Hygro(Invitrogen公司产品)回收载体与GVP4连接。连接正确的命名为pCDNA3.1/Hy/GVP4。

2.表达EGFP载体的构建

用NheI和BclI酶切pEGFP-C1(Clontech公司产品)，Kelnow补平，回收约800bp的片段。pCDNA3.1(+)、pCDNA3.1(+)/1UAS、pCDNA3.1(+)/2UAS、pCDNA3.1(+)/4UAS用EcoRV酶切、脱磷(按NEB公司CIP酶使用说明书进行操作)；回收载体与800bp的EGFP连接，连接正确的载体命名为pCDNA3.1(+)/0UAS/EGFP、pCDNA3.1(+)/1UAS/EGFP、pCDNA3.1(+)/2UAS/EGFP、pCDNA3.1(+)/4UAS/EGFP。

3.表达t-PA载体的构建

用NheI和BamHI酶切pCDNA/FRT/tPA(本实验室构建)，回收约1700bp的tPA片段。pCDNA3.1(+)/2UAS、同样用NheI和BamHI酶切回收载体与1700bp的tPA片段连接，连接正确的载体命名为pCDNA3.1(+)/2UAS/tPA。

实施例4、人工转录因子对EGFP表达的影响

将载体pCDNA3.1/Hy/GVP4分别与pCDNA3.1(+)/0UAS/EGFP、pCDNA3.1(+)/1UAS/EGFP、pCDNA3.1(+)/2UAS/EGFP和pCDNA3.1(+)/4UAS/EGFP共转染的CHO-K1细胞(美国ATCC)，将阳性细胞收集起来，用流式细胞仪测定EGFP荧光强度，结果如图3所示。与没有人工转录因子结合位点的实验对照即pCDNA3.1(+)/0UAS/EGFP的载体比较，人工转录因子促进EGFP的表达增加2-3倍(如图4)。含不同人工转录因子结合位点数量的载体外源基因表达的促进效果不同。其中，含5个和20个结合位点的载体源基因表达的促进效果基本相同，平均荧光强度分别为955、911单位；10个结合位点的载体源基因表达的促进效果最明显，平均荧光强度为1168单位，且高强度荧光的细胞数相对较高(M4部分占30％)。

实施例5、人工转录因子对t-PA表达的影响

根据人工转录因子对EGFP表达的影响，初步选定载体pCDNA3.1(+)/2UAS为人工转录因子GVP4促进外源基因表达的优选载体。为了进一步验证该载体在GVP4作用下的外源基因表达促进作用，选用t-PA作为报告基因，将载体分别与pCDNA3.1/Hy/GVP4与pCDNA3.1(+)/0UAS/tPA、pCDNA3.1(+)/2UAS/tPA共转染的CHO-K1细胞(美国ATCC)，用含抗生素G418(浓度0.6mg/ml)和潮霉素(浓度0.4mg/ml)的DF培养基，三到四天换一次液，将抗生素筛选得到的阳性细胞，用有限稀释法在96孔板中按每孔2个细胞单克隆化，两周后，测定单克隆细胞活性，将活性较高的单克隆细胞在24孔中扩大培养，长满后移至T100方瓶中，用DF培养基在37℃培养，待细胞长满后，测定24小时每100万细胞表达t-PA的活性单位。结果如图5所示，与对照载体比较，人工转录因子对t-PA表达增加了2-5倍。

综上所述，本发明提供的四聚体人工转录因子能够促进外源基因在CHO细胞中的高效表达。该氨基酸序列和编码该氨基酸序列的核苷酸序列具有突出的实质性特点和显著的技术进步，并且能够在产业上得以应用。

                               序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院

<120>一种人工转录因子及其促进外源基因在CHO细胞中的高效表达方法

<130>

<160>15

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>624

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

atgaagctac tgtcttctat cgaacaagca tgcgatattt gccgacttaa aaagctcaag     60

tgctccaaag aaaaaccgaa gtgcgccaag tgtctgaaga acaactggga gtgtcgctac    120

tctcccaaaa ccaaaaggtc tccgctgact agggcacatc tgacagaagt ggaatcaagg    180

ctagaaagac tggaacagct atttctactg atttttcctc gagaagacct tgacatgatt    240

ttgaaaatgg attctttaca ggatataaaa gcattgttaa caggattatt tgtacaagat    300

aatgtgaata aagatgccgt cacagataga ttggcttcag tggagactga tatgcctcta    360

acattgagac agcatagaat aagtgcgaca tcatcatcgg aagagagtag taacaaaggt    420

caaagacagt tgactgtatc gccaaaaaag aagagaaagg tagatggtac cgacgcgcta    480

gacgatttcg atctggacat gttgggggac gcgctagacg atttcgatct ggacatgttg    540

gggggatccg acgcgctaga cgatttcgat ctggacatgt tgggggacgc gctagacgat    600

ttcgatctgg acatgttggg gtag                                           624

<210>2

<211>207

<212>PRT

<213>人工合成

<400>2

Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu

                  5                  10                   15

Lys Lys Leu Lys Cys  Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu

             20                   25                  30

Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro

         35                  40                  45

Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu

     50                  55                  60

Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile

65                   70                  75                  80

Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu

                 85                  90                   95

Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala

             100                  105              110

Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser

        115                 120                 125

Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu

    130                 135                 140

Thr Val Ser Pre Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Gly Thr Asp Ala Leu

145                 150                 155                  160

Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp

                165                  170                 175

Leu Asp Met Leu Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp

            180                 185                  190

Met Leu Gly Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly

          195           200                     205

<210>3

<211>49

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

atagaattcg ctagcgccgc caccatgaag ctaatgtctt ctatcgaac                49

<210>4

<211>54

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

ataggtacca tctacctttc tcttcttttt tggcgataca gtcaactgtc tttg          54

<210>5

<211>74

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

cgacgcgcta gacgatttcg atctggacat gttgggggac gcgctagacg atttcgatct    60

ggacatgttg gggg                                                      74

<210>6

<211>82

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

gatcccccca acatgtccag atcgaaatcg tctagcgcgt cccccaacat gtccagatcg    60

aaatcgtcta gcgcgtcggt ac                                             82

<210>7

<211>81

<212>DNA

<213>人工合成

<400>7

gatccgacgc gctagacgat ttcgatctgg acatgttggg ggacgcgcta gacgatttcg    60

atctggacat gttggggtag a                                              81

<210>8

<211>84

<212>DNA

<213>人工合成

<400>8

agcttctacc ccaacatgtc cagatcgaaa tcatcgtcta gcgcgtcccc caacatgtcc    60

agatcgaaat cgtctagcgc gtcg                                           84

<210>9

<211>52

<212>DNA

<213>人工合成

<400>9

aattaattcg aaaccggtat gcatgttaac cgatgtacgg gccagatata cg    52

<210>10

<211>52

<212>DNA

<213>人工合成

<400>10

cgaggcgcgc ctaggggcca tcgatttaat taattcgaaa ccggtatgca tg    52

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<400>11

aacgctagcc agcttgggtc tc                                     22

<210>12

<211>32

<212>DNA

<213>人工合成

<400>12

gcgttaatta agagtttcta gacggagtac tg                32

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<400>13

ataaccggtt agccccccgc tagcgtcttc                   30

<210>14

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<400>14

ataaccggtg agtttctaga cggagtactg                   30

<210>15

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<400>15

atagttaact agccccccgc tagcgtcttc                     30

Claims (4)

1.一种人工转录因子，它的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

2.一种编码氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示的人工转录因子的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的一种编码人工转录因子的核苷酸序列，它的碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示。

4.一种人工转录因子促进外源基因在CHO细胞、293细胞或BHK细胞中的高效表达方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)构建编码人工转录因子的核苷酸序列：以酵母转录因子GAL4中1-147位氨基酸序列为构建人工转录因子的DNA结合结构域，单纯疱疹病毒转录激活子VP16中12肽DALDDFDLDMLG的4个串联重复作为人工转录因子的功能结构域，用SV40的核定位序列将两部分连接起来，构建了人工转录因子GVP4；

(2)构建具有人工转录因子结合位点的载体：将5个、10个、20个不同长度的人工转录因子结合序列构建在外源基因表达载体pcDNA3.1(+)启动子CMV的上游；

(3)构建表达人工转录因子、表达EGFP、表达t-PA的载体：将人工转录因子GVP4克隆进入表达载体pCDNA3.1/Hygro(+)中，EGFP和tPA连入在含不同数量人工转录因子结合位点表达载体pcDNA3.1(+)中；

(4)表达人工转录因子的载体与表达EGFP、表达t-PA的载体的共转染：将表达人工转录因子的载体与表达EGFP、表达t-PA的载体按等摩尔比共转染，用抗生素加压筛选后分别测定EGFP和t-PA的表达。

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