CN101006179B - 包括在种子中表达细胞分裂素氧化酶的改变植物形态学、生物化学和生理学的方法 - Google Patents

包括在种子中表达细胞分裂素氧化酶的改变植物形态学、生物化学和生理学的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及增加植物的种子产量的方法和组合物。该方法包括在种子的糊粉和/或胚胎中表达细胞分裂素氧化酶。本发明还涉及包含有效连接到能在种子的糊粉和/或胚胎中推动表达的启动子上的、编码细胞分裂素氧化酶的核酸的载体，并且涉及包含此类序列的宿主细胞、转基因细胞和植物。还提供了这些序列用于增加产量的用途。

Description

包括在种子中表达细胞分裂素氧化酶的改变植物形态学、生物化学和生理学的方法
本发明总体涉及改变植物形态学性质或特征(如发育过程)并且特别是种子发育和/或种子产量的方法。此方法包括在植物中表达有效地受到可调节的启动子序列调控的细胞分裂素降解调控蛋白质，特别是细胞分裂素氧化酶，其中可调节的启动子是糊粉和/或胚胎特异性的启动子序列。本发明涉及可用于开展本发明方法的基因构建体以及使用其所转化的植物，该植物与它们另外的同基因对等物相比具有改变的形态性质。
种子是高等植物的繁殖单元。种子包含储备化合物以确保萌发后胚胎的营养。这些贮藏化合物明显有助于人的营养以及家畜的喂养。种子由三个主要部分组成：即胚胎、胚乳和种皮。储备化合物存放在贮藏组织中，它可以是胚乳(由双受精产生，例如在所有的谷类中)、所谓的外胚乳(来自珠心组织)或子叶(例如豆类变种)。胚乳由一层密集的胞质细胞(已知为糊粉)覆盖。贮藏化合物包括脂类(油菜)、蛋白质(例如在谷类的糊粉中)、或碳水化合物(淀粉、例如棉子糖的寡糖)。
淀粉是谷类种子中的贮藏化合物。最重要的谷类物种是玉米(每年产生约5亿7000万吨)、稻(每年5亿4000万吨)和小麦(每年5亿3000万吨)。富含蛋白质的种子包括不同种类的豆(菜豆(Phaseolus spec.)，蚕豆(Viciafaba)，豇豆(Vigna spec.)；每年约2千万吨)、豌豆(Pisum sativum；每年百万吨)和大豆(Glycine max；每年1亿3600万吨)。大豆种子也是脂类的重要来源，同样还有下列植物的种子：不同芸苔物种(大约3千万吨每年)、棉花、东方芝麻、亚麻、罂粟、蓖麻子、向日葵、花生、椰子、油椰子以及具有较低经济价值的其他植物。
在受精后，发育的种子变成了库器官(sink organ)，它吸引来自植物的源器官(source organ)的营养化合物并且使用它们来产生贮藏器官(如种子、鳞茎或块茎)中的储备化合物。常规观念认为细胞分裂素是库活力的正向调节子。
很多报道描述了细胞分裂素在不同的发育过程(如根的生长和分支、枝条中顶端优势的控制、叶绿体发育和叶子老化)中的刺激功能或抑制功能(Mok M.C.(1994)in Cytokines：Chemistry，Activity and Function，编者Mok，D.W.S.&Mok，M.C.(CRC Boca Raton，Fl)，第155-166页)。关于细胞分裂素生物学功能的结论主要来自对应用外源细胞分裂素或增强内源细胞分裂素水平的结果的研究(Klee，H.J.&Lanehon，M.B.(1995)PlantHormones：Physiology，Biochemisry and Molecular Biology，编者Davies，P.J.(Kluwer，Dordrecht，the Netherlands)，第340-353页，Schmülling，T.，Rupp，H.M.Frank，M.&Schafer，S.(1999)Advances in Regulation ofPlant Growth and Development，编者Surnad，M.Pac P.&Beck，E.(Peres，Prague)，第85-96页)。
细胞分裂素氧化酶的克隆可用于研究在高等植物的整个生活周期期中iP型和Z型细胞分裂素的相关性。分解代谢酶细胞分裂素氧化酶(CKX)在调控植物组织的细胞分裂素水平中起到主要的作用。已经在许多高等植物和不同的植物组织中发现了CKX活性。该酶是含有FAD的氧化还原酶，它催化具有不饱和类异戊二烯侧链的细胞分裂素的降解并且有时称作细胞分裂素脱氢酶(Frébortova等人，Biochem.J.380，121-130，2004)。游离碱iP和Z以及它们各自的核苷是优选的底物。iP分解代谢的反应产物是腺嘌呤和不饱和的醛3-甲基-2-丁醇(3-methyl-2-butonal)(Armstrong，D.J.(1994)，Cytokinins：Chemistry，Activity and Functions，编者Mok.D.W.S&Mok，M.C.(CRC Boca Raton，FL)，第139-154页)。
已经分离了多种植物物种的细胞分裂素氧化酶基因：玉米(Zeamays)(Morris，R.O.，Bilyeu，K.D.，Laskey，J.G.&Cherich，N.N.(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.255，328-333，Houba-Herin，N.，Pethe，C.，d’Alayer，J.&Laloue，M.(1999)Plant J.17，615-626)、拟南芥(ArabidopsisThaliana)(WO 01/96580，WO 03/050287)和石斛(Dendrobium sp.)(Yang等人，J.Exp.Bot.53，1899-1907)。对CKX基因表达的操作被用作研究高等植物的生活周期期中iP-型和Z-型细胞分裂素相关性的有力工具；特别是对CKX表达的操作允许细胞分裂素影响待确定的根的生长和枝条的发育和形态、种子大小以及叶子衰老(WO 01/96580，WO 03/050287，Werner等人，Plant Cell 15，2632-2550，2003)。表现出AtCKX mRNA组成型表达以及增加的细胞分裂素氧化酶活性的转化体呈现出根的形成和生长增强。还观察到了对枝条生长的负面影响。
认为在不利的环境条件期间，在玉米中细胞分裂素对确立种子大小、减少顶端籽粒败育和增加结实起到了基础作用(WO 00/63401)。Smigocki等人(Proc Natl Acad Sci USA 85，5131-5135，1988)观察到，在过量表达异戊烯基转移酶(ipt)的根瘤土壤杆菌(Agrabacterium tumefaciens)感染茎、叶片和幼苗时，枝条的器官发生增加。因此还认为，在种子中细胞分裂素水平的增强会增加种子大小和结实增加(WO 00/63401)。
本领域已知，在植物中CKX组成型表达导致根生长增加但枝条生长减少(WO 01/96580)。另外已经证明，在植物中处于强组成型启动子控制下的CKX的表达导致种子大小增加、胚胎大小增加和子叶大小增加(WO03/050287)。但是，不知道种子的哪个部分会最适合CKX表达以实现种子产量增加。发明人在此第一次证明，当种子的某些部分(即糊粉和/或胚胎)中CKX过量表达时，相对于对照植物而言，可以实现种子产量的增加。发明人还已经证明，与胚乳特异性的CKX过量表达相比，糊粉和/或胚胎特异性的CKX过量表达使得种子产量增加更多。
与本发明相一致，已经惊讶的发现，在种子的限定部分(此限定部分是糊粉和/或胚胎)过量表达细胞分裂素氧化酶基因的转基因植物比相应的野生型植物相比种子产量增加。这些结果是令人惊讶的，因为预期细胞分裂素含量减少与器官生长降低相关，并且因此与产量降低相关。
本发明提供了改变植物形态性质(特别是增加植物种子产量)的方法，包括在种子的糊粉和/或胚胎中表达处于能够推动表达的可调节启动子控制下的细胞分裂素氧化酶。本发明还提供了改变植物形态性质(特别是增加植物种子产量)的组合物。
当在本文使用时，“植物形态”或“植物形态特征”或类似术语是本领域的技术人员所能理解的，指的是植物的外观。更特别地，通过使用本发明的方法改善的植物形态特征是种子产量。
本文用到的术语“对照植物”指的是除了改变或改善的形态特征外，与所改变植物尽可能相似或一致的植物。此类对照植物也称作“野生型植物/品系”或“另外的同基因植物/品系”。此外，发明人还证明，与在胚乳中过量表达CKX的植物相比，在糊粉和/或胚胎中过量表达CKX的植物的种子产量增加更多。因此，术语“对照植物”也包括在胚乳中过量表达CKX的植物。
可使用几个众所周知的参数来测量种子产量的增加，它们包括但不限于：种子的总重量、种子的总数、饱满种子的总数、收获指数和千粒重。如本文的实施例所描述，可通过称量从植物中收获的所有饱满的种子来测量种子的总重量。种子的总数可以通过计算从植物中收获的种子的数量来测量。饱满种子的总数可以通过计数从植物中收获的饱满种子的数量来测量。本文用到的术语“收获指数”定义为总的种子重量和地上面积(mm2)的比值再乘以系数106。从所计数的饱满种子的数量和它们的总重量可以得到千粒重。
有利地优选地，开展本发明方法导致产生与相应对照植物相比产量和生物量增加的植物。
“产量”指的是每单位生产面积下收获物质的量。术语“增加的产量”包括与相应对照植物的生物量相比，在植物的一个或多个部分中生物量增加。植物的收获部分可以根据作物的不同而不同，例如收获部分可以是种子(例如当为了获得种子而种植的稻、高梁或谷)、全部地上生物量(例如用作青贮饲料的谷、甘蔗)、根(例如甜菜)、果实(例如番茄)、棉花纤维，或具有经济价值的植物的任何其它部分。例如，本发明的方法用来增加稻和谷中的种子产量。产量的增加包括种子产量的增加，其包括种子总生物量(总种子重量)、种子总数的增加和/或(饱满)种子数量的增加。产量的增加还反映为收获指数(表示为收获部分(例如种子)的产量占总生物量的比例)的增加，且还反映为千粒重(从所计数的饱满种子数量和它们的总重量得到)的增加。
因此，本发明提供了增加植物种子产量、增加植物种子的胚胎和/或糊粉中细胞分裂素氧化酶(CKX)的水平和/或活性的方法，其中所述的胚胎和/或糊粉相对于所述种子的其它部分具有增加的细胞分裂素氧化酶水平和/或活性，并且其中种子产量的增加至少包含下列之一：增加的种子总重量、增加的种子总数、增加的饱满种子数量、增加的收获指数或增加的千粒重，每种都是相对于相应对照植物而言。
就其性质而言，产量是一个复杂的参数，其中总产量决定于众多产量构成因素。增加作物产量的参数为本领域技术人员所已知。例如，对于谷类，关键的产量构成因素包括每公顷或每英亩的植物数量、每株植物穗的数量、每穗的(种子)排(row)的数量、每排的籽粒数量和千粒重。按照本发明方法得到的产量的增加可以作为一种或多种这些产量构成因素的结果得到。例如，稻的主要产量构成因素包括每公顷或每英亩植物的数量、每株植物圆锥花序的数量、每个圆锥花序的小穗的数量、种子饱满率率和千粒重。根据本发明的方法得到的产量增加可以作为一种或多种这些产量构成因素的结果得到，优选地，产量的增加主要是在每个圆锥花序的花的数量增加和种子饱满率增加的基础上得到的。
本发明方法的开展导致产生种子产量改变的植物。改变的产量至少包括以下任意一项或多项的增加，即种子总重量、总的种子数量、饱满种子数量、千粒重和收获指数，每项都是相对于对照植物的。因此，根据本发明，提供了增加以下一项或多项的方法：植物总的种子数量、种子总重量、饱满种子的数量、千粒重和收获指数，此方法包括调节编码CKX蛋白质的核酸分子的表达和/或以优选糊粉和/或胚胎的方式调节CKX自身在植物中的表达，优选地，其中CKX蛋白质由SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：42所代表核酸序列或其一部分编码或者由能够与之杂交的序列编码，或者其中CKX是SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：36所代表多肽或其同源物(homologue)、衍生物或活性片段。备选地，CKX可以由SEQ ID NO：37所代表的核酸序列或其一部分或能够与之杂交的序列编码，或者其中CKX是SEQ ID NO：38所代表的多肽、或任何同源物、衍生物或活性片段。
本发明可用于任何植物，特别是单子叶植物和双子叶植物，包括饲料或草料豆类、观赏植物、食物作物、树或灌木，它们选自：金合欢(Acaciaspp.)、槭树(Acer spp.)、猕猴桃(Actinidia spp.)、七叶树(Aesculus spp.)、新西兰贝壳杉(Agathis australis)、Albizia amara、三色桫椤(Alsophilatricolor)、须芒草(Andropogon spp.)、落花生(Arachis spp)、槟榔(Arecacatechu)、Astelia fragrans、鹰嘴紫云英(Astragalus cicer)、燕麦(Avenasativa)、多小叶红苏木(Baikiaea plurijuga)、桦木(Betula spp.)、长萼兰(Brassica spp.)、木榄(Bruguiera gymnorrhiza)、Burkea africana、紫铆(Butea frondosa)、Cadaba farinosa、朱缨花(Calliandra spp)、普洱茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒(Capsicum spp.)、决明(Cassia spp.)、Centroema pubescens、木瓜(Chaenomeles spp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffea arabica)、可乐豆木(Colophospermum mopane)、变异小冠花(Coronillia varia)、Cotoneasterserotina、山楂(Crataegus spp.)、香瓜(Cucumis spp.)、柏木(Cupressusspp.)、银白树蕨(Cyathea dealbata)、榅桲(Cydonia oblonga)、日本柳杉(Cryptomeria japonica)、香茅(Cymbopogon spp.)、银蕨(Cyntheadealbata)、榅桲(Cydonia oblonga)、Dalbergia monetaria、大叶骨碎补(Davallia divaricata)、山马蝗(Desmodium spp.)、粗糙蚌壳蕨(Dicksoniasquarosa)、Diheteropogon amplectens、Dioclea spp、镰扁豆(Dolichosspp.)、Dorycnium rectum、Echinochloa pyramidalis、Ehrartia spp.、龙爪稷(Eleusine coracana)、Eragrestis spp.、刺桐(Erythrina spp.)、桉(Eucalyptus spp.)、希氏假乌木(Euclea schimperi)、Eulalia villosa、荞麦(Fagopyrum spp.)、费约果(Feijoa sellowiana)、草莓(Fragaria spp.)、千斤拔(Flemingia spp)、Freycinetia banksii、玄野菖(Geranium thunbergii)、银杏(Ginkgo biloba)、爪哇大豆(Glycine javanica)、Gliricidia spp.、陆地棉(Gossypium hirsutum)、银桦(Grevillea spp.)、非洲花梨(Guibourtiacoleosperma)、岩黄芪(Hedysarum spp.)、牛鞭草(Hemarthia altissima)、扭黄茅(Heteropogon contortus)、大麦(Hordeum vulgare)、红苞茅(Hyparrheniarufa)、小连翘(Hypericum erectum)、Hyperthelia dissoluta、Indigo incarnata、鸢尾(Iris spp.)、Leptarrhena pyrolifolia、胡枝子(Lespediza spp.)、Lettucaspp.、银合欢(Leucaena leucocephala)、Loudetia simplex、Lotonus bainesii、百脉根(Lotus spp.)、阿切尔结豆(Macrotyloma axillare)、苹果(Malus spp.)、木薯(Manihot esculenta)、紫苜蓿(Medicago sativa)、水杉(Metasequoiaglyptostroboides)、大蕉(Musa sapientum)、烟草(Nicotianum spp.)、驴食豆(Onobrychis spp.)、鸟足豆(Ornithopus spp.)、稻(Oryza spp.)、Peltophorumafricanum、狼尾草(Pennisetum spp.)、食物鳄梨(Persea gratissima)、碧冬茄(Petunia spp.)、菜豆(Phaseolus spp.)、槟榔竹(Phoenix canariensis)、新西兰剑麻(Phormium cookianum)、石楠(Photinia spp.)、白云杉(Piceaglauca)、松(Pinus spp.)、豌豆(Pisum sativum)、新西兰罗汉松(Podocarpustotara)、Pogonarthria fleckii、Pogonarthria squarrosa、杨(Populus spp.)、牧豆树(Prosopis cineraria)、花旗松(Pseudotsuga menziesii)、翼荚木(Pterolobium stellatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎(Quercus spp.)、Rhaphiolepsis umbellata、美味棒花棕(Rhopalostylis sapida)、Rhusnatalensis、欧洲醋栗(Ribes grossularia)、茶蔗子(Ribes spp.)、洋槐(Robiniapseudoacacia)、蔷薇(Rosa spp.)、悬钩子(Rubus spp.)、柳(Salix spp.)、Schyzachyrium sanguineum、金松(Sciadopitys verticillata)、北美红杉(Sequoia sempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜(Spinacia spp.)、Sporobolus fimbriatus、Stiburusalopecuroides、Stylosanthos humilis、胡芦茶(Tadehagi spp)、落羽杉(Taxodium distichum)、阿拉伯黄背草(Themeda triandra)、车轴草(Trifoliumspp.)、小麦(Triticum spp.)、异叶铁杉(Tsuga heterophylla)、越桔(Vacciniumspp.)、豇豆(Vicia spp.)、葡萄(Vitis vinifera)、锥穗沃森花(Watsoniapyramidata)、马蹄莲(Zantedeschia aethiopica)、玉米、苋、洋蓟、天门冬、椰菜、抱子甘蓝、甘蓝、油菜(canola)、胡萝卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘蓝、亚麻、无头甘蓝、兵豆、油菜(oilseed rape)、黄秋葵、洋葱、马铃薯、稻、大豆、稻草、甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜和茶等等，或在上面特别提到的任何植物的种子或者任何上述物种的组织、细胞或器官培养物。
根据本发明的优选的实施方案，植物是作物植物如大豆、向日葵、油菜、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、马铃薯或烟草。更优选地，植物是单子叶植物，如甘蔗。更优选地，植物是谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、高粱或燕麦。
本文用到的术语“植物”包括整个植物、植物的祖先和后代以及植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花以及组织和器官，其中上述每一种包括目的基因/核酸。术语“植物”还包括悬浮培养物、愈伤组织、胚胎、分生组织区域、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样，上述每一种包括目的基因/核酸。术语“植物”和“植物部分”可以与“多个植物”和“多个植物部分”互换使用。
要明确的是，尽管本发明在实施例部分受到AtCKX基因和蛋白质所支持，但是发明概念也涉及从其它植物中分离并且在这些其它植物的种子糊粉和/或胚胎中表达以得到如实施例部分所描述的植物中类似效果的细胞分裂素氧化酶的用途。
细胞分裂素氧化酶基因家族包括至少六个来自拟南芥的成员。考虑到细胞分裂素氧化酶活性存在于多种绿色植物(Hare和van Staden，PhysiolPlant 91：128-136，1994；Jones和Schreiber，Plant Growth Reg 23：123-134，1997)以及其它生物中(Armstrong，Cytokinins：Chemistry，Activity andFunction.编者Mok和Mok，CRC Press，第139-154页，1994)，所以可以预见，可以从其它生物中分离所描述拟南芥细胞分裂素氧化酶的功能性同系物。因此，在本发明中有功能的细胞分裂素氧化酶的序列不需要与在本文描述的那些相同。总体上，本发明尤其用于谷类作物和单子叶植物作物，并且也可以使用来自例如小麦或玉米的细胞分裂素氧化酶基因(Morris等人，1999；Rinaldi和Comandini，1999)。可以想象，具有细胞分裂素氧化酶活性或具有任何其它细胞分裂素新陈代谢活性的其它基因(见
Figure S05828129220070227D000091
等人，Biochemistry and Molecular Biology of Plant Hormones，Hooykaas，Hall和Libbenga(编者)，Elsevier Science，第141-160页，1997)也可以用于本发明的目的。类似地，编码增加内源细胞分裂素新陈代谢活性的蛋白质的基因也可以用于本发明的目的。原则上，通过干涉作用于细胞分裂素下游的基因(例如参与细胞分裂素信号传导通路的受体或蛋白质)，也可以得到类似的表型。
本发明的方法中可以使用编码具有细胞分裂素氧化酶活性的多肽的任何核苷酸序列。例如，在增加种子产量的方法中可以使用在本文提供的编码具有细胞分裂素氧化酶活性的多肽的任意多种序列。
当用在本文中时，术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”或“寡肽”指的是任何长度的聚合形式的氨基酸。这些术语还包括已知的氨基酸修饰和非天然存在的氨基酸残基、L-氨基酸残基和D-氨基酸残基。
在本文中，将可用于本发明方法的CKX蛋白质定义为具有细胞分裂素氧化酶/脱氢酶活性并且包含17个和19个连续氨基酸残基中至少两个序列的蛋白质，所述的连续氨基酸残基分别具有如下所示的共有序列：
共有序列1(17个氨基酸)：hTDYLhholGGTLSssG，(SEQ ID NO：44)
共有序列2(19个氨基酸)：cLFxushGsLGQFGllstA，(SEQ ID NO：45)其中大写字母是多种氨基酸的标准单字母IUPAC代码，并且其它字母象征着氨基酸的性质，如在表1中所示。右列列出了可存在于共有序列的每类特定的氨基酸。此分类基于如SMART数据库中所定义的氨基酸分组(Schultz等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864：Letunic等人，(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244)。
表1
  类   关键特性  允许的氨基酸
  h   疏水性  G，H，L，R，T，W，Y
  o   醇   S，T
  l   脂族族   V，I
  s   小   A，D，G，N，T，V
  c   带电荷的   D，E，R
  x   任意的   Y，R，N，F，D，H
  u   极小   A，G，S
  t   转角偏好的   R，N
玉米CKX的晶体结构是由Malito等人(J.Mol.Biol.341，1237-1249，2004)阐明的，它可用于结构-功能分析和对玉米CKX的催化活性重要的氨基酸的鉴定。可以通过比较蛋白质序列，可以将这些结果推论到其它CKX蛋白质。
本领域众所周知测量细胞分裂素氧化酶/脱氢酶活性的方法。适当的方法基于[2-3H]iP到腺嘌呤的转变(Motyka等人，Plant Physiology 112，1035-1043，1996)、基于显色测定法(Libreros-Minotta和Tipton，Anal.Biochem.231，339-341，1995)或基于对减少的电子受体的测量(Bilyeu等人，Plant Physiol.125，378-386，2001)。
本发明涉及增加种子产量的方法。特别地，方法包括在种子的糊粉和/或胚胎中表达选自下列的编码细胞分裂素氧化酶的核酸：
(a)包含在任意的SEQ ID NO：42、37、27、1、3、5、7、9、11、25、26、28至31、33或34中给出的DNA序列的核酸或其互补序列，
(b)包含对应于任意的SEQ ID NO：42、37、27、1、3、5、7、9、11、25、26、28至31、33或34的RNA序列的核酸或其互补序列，
(c)与任意的SEQ ID NO：42、37、27、1、3、5、7、9、11、25、26、28至31、33或34或其互补序列特异性杂交的核酸，
(d)编码包含在任意的SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、32、35、36或38中给出的氨基酸序列的蛋白质的核酸或其互补序列，
(e)如在任意的(a)至(d)中所定义的核酸，其特征在于所述的核酸是DNA、基因组DNA、cDNA、合成DNA或RNA(其中T换成U)，
(f)由于遗传密码的原因，而与在任意的SEQ ID NO：42、37、27、1、3、5、7、9、11、25、26、28至31、33或34中给出的核酸相比或者与在任意的(a)至(e)中所定义的核酸相比为简并性的核酸。
(g)由于生物间密码子选择的不同，而与编码在任意的SEQ IDNO：2、4、6、8、10、12、35、36或38中所给出的蛋白质的核酸不同或者与如在任意的(a)至(e)中所定义的核酸不同的核酸，
(h)编码如在SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、35、36或38中所给出的蛋白质的核酸，或者如在(a)至(e)中所定义的核酸，其由于等位基因间的不同而不同，
(i)编码如在任意的SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、35、36或38中所给出的蛋白质的核酸，
(j)如在任意的(a)至(i)中所定义的核酸的功能性片段，其具有细胞分裂素氧化酶的生物活性，以及
(k)编码植物细胞分裂素氧化酶的核酸，所述细胞分裂素氧化酶包含共有序列hTDYLhholGGTLSssG和cLFxushGsLGQFGllstA，或者包括编码降低植物或植物部分中活性细胞分裂素水平的蛋白质的核酸在种子中表达。
还可以通过引入遗传修饰(优选的是在CKX基因的基因座中)来增加编码CKX多肽或其同源物的核酸的表达。
除了上述细胞分裂素氧化酶基因和相应的蛋白质之外，细胞分裂素氧化酶2基因(CKX2)尤其适用于增加植物中的种子产量。除了在SEQ IDNO：36中所阐明的拟南芥CKX2之外，还可以使用来自拟南芥的其它CKX蛋白质，如GeneBank登录号NP_181682、NP_200507、NP_849470、NP_194703、NP_850863或AAG30909所代表的蛋白质。来自其它物种如玉米(例如GeneBank登录号CAE55202、CAE55200或AAC27500)、石斛(GeneBank CAC17752)、大麦(GeneBank AAN16383、AAO50082、AAM08400)或稻(GeneBank NP_913145、NP_916348、NP_922039)的CKX蛋白质也可用于本发明的方法和组合物。GeneBank登录号P46377代表了SEQ ID NO：36的原核同源物。
因此，本发明更普遍地涉及增加植物中种子产量的方法，所述的方法包括在植物种子的胚胎和/或糊粉中增加细胞分裂素氧化酶(CKX)的水平和/或活性。其中相对于所述种子的其它部分，所述的胚胎和/或糊粉具有增加的细胞分裂素氧化酶的水平和/或活性。优选地，待使用的细胞分裂素氧化酶由上述定义的编码细胞分裂素氧化酶的核酸所编码。更优选地，待使用的细胞分裂素氧化酶来自拟南芥，最优选地，待使用的细胞分裂素氧化酶是由SEQ ID NO：3、26、37或42的一种所编码的AtCKX2。
本文用到的术语“基因”、“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸分子”指的是任何长度聚合形式的核苷酸，可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，也可以是二者的组合。此术语另外包括双链和单链的DNA和RNA。术语还包括已知的核苷酸修饰，如甲基化、环化和“加帽”，以及用类似物(例如肌苷)替换一个或多个天然存在的核苷酸。术语还包括肽核酸(PNA)，即主链是由N-(2-氨乙基)-甘氨酸单元组成的假肽而不是糖的DNA类似物。
“编码序列”或“可读框”或“ORF”定义为这样的核苷酸序列，当置于适当的控制序列或调节序列的控制之下时，即当编码序列或ORF以可表达形式存在时，它能被转录成为mRNA和/或翻译成为多肽。此编码序列或ORF是由5’翻译起始密码子和3’翻译终止密码子所限制。编码序列或ORF可以包括但不限于RNA、mRNA、cDNA、重组核苷酸序列、合成生产的核苷酸序列或基因组DNA。此类编码序列或ORF可以被间插核酸序列所打断。
本质上编码相同蛋白质但是从不同来源分离出的基因和编码序列可以由基本不同的核酸序列所组成。相反地，可以有计划地涉及基本不同的核酸序列以便达到本质相同的蛋白质的表达。这些核酸序列是因为例如特定基因的不同等位基因的存在、遗传密码简并的存在或密码子选择的不同而产生的。因此，氨基酸如甲硫氨酸和色氨酸由单一密码子编码，而其它氨基酸如精氨酸、亮氨酸和丝氨酸中的每一个均可以由多达6个不同的密码子翻译。本领域已知优选密码子选择中的差异。例如，密码子GGC(编码甘氨酸)在根瘤土壤杆菌中是最频繁使用的密码子(36.2‰)，在稻(Oryzasativa)中是第二频繁使用的密码子，但是在拟南芥和紫苜蓿中以极低的频率使用(分别为9‰和8.4‰)。在编码甘氨酸的四个可能的密码子中，GGC密码子在根瘤土壤杆菌和稻中是最优选使用的。但是在拟南芥中最优选使用的是GGA(和GGU)密码子而在紫苜蓿中最优选使用的是GGU(和GGA)密码子。
等位基因天然存在，并且包含在本发明的方法中的是这些天然等位基因变体的应用。等位基因变体包括单核苷酸多态性(SNP)以及小插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。在大多数生物的天然存在的多态性品系中SNP和INDEL形成了最大的一组序列变体。
本发明所定义的DNA序列可以被间插序列所打断。“间插序列”指的是中断编码序列(包括如本发明的DNA序列)或者打断DNA序列(包含发明的DNA序列)的可表达模式的任何核酸序列。去除间插序列可以恢复编码序列或可表达模式。间插序列的实例包括内含子和可移动的DNA序列(如转座子)。“可移动的DNA序列”指的是作为重组事件结果而能移动的任何DNA序列。
也可以使用编码CKX蛋白质的核酸分子的选择性剪接变体来实践本发明的方法。本文用到的术语“选择性剪接变体”包括其中所选择的内含子和/或外显子被切除、替代或加入的核酸分子的变体。此类变体可以是其中蛋白质的生物活性未被影响的变体，这可以通过有选择地保留蛋白质的功能性区段来实现。此类剪接变体可天然存在或者是人造的。本领域众所周知制造此类剪接变体的方法。因此，根据本发明的另一方面，提供了改变植物的形态特征(并且特别是种子产量)的方法，包括在种子的糊粉和/或胚胎中表达编码CKX的核酸分子的选择性剪接变体。优选地，剪接变体是由SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11或33所代表的序列的剪接变体。优选的AtCKX2剪接变体是如SEQ ID NO：38所代表的变体。
同样可用于本发明方法的是能够在降低的严格条件下(优选在严格条件下)与编码CKX的核酸杂交的核酸。优选的是能够与SEQ ID NO：42或26所代表核酸杂交的核酸。
“杂交”是其中基本同源的互补核苷酸序列相互退火的过程。杂交过程可以完全在溶液中发生，即互补核酸都在溶液中。依靠此过程的分子生物学工具包括PCR、削减杂交和DNA序列测定。杂交过程也可以用一种固定在例如磁珠、琼脂糖珠或其它任何树脂的基质上的互补核酸来实现。依靠此类过程的分子生物学工具包括poly(A+)mRNA的分离。此外，杂交过程还可以用一种固定于固相支持物(如硝化纤维素膜或尼龙膜)或者例如通过照相平板印刷固定至硅质玻璃支持物(后一种称作核酸阵列或微阵列或核酸芯片)上的互补核酸来实现。依靠此过程的分子生物学工具包括RNA和DNA凝胶印迹分析、菌落杂交、噬斑杂交和微阵列杂交。为了能够杂交，通常将核酸分子热变性或化学变性(例如通过NaOH)以便将双链解开成两个单链和/或去除单链核酸中的发夹结构或其它二级结构。杂交的严格性受条件如温度、盐浓度和杂交缓冲液组成的影响。杂交的高严格条件包括高温和/或低盐浓度(盐包括NaCl和柠檬酸三钠)和/或杂交缓冲液中存在甲酰胺和/或降低杂交缓冲液中化合物如SDS(去污剂)的浓度和/或去除杂交缓冲液中的化合物如硫酸葡聚糖或聚乙二醇(促进分子聚集)。常规杂交条件描述于例如Sambrook等人(1989)中，但是技术人员会意识到，可以按照已知或所希望的核酸序列的同源性和/或核酸序列的长度设计出多种不同的杂交条件。尤其优选足够低的严格杂交条件来分离与上面定义的本发明DNA序列异源的核酸。助于产生异源性的元素包括上述讨论的等位性、遗传密码子的简并和优选密码子选择的差异。
术语“特异性杂交”指的是当特定核苷酸序列存在于复合体混合物(例如总的细胞DNA或RNA)中时，在中等或严格条件下，分子与该特定序列结合、形成双链体或杂交。
在核酸杂交实验如Southern杂交和Northern杂交中，“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的并且在不同的环境参数下是不同的。例如，更长的序列在更高的温度下特异性杂交。Tm是在确定的离子强度和pH下，当50％的靶标序列与完全匹配的探针杂交时的温度。典型地，杂交后洗涤决定特异性。洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度。
总体上，所选择的严格条件为比在固定离子强度和pH下特定序列的解链温度(Tm)低50℃以上的温度。Tm是50％的靶标序列与完全匹配探针杂交(在固定的离子强度和pH下)的温度。Tm取决于溶液条件和探针的碱基组成，并且可以使用下列方程式计算出来：
Tm＝79.8℃+(18.5×Log[Na+])
          +(58.4℃×％[G+C])
          -(820/双链体中的bp)
          -(0.5×％甲酰胺)
更优选的严格条件是温度比Tm低20℃，并且最优选的严格条件是温度比Tn低10℃。非特异性结合也可以使用多个已知技术(例如用含有蛋白质的溶液将膜封闭、向杂交缓冲液中加入异源RNA、DNA和SDS，以及用RNase处理)的任意一种来控制。
典型地，洗涤条件在严格条件或低于严格条件下进行。总体上，对于核酸杂交测定或基因扩增检测方法适当的严格条件如上述说明。也可以选择差不多的严格条件。
为了定义严格性水平，可以方便地参考Sambrook，J.，E.F.Fritsch，等人，1989“Molecular Cloning：a Laboratory Manual”，2nd Edition，ColdSpring Harbor，NY，Cold Spring Harbor Laboratory Press。低严格条件的实例是4-6×SSC/0.1-0.5％w/v SDS，37℃-45℃下进行2-3小时。根据在杂交中所涉及核酸的来源和浓度，可以使用可选的严格条件如中等严格条件。中等严格条件的实例包括1-4×SSC/0.25％w/v SDS，在≥45℃进行2-3小时。高严格条件的实例包括0.1-1×SSC/0.1％w/v SDS，在60℃下进行1-3小时。技术人员知道可以在杂交和洗涤期间改变的并且将会保持或改变严格条件的多种参数。例如，另一个严格杂交条件是在4×SSC、65℃下杂交，随后在0.1×SSC、65℃下洗涤大约1个小时。备选地，示例性的严格杂交条件是在50％甲酰胺、4×SSC中于42℃下。严格条件的另一个实例包括在62℃下在6×SSC、0.05×BLOTTO中杂交，并且在2×SSC、0.1％SDS中于62℃洗涤。
明显地，本发明包括与编码如下所定义的细胞分裂素氧化酶、其同源物、衍生物或免疫活性片段和/或功能片段的DNA序列杂交的DNA序列在增加种子产量的方法中的用途，所述的方法包括在种子的糊粉和/或胚胎中表达这些DNA序列。优选地，细胞分裂素氧化酶是植物细胞分裂素氧化酶，更加具体而言是拟南芥(At)CKX。
CKX多肽的“同源物”也可以用于本发明。
可用于本发明方法的CKX“同源物”是那些肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，即它们与蛋白质(它们是该蛋白质的同源物)相比包含氨基酸替换、缺失和/或添加，但是没有改变其一种或多种功能性质，尤其是没有降低所获得蛋白质的活性。例如CKX同源物由该CKX的生物活性氨基酸序列变体组成。
同源性的两种特定形式(直向同源性和种内同源性)是用来描述基因的遗传关系的进化上的概念。术语“种内同源的”指源自物种基因组内一个或多个基因重复的同源基因。术语“直向同源的”指由于这些基因的遗传关系而存在于不同生物中的同源基因。本文用到的术语“同源物”还包括在本发明方法中有用的蛋白质的种内同源物和直向同源物。通过使用例如BLAST程序用目标基因查询来查询一个或多个基因数据库，可以鉴定直向同源基因。将此搜索中排在最高等级的那些基因再次进行BLAST分析，并且只有再次与查询基因相匹配的这些基因才是真正的直向同源基因。例如，为了查找到拟南芥基因的稻直向同源物，可以先在稻数据库例如(但不限于)在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)下可用的稻Nipponbare数据库或者在稻(印度栽培种或者日本栽培种)的基因组序列上进行BLASTN或TBLASTX分析。下一步中，使用拟南芥数据库，对所得到的稻序列用于反向BLAST分析。当将得到的序列用ClustalW分析并且在邻接树中显现时，可以将结果进一步的精修。本方法可以用来从许多不同的物种中鉴定直向同源物。
BLAST(基本局部比对搜索工具)是程序集(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，其目标是用来鉴定最优局部比对区域，即两种核酸或蛋白质序列的一些部分的比对，并且用来检测仅共有分隔区相似性的序列之间的关系(Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997))。
为了产生此类同源物，可以用具有相似性质(如疏水性、亲水性、疏水矩、抗原性、形成或破坏α螺旋结构或β折叠结构的倾向等)的其它氨基酸替换蛋白质中存在的氨基酸。在表2中总结了氨基酸的物理和化学性质。
表2天然存在氨基酸的性质。
  电荷性质/疏水性   侧基   氨基酸
  非极性疏水性  脂肪族含S脂肪族芳香族亚氨基   ala、ile、leu、valmetphe、trppro
  极性不带电荷  脂肪族酰胺芳香族羟基巯基   glyasn、glntyrser、thrcys
  带正电荷  碱性   arg、his、lys
  带负电荷  酸性   asp、glu
在本发明方法中有用的同源物优选的具有细胞分裂素氧化酶/脱氢酶活性并且至少包含分别具有如下所示共有序列的17个和19个连续氨基酸残基的两个序列：
共有序列1(17个氨基酸)：hTDYLhholGGTLSssG，(SEQ ID NO：44)
共有序列2(19个氨基酸)：cLFxushGsLGQFGllstA，(SEQ ID NO：45)
其中大写字母是各种氨基酸的标准单字母IUPAC代码，并且其它字母象征着氨基酸的性质，如在上述表2中所示。右列列出了可存在于共有序列中的每类特定氨基酸。
本发明蛋白质的替换变体是在蛋白质或氨基酸序列中至少一个残基被移除并将不同的残基插入到该位置中的那些变体。典型的氨基酸替换可以是分开残基也可以是成簇的，这取决于多肽上的功能性约束；插入通常是达到大约1-10个氨基酸残基的数量并且缺失通常的范围是大约1-20个残基。优选地，氨基酸替换包含保守氨基酸替换，如在上面所描述的那些。
本发明蛋白质的插入性氨基酸序列变体是在其中将一个或多个氨基酸残基引入到蛋白质中的预定位点的那些蛋白质。插入可以包括氨基端和/或羧基端融合以及单个或多个氨基酸的序列内插入。总体上，在氨基酸序列中的插入会小于氨基端或羧基端融合，达到大约1-10个残基的数量。氨基端或羧基端融合蛋白质或肽的实例包括在双杂交系统中使用的转录激活子的结合结构域或激活结构域、噬菌体外被蛋白、(组氨酸)6-标记、谷胱甘肽S-转移酶、A蛋白、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位(EETARFQPGYRS)、c-myc表位(EQKLISEEDL)、
Figure S05828129220070227D000181
表位(DYKDDDK)、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位(YPYDVPDYA)、蛋白质C表位(EDQVDPRLIDGK)和VSV表位(YTDIEMNRLGK)。
本发明蛋白质的缺失变体的特征在于从蛋白质的氨基酸序列中去除一个或多个氨基酸。
可以使用本领域众所周知的肽合成技术(如固相肽合成等)或者通过重组DNA操作来容易地制造本发明蛋白质的氨基酸变体。产生表现为替换变体、插入变体或缺失变体的变体蛋白质的DNA序列操作在本领域中是众所周知的。例如，本领域的技术人员众所周知在具有已知序列的DNA预定位点上产生替换突变的技术，如M13诱变、T7-Gen体外诱变试剂盒(USB，Cleveland，OH)，QuickChange位点定向诱变试剂盒(Stratagene，San Diego，CA)、PCR介导的位点定向诱变或其它位点定向诱变方法。
CKX蛋白质的衍生物也可以用于本发明的方法。本发明蛋白质的“衍生物”是至少包含了多肽的大约5个邻接氨基酸残基但是保持了此蛋白质生物活性那些肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶。与天然存在形式多肽的氨基酸序列相比，“衍生物”另外包含了其它天然存在的、糖基化改变的、酰基化的或非天然存在的氨基酸残基。可选地或另外地，与天然存在形式多肽的氨基酸序列相比，衍生物可以包含一个或多个非氨基酸取代基，例如报道分子或其它共价或非共价结合到氨基酸序列的配体，例如结合到其上以促进其检测的报道分子。
具有“免疫活性”指的是分子或其特异性片段(例如特异性表位或半抗原)被抗体识别，即结合至抗体上。可以使用例如在Geysen等人(Geysen，H.M.，Rodda，S.J.和Mason，T.J.(1986).A priori delineation of a peptidewhich mimics a discontinuous antigenic determinant.Mol.Immunol.23，709-715，1996)所描述的肽扫描技术来确定特异性的表位。
术语“序列片段”或“序列部分”指的是所涉及的原始序列的截短的序列。截短的序列(核酸或蛋白质序列)可以在长度上相差很大；最小的是具有足够长度以便能够提供至少具有与所涉及原始序列相当的功能和/或活性的序列(例如功能性片段)的序列，而最大长度并不重要。在一些应用中，最大长度通常不显著大于提供所希望的原始序列活性和/或功能的所需要的那种长度。典型地，截短的氨基酸序列长度范围是大约5个至大约60个氨基酸。但是更典型地，序列长度最大为大约50个氨基酸，优选地最大为大约60个氨基酸。通常希望选择至少大约10、12或15个氨基酸而最多大约20或25个氨基酸的序列。功能性片段包括至少50个氨基酸，包括FAD结合结构域(如在Pfam(14.0版，2004年6月)登录号1565，Bateman等人，Nucleic Acids Research Database Issue 32，D138-D141，2004中所定义)并且表现出细胞分裂素氧化酶/脱氢酶活性。更优选地，功能性片段表现出细胞分裂素氧化酶/脱氢酶活性并且包含对应于SEQ ID NO：26中从Leu94至Leu461的序列的氨基酸序列。功能性片段还可以包括包含CKX蛋白质特异性表位的那些片段。
因此，需要理解的是，功能性片段还可以是免疫活性片段。
在本发明方法中考虑了如上所定义的细胞分裂素氧化酶的同源物、衍生物和/或免疫活性和/或功能片段的用途。考虑用于本发明方法的特别优选的细胞分裂素氧化酶蛋白质同源物、衍生物和/或免疫活性和/或功能片段来自植物，更特别的来自拟南芥，甚至更特别地，细胞分裂素氧化酶是拟南芥(At)CKX，或者能够在谷类(优选是稻或谷)种子的糊粉和/或胚胎中表达。本发明明确考虑了AtCKX蛋白质的功能性同源物或衍生物和/或免疫活性片段的用途，并且不是将本发明限制成为编码这些AtCKX蛋白质之一的核苷酸序列在本发明方法中的用途。
为了实现CKX蛋白质在细胞、组织或器官(优选是植物来源的)中的表达，既可以将蛋白质直接引入细胞，如通过显微注射或射弹方法，或者备选地，将编码CKX蛋白质的分离的核酸分子以可表达形式引入细胞、组织或器官。
在本发明的背景中，要理解的是，术语“表达”和/或“过量表达”可以互换使用，均指植物细胞分裂素氧化酶的“增强表达和/或异位表达”。因此应当清楚的是，植物细胞分裂素氧化酶的增强表达以及植物细胞分裂素氧化酶的“从头”表达是有意义的。增加基因或蛋白质表达的方法在本领域中是已知的，并且包括例如通过适当启动子、使用转录增强子或翻译增强子推动的过量表达。将用作启动子或增强子元件的分离的核酸引入非异源形式多核苷酸的适当位置(一般为上游)中，从而上调编码CKX的核酸或其变体的表达。例如，可以通过突变、缺失、和/或替换在体内改变内源启动子(见Kmiec，美国专利号5,565,350；Zarling等人，PCT/US93/03868)，或者将分离的启动子以正确方向和距本发明基因的距离引入植物细胞，从而控制基因的表达。本领域明确已知减少基因或基因产物表达的方法。
通过引入遗传修饰(优选在CKX基因的基因座中)，可以在种子的糊粉和/或胚胎中增加编码CKX多肽或其同源物的核酸的表达。如本文中所定义的基因的基因座意思是指包括目的基因和编码区域上游或下游10kb的基因组区域。
例如，可以通过以下任何一种(或多种)方法将遗传修饰引入：T-DNA激活、TILLING、位点定向诱变、定向进化和同源重组；或者通过在植物中引入和表达编码CKX多肽或其同源物的核酸。在引入遗传修饰后，接下来的步骤是选择编码CKX多肽或其同源物的核酸的修饰的表达，此修饰使得植物具有增加的产量。
T-DNA标记(Hayashi等人.Science(1992)1350-1353)包括T-DNA的插入，它通常在目的基因的基因组区域内或在基因编码区上游或下游10kb内以使得启动子指导靶标基因表达的构造含有启动子(也可以是翻译增强子或内含子)。典型地，天然启动子对靶标基因表达的调节被破坏了，并且基因处于新引入启动子的控制下。启动子通常插入在T-DNA中。例如通过土壤杆菌侵染，此T-DNA随机插入到植物基因组中并且使得所插入T-DNA附近的基因过量表达。由于接近所引入启动子的基因的过量表达，所得到的转基因植物表现出显性表型。根据本发明，待引入的启动子是能够推动在种子的糊粉和/或胚胎中表达的启动子。
也可以使用TILLING技术(基因组中靶向引入局部损害)将遗传修饰引入CKX基因的基因座中。这是用于产生和/或鉴定并且最终分离能够表现出CKX活性的CKX核酸诱变变体的诱变技术。TILLING也可用于选择携带此类突变变体的植物。这些突变体甚至可以表现出比天然形式的基因所表现出的CKX活性更高的CKX活性。TILLING将高密度诱变和高通量筛选方法组合起来。在TILLING中，之后的典型步骤是：(a)EMS诱变(Redei GP和Koncz C(1992)，Methods in Arabidopsis Research，Koncz C，Chua NH，Schell J编.Singapore，World Scientific Publishing Co，第16-82页；Feldmann等人，(1994)，Meyerowitz EM，Somerville CR编，Arabidopsis.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第137-172页；Lightner J和Caspar T(1998)，J Martinez-Zapater，JSalinas编，Methods on Molecular Biology，第82卷.Humana Press，Totowa，NJ，第91-104页)；(b)DNA制备和个体合并；(c)目标区域的PCR扩增；(d)变性和复性以允许异源双链体的形成；(e)DHPLC，其中异源双链体在集合体中的存在被检测为层析谱中的额外峰；(f)突变个体的鉴定；以及(g)突变PCR产物的测序。TILLING的方法在本领域中众所周知(McCallum等人，(2000)Nat Biotechnol 18：455-457；Stemple(2004)NatRev Genet 5(2)：145-50综述)。
位点定向诱变可用于产生CKX核酸的变体。很多方法可用来实现位点定向诱变，最常用方法是基于PCR的方法(current protocols in molecularbiology.Wiley Eds.http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html)。
定向进化也可以用来产生CKX核酸的变体。这由下列组成：DNA改组的重复，随后适当的筛选和/或选择来产生编码具有改变生物活性的CKX多肽或其同源物或部分的CKX核酸或其部分的变体(Castle等人，(2004)Science 304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。
T-DNA激活、TILLING、位点定向诱变和定向进化是能够产生新的等位基因和CKX变体的技术实施。
同源重组可用于在基因组中的所选择位置上引入所选择的核酸。同源重组是生物科学中常规使用的用于低等生物如酵母或剑叶藓(Physcomitrella)的标准技术。在植物中进行同源重组的方法不仅对于模式植物进行了描述(Offringa等人，(1990)EMBO J 9(10)：3077-84)，还对于谷类植物如稻进行了描述(Terada等人，(2002)Nat Biotech 20(10)：1030-4；Iida和Terada(2004)Curr Opin Biotech 15(2)：132-8)。待靶向的核酸(如上文所定义的CKX核酸或其变体)不需要被靶向至CKX基因的基因座上，但是可以被引入至例如高表达的区域。待靶向的核酸可以是用来替换内源基因的改进的等位基因或可以被另外引入至内源基因中。
本发明还涉及产生具有增加的种子产量的修饰植物的方法，包括引入使得在种子的糊粉和/或胚胎中细胞分裂素氧化酶的表达增加的遗传修饰。本发明另外涉及在植物中增加种子产量的方法，包括引入编码如上定义CKX的核酸分子，它被有效连接至能稳定整合到植物细胞基因组上并且能够推动在种子的糊粉和/或胚胎中表达的一个或多个控制序列或载体上。
因此，本发明还涉及包含编码如上定义CKX的核酸的载体，其中载体是表达载体，并且其中编码CKX的核酸被有效连接至可用于在种子的糊粉和/或胚胎中表达的一个或多个控制序列上。
在本发明中，发明人令人惊讶地证明，在种子的糊粉和/或胚胎中表达细胞分裂素氧化酶导致产生上述种子相关的特征。种子特异性启动子的实例包括但不限于在表3中列出的那些。
表3能够在种子中促进表达的植物可表达启动子实例
基因来源   表达模式 参考文献
 α-淀粉酶(Amy32b)   糊粉   Lanahan，M.B.，等人，Plant Cell 4：203-211，1992；Skriver，K.，等人Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)88：7266-7270，1991
 组织蛋白酶β-样基因   糊粉   Cejudo，F.J.，等人Plant Molecular Biology20：849-856，1992.
 种子特异性基因   种子   Simon，等人，Plant Mol.Biol.5：191，1985；Scofield，等人，J.Biol.Chem.262：12202，1987.；Baszczynski，等人，Plant Mol.Biol.14：633，1990.
 巴西坚果清蛋白   种子   Pearson，等人，Plant Mol.Biol.18：235-245，1992.
 豆球蛋白   种子   Ellis，等人，Plant Mol.Biol.10：203-214，1988.
谷蛋白(稻)   种子   Takaiwa，等人，Mol.Gen.Genet.208：15-22，1986；Takaiwa，等人，FEBS Letts.221：43-47，1987.
玉米醇溶蛋白   种子   Matzke等，Plant Mol Biol，14(3)：323-321990
NapA   种子   Stalberg等，Planta 199：515-519，1996.
小麦LMW和HMW麦谷蛋白-1   胚乳   Mol Gen Genet 216：81-90，1989；NAR 17：461-2，1989
小麦SPA   种子   Albani et al，Plant Cell，9：171-184，1997
小麦α、β、γ-麦醇溶蛋白  胚乳   EMBO 3：1409-15，1984
大麦Itr1启动子   胚乳
大麦B1、C、D大麦醇溶蛋白   胚乳   Theor Appl Gen 98：1253-62，1999；Plant J4：343-55，1993；Mol Gen Genet 250：750-60，1996
大麦DOF   胚乳   Mena等，The Plant Journal，116(1)：53-62，1998
blz2   胚乳   EP99106056.7
合成性启动子   胚乳   Vicente-Carbajosa等人，Plant J.13：629-640，1998.
稻的谷醇溶蛋白NRP33   胚乳   Wu等人，Plant Cell Physiology 39(8)885-889，1998
稻α-球蛋白Glb-1   胚乳   Wu等人，Plant Cell Physiology 39(8)885-889，1998
稻OSH1   胚胎   Sato等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：8117-8122，1996
稻α-球蛋白REB/OHP-1   胚乳   Nakase等人，Plant Mol.Biol.33：513-522，1997
 稻ADP-葡萄糖PP  胚乳   Trans Res 6：157-68，1997
 玉米ESR基因家族  胚乳   Plant J 12：235-46.1997
 高粱γ-高粱醇溶蛋白  胚乳   PMB 32：1029-35，1996
 KNOX  胚胎   Postma-Haarsma等人，Plant Mol.Biol.39：257-71，1999
 稻油质蛋白  胚胎和糊粉   Wu等人，J.Biochem.，123：386，1998
 向日葵油质蛋白  种子(胚胎和干种子)   Cummins，等人，Plant Mol.Biol.19：873-876，1992
可以在实施例部分表4中找到适合在植物中进行种子特异性表达的启动子的另外实例。
根据本发明，提供了增加植物中种子产量的方法和组合物。可以通过在植物种子的胚胎和/或糊粉中增加细胞分裂素氧化酶基因的表达来增加种子产量。因此，可以使用胚胎和/或糊粉优选的启动子来驱动细胞分裂素氧化酶在种子的这些特定成分中表达。
根据本发明，可以将细胞分裂素氧化酶基因置于基因构建体，如处于胚胎和/或糊粉优选启动子控制下的载体中。能够驱动在胚胎和/或糊粉中表达的此类启动子的实例是如GenBank登录号AF019212所代表的序列(从核苷酸1至1256的序列，此后称为PRO0218)。
例如，可以将AtCKX2基因(SEQ ID NO：42)置于能够驱动在种子中表达的启动子、更加具体而言能够驱动在胚胎和/或糊粉中表达的启动子(例如PRO0218)控制之下。
因此，本发明提供了包含具有SEQ ID NO：41或43所列序列的分离的核酸分子的载体。
之后，可以用这些构建体转化植物，可以是双子叶植物也可以是单子叶植物。根据本发明，与失效合子对照植物相比，用本发明载体转化的植物具有增加的种子产量。
优选地，本发明的载体包含编码如上所定义的细胞分裂素氧化酶蛋白质或其同源物或衍生物或者其免疫活性和/或功能片段的编码序列或可读框(ORF)。优选的细胞分裂素氧化酶是植物细胞分裂素氧化酶并且更特定的是拟南芥(At)CKX。最优选地，CKX如SEQ ID NO：4、36或38之一所代表。
“载体”或“载体序列”或“基因构建体”指的是可以通过转化被引入到生物中并且可以在此生物中稳定维持的DNA序列。在例如大肠杆菌(Escherichia coli)、根瘤土壤杆菌、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或者粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)的培养物中，载体的维持是可能的。其它载体如噬菌粒和黏粒载体可以在细菌和/或病毒中维持并增殖。载体序列通常包括一系列由限制性内切核酸酶所识别的单一位点，即多克隆位点(MCS)，在其中可以插入一个或多个非载体的序列。作为多克隆位点的替代选择，载体还可以包含重组位点。通过重组进行基因克隆在本领域中是众所周知的。
因此，“非载体序列”指的是被整合进载体所包含MCS的一个或多个位点中的DNA序列。
“表达载体”形成了一亚类载体，由于所述载体包含能够使插入的非载体序列表达的适当调节或控制序列，因此允许表达此非载体序列编码的蛋白质。在本领域中已知能够使蛋白质在包括细菌(例如大肠杆菌)、真菌(例如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))、昆虫细胞(例如杆状病毒表达载体)、动物细胞(例如COS或CHO细胞)和植物细胞(例如基于马铃薯病毒X的表达载体)在内的生物中表达的表达载体。
“可表达模式”指的是分离的核酸分子处于这样的形式，即它适合于组成型地或在胞内或胞外信号诱导后转录成为mRNA和/或翻译产生蛋白质产物，其中所述的胞内或胞外信号如环境刺激或环境胁迫(促细胞分裂原、缺氧、低氧、温度、盐、光、脱水)或者化学化合物如IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷)或如抗生素(四环素、氨苄青霉素、利福平、卡那霉素)、激素(如赤霉素、生长素、细胞分裂素、糖皮质激素、油菜素类固醇、乙烯、脱落酸等)、激素类似物(吲哚乙酸(IAA)，2，4-D等)、金属(锌、铜、铁等)或者地塞米松等等。如本领域的技术人员所已知，功能性蛋白质的表达还需要一种或多种翻译后修饰，如糖基化、磷酸化、去磷酸化或者一种或多种蛋白质-蛋白质相互作用等。所有的此类方法包括在术语“可表达模式”的范围内。
要理解的是，为了根据本发明的方法在单子叶植物中表达细胞分裂素氧化酶基因，要使用对应于cDNA序列的核酸序列以避免在单子叶植物中内含子错误剪接。待用于在单子叶植物中表达的优选cDNA序列具有SEQID NO：25至30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：42中任何一个所代表的核酸序列。
在植物中细胞分裂素氧化酶基因的组成型表达导致了根生长增加和枝条生长减少，这说明了细胞分裂素氧化酶基因的限制性表达对一般植物生长性质的重要性。可以通过使用细胞特异性启动子、组织特异性启动子或器官特异性启动子来实现对细胞分裂素氧化酶活性的保留，这是因为细胞分裂素的降解是仅限于表达CKX蛋白质的组织或细胞的一个过程，这与依靠激素合成的方法相反。
优选地，在特异性的细胞、组织或器官(优选是植物来源的)中表达蛋白质是通过将编码蛋白质的分离的核酸分子，例如cDNA分子、基因组基因、合成的寡核苷酸分子、mRNA分子或可读框引入此细胞、组织或器官中并表达来实现的，其中核酸分子被有效连接至适当的调节序列或控制序列，包括启动子(优选植物可表达启动子)和终止序列。具体而言并根据本发明的方法，编码CKX的核酸序列被有效连接至能够驱动在种子的糊粉和/或胚胎中表达的启动子上。
本文提到的“启动子”以其最广的内容理解，并且包括来自典型的真核基因组基因的转录调节序列，其包括精确转录起始所需的TATA框，具有或不具有CCAAT框序列以及响应发育和/或外部刺激物或者以组织特异性方式改变基因表达的其它的调节或控制元件(即上游激活序列、增强子和沉默基因)。
术语“启动子”还包括典型原核基因的转录调节序列，在此情况下它可以包括-35框序列和/或-10框转录调节序列。
术语“启动子”还可以用来描述合成分子或融合分子或者激活或增强核酸分子在细胞、组织或器官中表达的衍生物。
启动子可以包含一个或多个特异性调节元件的额外拷贝，以进一步增强与其有效连接的核酸分子的表达和/或改变其空间表达和/或时间性表达。可以将此类调节元件置于与异源启动子序列的相临以驱动核酸分子响应例如铜、糖皮质激素、地塞米松、四环素、赤霉素、cAMP、脱落酸、生长素、创伤、乙烯、茉莉酸或水杨酸表达，或者使得核酸分子对特异性的细胞、组织或器官(例如分生组织、叶、根、胚胎、花、种子或果实)表达。
在本发明中，启动子是能够驱动在种子的糊粉和/或胚胎中表达的植物可表达启动子序列。“植物可表达的”指包含连接到其上的或在其中所包含的任何其它调节元件的启动子序列至少能够在植物细胞、组织或器官(优选单子叶或双子叶植物细胞、组织或器官，例如糊粉和/或胚胎)中诱导、赋予、激活或增强表达。
当在本文中以与启动子序列相关使用时，术语“植物有效性的”和“在植物中有效的”应认为与植物可表达启动子序列等效。
本领域的技术人员还已知作为二元病毒植物表达系统一部分的可调节启动子(Yadav 1999-WO9922003；Yadav 2000-WO0017365)。
在本文中，“可调节启动子序列”是这种启动子，即它能任选地在特定条件下使结构基因在植物的特定细胞、组织或器官或者一群细胞、组织或器官中表达，但是通常不会在所有条件下使其在整个植物中表达。因此，可调节启动子序列可以是这种启动子序列，它能使与其有效连接的基因在特定的一组条件(例如在通过化学化合物或其它诱导物诱导基因表达后)下在植物的特定位置或备选地在全部植物中表达。
优选地，在本发明的方法中使用的可调节启动子使得在植物中的特定位置组成型表达或在诱导后表达，而不是在任何环境下在整个植物中表达。特定地，用于本发明中的可调节启动子是能够驱动在种子的糊粉和/或胚胎中表达的启动子。此类启动子的其它类型是细胞特异性启动子序列、组织特异性启动子序列、器官特异性启动子序列、细胞周期特异性基因启动子序列、诱导型启动子序列和被修饰以使得在任何一个时间在植物的特定部分中表达的组成型启动子序列，例如通过将此类组成型启动子整合到转座遗传元件中(Ac、Ds、Spm、En或其它转座子)。
术语“细胞特异性”应当理解为指，虽然表达在特定的细胞或细胞类型(优选是植物来源的)中不是排他性的，但是表达在该细胞或细胞类型中是占优势的。术语“组织特异性”应当理解为指，虽然表达在特定的组织或组织类型(优选是植物来源的)中不是排他性的，但是表达在该组织或组织类型中是占优势的。类似地，术语“器官特异性”应当理解为指，虽然表达在特定的器官(优选是植物来源的)中不是排他性的，但是表达在该器官中是占优势的。类似地，术语“细胞周期特异性”应当理解为指，虽然表达在循环的细胞(优选是植物来源的)中不是排他性的，但是表达是周期性优势的并且发生在一个或多个(不必是连续的)细胞周期的阶段中。
本领域的技术人员将意识到，“诱导型启动子”是响应发育刺激、化学刺激、环境刺激或物理刺激来增加或诱导其转录活性的启动子。类似地，技术人员会理解，“组成启动子”是在生物(优选是植物)的绝大部分(但不必是所有部分)中，在其生长和发育的绝大部分阶段(但不必是所有阶段)有转录活性的启动子。
本领域的技术人员在不需要过多实验的情况下能够从公开可用资源或容易获得的来源中容易地选择出用于本发明的用途的适当启动子序列。
将核酸分子置于启动子序列调节的控制下或者将其有效连接至启动子序列上，意思是指，将核酸分子以使得其表达受到启动子序列控制的方式放置。启动子通常(但不必须)位于它所调控核酸分子的上游、或5’端，并且在转录起始位点的2kb内。在异源启动子/结构基因组合的构建中，通常优选的是将启动子置于距基因转录起始位点一定距离处，此距离与启动子和启动子在天然状态所控制基因(即启动子来源的基因)之间的距离大致相同。如本领域中所已知，没有丧失启动子功能的一些此距离上的变化是可以接受的。类似地，相对于受调节序列元件控制的异源基因而言，该调节序列元件的优选定位是通过该元件在天然状态(即启动子来源的基因)中的定位确定的。同样地，如在本领域中所已知，也可以存在此距离上的一些改变。
术语“终止子”指的是在转录单元末端的发出转录终止信号的DNA序列。终止子是含有聚腺苷酸化信号的3’-非翻译DNA序列，它促进聚腺苷酸序列添加到初级转录物的3’端。来自病毒、酵母、霉菌、细菌、昆虫、鸟、哺乳动物和植物的在细胞中有活性的终止子是已知的并描述于文献中。它们可以从细菌、真菌、病毒、动物和/或植物分离。
尤其适合于用于本发明基因构建体中的终止子实例包括根瘤土壤杆菌胭脂氨酸合酶(NOS)基因终止子、根瘤土壤杆菌章鱼碱合酶(OCS)基因终止子序列、花椰菜花叶病毒(CaMV)35S基因终止子序列、稻ADP-葡萄糖焦磷酸化酶终止子序列(t3’Bt2)、玉米的玉米醇溶蛋白基因终止子序列、rbcs-1A基因终止子和rbcs-3A基因终止子序列等。
本领域的技术人员将了解适合用于开展本发明的额外启动子序列和终止子序列。可以不用任何过多实验容易地使用此类序列。
在本发明中，术语基因或蛋白质的“异位表达”或“异位过量表达”指的是通常在天然条件下不存在的此基因或蛋白质的表达模式和/或表达水平，更加具体而言是指一个或多个种子的糊粉和/或胚胎中表达增加和/或表达水平增加。
优选地，用于本发明中的启动子序列被有效地连接至编码如上定义的细胞分裂素氧化酶蛋白质或其同源物、衍生物或免疫活性和/或功能性片段的编码序列或可读框(ORF)上。
载体可以任选地包含选择标记基因。如本文所用，术语“选择标记基因”或“选择标记”或“用于选择的标记”或“筛选标记”包括任何使得表达其的细胞具有一种易于对本发明构建体或其衍生物所转染或转化细胞进行鉴定和/或选择的表型的基因。在本文所涉及的适当的选择标记基因包括氨苄青霉素抗性(Ampr)、四环素抗性基因(Tcr)、细菌卡那霉素抗性基因(Kanr)、膦丝菌素抗性基因、新霉素磷酸转移酶基因(nptII)、潮霉素抗性基因、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因、绿色荧光蛋白(gfp)基因(Haseloff等人，1997)，以及荧光素酶基因等。
本发明还涉及包含任何本发明核酸分子或载体的宿主细胞。此宿主细胞选自细菌细胞、昆虫细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞。
本发明另外涉及产生转基因植物、植物细胞或植物组织的方法，其包含将可表达模式的本发明核酸或本发明的载体引入植物、植物细胞或植物组织。
因此，本发明提供了产生具有增加的种子产量的植物的方法，此方法包括：
(a)将包含有编码细胞分裂素氧化酶的分离的核酸分子的基因构建体引入到植物细胞中，其中分离的核酸分子被有效地连接至能够驱动在种子的糊粉和/或胚胎、胚乳中表达的启动子上；
(b)从其再生植物；
(c)使再生的植物生长到结种；以及
(d)选择与相应对照植物相比具有增加的种子产量的植物。
通常在转化后，选择出存在有一个或多个由与目的基因共转移的植物可表达基因所编码标记的植物细胞或细胞组，之后使转化的材料再生成完整植物。
在DNA转移和再生后，可以例如使用Southern分析评估假定转化植物中目的基因的存在、拷贝数量和/或基因组组织。备选地或另外地，新引入DNA的表达水平可以使用Northern和/或Western分析来监测，这两种技术都是本领域的技术人员众所周知的。
可以通过多种方法使产生的转化植物繁殖，例如通过克隆繁殖或经典的培育技术。例如，第一代(或T1)转化植物可以自花授粉以产生纯合的第二代(或T2)转化体，并且将第二代植物通过经典的培育技术进一步繁殖。
所产生的转化生物可以是多种形式。例如，它们可以是转化细胞和未转化细胞的嵌合体；克隆转化体(例如被转化从而含有表达盒的所有细胞)；转化和未转化组织的嫁接(例如在植物中，将转化的根状茎嫁接到未转化的接穗上)。
本发明还涉及包含本发明核酸序列的转基因植物细胞，所述的核酸序列被有效地连接至可允许在种子的糊粉和/或胚胎中转录和/或表达此核酸的调节元件上。
根据另一个优选的实施方案，本发明涉及如上述描述的转基因植物细胞，其中本发明的核酸被稳定整合到此植物细胞的基因组中。
本发明另外涉及包含如本文所描述的植物细胞的转基因植物或植物组织，并且涉及此类转基因植物的可收获部分，优选的选自种子、叶、果实、茎的培养物、根、块茎、根茎和鳞茎。本发明另外涉及直接来自本发明转基因植物可收获部分的产物，如干的颗粒或粉、油、脂肪、脂肪酸、淀粉或蛋白质。本发明还涉及来自任何本发明转基因植物的后代。
优选地，产生了在种子的糊粉和/或胚胎中表达编码CKX的核酸的转基因植物，所述CKX优选是拟南芥CKX、最优选是由SEQ ID NO：3、26、37或42中任何一个所列核酸以及此类核酸的直向同源物所编码的CKX。优选地，直向同源物来自转基因植物的相关物种。更优选地，直向同源物对转基因植物的物种是特异性的(天然或内源的)。
将重组DNA引入植物组织或细胞中的方法包括但不限于，使用CaCl2的转化及其变体，尤其是Hanahan(1983)所描述的方法、原生质体的直接DNA摄取(Krens等人，1982；Paszkowski等人，1984)、PEG介导的原生质体摄取(Armstrong等人，1990)、微粒轰击、电穿孔(Fromm等人，1985)、DNA的显微注射(Crossway等人，1986)、组织外植体或细胞的微粒轰击(Christou等人，1988；Sanford，1988)、用核酸对组织真空渗入、或在植物的情况下的如An等人(1985)，Dodds等人，(1985)，Herrera-Estrella等人(1983a，1983b，1985)所描述的T-DNA介导的从土壤杆菌向植物组织的转移。用于单子叶植物的转化方法是本领域众所周知的并且包括土壤杆菌介导的转化(Cheng等人，1997-WO9748814；Hansen 1998-WO9854961；Hiei等人，1994-WO9400977；Hiei等人，1998-WO9817813；Rikiishi等人，1999-WO9904618；Saito等人，1995-WO9506722)、微粒轰击(Adams等人，1999-US5969213；Bowen等人，1998-US5736369；Chang等人，1994-WO9413822；Lundquist等人，1999-US5874265/US5990390；Vasil和Vasil，1995-US5405765.Walker等人，1999-US5955362)、DNA摄取(Eyal等人，1993-WO9318168)、土壤杆菌细胞的显微注射(von Holt，1994-DE4309203)和超声处理(Finer等人，1997-US5693512)。
根据本领域众所周知的方法，整个植物可以从转化的或转染的细胞再生。能够随后克隆繁殖(不管是通过器官发生还是通过胚胎发生)的植物组织可以用本发明的基因构建体转化，并且从中再生整个植物。所选择的特定组织可以根据可用于或最适合于待转化的特定物种的克隆繁殖系统而不同。作为实例的组织靶标包括叶片、花粉、胚胎、子叶、下胚轴、雌配子、愈伤组织、存在的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)，以及诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。
本文用到的术语“器官发生”指的是这样一种过程，即通过此过程枝条和根从分生组织中心依次发育。
本文用到的术语“胚胎发生”指的是这样一种过程，即通过此过程枝条和根以协同形式(不是依次的)共同发育，既可以从体细胞发育也可以从配子发育。
优选地，通过任何本领域已知的方法用基因序列转染或转化根据本发明方法产生的转基因植物，所述方法例如微粒轰击、显微注射、土壤杆菌介导的转化(包括 in planta转化)、原生质体融合或电穿孔等。最优选的此类植物是由土壤杆菌介导的转化产生的。
对植物、酵母、霉菌或丝状真菌的土壤杆菌介导的转化或农杆枪法转化(agrolistic transformation)是基于一部分转化载体序列(称为T-DNA)向胞核中得转移以及该T-DNA向真核基因组中的整合。
“T-DNA”或转移的DNA意思是指侧翼为T-DNA边界的转化载体部分，在土壤杆菌毒力(vir)基因活化后，于T-DNA边界处将其切个切口，并且作为单链DNA被转移到真核细胞的胞核中。
“农杆枪法转化”指的是组合了土壤杆菌介导的转化和生物射弹DNA送递的特征的转化方法。照此，可将含有靶标质粒的T-DNA与能在植物中(in planta)产生VirD1和VirD2(带有或不带有VirE2)的DNA/RNA共送递(Hansen和Chilton 1996；Hansen等人，1997；Hansen和Chilton1997-WO9712046)。
“外源DNA”指的是通过重组技术引入到宿主基因组中的任何DNA序列。外源DNA包括例如T-DNA序列或其一部分，例如包含可表达模式的选择标记的T-DNA。外源DNA另外包括如上所定义的间插DNA序列。
本发明还包括有效连接至能够驱动在种子的糊粉和/或胚胎中表达的启动子上的编码CKX的核酸的用途和CKX多肽的用途。此类用途之一涉及增加植物、尤其是种子的产量。种子产量可以包括下列一种或多种：增加的每个圆锥花序的花数量、增加的总种子重量、增加的饱满种子数量、增加的千粒重和增加的收获指数，每一种都是相对于野生型植物而言的。
特别地，本发明提供了编码细胞分裂素氧化酶的核酸用于增加植物种子产量的用途，所述的核酸有效连接至能够驱动在种子的糊粉和/或胚胎中过量表达(相对于种子的其它部分)的启动子上。此类用途之一是其中编码细胞分裂素氧化酶的核酸包含在引入到植物细胞的基因构建体中。特别地，编码细胞分裂素氧化酶的核酸的用途被考虑用于增加植物的种子产量，所述的核酸被有效连接至能够驱动在种子的胚胎和/或糊粉中过量表达(相对于种子的其它部分)的启动子上，其中该编码细胞分裂素氧化酶的核酸选自：
(a)包含在任意的SEQ ID NO：42、37、27、1、3、5、7、9、11、25、26、28至30、33或34中给出的DNA序列的核酸或其互补序列，
(b)包含对应于任意的SEQ ID NO：42、37、27、1、3、5、7、9、11、25、26、28至30、33或34的RNA序列的核酸或其互补序列，
(c)与任意的SEQ ID NO：42、37、27、1、3、5、7、9、11、25、26、28至30、33或34或其互补序列特异性杂交的核酸，
(d)编码包含在任意的SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、35、36或38中给出的氨基酸序列的蛋白质的核酸或其互补序列，
(e)如在任意的(a)至(d)中所定义的核酸，其特征在于所述的核酸是DNA、基因组DNA、cDNA、合成DNA或RNA(其中T换成U)，
(f)由于遗传密码的原因，而与在任意的SEQ ID NO：42、37、27、1、3、5、7、9、11、25、26、28至30、33或34中给出的核酸相比或者与在任意的(a)至(e)中所定义的核酸相比为简并性的核酸，
(g)由于生物间密码子选择的不同，而与编码在任意的SEQ IDNO：2、4、6、8、10、12、35、36或38中所给出的蛋白质的核酸不同或者与如在任意的(a)至(e)中所定义的核酸不同的核酸，
(h)编码如在SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、35、36或38中所给出的蛋白质的核酸，或者如在(a)至(e)中所定义的核酸，其由于等位基因间的不同而不同，
(i)编码如在任意的SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、35、36或38中所给出的蛋白质的核酸，
(j)如在任意的(a)至(i)中所定义的核酸的功能性片段，其具有细胞分裂素氧化酶的生物活性，以及
(k)编码植物细胞分裂素氧化酶的核酸，所述细胞分裂素氧化酶包含共有序列hTDYLhholGGTLSssG和cLFxushGsLGQFGllstA。
另外，本发明提供了SEQ ID NO：41的用途和包含如上述(a)至(k)中所定义的细胞分裂素氧化酶的载体的用途，其用于增加植物中的种子产量。
本领域的技术人员应当意识到，除了特定描述的那些以外，还可以对本文中描述的本发明进行变化和修改。要理解的是，在本文描述的本发明包括所有的此类变化和修改。本发明还包括在该说明书中单独或共同涉及和指出的所有此类步骤、特征、组合物和化合物，以及任何或多数这些步骤或特征的任何及所有组合。
在整个说明书中，除了文中另外需要，“包含”将被理解为包括所述的整体或步骤或者整体或步骤的组合，但是并不排除任何其它的整体或步骤或者整体或步骤的组合。
如本文所使用，术语“来自”应当理解为指的是特定的整体或整体组合源自特定物种，但是不必从此特定来源直接得到。
给出下列实施例是为了说明本发明而决不是对本发明的限制。在本申请中所包括的所有参考文献的内容在此引用作为参考，似乎这些参考文献都全部阐述一样。
附图概述
图1：植物细胞分裂素氧化酶基因的图示
显示了从玉米(ZmCKX1，登录号AF044603，Biochem.Biophys.Res.Com.255：328-333，1999)和拟南芥(AtCKX1至AtCKX4)中分离的不同的细胞分裂素氧化酶基因的结构。外显子命名为‘E”并且用阴影框表示。内含子用白色框表示。另外说明了基因大小(以kb计，置于每个结构的顶端)、基因登录号(位于名字下面)和代表了0.5kb的尺寸条。
图2：植物细胞分裂素氧化酶氨基酸序列的比对
将来自玉米的细胞分裂素氧化酶(zmCKX1)和来自拟南芥的细胞分裂素氧化酶(AtCKX1至AtCKX4)的氨基酸序列比对。用黑色框标记完全一致的氨基酸残基，相似的氨基酸残基用灰色框标记。氨基酸相似组：(M、I、L、V)、(F、W、Y)、(G、A)、(S、T)、(R、K、H)、(E、D)、(N、Q)。
图3：入门克隆p41的图示
其在pDONR201主链中用于
Figure S05828129220070227D000371
克隆的AttL1和AttL2位点中包含CDS0427_2。CDS0427_2是拟南芥CKX2编码序列(SEQ ID NO：26)的内部代码。此载体还包含细菌卡那霉素抗性盒和细菌复制原点。
图4：用于在稻中表达受PRO0218启动子控制的拟南芥CKX2基因的二元载体p37。
此载体包含来自Ti质粒的由左边界(LB重复，LB Ti C58)和右边界(RB重复，RBTi C58)限制的T-DNA。此T-DNA从左边界到右边界包含：用于选择所转化植物的选择标记和筛选标记(每一个均处于组成型启动子的控制下)；用于表达拟南芥CKX2基因的PRO0218-CDS0427_2-zein和rbcS-deltaGA的双终止子盒。此载体还包含用于细菌复制的来自pBR322的复制原点和用于使用壮观霉素和链霉素进行细菌选择的选择标记(Spe/SmeR)。
图5：用于在稻中表达受PRO0090启动子控制的拟南芥CKX2基因的二元载体p35。
此载体包含来自Ti质粒的由左边界(LB重复，LB Ti C58)和右边界(RB重复，RB Ti C58)限制的T-DNA。此T-DNA从左边界到右边界包含：用于选择所转化植物的选择标记和筛选标记(每一个均处于组成型启动子的控制下)；用于表达拟南芥CKX2基因的PRO0090-CDS0427_2-zein和rbcS-deltaGA的双终止子盒。此载体还包含用于细菌复制的来自pBR322的复制原点和用于使用壮观霉素和链霉素进行细菌选择的选择标记(Spe/SmeR)。
实施例
实施例1：本发明序列的概述和种子特异性启动子的实例
 SEQ ID NO：   描述
 1   AtCKX1基因组
 2   AtCKX1蛋白质
 3   AtCKX2基因组
 4   AtCKX2蛋白质
 5   AtCKX3基因组
 6   AtCKX3蛋白质
 7   AtCKX4基因组
 8   AtCKX4蛋白质
 9   AtCKX5基因组(短)
 10   AtCKX5蛋白质(短)
 11   AtCKX6基因组
 12   AtCKX6蛋白质
  13   AtCKX15’引物
  14   AtCKX13’引物
  15   AtCKX25’引物
  16   AtCKX23’引物
  17   AtCKX35’引物
  18   AtCKX33’引物
  19   AtCKX45’引物
  20   AtCKX43’引物
  21   AtCKX55’引物
  22   AtCKX53’引物
  23   AtCKX65’引物
  24   AtCKX63’引物
  25   AtCKX1cDNA
  26   AtCKX2cDNA
  27   AtCKX3cDNA
  28   AtCKX4cDNA
  29   AtCKX5cDNA(短)
  30   AtCKX6cDNA
  31   AtCKX2cDNA片段
  32   AtCKX2肽片段
  33   AtCKX5基因组(长)
  34   AtCKX5cDNA(长)
  35   AtCKX5蛋白质(长)
  36   AtCKX2，CDS0427_2推导蛋白质序列
  37   AtCKX2剪接变体，DNA序列
  38   AtCKX2剪接变体，推导蛋白质序列
  39   PRM3769(有义链，起始密码子在位置35至37)
  40   PRM1526(反向链，互补的终止密码子在位置30-32)
  41   具有PRO0218-CDS0427_2-zein和rbcS-deltaGA双终止子的表达盒
  42   AtCKX2，CDS0427_2cDNA
  43   具有PRO0090-CDS0427_2-zein和rbcS-deltaGA双终止子的表达盒
  44   HTDYLhholGGTLSssG特征
  45   cLFxushGsLGQFGllstA特征
表4：适合于种子特异性表达或幼苗优选表达的启动子的实例
  基因名   表达
  金属硫蛋白Mte   胚胎/盾片+愈伤组织
  推定的β淀粉酶   胚胎/盾片
  未知   盾片
  蛋白酶抑制剂Rgpi9   种子
  结构蛋白   早期组织、愈伤组织、胚胎/盾片
  谷醇溶蛋白10Kda   在胚乳中强
  过敏原RA2   种子
  谷醇溶蛋白RP7   胚乳
  类金属硫蛋白ML2   胚胎/盾片+愈伤组织
  谷醇溶蛋白RM9   在胚乳中强
  谷醇溶蛋白RP5   在胚乳中强
  推定的甲硫氨酸氨肽酶   胚胎
  推定的40S核糖体蛋白   在胚乳中弱
  α-球蛋白   在胚乳中强
  谷丙转氨酶   糊粉，胚乳
  cyclophyllin 2   枝条，胚胎/胚乳
  蔗糖合酶SS1(大麦)   适度组成型，枝条胚乳/糊粉
  胰蛋白酶抑制剂ITR1(大麦)   在胚乳中弱
  WSI18   胚胎/糊粉
  水通道蛋白(aquaporine)   幼苗
  RAB21   胚胎/糊粉
  OSH1   幼苗
  Arceline 5A   种子
  Cruciferine   种子
  清蛋白2S3(Albumine 2S3)   种子
  清蛋白2S2   种子
  FAE1   胚胎
  菜豆蛋白β亚基   种子
  Lec1   胚胎
  γ玉米醇溶蛋白   种子
  脂转移蛋白质   种子
实施例2.CKX2基因的种子优选表达或幼苗优选表达使得种子产量增加
A)DNA操作和AtCKX2的克隆
除非另外说明，重组DNA技术根据在(Sambrook & Russell(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New York中或者在Ausubel等人(1994)，CurrentProtocols in Molecular Biology，Current Protocols的第1卷和第2卷中所描述的标准方法进行。用于植物分子操作的标准材料和方法描述于BIOSScientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版的R.D.D.Croy编的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中。
使用拟南芥幼苗cDNA文库(Invitrogen，Paisley，UK)作为模板，通过PCR扩增拟南芥CKX2基因(对应于SEQ ID NO：42)。在从幼苗中提取的RNA逆转录后，将cDNA克隆到pCMV Sport 6.0中。文库的平均插入大小是1.5kb，并且克隆的初始数量是1.59×107cfu。最初的效价被确定为9.6×105cfu/ml，并且在第一次扩增后为6×1011cfu/ml。在质粒提取后，在50μl的PCR混合物中使用200ng模板。使用包括用于Gateway重组的AttB位点的引物prm3769(SEQ ID NO：39)和prm1526(SEQ ID NO：40)用于PCR扩增。
在标准条件下使用Hifi Tag DNA聚合酶进行PCR。使用标准方法扩增和纯化1506bp的PCR片段。之后进行Gateway方法的第一步-BP反应，在此过程中PCR片段和pDONR质粒体内重组以产生“入门克隆”(Gateway的术语)，p41(图3)。pDONR可以作为Gateway技术的一部分从Invitrogen商购。
B)载体构建
随后在LR反应中使用入门克隆p41以及p831或者p830，其中p831或p830都是根据Gateway TM术语的指定载体，用于稻的转化。
p831包含在T-DNA边界内的作为功能性元件的植物选择标记、筛选标记和旨在用于同已经克隆到供体载体中的目标序列进行LR体内重组的Gateway盒。用于胚胎和糊粉优选表达的PRO0218启动子位于此Gateway盒的上游。
类似地，p830包含在T-DNA边界内的作为功能性元件的：植物选择标记、筛选标记和旨在用于同已经克隆到供体载体中的目标序列进行LR体内重组的Gateway盒。用于胚乳优选表达的PRO0090启动子位于此Gateway盒的上游。
在重组步骤后，将得到的表达载体p37(来源自p831，图4)和p35(来源自p830，图5)转化到土壤杆菌菌株LBA4404中并且随后转化到稻植物中。
C)稻的转化
将稻的日本栽培种Nipponbare的成熟干燥种子去壳。将种子在70％乙醇中温育一分钟，随后在0.2％HgCl2中温育30分钟并且用灭菌的蒸馏水洗涤6次(每次15分钟)，来进行灭菌。之后使灭菌的种子在含有2，4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上发芽。在黑暗中培育4周后，将胚性的、来自盾片的愈伤组织切除并且在相同的培养基上繁殖。2周后，通过在相同的培养基上继代培养另外2周将愈伤组织增殖或繁殖。在共培养3天前，将胚性愈伤组织片在新鲜的培养基上继代培养以增加细胞分裂活性。将带有包含适当的选择标记的T-DNA载体的土壤杆菌菌株LBA4404用于共培养。将土壤杆菌在具有适当抗生素的AB培养基上于28℃下培养3天。将细菌收集并且悬浮于液体共培养培养基中，OD600大约为1。将悬液转移到培养皿中并且将愈伤组织浸渍在悬液中15分钟。随后，将愈伤组织在滤纸上吸干，转移到凝固的共培养培养基中并且于25℃黑暗培养3天。
此后，在适当浓度选择试剂存在下，在含有2，4-D的培养基上使共培养的愈伤组织于28℃黑暗生长4周。在此期间，发育出快速生长的抗性愈伤组织岛。将此材料转移到再生培养基中并且在光下培育时，胚发生的潜能被释放并且在随后的4至5周中枝条发育。将枝条从愈伤组织上切除并且在含有生长素的培养基上培育2至3周，将它们从培养基上转移到土壤中。在温室中的高湿度和短日照下硬化枝条生长。最终在移植3至5个月后收获种子。本方法提供了比率大于50％的单基因座转化体(Aldemita和Hodges，1996，Chan等人，1993，Hiei等人，1994)。
D)转化体的评估：营养生长测量
生成了大约15至20个独立的T0转化体。将初级转化体从组织培养室中转移到温室中用来生长和收获T1种子。将转基因在T1后代以存在/缺失为3∶1的比例分离的个转基因事件(对于p37转化体，PRO0218启动子)或5个转基因事件(对于p35转化体，PRO0090启动子)保留下来。对于这些事件中的每一个，通过监测可见标记的表达，选择了10个含有转基因的T1幼苗(杂合的和纯合的)以及10个不含转基因的幼苗(失效合子的)。将选择的T1植物转移到温室中。每个植物具有一个唯一的条形标签以明确地将表型数据与对应植物联系起来。所选择的T1植物在10cm直径花盆中的土壤中并在下列环境状态下生长：光周期：11.5h，日光强度：30,000勒克斯或更多，日间温度：28℃或更高，夜间温度：22℃，相对湿度：60-70％。转基因植物和相应的失效合子在随机位置上并排生长。从播种期到成熟期，植物几次通过数字成像箱。在每个时间点上对每株植物从至少6个不同的角度取得数字图像(2048×1536像素，1千6百万色)。
在下一步中，将成熟的原发圆锥花序收获、装包、用条形标签标记，然后在烘箱中于37℃干燥3天。随后将圆锥花序脱粒并且收集和计数所有的种子。使用鼓风设备将饱满外壳从空的外壳中分离出来。丢弃空的外壳并且再次计算剩下的部分。在分析天平上称重饱满的外壳并且使用数字成像测量种子的截面积。此方法可用于推出一组种子相关参数。
下面描述的参数是使用图像分析软件，以自动方式从数字图像中得到并且进行统计分析的。
将对不平衡设计进行修正的双因素ANOVA(方差分析)用作统计模型用于植物表型特征的全面评估。对在所有植物中测量所有参数和所有带有该基因的转化事件的所有参数进行F检验。进行F检验是为了检查基因在所有转化事件中的效应和证实基因的全面效应(在本文中也称作“全面基因效应”)。如果F检验的值显示数据具有显著意义，那么结论是有“基因”效应，这意味着基因的存在或定位引起了效应。对于F检验，真的全面基因效应显著性的阈值被设定为5％概率水平。
为了检查基因在事件中的效应，即品系特异性效应，在每一事件中使用来自转基因植物和相应无效植物的数据集进行t检验。“无效植物”或“无效分离子”或“无效合子”是以与转基因植物相同的方式处理的但是转基因已经从中分离的植物。也可以将无效植物描述为纯合的阴性转化植物。将t检验显著性的阈值设定为10％概率水平。一些事件的结果可以是在此阈值之内或低于此阈值。这是基于这种假设，即基因可以仅在基因组中的某些位置中具有效应，并且此位置依赖性效应的发生不是罕见的。本文中此类基因效应也称为“基因的品系效应”。通过比较t值和t分布得到p值，或者备选地通过比较F值和F分布得到p值。p值给出了零假设(即没有转基因的作用)为正确的概率。将显著性阈值设定为：对于F检验p值是5％；对于t检验p值是10％。
根据上述方法测量了植物生长和种子产量。发明人令人惊讶地发现，当与无效植物对比时，对于胚乳优选的启动子构建体和胚胎和/或糊粉优选的启动子构建体来说，转基因植物的种子产量都增加(表示为种子总重量、(饱满)种子数量和收获指数)，而与具有胚乳优选的启动子构建体的转基因植物相比，具有胚胎和/或糊粉优选的启动子构建体的转基因植物额外具有增加的千粒重。发明人另外观察到，用胚胎和/或糊粉优选的启动子构建体转化的植物的产量增加高于具有胚乳优选的启动子构建体的植物。具体数据在E和F节给出。
然后，将在使用T1植物的实验中得到的数据在使用T2植物的另外实验中得以证实。通过监测标记基因表达来筛选T1中的来自阳性植物(杂合的和纯合的)的一批种子。对于每一个所选事件，随后保存几批杂合种子用于T2评估。在每批种子中，在温室中种植等量的阳性和阴性植物用于评估。特别地，选择了p37T2转化体的4个事件和p35T2转化体的3个事件用于进一步分析。对于p37T2转化体和p35T2转化体，总共测试了平均分布在每个事件中的120个植物。
E)p37转化体的评估：种子相关参数的测量
当如上所述对种子进行分析时，发明人发现，用处于胚胎和/或糊粉优选启动子控制下的AtCKX2基因转化的植物比缺乏CKX2转基因的植物具有更高的种子总重量、更高的饱满种子数量、更高的收获指数和更高的千粒重。如表5所示，这些发现在使用T1植物的2个独立实验中以及使用T2植物的一个实验中是一致的。除了这些产量参数，T1中3个品系在种子总数方面的评分也是正值。在种子总数方面的这种增加在T2中也得到了证实，其中此效应显示为显著的全面基因效应(平均增加+24％，F检验的p值是0.0032)。
表5：对p37转化体的种子相关参数的分析
Figure S05828129220070227D000461
通过称量从转化的稻植物上收获的所有饱满种子来测量种子总重量。通过计数从转化的稻植物上收获的饱满种子的数量来测量饱满种子数量。通过计数从植物上收获的种子数量来测量总种子数。将收获指数定义为总的种子重量和地上面积(mm2)的比值乘以系数106。千粒重(TKW)可以从所计数的饱满种子数量和它们的总重量得到。图给出了从T1代中4个独立事件(每一事件包含10个携带有转基因的植物和10个无效合子)和T2代中4个独立事件(每一事件包含20个携带转基因的植物和20个无效合子)中的转基因对相应无效合子计算出来的每个参数的平均增加(以％)。对于T2代数据所列出的F检验的p值证明，对于多个种子产量参数，所得到的增加都是显著的并且明显存在全基因效应。
F)p35转化体的评估：种子相关参数的测量
用处于胚乳优选启动子控制下的AtCKX2基因转化的植物与对照无效合子植物相比具有更好的产量，特别是总种子重量、饱满种子数量和收获指数。总种子重量、饱满种子数量和收获指数如上所定义。
在第一个实验中，对比了5个独立事件的T1代植物，对于每一事件为10个携带转基因的T1植物对10个相应的对照T1植物。对于参数“总种子重量”5个事件中有2个事件具有显著的增加(58％和67％，t检验的p值分别是0.0551和0.0211)。对于饱满种子数量得到了类似结果，这两个品系表现出47％和68％的增加，p值分别为0.0846和0.0166。这两个品系的收获指数值是正的(分别增加41％(p值是0.0223)和31％)。除了这两个品系之外，第三个品系也显著高于相应的无效合子对照植物(+41％，p值为0.035)。
在T2代中证实了在T1代中观察到的种子产量的正值数据。在表6中给出了数据。
表6：p37转化体的种子相关参数的分析
Figure S05828129220070227D000471
Figure S05828129220070227D000481
图给出了从T2代中3个独立事件(每一事件包含20个携带转基因的植物和20个无效合子)的转基因对相应的无效合子计算得到的每个参数的平均增加(以％)。对于T2代数据所列出的F检验的p值证明，对于多个种子产量的参数，所得到的增加都是显著的并且明显存在全基因效应。
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序列表
<110>托马斯·施米林
     托马斯·沃纳
<120>包括在种子中表达细胞分裂素氧化酶的改变植物形态学、生物化学和生理学的
     方法
<130>CD-029-PCT-3
<150>US 10/871,304
<151>2004-06-18
<160>45
<170>PatentIn 3.3版
<210>1
<211>2236
<212>DNA
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>1
atgggattga cctcatcctt acggttccat agacaaaaca acaagacttt cctcggaatc   60
ttcatgatct tagttctaag ctgtatacca ggtagaacca atctttgttc caatcattct  120
gttagtaccc caaaagaatt accttcttca aatccttcag atattcgttc ctcattagtt  180
tcactagatt tggagggtta tataagcttc gacgatgtcc acaatgtggc caaggacttt  240
ggcaacagat accagttacc acctttggca attctacatc caaggtcagt ttttgatatt  300
tcatcgatga tgaagcatat agtacatctg ggctccacct caaatcttac agtagcagct  360
agaggccatg gtcactcgct tcaaggacaa gctctagctc atcaaggtgt tgtcatcaaa  420
atggagtcac ttcgaagtcc tgatatcagg atttataagg ggaagcaacc atatgttgat  480
gtctcaggtg gtgaaatatg gataaacatt ctacgcgaga ctctaaaata cggtctttca  540
ccaaagtcct ggacagacta ccttcatttg accgttggag gtacactatc taatgctgga  600
atcagcggtc aagcattcaa gcatggaccc caaatcaaca acgtctacca gctagagatt  660
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aaagaatatc catctcttca tgagcaaaaa cactgacgac tttaaataat ttttgactat  780
aaaacaagag tgcataggca caaatgtgaa atatgcaaca cacaattgta acttgcacca  840
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acctagaact gtataa                                                  2236
<210>2
<211>575
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>2
Met Gly Leu Thr Ser Ser Leu Arg Phe His Arg Gln Asn Asn Lys Thr
1               5                   10                  15
Phe Leu Gly Ile Phe Met Ile Leu Val Leu Ser Cys Ile Pro Gly Arg
            20                  25                  30
Thr Asn Leu Cys Ser Asn His Ser Val Ser Thr Pro Lys Glu Leu Pro
        35                  40                  45
Ser Ser Asn Pro Ser Asp Ile Arg Ser Ser Leu Val Ser Leu Asp Leu
    50                  55                  60
Glu Gly Tyr Ile Ser Phe Asp Asp Val His Asn Val Ala Lys Asp Phe
65                  70                  75                  80
Gly Asn Arg Tyr Gln Leu Pro Pro Leu Ala Ile Leu His Pro Arg Ser
               85                  90                  95
Val Phe Asp Ile Ser Ser Met Met Lys His Ile Val His Leu Gly Ser
            100                 105                 110
Thr Ser Asn Leu Thr Val Ala Ala Arg Gly His Gly His Ser Leu Gln
        115                 120                 125
Gly Gln Ala Leu Ala His Gln Gly Val Val Ile Lys Met Glu Ser Leu
    130                 135                 140
Arg Ser Pro Asp Ile Arg Ile Tyr Lys Gly Lys Gln Pro Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Val Ser Gly Gly Glu Ile Trp Ile Asn Ile Leu Arg Glu Thr Leu Lys
                165                 170                 175
Tyr Gly Leu Ser Pro Lys Ser Trp Thr Asp Tyr Leu His Leu Thr Val
            180                 185                 190
Gly Gly Thr Leu Ser Asn Ala Gly Ile Ser Gly Gln Ala Phe Lys His
        195                 200                 205
Gly Pro Gln Ile Asn Asn Val Tyr Gln Leu Glu Ile Val Thr Gly Lys
    210                 215                 220
Gly Glu Val Val Thr Cys Ser Glu Lys Arg Asn Ser Glu Leu Phe Phe
225                 230                 235                 240
Ser Val Leu Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr Arg Ala Arg
                245                 250                 255
Ile Ser Leu Glu Pro Ala Pro His Met Val Lys Trp Ile Arg Val Leu
            260                 265                 270
Tyr Ser Asp Phe Ser Ala Phe Ser Arg Asp Gln Glu Tyr Leu Ile Ser
        275                 280                 285
Lys Glu Lys Thr Phe Asp Tyr Val Glu Gly Phe Val Ile Ile Asn Arg
    290                 295                 300
Thr Asp Leu Leu Asn Asn Trp Arg Ser Ser Phe Ser Pro Asn Asp Ser
305                 310                 315                 320
Thr Gln Ala Ser Arg Phe Lys Ser Asp Gly Lys Thr Leu Tyr Cys Leu
                325                 330                 335
Glu Val Val Lys Tyr Phe Asn Pro Glu Glu Ala Ser Ser Met Asp Gln
            340                 345                 350
Glu Thr Gly Lys Leu Leu Ser Glu Leu Asn Tyr Ile Pro Ser Thr Leu
        355                 360                 365
Phe Ser Ser Glu Val Pro Tyr Ile Glu Phe Leu Asp Arg Val His Ile
    370                 375                 380
Ala Glu Arg Lys Leu Arg Ala Lys Gly Leu Trp Glu Val Pro His Pro
385                 390                 395                 400
Trp Leu Asn Leu Leu Ile Pro Lys Ser Ser Ile Tyr Gln Phe Ala Thr
                 405                 410                 415
Glu Val Phe Asn Asn Ile Leu Thr Ser Asn Asn Asn Gly Pro Ile Leu
            420                 425                 430
Ile Tyr Pro Val Asn Gln Ser Lys Trp Lys Lys His Thr Ser Leu Ile
        435                 440                 445
Thr Pro Asn Glu Asp Ile Phe Tyr Leu Val Ala Phe Leu Pro Ser Ala
    450                 455                 460
Val Pro Asn Ser Ser Gly Lys Asn Asp Leu Glu Tyr Leu Leu Lys Gln
465                 470                 475                 480
Asn Gln Arg Val Met Asn Phe Cys Ala Ala Ala Asn Leu Asn Val Lys
                485                 490                 495
Gln Tyr Leu Pro His Tyr Glu Thr Gln Lys Glu Trp Lys Ser His Phe
            500                 505                 510
Gly Lys Arg Trp Glu Thr Phe Ala Gln Arg Lys Gln Ala Tyr Asp Pro
        515                 520                 525
Leu Ala Ile Leu Ala Pro Gly Gln Arg Ile Phe Gln Lys Thr Thr Gly
    530                 535                 540
Lys Leu Ser Pro Ile Gln Leu Ala Lys Ser Lys Ala Thr Gly Ser Pro
545                 550                 555                 560
Gln Arg Tyr His Tyr Ala Ser Ile Leu Pro Lys Pro Arg Thr Val
                565                 570                 575
<210>3
<211>2991
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>3
atggctaatc ttcgtttaat gatcacttta atcacggttt taatgatcac caaatcatca   60
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atgttttttg tacatattga atgttgttca tgagaaataa agtaattaca tatacacaca  780
tttattgtcg tacatatata aataattaaa gacaaatttt cacaattggt agcgtgttaa  840
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gatttgtgta gtatttcaaa tatatcattt attttctttc gaataaagag gtggtatatt  960
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<210>4
<211>501
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>4
Met Ala Asn Leu Arg Leu Met Ile Thr Leu Ile Thr Val Leu Met Ile
1               5                   10                  15
Thr Lys Ser Ser Asn Gly Ile Lys Ile Asp Leu Pro Lys Ser Leu Asn
            20                  25                  30
Leu Thr Leu Ser Thr Asp Pro Ser Ile Ile Ser Ala Ala Ser His Asp
        35                  40                  45
Phe Gly Asn Ile Thr Thr Val Thr Pro Gly Gly Val Ile Cys Pro Ser
    50                  55                  60
Ser Thr Ala Asp Ile Ser Arg Leu Leu Gln Tyr Ala Ala Asn Gly Lys
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Ser Thr Phe Gln Val Ala Ala Arg Gly Gln Gly His Ser Leu Asn Gly
                85                  90                  95
Gln Ala Ser Val Ser Gly Gly Val Ile Val Asn Met Thr Cys Ile Thr
            100                 105                 110
Asp Val Val Val Ser Lys Asp Lys Lys Tyr Ala Asp Val Ala Ala Gly
        115                 120                 125
Thr Leu Trp Val Asp Val Leu Lys Lys Thr Ala Glu Lys Gly Val Ser
    130                 135                 140
Pro Val Ser Trp Thr Asp Tyr Leu His Ile Thr Val Gly Gly Thr Leu
145                 150                 155                 160
Ser Asn Gly Gly Ile Gly Gly Gln Val Phe Arg Asn Gly Pro Leu Val
                165                 170                 175
Ser Asn Val Leu Glu Leu Asp Val Ile Thr Gly Lys Gly Glu Met Leu
            180                 185                 190
Thr Cys Ser Arg Gln Leu Asn Pro Glu Leu Phe Tyr Gly Val Leu Gly
        195                 200                 205
Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr Arg Ala Arg Ile Val Leu Asp
    210                 215                 220
His Ala Pro Lys Arg Ala Lys Trp Phe Arg Met Leu Tyr Ser Asp Phe
225                 230                 235                 240
Thr Thr Phe Thr Lys Asp Gln Glu Arg Leu Ile Ser Met Ala Asn Asp
                245                 250                 255
Ile Gly Val Asp Tyr Leu Glu Gly Gln Ile Phe Leu Ser Asn Gly Val
            260                 265                 270
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        275                 280                 285
Leu Val Lys Gln His Gly Ile Ile Tyr Val Leu Glu Val Ala Lys Tyr
    290                 295                 300
Tyr Asp Asp Pro Asn Leu Pro Ile Ile Ser Lys Val Ile Asp Thr Leu
305                 310                 315                 320
Thr Lys Thr Leu Ser Tyr Leu Pro Gly Phe Ile Ser Met His Asp Val
                325                 330                 335
Ala Tyr Phe Asp Phe Leu Asn Arg Val His Val Glu Glu Asn Lys Leu
            340                 345                 350
Arg Ser Leu Gly Leu Trp Glu Leu Pro His Pro Trp Leu Asn Leu Tyr
        355                 360                 365
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Thr Asn Arg Asn Lys Trp Asp Asn Arg Met Ser Ala Met Ile Pro Glu
                405                 410                 415
Ile Asp Glu Asp Val Ile Tyr Ile Ile Gly Leu Leu Gln Ser Ala Thr
            420                 425                 430
Pro Lys Asp Leu Pro Glu Val Glu Ser Val Asn Glu Lys Ile Ile Arg
        435                 440                 445
Phe Cys Lys Asp Ser Gly Ile Lys Ile Lys Gln Tyr Leu Met His Tyr
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Thr Ser Lys Glu Asp Trp Ile Glu His Phe Gly Ser Lys Trp Asp Asp
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Phe Ser Lys Arg Lys Asp Leu Phe Asp Pro Lys Lys Leu Leu Ser Pro
                485                 490                 495
Gly Gln Asp Ile Phe
            500
<210>5
<211>3302
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>5
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ag                                                                 3302
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<212>PRT
<213>拟南芥
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Ile Val Ile Ile Ile Thr Leu Ser Thr Pro Ile Thr Thr Asn Thr Ser
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Pro Gln Pro Trp Asn Ile Leu Ser His Asn Glu Phe Ala Gly Lys Leu
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Val Thr Lys Ile Phe Pro Ser Ala Val Leu Ile Pro Ser Ser Val Glu
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Asp Ile Thr Asp Leu Ile Lys Leu Ser Phe Asp Ser Gln Leu Ser Phe
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Pro Leu Ala Ala Arg Gly His Gly His Ser His Arg Gly Gln Ala Ser
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Ala Lys Asp Gly Val Val Val Asn Met Arg Ser Met Val Asn Arg Asp
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Arg Gly Ile Lys Val Ser Arg Thr Cys Leu Tyr Val Asp Val Asp Ala
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Ile Thr Asn Val Leu Glu Met Asp Val Ile Thr Gly Lys Gly Glu Ile
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Ala Thr Cys Ser Lys Asp Met Asn Ser Asp Leu Phe Phe Ala Val Leu
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Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr Arg Ala Arg Ile Lys Leu
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Phe Ser Glu Phe Thr Arg Asp Gln Glu Arg Val Ile Ser Lys Thr Asp
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Asp Asn Trp Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Pro Ser Asp His Leu Arg Ile
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Lys Gly Ile Ile Leu Arg Asn Asn Ile Thr Ser Gly Pro Val Leu Val
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Phe Val Glu Arg Lys Tyr Lys Tyr Asp Pro Lys Met Ile Leu Ser Pro
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<400>8
Met Thr Asn Thr Leu Cys Leu Ser Leu Ile Thr Leu Ile Thr Leu Phe
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Ile Ser Leu Thr Pro Thr Leu Ile Lys Ser Asp Glu Gly Ile Asp Val
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Phe Leu Pro Ile Ser Leu Asn Leu Thr Val Leu Thr Asp Pro Phe Ser
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Phe Arg His Gly Pro Gln Ile Ser Asn Val His Glu Leu Asp Val Ile
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aacggacaag ccgcggcggg gaggaacggt gtggtggttg aaatgaacca cggcgtaacc  360
gggacgccca agccactcgt ccgaccggat gaaatgtatg tggatgtatg gggtggagag  420
ttatgggtcg atgtgttgaa gaaaacgttg gagcatggct tagcaccaaa atcatggacg  480
gattacttgt atctaaccgt tggaggtaca ctctccaatg caggaatcag tggtcaagct  540
tttcaccatg gtcctcaaat tagtaacgtc cttgagctcg acgttgtaac tggttagtat  600
taaaacattc aagttcatat attttaaatg cttttgtctg aagttttact aataacaaga  660
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ccctggcggg tccatacgtt gtaatctttt tagtttttac tgttgatggt attttttata  900
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ctcactcacc aaataatgat tcctctttac tcttaagttt aattttaata aaaccaactc  1620
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taccccatga acaaagacaa gtaagtcttg acattaccat tgattactac ttctaaattt  2040
cttctctaga aaaaagaata aaacgagttt tgcattgcat gcatgcaaag ttacacttgt  2100
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<210>10
<211>536
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>10
Met Thr Ser Ser Phe Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ile Cys Lys Leu Ile
1               5                   10                  15
Ile Ala Val Gly Leu Asn Val Gly Pro Ser Glu Leu Leu Arg Ile Gly
            20                  25                  30
Ala Ile Asp Val Asp Gly His Phe Thr Val His Pro Ser Asp Leu Ala
        35                  40                  45
Ser Val Ser Ser Asp Phe Gly Met Leu Lys Ser Pro Glu Glu Pro Leu
    50                  55                  60
Ala Val Leu His Pro Ser Ser Ala Glu Asp Val Ala Arg Leu Val Arg
65                  70                  75                  80
Thr Ala Tyr Gly Ser Ala Thr Ala Phe Pro Val Ser Ala Arg Gly His
                85                  90                  95
Gly His Ser Ile Asn Gly Gln Ala Ala Ala Gly Arg Asn Gly Val Val
            100                 105                 110
Val Glu Met Asn His Gly Val Thr Gly Thr Pro Lys Pro Leu Val Arg
        115                 120                 125
Pro Asp Glu Met Tyr Val Asp Val Trp Gly Gly Glu Leu Trp Val Asp
    130                 135                 140
Val Leu Lys Lys Thr Leu Glu His Gly Leu Ala Pro Lys Ser Trp Thr
145                 150                 155                 160
Asp Tyr Leu Tyr Leu Thr Val Gly Gly Thr Leu Ser Asn Ala Gly Ile
                165                 170                 175
Ser Gly Gln Ala Phe His His Gly Pro Gln Ile Ser Asn Val Leu Glu
            180                 185                 190
Leu Asp Val Val Thr Gly Lys Gly Glu Val Met Arg Cys Ser Glu Glu
        195                 200                 205
Glu Asn Thr Arg Leu Phe His Gly Val Leu Gly Gly Leu Gly Gln Phe
    210                 215                 220
Gly Ile Ile Thr Arg Ala Arg Ile Ser Leu Glu Pro Ala Pro Gln Arg
225                 230                 235                 240
Val Arg Trp Ile Arg Val Leu Tyr Ser Ser Phe Lys Val Phe Thr Glu
                245                 250                 255
Asp Gln Glu Tyr Leu Ile Ser Met His Gly Gln Leu Lys Phe Asp Tyr
            260                 265                 270
Val Glu Gly Phe Val Ile Val Asp Glu Gly Leu Val Asn Asn Trp Arg
        275                 280                 285
Ser Ser Phe Phe Ser Pro Arg Asn Pro Val Lys Ile Ser Ser Val Ser
    290                 295                 300
Ser Asn Gly Ser Val Leu Tyr Cys Leu Glu Ile Thr Lys Asn Tyr His
305                 310                 315                 320
Asp Ser Asp Ser Glu Ile Val Asp Gln Glu Val Glu Ile Leu Met Lys
                325                 330                 335
Lys Leu Asn Phe Ile Pro Thr Ser Val Phe Thr Thr Asp Leu Gln Tyr
            340                 345                 350
Val Asp Phe Leu Asp Arg Val His Lys Ala Glu Leu Lys Leu Arg Ser
        355                 360                 365
Lys Asn Leu Trp Glu Val Pro His Pro Trp Leu Asn Leu Phe Val Pro
    370                 375                 380
Lys Ser Arg Ile Ser Asp Phe Asp Lys Gly Val Phe Lys Gly Ile Leu
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Gly Asn Lys Thr Ser Gly Pro Ile Leu Ile Tyr Pro Met Asn Lys Asp
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Lys Trp Asp Glu Arg Ser Ser Ala Val Thr Pro Asp Glu Glu Val Phe
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Tyr Leu Val Ala Leu Leu Arg Ser Ala Leu Thr Asp Gly Glu Glu Thr
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Gln Lys Leu Glu Tyr Leu Lys Asp Gln Asn Arg Arg Ile Leu Glu Phe
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Thr Gln Glu Glu Trp Val Ala His Phe Gly Asp Lys Trp Asp Arg Phe
                485                 490                 495
Arg Ser Leu Lys Ala Glu Phe Asp Pro Arg His Ile Leu Ala Thr Gly
            500                 505                 510
Gln Arg Ile Phe Gln Asn Pro Ser Leu Ser Leu Phe Pro Pro Ser Ser
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Ser Ser Ser Ser Ala Ala Ser Trp
    530                 535
<210>11
<211>1936
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>11
atgcttatag taagaagttt caccatcttg cttctcagct gcatagcctt taagttggct   60
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caagctcaaa caagacatgg aattgttata cacatggaat cactccatcc ccagaagctg  360
caggtctaca gtgtggattc ccctgctcca tatgttgatg tgtctggtgg tgagctgtgg  420
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ctgcatttaa ctgtaggtgg tactctgtcc aatgctggaa taagcggcca ggcattccga  540
catggaccac agatcagcaa tgttcatcaa ctggagattg tcacaggtta gttcagagtt  600
gcagtattcg tgttttgaaa gcatagactc tatatggttg gtgactatta acaacatgaa  660
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caatcaaaca tcagcagtaa caccggagga agaggtattc tacctggtgg cgatcctaac  1680
atcggcatct ccagggtcgg caggaaagga tggagtagaa gagatcttga ggcggaacag  1740
aagaatactg gaattcagtg aagaagcagg gatagggttg aagcagtatc tgccacatta  1800
cacgacaaga gaagagtgga gatcccattt cggggacaag tggggagaat ttgtgaggag  1860
gaaatccaga tatgatccat tggcaattct tgcgcctggc caccgaattt ttcaaaaggc  1920
agtctcatac tcatga                                                  1936
<210>12
<211>504
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>12
Met Leu Ile Val Arg Ser Phe Thr Ile Leu Leu Leu Ser Cys Ile Ala
1               5                   10                  15
Phe Lys Leu Ala Cys Cys Phe Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Lys Ala
            20                  25                  30
Leu Pro Leu Val Gly His Leu Glu Phe Glu His Val His His Ala Ser
        35                  40                  45
Lys Asp Phe Gly Asn Arg Tyr Gln Leu Ile Pro Leu Ala Val Leu His
    50                  55                  60
Pro Lys Ser Val Ser Asp Ile Ala Ser Thr Ile Arg His Ile Trp Met
65                  70                  75                  80
Met Gly Thr His Ser Gln Leu Thr Val Ala Ala Arg Gly Arg Gly His
                85                  90                  95
Ser Leu Gln Gly Gln Ala Gln Thr Arg His Gly Ile Val Ile His Met
            100                 105                 110
Glu Ser Leu His Pro Gln Lys Leu Gln Val Tyr Ser Val Asp Ser Pro
        115                 120                 125
Ala Pro Tyr Val Asp Val Ser Gly Gly Glu Leu Trp Ile Asn Ile Leu
    130                 135                 140
His Glu Thr Leu Lys Tyr Gly Leu Ala Pro Lys Ser Trp Thr Asp Tyr
145                 150                 155                 160
Leu His Leu Thr Val Gly Gly Thr Leu Ser Asn Ala Gly Ile Ser Gly
                165                 170                 175
Gln Ala Phe Arg His Gly Pro Gln Ile Ser Asn Val His Gln Leu Glu
            180                 185                 190
Ile Val Thr Gly Lys Gly Glu Ile Leu Asn Cys Thr Lys Arg Gln Asn
        195                 200                 205
Ser Asp Leu Phe Asn Gly Val Leu Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile
    210                 215                 220
Ile Thr Arg Ala Arg Ile Ala Leu Glu Pro Ala Pro Thr Met Asp Gln
225                 230                 235                 240
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                245                 250                 255
Phe Val Ile Ile Asn Arg Thr Gly Leu Leu Asn Ser Trp Arg Leu Ser
            260                 265                 270
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        275                 280                 285
Arg Thr Leu Tyr Cys Leu Glu Leu Ala Lys Tyr Leu Lys Gln Asp Asn
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Tyr Val Thr Ser Thr Leu Phe Thr Thr Glu Val Ala Tyr Glu Ala Phe
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            420                 425                 430
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        435                 440                 445
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    450                 455                 460
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            500
<210>13
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸：引物或探针
<400>13
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<210>14
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸：引物或探针
<400>14
gcgtcgactt atacagttct aggtttcggc agtat                 35
<210>15
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸：引物或探针
<400>15
gcggtaccag agagagaaac ataaacaaat ggc                   33
<210>16
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸：引物或探针
<400>16
gcggtaccca attttacttc caccaaaatg c                     31
<210>17
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸：引物或探针
<400>17
gcggtacctt cattgataag aatcaagcta ttca                  34
<210>18
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸：引物或探针
<400>18
gcggtaccca aagtggtgag aacgactaac a                     31
<210>19
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸：引物或探针
<400>19
gcggtacccc cattaaccta cccgtttg                         28
<210>20
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸：引物或探针
<400>20
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<210>21
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸：引物或探针
<400>21
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<210>22
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸：引物或探针
<400>22
ggggtaccct ttcctcttgg ttttgtcctg t                     31
<210>23
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸：引物或探针
<400>23
gctctagatc aggaaaagaa ccatgcttat ag                                32
<210>24
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸：引物或探针
<400>24
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<210>25
<211>1728
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>25
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<212>DNA
<213>拟南芥
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<212>PRT
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<400>32
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1               5                   10                  15
Asp Asn Arg Met Ser Ala Met Ile Pro Glu Ile Asp
            20                  25
<210>33
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<212>DNA
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<400>33
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atcagattct cctagaccaa accgatctca acgaaccctc cgcacatcat tgattattac  2400
attaatatag atattgtcgt tgctgacgtg tcgtaatttg atgttattgt cagatgggac  2460
gagaggagct cagccgtgac gccggatgag gaagttttct atctggtggc tctattgaga  2520
tcagctttaa cggacggtga agagacacag aagctagagt atctgaaaga tcagaaccgt  2580
cggatcttgg agttctgtga acaagccaag atcaatgtga agcagtatct tcctcaccac  2640
gcaacacagg aagagtgggt ggctcatttt ggggacaagt gggatcggtt cagaagctta  2700
aaggctgagt ttgatccgcg acacatactc gctactggtc agagaatctt tcaaaaccca  2760
tctttgtctt tgtttcctcc gtcgtcgtct tcttcgtcag cggcttcatg gtga        2814
<210>34
<211>1620
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>34
atgaatcgta tgacgtcaag ctttcttctc ctgacgttcg ccatatgtaa actgatcata    60
gccgtgggtc taaacgtggg ccccagtgag ctcctccgca tcggagccat agatgtcgac  120
ggccacttca ccgtccaccc ttccgactta gcctccgtct cctcagactt cggtatgctg  180
aagtcacctg aagagccatt ggccgtgctt catccatcat cggccgaaga cgtggcacga  240
ctcgtcagaa cagcttacgg ttcagccacg gcgtttccgg tctcagcccg aggccacggc  300
cattccataa acggacaagc cgcggcgggg aggaacggtg tggtggttga aatgaaccac  360
ggcgtaaccg ggacgcccaa gccactcgtc cgaccggatg aaatgtatgt ggatgtatgg  420
ggtggagagt tatgggtcga tgtgttgaag aaaacgttgg agcatggctt agcaccaaaa  480
tcatggacgg attacttgta tctaaccgtt ggaggtacac tctccaatgc aggaatcagt  540
ggtcaagctt ttcaccatgg tcctcaaatt agtaacgtcc ttgagctcga cgttgtaact  600
gggaaaggag aggtgatgag atgctcagaa gaagagaaca caaggctatt ccatggagtt  660
cttggtggat taggtcaatt tgggatcatc actcgagcac gaatctctct cgaaccagct  720
ccccaaaggg tgagatggat acgggtattg tattcgagct tcaaagtgtt tacggaggac  780
caagagtact taatctcaat gcatggtcaa ttaaagtttg attacgtgga aggttttgtg  840
attgtggacg aaggactcgt caacaattgg agatcttctt tcttctctcc acgtaacccc  900
gtcaagatct cctctgttag ttccaacggc tctgttttgt attgccttga gatcaccaag  960
aactaccacg actccgactc cgaaatcgtt gatcaggaag ttgagattct gatgaagaaa 1020
ttgaatttca taccgacatc ggtctttaca acggatttac aatatgtgga ctttctcgac 1080
cgggtacaca aggccgaatt gaagctccgg tccaagaatt tatgggaggt tccacaccca 1140
tggctcaacc tcttcgtgcc aaaatcaaga atctctgact tcgataaagg cgttttcaag 1200
ggcattttgg gaaataaaac aagtggccct attcttatct accccatgaa caaagacaaa 1260
tgggacgaga ggagctcagc cgtgacgccg gatgaggaag ttttctatct ggtggctcta 1320
ttgagatcag ctttaacgga cggtgaagag acacagaagc tagagtatct gaaagatcag 1380
aaccgtcgga tcttggagtt ctgtgaacaa gccaagatca atgtgaagca gtatcttcct 1440
caccacgcaa cacaggaaga gtgggtggct cattttgggg acaagtggga tcggttcaga 1500
agcttaaagg ctgagtttga tccgcgacac atactcgcta ctggtcagag aatctttcaa 1560
aacccatctt tgtctttgtt tcctccgtcg tcgtcttctt cgtcagcggc ttcatggtga 1620
<210>35
<211>539
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>35
Met Asn Arg Met Thr Ser Ser Phe Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ile Cys
1               5                   10                  15
Lys Leu Ile Ile Ala Val Gly Leu Asn Val Gly Pro Ser Glu Leu Leu
            20                  25                  30
Arg Ile Gly Ala Ile Asp Val Asp Gly His Phe Thr Val His Pro Ser
        35                  40                  45
Asp Leu Ala Ser Val Ser Ser Asp Phe Gly Met Leu Lys Ser Pro Glu
    50                  55                  60
Glu Pro Leu Ala Val Leu His Pro Ser Ser Ala Glu Asp Val Ala Arg
65                  70                  75                  80
Leu Val Arg Thr Ala Tyr Gly Ser Ala Thr Ala Phe Pro Val Ser Ala
                85                  90                  95
Arg Gly His Gly His Ser Ile Asn Gly Gln Ala Ala Ala Gly Arg Asn
            100                 105                 110
Gly Val Val Val Glu Met Asn His Gly Val Thr Gly Thr Pro Lys Pro
        115                 120                 125
Leu Val Arg Pro Asp Glu Met Tyr Val Asp Val Trp Gly Gly Glu Leu
    130                 135                 140
Trp Val Asp Val Leu Lys Lys Thr Leu Glu His Gly Leu Ala Pro Lys
145                 150                 155                 160
Ser Trp Thr Asp Tyr Leu Tyr Leu Thr Val Gly Gly Thr Leu Ser Asn
                165                 170                 175
Ala Gly Ile Ser Gly Gln Ala Phe His His Gly Pro Gln Ile Ser Asn
            180                 185                 190
Val Leu Glu Leu Asp Val Val Thr Gly Lys Gly Glu Val Met Arg Cys
        195                 200                 205
Ser Glu Glu Glu Asn Thr Arg Leu Phe His Gly Val Leu Gly Gly Leu
    210                 215                 220
Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr Arg Ala Arg Ile Ser Leu Glu Pro Ala
225                 230                 235                 240
Pro Gln Arg Val Arg Trp Ile Arg Val Leu Tyr Ser Ser Phe Lys Val
                245                 250                 255
Phe Thr Glu Asp Gln Glu Tyr Leu Ile Ser Met His Gly Gln Leu Lys
            260                 265                 270
Phe Asp Tyr Val Glu Gly Phe Val Ile Val Asp Glu Gly Leu Val Asn
        275                 280                 285
Asn Trp Arg Ser Ser Phe Phe Ser Pro Arg Asn Pro Val Lys Ile Ser
    290                 295                 300
Ser Val Ser Ser Asn Gly Ser Val Leu Tyr Cys Leu Glu Ile Thr Lys
305                 310                 315                 320
Asn Tyr His Asp Ser Asp Ser Glu Ile Val Asp Gln Glu Val Glu Ile
                325                 330                 335
Leu Met Lys Lys Leu Asn Phe Ile Pro Thr Ser Val Phe Thr Thr Asp
            340                 345                 350
Leu Gln Tyr Val Asp Phe Leu Asp Arg Val His Lys Ala Glu Leu Lys
        355                 360                 365
Leu Arg Ser Lys Asn Leu Trp Glu Val Pro His Pro Trp Leu Asn Leu
    370                 375                 380
Phe Val Pro Lys Ser Arg Ile Ser Asp Phe Asp Lys Gly Val Phe Lys
385                 390                 395                 400
Gly Ile Leu Gly Asn Lys Thr Ser Gly Pro Ile Leu Ile Tyr Pro Met
                405                 410                 415
Asn Lys Asp Lys Trp Asp Glu Arg Ser Ser Ala Val Thr Pro Asp Glu
            420                 425                 430
Glu Val Phe Tyr Leu Val Ala Leu Leu Arg Ser Ala Leu Thr Asp Gly
        435                 440                 445
Glu Glu Thr Gln Lys Leu Glu Tyr Leu Lys Asp Gln Asn Arg Arg Ile
    450                 455                 460
Leu Glu Phe Cys Glu Gln Ala Lys Ile Asn Val Lys Gln Tyr Leu Pro
465                 470                 475                 480
His His Ala Thr Gln Glu Glu Trp Val Ala His Phe Gly Asp Lys Trp
                485                 490                 495
Asp Arg Phe Arg Ser Leu Lys Ala Glu Phe Asp Pro Arg His Ile Leu
            500                 505                 510
Ala Thr Gly Gln Arg Ile Phe Gln Asn Pro Ser Leu Ser Leu Phe Pro
        515                 520                 525
Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ala Ser Trp
    530                 535
<210>36
<211>501
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>36
Met Ala Asn Leu Arg Leu Met Ile Thr Leu Ile Thr Val Leu Met Ile
1               5                   10                  15
Thr Lys Ser Ser Asn Gly Ile Lys Ile Asp Leu Pro Lys Ser Leu Asn
            20                  25                  30
Leu Thr Leu Ser Thr Asp Pro Ser Ile Ile Ser Ala Ala Ser His Asp
        35                  40                  45
Phe Gly Asn Ile Thr Thr Val Thr Pro Gly Gly Val Ile Cys Pro Ser
    50                  55                  60
Ser Thr Ala Asp Ile Ser Arg Leu Leu Gln Tyr Ala Ala Asn Gly Lys
65                  70                  75                  80
Ser Thr Phe Gln Val Ala Ala Arg Gly Gln Gly His Ser Leu Asn Gly
                85                  90                  95
Gln Ala Ser Val Ser Gly Gly Val Ile Val Asn Met Thr Cys Ile Thr
            100                 105                 110
Asp Val Val Val Ser Lys Asp Lys Lys Tyr Ala Asp Val Ala Ala Gly
        115                 120                 125
Thr Leu Trp Val Asp Val Leu Lys Lys Thr Ala Glu Lys Gly Val Ser
    130                 135                 140
Pro Val Ser Trp Thr Asp Tyr Leu His Ile Thr Val Arg Gly Thr Leu
145                 150                 155                 160
Ser Asn Gly Gly Ile Gly Gly Gln Val Phe Arg Asn Gly Pro Leu Val
                165                 170                 175
Ser Asn Val Leu Glu Leu Asp Val Ile Thr Gly Lys Gly Glu Met Leu
            180                 185                 190
Thr Cys Ser Arg Gln Leu Asn Pro Glu Leu Phe Tyr Gly Val Leu Gly
        195                 200                 205
Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr Arg Ala Arg Ile Val Leu Asp
    210                 215                 220
His Ala Pro Lys Arg Ala Lys Trp Phe Arg Met Leu Tyr Ser Asp Phe
225                 230                 235                 240
Thr Thr Phe Thr Lys Asp Gln Glu Arg Leu Ile Ser Met Ala Asn Asp
                245                 250                 255
Ile Gly Val Asp Tyr Leu Glu Gly Gln Ile Phe Leu Ser Asn Gly Val
            260                 265                 270
Val Asp Thr Ser Phe Phe Pro Pro Ser Asp Gln Ser Lys Val Ala Asp
         275                 280                 285
Leu Val Lys Gln His Gly Ile Ile Tyr Val Leu Glu Val Ala Lys Tyr
    290                 295                 300
Tyr Asp Asp Pro Asn Leu Pro Ile Ile Ser Lys Val Ile Asp Thr Leu
305                 310                 315                 320
Thr Lys Thr Leu Ser Tyr Leu Pro Gly Phe Ile Ser Met His Asp Val
                325                 330                 335
Ala Tyr Phe Asp Phe Leu Asn Arg Val His Val Glu Glu Asn Lys Leu
            340                 345                 350
Arg Ser Leu Gly Leu Trp Glu Leu Pro His Pro Trp Leu Asn Leu Tyr
        355                 360                 365
Val Pro Lys Ser Arg Ile Leu Asp Phe His Asn Gly Val Val Lys Asp
    370                 375                 380
Ile Leu Leu Lys Gln Lys Ser Ala Ser Gly Leu Ala Leu Leu Tyr Pro
385                 390                 395                 400
Thr Asn Arg Asn Lys Trp Asp Asn Arg Met Ser Ala Met Ile Pro Glu
                405                 410                 415
Ile Asp Glu Asp Val Ile Tyr Ile Ile Gly Leu Leu Gln Ser Ala Thr
            420                 425                 430
Pro Lys Asp Leu Pro Glu Val Glu Ser Val Asn Glu Lys Ile Ile Arg
        435                 440                 445
Phe Cys Lys Asp Ser Gly Ile Lys Ile Lys Gln Tyr Leu Met His Tyr
    450                 455                 460
Thr Ser Lys Glu Asp Trp Ile Glu His Phe Gly Ser Lys Trp Asp Asp
465                 470                 475                 480
Phe Ser Lys Arg Lys Asp Leu Phe Asp Pro Lys Lys Leu Leu Ser Pro
                485                 490                 495
Gly Gln Asp Ile Phe
            500
<210>37
<211>1455
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>37
atggctaatc ttcgtttaat gatcacttta atcacggttt taatgatcac caaatcatca     60
aacggtatta aaattgattt acctaaatcc cttaacctca ccctctctac cgatccttcc    120
atcatctccg cagcctctca tgacttcgga aacataacca ccgtgacccc cggcggcgta    180
atctgcccct cctccaccgc tgatatctct cgtctcctcc aatacgccgc aaacggaaaa    240
agtacattcc aagtagcggc tcgtggccaa ggccactcct taaacggcca agcctcggtc    300
tccggcggag taatcgtcaa catgacgtgt atcactgacg tggtggtttc aaaagacaag  360
aagtacgctg acgtggcggc cgggacgtta tgggtggatg tgcttaagaa gacggcggag  420
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tcgaatggtg gaattggtgg tcaagtgttt cgaaacggtc ctcttgttag taacgtcctt  540
gaattggacg ttattactgg gaaaggtgaa atgttgacat gctcgcgaca gctaaaccca  600
gaattgttct atggagtgtt aggaggtttg ggtcaatttg gaattataac gagagccaga  660
attgttttgg accatgcacc taaacggcaa gaacgtttga tatcaatggc aaacgatatt  720
ggagtcgact atttagaagg tcaaatattt ctatcaaacg gtgtcgttga cacctctttt  780
ttcccacctt cagatcaatc taaagtcgct gatctagtca agcaacacgg tatcatctat  840
gttcttgaag tagccaagta ttatgatgat cccaatctcc ccatcatcag caaggttatt  900
gacacattaa cgaaaacatt aagttacttg cccgggttca tatcaatgca cgacgtggcc  960
tacttcgatt tcttgaaccg tgtacatgtc gaagaaaata aactcagatc tttgggatta 1020
tgggaacttc ctcatccttg gcttaacctc tacgttccta aatctcggat tctcgatttt 1080
cataacggtg ttgtcaaaga cattcttctt aagcaaaaat cagcttcggg actcgctctt 1140
ctctatccaa caaaccggaa taaatgggac aatcgtatgt cggcgatgat accagagatc 1200
gatgaagatg ttatatatat tatcggacta ctacaatccg ctaccccaaa ggatcttcca 1260
gaagtggaga gcgttaacga gaagataatt aggttttgca aggattcagg tattaagatt 1320
aagcaatatc taatgcatta tactagtaaa gaagattgga ttgagcattt tggatcaaaa 1380
tgggatgatt tttcgaagag gaaagatcta tttgatccca agaaactgtt atctccaggg 1440
caagacatct tttga                                                  1455
<210>38
<211>484
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>38
Met Ala Asn Leu Arg Leu Met Ile Thr Leu Ile Thr Val Leu Met Ile
1               5                   10                  15
Thr Lys Ser Ser Asn Gly Ile Lys Ile Asp Leu Pro Lys Ser Leu Asn
            20                  25                  30
Leu Thr Leu Ser Thr Asp Pro Ser Ile Ile Ser Ala Ala Ser His Asp
        35                  40                  45
Phe Gly Asn Ile Thr Thr Val Thr Pro Gly Gly Val Ile Cys Pro Ser
    50                  55                  60
Ser Thr Ala Asp Ile Ser Arg Leu Leu Gln Tyr Ala Ala Asn Gly Lys
65                  70                  75                  80
Ser Thr Phe Gln Val Ala Ala Arg Gly Gln Gly His Ser Leu Asn Gly
                85                  90                  95
Gln Ala Ser Val Ser Gly Gly Val Ile Val Asn Met Thr Cys Ile Thr
            100                 105                 110
Asp Val Val Val Ser Lys Asp Lys Lys Tyr Ala Asp Val Ala Ala Gly
        115                 120                 125
Thr Leu Trp Val Asp Val Leu Lys Lys Thr Ala Glu Lys Gly Val Ser
    130                 135                 140
Pro Val Ser Trp Thr Asp Tyr Leu His Ile Thr Val Arg Gly Thr Leu
145                 150                 155                 160
Ser Asn Gly Gly Ile Gly Gly Gln Val Phe Arg Asn Gly Pro Leu Val
                165                 170                 175
Ser Asn Val Leu Glu Leu Asp Val Ile Thr Gly Lys Gly Glu Met Leu
            180                 185                 190
Thr Cys Ser Arg Gln Leu Asn Pro Glu Leu Phe Tyr Gly Val Leu Gly
        195                 200                 205
Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr Arg Ala Arg Ile Val Leu Asp
    210                 215                 220
His Ala Pro Lys Arg Gln Glu Arg Leu Ile Ser Met Ala Asn Asp Ile
225                 230                 235                 240
Gly Val Asp Tyr Leu Glu Gly Gln Ile Phe Leu Ser Asn Gly Val Val
                245                 250                 255
Asp Thr Ser Phe Phe Pro Pro Ser Asp Gln Ser Lys Val Ala Asp Leu
            260                 265                 270
Val Lys Gln His Gly Ile Ile Tyr Val Leu Glu Val Ala Lys Tyr Tyr
        275                 280                 285
Asp Asp Pro Asn Leu Pro Ile Ile Ser Lys ValIle Asp Thr Leu Thr
    290                 295                 300
Lys Thr Leu Ser Tyr Leu Pro Gly Phe Ile Ser Met His Asp Val Ala
305                 310                 315                 320
Tyr Phe Asp Phe Leu Asn Arg Val His Val Glu Glu Asn Lys Leu Arg
                325                 330                 335
Ser Leu Gly Leu Trp Glu Leu Pro His Pro Trp Leu Asn Leu Tyr Val
            340                 345                 350
Pro Lys Ser Arg Ile Leu Asp Phe His Asn Gly Val Val Lys Asp Ile
        355                 360                 365
Leu Leu Lys Gln Lys Ser Ala Ser Gly Leu Ala Leu Leu Tyr Pro Thr
    370                 375                 380
Asn Arg Asn Lys Trp Asp Asn Arg Met Ser Ala Met Ile Pro Glu Ile
385                 390                 395                 400
Asp Glu Asp Val Ile Tyr Ile Ile Gly Leu Leu Gln Ser Ala Thr Pro
                405                 410                 415
Lys Asp Leu Pro Glu Val Glu Ser Val Asn Glu Lys Ile Ile Arg Phe
            420                 425                 430
Cys Lys Asp Ser Gly Ile Lys Ile Lys Gln Tyr Leu Met His Tyr Thr
        435                 440                 445
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Ser Lys Arg Lys Asp Leu Phe Asp Pro Lys Lys Leu Leu Ser Pro Gly
465                 470                 475                 480
Gln Asp Ile Phe
<210>39
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸：引物或探针
<400>39
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggct aatcttcgtt taatgatcac    60
<210>40
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸：引物或探针
<400>40
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt caaaagatgt cttgccctg                49
<210>41
<211>3328
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>表达盒
<220>
<221>misc_feature
<222>(2495)..(2496)
<223>n是a、c、g或t
<400>41
ggtcagccaa tacattgatc cgttgccaat catgcaaagt attttggctg tggccgagtg    60
ccggaattga taattgtgtt ctgactaaat taaatgacca gaagtcgcta tcttccaatg   120
tatccgaaac ctggattaaa caatcctgtt ctgttctcta gcccctcctg catggccgga   180
ttgttttttt gacatgtttt cttgactgag gcctgtttgt tctaaacttt ttcttcaaac   240
ttttaacttt ttcatcacat cagaactttt ctacacatat aaacttttaa cttttccgtc   300
acatcgttcc aatttcaatc aaactttcaa ttttggcgtg aactaaacac accctgagtc   360
ttttattgct cctccgtacg ggttggctgg ttgagaatag gtattttcag agagaaaatc   420
tagatattgg gaggaacttg gcatgaatgg ccactatatt tagagcaatt ctacggtcct   480
tgaggaggta ccatgaggta ccaaaatttt agtgtaaatt ttagtatctc attataacta   540
ggtattatga ggtaccaaat ttacaataga aaaaatagta cttcatggta ctttcttaag   600
taccgtaaaa ttgctcctat atttaagggg atgtttatat ctatccatat ccataatttg   660
attttgataa gaaaaaatgt gagcacacca agcatgtcca tgaccttgca ctcttggctc     720
actcgtcaac tgtgaagaac ctcaaaaatg ctcaatatag ctacaggtgc ctgaaaaaat     780
aactttaaag ttttgaacat cgatttcact aaacaacaat tattatctcc ctctgaaaga     840
tgatagttta gaactctaga atcattgtcg gcggagaaag taaattattt tccccaaatt     900
tccagctatg aaaaaaccct caccaaacac catcaaacaa gagttcacca aaccgcccat     960
gcggccatgc tgtcacgcaa cgcaccgcat tgcctgatgg ccgctcgatg catgcatgct    1020
tccccgtgca catatccgac agacgcgccg tgtcagcgag ctcctcgacc gacctgtgta    1080
gcccatgcaa gcatccaccc ccgccacgta caccccctcc tcctccctac gtgtcaccgc    1140
tctctccacc tatatatgcc cacctggccc ctctcetccc atctccactt cacccgatcg    1200
cttcttcttc ttcttcgttg cattcatctt gctagcattt aaatcaacta gggatatcac    1260
aagtttgtac aaaaaagcag gcttcacaat ggctaatctt cgtttaatga tcactttaat    1320
cacggtttta atgatcacca aatcatcaaa cggtattaaa attgatttac ctaaatccct    1380
taacctcacc ctctctaccg atccttccat catctccgca gcctctcatg acttcggaaa    1440
cataaccacc gtgacccccg gcggcgtaat ctgcccctcc tccaccgctg atatctctcg    1500
tctcctccaa tacgccgcaa acggaaaaag tacattccaa gtagcggctc gtggccaagg    1560
ccactcctta aacggccaag cctcggtctc cggcggagta atcgtcaaca tgacgtgtat    1620
cactgacgtg gtggtttcaa aagacaagaa gtacgctgac gtggcggccg ggacgttatg    1680
ggtggatgtg cttaagaaga cggcggagaa aggggtgtcg ccggtttctt ggacggatta    1740
tttgcatata accgtcggag gaacgttgtc gaatggtgga attggtggtc aagtgtttcg    1800
aaacggtcct cttgttagta acgtccttga attggacgtt attactggga aaggtgaaat    1860
gttgacatgc tcgcgacagc taaacccaga attgttctat ggagtgttag gaggtttggg    1920
tcaatttgga attataacga gagccagaat tgttttggac catgcaccta aacggcaaga    1980
acgtttgata tcaatggcaa acgatattgg agtcgactat ttagaaggtc aaatatttct    2040
atcaaacggt gtcgttgaca cctctttttt cccaccttca gatcaatcta aagtcgctga    2100
tctagtcaag caacacggta tcatctatgt tcttgaagta gccaagtatt atgatgatcc    2160
caatctcccc atcatcagca aggttattga cacattaacg aaaacattaa gttacttgcc    2220
cgggttcata tcaatgcacg acgtggccta cttcgatttc ttgaaccgtg tacatgtcga    2280
agaaaataaa ctcagatctt tgggattatg ggaacttcct catccttggc ttaacctcta    2340
cgttcctaaa tctcggattc tcgattttca taacggtgtt gtcaaagaca ttcttcttaa    2400
gcaaaaatca gcttcgggac tcgctcttct ctatccaaca aaccggaata agtacatact  2460
tctcttcatt catatttatc ttcaagaacc aaagnnatgg gacaatcgta tgtcggcgat  2520
gataccagag atcgatgaag atgttatata tattatcgga ctactacaat ccgctacccc  2580
aaaggatctt ccagaagtgg agagcgttaa cgagaagata attaggtttt gcaaggattc  2640
aggtattaag attaagcaat atctaatgca ttatactagt aaagaagatt ggattgagca  2700
ttttggatca aaatgggatg atttttcgaa gaggaaagat ctatttgatc ccaagaaact  2760
gttatctcca gggcaagaca tcttttgaac ccagctttct tgtacaaagt ggtgatatca  2820
caagcccggg cggtcttcta gggataacag ggtaattata tccctctaga tcacaagccc  2880
gggcggtctt ctacgatgat tgagtaataa tgtgtcacgc atcaccatgg gtggcagtgt  2940
cagtgtgagc aatgacctga atgaacaatt gaaatgaaaa gaaaaaaagt actccatctg  3000
ttccaaatta aaattcattt taacctttta ataggtttat acaataattg atatatgttt  3060
tctgtatatg tctaatttgt tatcatccgg gcggtcttct agggataaca gggtaattat  3120
atccctctag acaacacaca acaaataaga gaaaaaacaa ataatattaa tttgagaatg  3180
aacaaaagga ccatatcatt cattaactct tctccatcca tttccatttc acagttcgat  3240
agcgaaaacc gaataaaaaa cacagtaaat tacaagcaca acaaatggta caagaaaaac  3300
agttttccca atgccataat actcgaac                                     3328
<210>42
<211>1506
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>42
atggctaatc ttcgtttaat gatcacttta atcacggttt taatgatcac caaatcatca   60
aacggtatta aaattgattt acctaaatcc cttaacctca ccctctctac cgatccttcc  120
atcatctccg cagcctctca tgacttcgga aacataacca ccgtgacccc cggcggcgta  180
atctgcccct cctccaccgc tgatatctct cgtctcctcc aatacgccgc aaacggaaaa  240
agtacattcc aagtagcggc tcgtggccaa ggccactcct taaacggcca agcctcggtc  300
tccggcggag taatcgtcaa catgacgtgt atcactgacg tggtggtttc aaaagacaag  360
aagtacgctg acgtggcggc cgggacgtta tgggtggatg tgcttaagaa gacggcggag  420
aaaggggtgt cgccggtttc ttggacggat tatttgcata taaccgtccg aggaacgttg  480
tcgaatggtg gaattggtgg tcaagtgttt cgaaacggtc ctcttgttag taacgtcctt  540
gaattggacg ttattactgg gaaaggtgaa atgttgacat gctcgcgaca gctaaaccca   600
gaattgttct atggagtgtt aggaggtttg ggtcaatttg gaattataac gagagccaga   660
attgttttgg accatgcacc taaacgggcc aaatggtttc ggatgctcta cagtgatttc   720
acaactttta caaaggacca agaacgtttg atatcaatgg caaacgatat tggagtcgac   780
tatttagaag gtcaaatatt tctatcaaac ggtgtcgttg acacctcttt tttcccacct   840
tcagatcaat ctaaagtcgc tgatctagtc aagcaacacg gtatcatcta tgttcttgaa   900
gtagccaagt attatgatga tcccaatctc cccatcatca gcaaggttat tgacacatta   960
acgaaaacat taagttactt gcccgggttc atatcaatgc acgacgtggc ctacttcgat  1020
ttcttgaacc gtgtacatgt cgaagaaaat aaactcagat ctttgggatt atgggaactt  1080
cctcatcctt ggcttaacct ctacgttcct aaatctcgga ttctcgattt tcataacggt  1140
gttgtcaaag acattcttct taagcaaaaa tcagcttcgg gactcgctct tctctatcca  1200
acaaaccgga ataaatggga caatcgtatg tcggcgatga taccagagat cgatgaagat  1260
gttatatata ttatcggact actacaatcc gctaccccaa aggatcttcc agaagtggag  1320
agcgttaacg agaagataat taggttttgc aaggattcag gtattaagat taagcaatat  1380
ctaatgcatt atactagtaa agaagattgg attgagcatt ttggatcaaa atgggatgat  1440
ttttcgaaga ggaaagatct atttgatccc aagaaactgt tatctccagg gcaagacatc  1500
ttttga                                                             1506
<210>43
<211>2746
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>表达盒
<220>
<221>misc_feature
<222>(1913)..(1914)
<223>n是a、c、g或t
<400>43
cttctacatc ggcttaggtg tagcaacacg actttattat tattattatt attattatta   60
ttattttaca aaaatataaa atagatcagt ccctcaccac aagtagagca agttggtgag  120
ttattgtaaa gttctacaaa gctaatttaa aagttattgc attaacttat ttcatattac  180
aaacaagagt gtcaatggaa caatgaaaac catatgacat actataattt tgtttttatt  240
attgaaatta tataattcaa agagaataaa tccacatagc cgtaaagttc tacatgtggt    300
gcattaccaa aatatatata gcttacaaaa catgacaagc ttagtttgaa aaattgcaat    360
ccttatcaca ttgacacata aagtgagtga tgagtcataa tattattttc tttgctaccc    420
atcatgtata tatgatagcc acaaagttac tttgatgatg atatcaaaga acatttttag    480
gtgcacctaa cagaatatcc aaataatatg actcacttag atcataatag agcatcaagt    540
aaaactaaca ctctaaagca accgatggga aagcatctat aaatagacaa gcacaatgaa    600
aatcctcatc atccttcacc acaattcaaa tattatagtt gaagcatagt agtaatttaa    660
atcaactagg gatatcacaa gtttgtacaa aaaagcaggc ttcacaatgg ctaatcttcg    720
tttaatgatc actttaatca cggttttaat gatcaccaaa tcatcaaacg gtattaaaat    780
tgatttacct aaatccctta acctcaccct ctctaccgat ccttccatca tctccgcagc    840
ctctcatgac ttcggaaaca taaccaccgt gacccccggc ggcgtaatct gcccctcctc    900
caccgctgat atctctcgtc tcctccaata cgccgcaaac ggaaaaagta cattccaagt    960
agcggctcgt ggccaaggcc actccttaaa cggccaagcc tcggtctccg gcggagtaat   1020
cgtcaacatg acgtgtatca ctgacgtggt ggtttcaaaa gacaagaagt acgctgacgt   1080
ggcggccggg acgttatggg tggatgtgct taagaagacg gcggagaaag gggtgtcgcc   1140
ggtttcttgg acggattatt tgcatataac cgtcggagga acgttgtcga atggtggaat   1200
tggtggtcaa gtgtttcgaa acggtcctct tgttagtaac gtccttgaat tggacgttat   1260
tactgggaaa ggtgaaatgt tgacatgctc gcgacagcta aacccagaat tgttctatgg   1320
agtgttagga ggtttgggtc aatttggaat tataacgaga gccagaattg ttttggacca   1380
tgcacctaaa cggcaagaac gtttgatatc aatggcaaac gatattggag tcgactattt   1440
agaaggtcaa atatttctat caaacggtgt cgttgacacc tcttttttcc caccttcaga   1500
tcaatctaaa gtcgctgatc tagtcaagca acacggtatc atctatgttc ttgaagtagc   1560
caagtattat gatgatccca atctccccat catcagcaag gttattgaca cattaacgaa   1620
aacattaagt tacttgcccg ggttcatatc aatgcacgac gtggcctact tcgatttctt   1680
gaaccgtgta catgtcgaag aaaataaact cagatctttg ggattatggg aacttcctca   1740
tccttggctt aacctctacg ttcctaaatc tcggattctc gattttcata acggtgttgt   1800
caaagacatt cttcttaagc aaaaatcagc ttcgggactc gctcttctct atccaacaaa   1860
ccggaataag tacatacttc tcttcattca tatttatctt caagaaccaa agnnatggga   1920
caatcgtatg tcggcgatga taccagagat cgatgaagat gttatatata ttatcggact   1980
actacaatcc gctaccccaa aggatcttcc agaagtggag agcgttaacg agaagataat  2040
taggttttgc aaggattcag gtattaagat taagcaatat ctaatgcatt atactagtaa  2100
agaagattgg attgagcatt ttggatcaaa atgggatgat ttttcgaaga ggaaagatct  2160
atttgatccc aagaaactgt tatctccagg gcaagacatc ttttgaaccc agctttcttg  2220
tacaaagtgg tgatatcaca agcccgggcg gtcttctagg gataacaggg taattatatc  2280
cctctagatc acaagcccgg gcggtcttct acgatgattg agtaataatg tgtcacgcat  2340
caccatgggt ggcagtgtca gtgtgagcaa tgacctgaat gaacaattga aatgaaaaga  2400
aaaaaagtac tccatctgtt ccaaattaaa attcatttta accttttaat aggtttatac  2460
aataattgat atatgttttc tgtatatgtc taatttgtta tcatccgggc ggtcttctag  2520
ggataacagg gtaattatat ccctctagac aacacacaac aaataagaga aaaaacaaat  2580
aatattaatt tgagaatgaa caaaaggacc atatcattca ttaactcttc tccatccatt  2640
tccatttcac agttcgatag cgaaaaccga ataaaaaaca cagtaaatta caagcacaac  2700
aaatggtaca agaaaaacag ttttcccaat gccataatac tcgaac                 2746
<210>44
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白质特征
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(7)
<223>Xaa可以是下列任何疏水性氨基酸：Gly、His、Leu、Arg、Thr、Trp或Tyr
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>Xaa可以是下列任何醇：Ser或Thr
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>Xaa可以是下列任何脂族氨基酸：Val或Ile
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(16)
<223>Xaa可以是下列任何小氨基酸：Ala、Asp、Gly、Asn、Thr或Val
<400>44
His Thr Asp Tyr Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Gly Thr Leu Ser Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Gly
<210>45
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白质特征
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>Xaa可以是下列任何带电荷的氨基酸：Asp、Glu或Arg
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa以是任何氨基酸、优选下列氨基酸：Tyr、Arg、Asn、Phe、Asp或His
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>Xaa可以是下列任何极小的氨基酸：Ala、Gly或Ser
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>Xaa可以是下列任何小氨基酸：Ala、Asp、Gly、Asn、Thr或Val
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>Xaa可以是下列任何疏水性氨基酸：Gly、His、Leu、Arg、Thr、Trp或Tyr
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>Xaa可以是下列任何小氨基酸：Ala、Asp、Gly、Asn、Thr或Val
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(16)
<223>Xaa以是下列任何脂族氨基酸：Val或Ile
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>Xaa可以是下列任何小氨基酸：Ala、Asp、Gly、Asn、Thr或Val
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>Xaa可以是下列任何转角偏好的氨基酸：Arg或Asn
<400>45
Xaa Leu Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Leu Gly Gln Phe Gly Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Ala

Claims (22)

1.增加植物中种子产量的方法，所述的方法包括在植物种子的胚胎和/或糊粉中增加细胞分裂素氧化酶2水平和/或活性，其中所述的胚胎和/或糊粉与所述种子的其它部分相比具有增加的细胞分裂素氧化酶2水平和/或活性。
2.根据权利要求1的方法，其中通过引入遗传修饰，实现所述的在胚胎和/或糊粉中增加表达。
3.根据权利要求2的方法，其中通过T-DNA激活、基因组中靶向引入局部损害、位点定向诱变或定向进化中的一种来实现所述遗传修饰。
4.用于增加植物中种子产量的方法，所述方法包括将包含编码细胞分裂素氧化酶2的分离的核酸分子的基因构建体引入植物细胞，其中所述的分离的核酸分子被有效连接至能够驱动在种子的糊粉和/或胚胎中相对于种子的其它部分而言过量表达的启动子上。
5.产生具有增加的种子产量和在种子的胚胎和/或糊粉中具有增加的细胞分裂素氧化酶2表达的植物的方法，所述的方法包括将包含编码细胞分裂素氧化酶2的分离的核酸分子的基因构建体引入植物细胞，其中所述的分离的核酸分子被有效连接至能够驱动在种子的糊粉和/或胚胎中相对于种子的其它部分而言过量表达的启动子上。
6.产生具有增加的种子产量和在种子的胚胎和/或糊粉中具有增加的细胞分裂素氧化酶2表达的植物的方法，所述的方法包括：
(a)将包含编码细胞分裂素氧化酶2的分离的核酸分子的基因构建体引入植物细胞中，其中所述的分离的核酸分子被有效地连接至能够驱动在种子的糊粉和/或胚胎中相对于种子的其它部分而言过量表达的启动子上；
(b)从其再生植物；
(c)使再生的植物生长到结种；以及
(d)选择与相应野生型植物相比具有增加的种子产量的植物。
7.权利要求4至6中任意一项的方法，其中能够驱动在胚胎和/或糊粉中表达的启动子包含SEQ ID NO：41的核苷酸1-1256。
8.权利要求2至6中任意一项的方法，其中编码细胞分裂素氧化酶2的核酸分子选自：
(a)包含在SEQ ID NO：42、37、3、或26之任一中给出的DNA序列的核酸或其互补序列，
(b)包含对应于SEQ ID NO：42、37、3、或26之任一的RNA序列的核酸或其互补序列，
(c)编码包含在SEQ ID NO：4、36或38之任一中给出的氨基酸序列的蛋白质的核酸或其互补序列，
(d)如在(a)至(c)之任一中所定义的核酸，其特征在于所述的核酸是DNA、基因组DNA、cDNA、合成DNA或其中的T换成U的RNA，
(e)由于遗传密码的原因，而与SEQ ID NO：42、37、3、或26之任一中给出的核酸相比或者与(a)至(d)之任一中所定义的核酸相比为简并性的核酸，
(f)由于生物间密码子选择的不同，而与编码SEQ ID NO：4、36或38之任一中所给出的蛋白质的核酸不同或者与如在(a)至(d)之任一中所定义的核酸不同的核酸，
(g)编码如在SEQ ID NO：4、36或38中所给出的蛋白质的核酸，或者如在(a)至(d)中所定义的核酸，其由于等位基因间的不同而不同，
(h)编码如在SEQ ID NO：4、36或38之任一中所给出的蛋白质的核酸，以及
(i)如在(a)至(h)之任一中所定义的编码植物细胞分裂素氧化酶2的核酸，所述细胞分裂素氧化酶2包含共有序列hTDYLhholGGTLSssG和cLFxushGsLGQFGllstA，其中x是Y，R，N，F，D或H。
9.权利要求4至6中任意一项的方法，其中被有效连接至能够驱动在胚胎和/或糊粉中表达的启动子上的分离的核酸分子包含如在SEQ IDNO：41中所列的核苷酸序列。
10.权利要求1至6中任意一项的方法，其中种子产量的增加包括种子总重量、种子总数量、饱满种子总数量、收获指数和千粒重中的至少一种。
11.分离的核酸分子，其为有效连接至能够驱动在种子的胚胎和/或糊粉中相对于种子的其它部分而言过量表达的启动子上的编码细胞分裂素氧化酶2的核酸。
12.包含权利要求11的分离的核酸分子的载体。
13.包含具有在SEQ ID NO：41中所列序列的与启动子有效连接的分离的核酸分子的载体，其中所述启动子能够驱动在种子的糊粉和/或胚胎中相对于种子的其它部分而言的过量表达。
14.包含权利要求11的分离的核酸分子的宿主细胞。
15.包含权利要求12或13的载体的宿主细胞。
16.权利要求15的宿主细胞，其为细菌、真菌或植物细胞。
17.编码细胞分裂素氧化酶2的核酸的用途，其用于增加种子产量，所述核酸被有效连接至能够驱动在种子的糊粉和/或胚胎中相对于种子的其它部分而言过量表达的启动子上。
18.根据权利要求17的用途，其中所述的编码细胞分裂素氧化酶2的核酸包含在被引入到植物细胞中的基因构建体中。
19.根据权利要求17或18的用途，其中所述的编码细胞分裂素氧化酶2的核酸选自：
(a)包含在SEQ ID NO：42、37、3、或26之任一中给出的DNA序列的核酸或其互补序列，
(b)包含对应于SEQ ID NO：42、37、3、或26之任一的RNA序列的核酸或其互补序列，
(c)编码包含在SEQ ID NO：4、36或38之任一中给出的氨基酸序列的蛋白质的核酸或其互补序列，
(d)如在(a)至(c)之任一中所定义的核酸，其特征在于所述的核酸是DNA、基因组DNA、cDNA、合成DNA或其中T换成U的RNA，
(e)由于遗传密码的原因，而与在SEQ ID NO：42、37、3、或26之任一中给出的核酸相比或者与在(a)至(d)之任一中所定义的核酸相比为简并性的核酸，
(f)由于生物间密码子选择的不同，而与编码在SEQ ID NO：4、36或38之任一中所给出的蛋白质的核酸不同或者与如在(a)至(d)之任一中所定义的核酸不同的核酸，
(g)编码如在SEQ ID NO：4、36或38中所给出的蛋白质的核酸，或者如在(a)至(d)中所定义的核酸，其由于等位基因间的不同而不同，
(h)编码如在SEQ ID NO：4、36或38之任一中所给出的蛋白质的核酸，以及
(i)如在(a)至(h)之任一中所定义的编码植物细胞分裂素氧化酶2的核酸，其包含共有序列hTDYLhholGGTLSssG和cLFxushGsLGQFGllstA，其中x是Y，R，N，F，D或H。
20.SEQ ID NO：41用于增加种子产量的用途。
21.根据权利要求12或13的载体用于增加种子产量的用途。
22.根据权利要求1的方法，其中通过在编码细胞分裂素氧化酶2的基因的基因座中引入遗传修饰，实现所述的在胚胎和/或糊粉中增加表达。
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