晶体形式的联苯化合物
发明背景
发明领域
本发明涉及联苯化合物的新的晶状1,2-乙烷二磺酸盐,预期其可以用作治疗肺疾病的治疗剂。本发明也涉及包含这种晶状化合物、或由这种晶状化合物制备的药物组合物,制备这种晶状化合物的方法和中间体,和使用这种晶状化合物治疗肺疾病的方法。
技术现状
普通转让的美国专利申请No.10/779,157(2004年2月13日申请)公开了新的联苯化合物,其可用作治疗肺疾病例如慢性阻塞性肺病(COPD)和哮喘的治疗剂。尤其是,在这些申请中具体公开了化合物联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯,其既具有胆碱拮抗剂活性又具有β2肾上腺素能受体激动剂活性。联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯的化学结构由式I代表:
可将适用于治疗肺疾病的治疗剂有利地通过吸入法直接给予到呼吸道中。在这方面,已经开发了几种类型药品的吸入装置,用于通过吸入法给予治疗剂,包括干粉吸入器(DPI),定量吸入器(MDI)和雾化器吸入器。当制备用于这类装置的药物组合物和制剂时,非常希望治疗剂具有既不吸湿也不潮解、并且其具有相对高的熔点(即大于约150℃)的晶型,由此可以使材料微粉化而不会显著地分解或失去结晶性。
先前还没有报道过式I化合物的晶状盐形式。相应地,对具有可接受水平的吸湿性和比较高的熔点的式I化合物的稳定、不潮解的晶状盐形式存在需求。
发明概述
本发明提供了联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯的晶状1,2-乙烷二磺酸盐或其溶剂合物。
令人意外地,发现式I化合物的这种晶状的1,2-乙烷二磺酸盐即使暴露于大气湿度下也不潮解。另外,这种晶状盐具有可接受程度的吸湿性和很高的熔点,例如大于约215℃。在一个具体实施方案中,本发明的晶状盐具有大于约230℃的熔点。
除了其它用途,式I化合物的晶状1,2-乙烷二磺酸盐可用于制备药物组合物,预期该药物组合物可用于治疗肺疾病。相应地,在其组合物方面的另一方面,本发明提供了一种药物组合物,其包含药学可接受的载体和联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯的1,2-乙烷二磺酸盐或其溶剂合物。
在一个具体实施方案中,本发明的药物组合物进一步包含甾族抗炎药,例如皮质甾类;或磷酸二酯酶-4抑制剂;或其组合。
在另一个实施方案中,本发明提供了一种药物组合物,其包含等渗压盐水溶液,该等渗压盐水溶液包含联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯的1,2-乙烷二磺酸盐,其中该溶液具有从约4至约6范围内的pH值。
在又一个实施方案中,本发明提供了包含下列物质的组合:
(a)联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯的晶状1,2-乙烷二磺酸盐或其溶剂合物;和
(b)甾族抗炎药。
式I的化合物既具有胆碱拮抗剂活性又具有β2肾上腺素能受体激动剂活性。相应地,预期本发明的1,2-乙烷二磺酸盐可用作治疗肺疾病例如哮喘和慢性阻塞性肺病的治疗剂。
相应地,在本发明方法方面的一个方面,本发明提供了一种治疗肺疾病的方法,该方法包括给予需要治疗的患者治疗有效量的联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯的1,2-乙烷二磺酸盐或其溶剂合物。
另外,在本发明方法方面的另一个方面,本发明提供了一种在患者中产生支气管扩张的方法,该方法包括:通过吸入法给予患者产生支气管扩张量的联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]-哌啶-4-基酯的1,2-乙烷二磺酸盐或其溶剂合物。
本发明也提供了一种治疗慢性阻塞性肺病或哮喘的方法,该方法包括给予需要治疗的患者治疗有效量的联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯的1,2-乙烷二磺酸盐或其溶剂合物。
本发明还涉及制备式I化合物的晶状1,2-乙烷二磺酸盐的方法。相应地,在本发明方法方面的另一个方面,本发明提供了一种制备联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯的晶状1,2-乙烷二磺酸盐或其溶剂合物的方法;该方法包括将联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯与1,2-乙烷二磺酸接触。
在本发明方法方面的又一个方面,本发明提供了一种制备式I化合物的晶状1,2-乙烷二磺酸盐的方法,该方法包括:
(a)将式II的化合物与氟化物离子接触:
其中R1a、R1b和R1c独立地选自C1-4烷基、苯基、-C1-4烷基-(苯基),或R1a、R1b和R1c中的一个是-O-(C1-4烷基);和
(b)将来自步骤(a)的产物与1,2-乙烷二磺酸或其水合物接触;形成式I化合物的晶状1,2-乙烷二磺酸盐,其中步骤(a)和(b)是在相同反应容器中进行的,不用分离步骤(a)的产物。
在本发明方法方面的另一个方面,本发明提供了一种制备熔点大于约230℃的式I化合物的晶状1,2-乙烷二磺酸盐的方法,该方法包括将式I化合物的晶状1,2-乙烷二磺酸盐的晶种加到包含溶于惰性稀释剂中的式I化合物的1,2-乙烷二磺酸盐的溶液中,其中晶种的熔点大于约230℃。
这种方法还可以用来将式I化合物的晶状1,2-乙烷二磺酸盐再结晶,以提供具有大于约230℃熔点的晶型。相应地,本发明进一步提供了一种制备具有大于约230℃熔点的式I化合物的晶状1,2-乙烷二磺酸盐的方法,该方法包括:
(a)在第一个温度下,将式I化合物的晶状1,2-乙烷二磺酸盐溶解在惰性稀释剂中;
(b)将步骤(a)的产物冷却到第二个温度;和
(c)加入式I化合物的1,2-乙烷二磺酸盐的晶种;
其中所述晶种具有高于约230℃的熔点,所述第一个温度是足以溶解1,2-乙烷二磺酸盐的温度,并且所述第二个温度低于当所述晶种加到步骤(b)的产物中时,该晶种完全溶解的温度。
另外,本发明涉及将联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯纯化的方法;该方法包括形成联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯的晶状1,2-乙烷二磺酸盐。本发明也涉及通过本文描述的方法制备的产物。
本发明还涉及联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯的晶状1,2-乙烷二磺酸盐或其溶剂合物,其用于治疗或作为药物。
另外,本发明涉及联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯的晶状1,2-乙烷二磺酸盐或其溶剂合物用于制备药物的用途;特别是用于制备治疗肺疾病的药物的用途。
本发明还涉及:
(a)联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯的晶状1,2-乙烷二磺酸盐或其溶剂合物;和
(b)甾族抗炎药;
在制备用于治疗肺疾病的药物中的用途。
本发明还涉及微粉化形式的联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯的晶状1,2-乙烷二磺酸盐或其溶剂合物;并涉及药物组合物,其包含药学可接受的载体和微粉化形式的联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]-哌啶-4-基酯的晶状1,2-乙烷二磺酸盐或其溶剂合物。
附图的简要说明
参考附图说明本发明的各个方面。
图1显示本发明联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯的晶状1,2-乙烷二磺酸盐样品的差示扫描量热法(DSC)图和热解重量分析(TGA)图,图2显示其DSC图。
图3和4显示本发明联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯的晶状1,2-乙烷二磺酸盐样品的粉末X射线衍射(PXRD)图形。
图5显示本发明联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯的晶状1,2-乙烷二磺酸盐的红外(IR)吸收光谱。
图6显示本发明联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯的晶状1,2-乙烷二磺酸盐的动态水份吸收(DMS)图。
本发明的详细说明
本发明提供了联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯的晶状1,2-乙烷二磺酸盐或其溶剂合物。在这些盐中的活性治疗剂(即式I的化合物)包含一个具有(R)构型的手性中心。然而,本领域技术人员可以理解,较小数量的(S)立体异构体可以存在于本发明组合物中,除非另有陈述,条件是,整体形式的组合物的实用性不会由于存在这样的异构体而被消除。
使用商业上-可获得的AutoNom软件(MDL,San Leandro,California)命名式I的化合物。另外,1,2-乙烷二磺酸盐有时也称为乙烷二磺酸盐(edisylate)或乙烷二磺酸盐(edisilate)。
定义
当描述本发明的化合物、组合物、方法和工艺时,下列术语具有下列含义,除非另有陈述。
本文中使用的术语“熔点”是指通过差示扫描量热法观察到最大吸热热流时的温度。
术语“微粉化形式”是指一种粒子形式,其中至少约90%的粒子具有小于约10微米的直径。
术语“溶剂合物”是指由一个或多个溶质分子和一个或多个溶剂分子形成的复合物或聚集物,所述溶质是式I化合物的1,2-乙烷二磺酸盐。这种溶剂合物典型地具有实质上固定的溶质与溶剂的摩尔比。该术语也包括包合物,包括有水的包合物。代表性的溶剂包括例如水,甲醇,乙醇,异丙醇,乙酸等等。当溶剂是水时,形成的溶剂合物是水合物。
术语“治疗有效量”是指当给予需要治疗的患者时、足以实现治疗的量。
本文中使用的术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指患者例如哺乳动物(尤其是人类)中的疾病或医学病症(例如COPD)的治疗,其包括:
(a)预防疾病或医学病症的出现,即预防性治疗患者;
(b)改善疾病或医学病症,即在患者中消除疾病或医疗病症或导致其消退;
(c)抑制疾病或医学病症,即在患者中迟缓或延滞疾病或医学病症的发展;或
(d)减轻患者的疾病或医学病症的症状。
术语“单位剂型”是指适合于给予患者的物理离散单位,即每个单位含有预定数量的本发明的盐,其被计算单独或与一或多种额外单位组合产生目标治疗效果。例如,这种单位剂型可以是干粉吸入器胶囊,来自定量吸入器的计量的剂量,胶囊,片剂,丸剂等等。
本发明的1,2-乙烷二磺酸盐
本发明的联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯的晶状1,2-乙烷二磺酸盐可以由联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯和1,2-乙烷二磺酸或其水合物来制备。
本发明的1,2-乙烷二磺酸盐,每摩尔当量的式I化合物典型地包含约0.90和约1.10摩尔当量之间的1,2-乙烷二磺酸;每摩尔当量的式I化合物,包括约0.95和约1.05摩尔当量之间的1,2-乙烷二磺酸。在一个具体的实施方案中,本发明的1,2-乙烷二磺酸盐,每摩尔当量的式I化合物包含约1摩尔当量的1,2-乙烷二磺酸。
1,2-乙烷二磺酸与联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯的摩尔比,可以利用本领域技术人员可得到的各种方法而很容易地测定。例如,这种摩尔比可以容易地利用1H NMR测定。或者,元素分析和HPLC方法可用于测定摩尔比。
在本发明中采用的联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]-哌啶-4-基酯,可以使用下面实施例中描述的方法,或使用在本申请的背景部分中描述的普通转让的美国申请中所描述方法,由可商业购买的原料和试剂很容易地制备。
1,2-乙烷二磺酸是可从例如Alfa Chemicals Ltd.,Berkshire,UK商业购买的。在一个实施方案中,在制备本发明盐中采用的1,2-乙烷二磺酸是二水合物。在一个具体实施方案中,1,2-乙烷二磺酸二水合物具有大于或等于97%的纯度(通过HPLC测定)。如果需要的话,在使用之前,本发明中采用的1,2-二磺酸二水合物可以从例如乙酸和乙酸酐中重结晶。
为了制备本发明的晶状盐,将联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯典型地与约0.75至约1.3摩尔当量的1,2-乙烷二磺酸或其水合物接触。通常,该反应在惰性稀释剂中、在约0℃至约60℃的温度范围;包括约20℃至约55℃,例如约25℃至约50℃下进行。用于该反应的合适惰性稀释剂包括但不局限于甲醇,乙醇,异丙醇,异丁醇,乙酸乙酯,二氯甲烷等等,任选包含水。在一个具体实施方案中,将1,2-乙烷二磺酸二水合物的乙醇溶液加到约五倍体积大的在异丙醇和二氯甲烷(64∶1)混合物中的联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯。在其它具体实施方案中,1,2-乙烷二磺酸二水合物溶液包括水或乙醇作为稀释剂,联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯溶液包括异丙醇或乙醇作为稀释剂。
或者,式I化合物的晶状1,2-乙烷二磺酸盐可以如下制备:将式I化合物的甲硅烷基保护的衍生物(即式II的化合物)与氟化物离子源接触,然后在相同反应容器中将产物与1,2-乙烷二磺酸或其水合物接触。在一个具体实施方案中,甲硅烷基保护基是叔丁基二甲基甲硅烷基。其它合适的甲硅烷基-保护基包括叔丁基二苯基甲硅烷基,二苯甲基甲硅烷基,二-叔丁基甲基甲硅烷基,叔丁氧基二苯基甲硅烷基等等。用于该工艺的氟化物离子源可以是包含或包括氟化物离子或氟化氢的任何试剂。在一个具体实施方案中,氟化物离子源是三乙胺三氢氟酸盐。其它合适的氟化物离子源包括氟化四丁铵,氟化钾与18-冠-6,氟化氢,吡啶氢氟酸盐,等等。
通常,该方法在惰性稀释剂中、在约0℃至约50℃的温度范围;包括约20℃至约35℃,例如约25℃至约30℃下进行。用于该反应的合适惰性稀释剂包括但不局限于二氯甲烷,甲醇和其混合物。在一个具体实施方案中,将联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(4-([(R)-2-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-2-氯-5-甲氧基-苯基氨基甲酰)乙基]哌啶-4-基酯溶液与约2.5至约3.0摩尔当量的三乙胺三氢氟酸盐在二氯甲烷中、在室温下接触约12至24小时,或直至除去甲硅烷基基团实质上完全。不用分离反应产物,向得到的溶液中加入约0.9至约1.1摩尔当量的1,2-乙烷二磺酸二水合物的甲醇溶液,并将该混合物在大约25℃至约35℃下加热约2至约6小时。当反应完成时,通过任何常规方法,例如沉淀、浓缩、离心等等,从反应混合物中分离出晶状的联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯的1,2-乙烷二磺酸盐。
任选地,可以在包含约15%至约25%(包括约20%,按体积计算)水的异丙醇中搅拌该盐或使其成浆,来进一步纯化本发明的晶状1,2-乙烷二磺酸盐。在一个具体实施方案中,每克1,2-乙烷二磺酸盐采用约10毫升的异丙醇/水混合物。
制备本发明的晶状1,2-乙烷二磺酸盐的方法,可以任选包括使用晶种,以主要产生特定的晶状盐。例如,通过使用高熔点晶状盐(即大于约230℃)的晶种,可以制备与晶种熔点基本上相同的式I化合物的晶状1,2-乙烷二磺酸盐。当最初形成晶状盐时,可以使用这种晶种,或它们可用于将晶状或部分晶状盐再结晶。
典型地,通过缓慢结晶来小规模制备品种,不用搅拌且不用施加冷却。作为例证说明,为了获得晶种,将晶状盐在足以提供溶解的温度下,典型地溶于惰性稀释剂中。通常,在获得晶种的初始过程中,使用少量,典型地小于10克,包括小于5克,例如小于1克的晶状盐。在一个具体实施方案中,包含约12%至约20%水(包括约13%至约15%水)的甲醇用作稀释剂,在从约60℃至约70℃的温度范围,例如约60℃至约65℃。将溶液冷却至室温。在约1天至约3天之后,通过过滤或其它常规方法分离所得到的晶体。或者,晶种可以从先前的结晶物质的制备物中获得。
在使用晶种的重结晶过程中,在从约60℃至约65℃的温度范围,将本发明的晶状1,2-乙烷二磺酸盐溶于惰性稀释剂中,该惰性稀释剂与获得晶种过程中的惰性稀释剂相同,典型地是包含15%水的甲醇。使该溶液冷却至晶种不溶解的温度,例如在从约30℃至约40℃范围内的温度,然后加入晶种。典型地,在溶液中,晶种重量与晶状盐重量的比例在约1∶5和约1∶35之间。将溶液冷却至出现结晶的温度,例如至约20℃,并搅拌约2小时至约24小时。通过常规方法分离得到的晶体。为了获得足够制备大批物质的晶种,可以使用第一次重结晶获得的晶体作为随后重结晶步骤的晶种,连续进行重结晶过程。应理解,选择进行重结晶过程的步骤的具体温度,取决于稀释剂的特性和稀释剂中晶状盐的浓度。另外,可以使用蒸发或反溶剂来代替冷却促进结晶,来进行重结晶过程。
除了其它优越性以外,已经发现,形成式I化合物的晶状1,2-乙烷二磺酸盐可用于纯化式I的化合物。通常,本发明的晶状1,2-乙烷二磺酸盐具有大于95%的纯度;典型地大于98%,通过高效液相色谱法测定。
如通过差示扫描量热法(DSC)图所证明的,本发明的晶状1,2-乙烷二磺酸盐特征在于非常高的熔点,所述图在约215℃至约240℃范围内表现出吸热热流的峰。已经观测到,晶状盐的熔点温度取决于形成晶状盐的方法。由不搅拌和不施加冷却而缓慢结晶形成的晶种,显现了比约230℃高的熔点。通过包括用这种晶种重结晶的方法形成的晶状盐,典型地显现了约230℃至约245℃范围内的熔点,如例如图1所示。不利用具有约230℃以上熔点的晶种形成的晶状盐,典型地显现了约215℃至约229℃范围内的熔点,如例如图2所示。因此,在具体实施方案中,本发明提供了式I化合物的晶状1,2-乙烷二磺酸盐,其在约200℃以上的温度范围中具有DSC图,该图实质上与示于图1或图2中所示的图一致。
在另一个实施方案中,本发明的晶状1,2-乙烷二磺酸盐的特点在于在5.0±0.3和15.0±0.3的2θ值处具有显著衍射峰的粉末X射线衍射(PXRD)图形。在用高熔点晶种重结晶制备的盐的PXRD谱(如图3所示)和不使用这种晶种制备的盐的PXRD谱(如图4所示)中的峰位之间,可以观测到细微的差异。相应地,在单独的实施方案中,式I化合物的晶状1,2-乙烷二磺酸盐的特点在于其中峰位实质上与图3所示或图4所示的峰位一致的粉末X射线衍射图。
在另一个实施方案中,式I化合物的晶状1,2-乙烷二磺酸盐的特点在于其在大约704、748、768、841、900、1055、1104、1166、1218、1294、1408、1522、1609、1655和1701cm-1处显示了显著的吸收谱带(如图5所说明)的红外(IR)吸收谱。
已经证实式I化合物的晶状1,2-乙烷二磺酸盐具有可逆转的吸收/解吸特性,具有可接受的、中等水平的吸湿性(即在40%相对湿度至75%相对湿度的湿度范围中,小于约2.5%增重)。
在下面实施例中进一步说明本发明盐的这些性能。
药物组合物和制剂
典型地以药物组合物或制剂的形式给予患者式I化合物的1,2-乙烷二磺酸盐。这种药物组合物可以通过任何可接受的给药途径给予患者,给药途径包括但不限于吸入、口服、鼻、局部(包括透皮)和肠胃外给药模式。然而,本领域技术人员可以理解,一旦已经配制了本发明的晶状盐,它可以不再呈晶型,即盐可以溶于合适的载体中。
相应地,在本发明组合物方面的一个方面,本发明涉及一种药物组合物,其包含药学可接受的载体或赋形剂和联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯的1,2-乙烷二磺酸盐或其溶剂合物。任选地,如果需要的话,这种药物组合物可以包含其它治疗和/或配制剂。
本发明的药物组合物典型地包含治疗有效量的联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯的1,2-乙烷二磺酸盐或其溶剂合物。典型地,这种药物组合物包含约0.01至约95%重量的活性剂;包括约0.01至约30%重量;例如约0.01至约10%重量的活性剂。
任何常规的载体或赋形剂可以用于本发明的药物组合物。具体载体或赋形剂、或多种载体或赋形剂的组合的选择,取决于用来治疗具体患者的给药模式或医学病症类型或疾病状态。在这方面,制备用于具体给药模式的合适药物组合物完全在药品领域技术人员的能力范围内。另外,用于这种组合物中的组分是可从例如Sigma,P.O.Box 14508,St.Louis MO 63178商业购买的。为了进一步例证说明,常规制剂技术描述在Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版,Lippincott Williams&White,Baltimore,Maryland(2000);和H.C.Ansel等人Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems,第7版,Lippincott Williams & White,Baltimore,Maryland(1999)中。
可以充当药学可接受的载体材料的代表性例子包括但不局限于下列:(1)糖,例如乳糖,葡萄糖和蔗糖;(2)淀粉,例如玉米淀粉和马铃薯淀粉;(3)纤维素,和其衍生物,例如羧甲基纤维素钠,乙基纤维素和纤维素乙酸酯;(4)粉末黄芪胶;(5)麦芽;(6)明胶;(7)滑石粉;(8)赋形剂,例如可可脂和栓剂石蜡;(9)油类,例如花生油,棉子油,红花油,芝麻油,橄榄油,玉米油和大豆油;(10)二元醇,例如丙二醇;(11)多元醇,例如甘油,山梨糖醇,甘露糖醇和聚乙二醇;(12)酯,例如油酸乙酯和月桂酸乙酯;(13)琼脂;(14)缓冲剂,例如氢氧化镁和氢氧化铝;(15)海藻酸;(16)无热原的水;(17)等渗盐水;(18)林格溶液;(19)乙醇;(20)磷酸盐缓冲液;(21)压缩的推进剂气体,例如氯氟烃和氢氟烷;和(22)药物组合物中采用的其它无毒相容的物质。
通过将本发明的盐与药学可接受的载体和一或多种任选组分彻底和密切混合或掺合,可以典型地制备本发明的药物组合物。如果必需或要求的话,然后使用常规方法和装置,将得到的均匀掺合的混合物形成为或装填到片剂、胶囊、丸剂、小罐、药筒、分散器等等中。
在一个实施方案中,本发明药物组合物适合于吸入给药。用于吸入给药的合适药物组合物典型地是气溶胶或粉末形式。通常使用众所周知的递送装置给予这种组合物,例如雾化器吸入器,定量吸入器(MDI),干粉吸入器(DPI)或类似的递送装置。
在本发明的一个具体实施方案中,使用雾化器吸入器吸入给予包含活性剂的药物组合物。这种雾化器装置典型地产生高速气流,这种高速气流导致包含活性剂的药物组合物以被携带到患者呼吸道中的雾气形式进行喷雾。相应地,当配制用于雾化器吸入器中时,将活性剂典型地溶于合适的载体中,以形成溶液。合适的雾化器装置可商业提供,例如PARI GmbH(Starnberg,German)。其它雾化器装置包括Respimat(Boehringer Ingelheim),和在美国专利No.6,123,068和WO97/12687中公开的那些装置。
用于雾化器吸入器中的代表性药物组合物包括水溶液,水溶液中包含从约0.05μg/mL至约10mg/mL的式I化合物的1,2-乙烷二磺酸盐或其溶剂合物。在一个实施方案中,含水雾化器制剂是等渗压的。在一个实施方案中,含水雾化器制剂具有从约4至约6的pH值范围。在一个具体实施方案中,含水雾化器制剂是用柠檬酸盐缓冲液缓冲至约5的pH值。在另一个具体实施方案中,含水雾化器制剂包含从约0.1mg/mL至约1.0mg/mL游离碱当量的联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯。
在本发明的另一个具体实施方案中,通过使用干粉吸入器吸入给予包含活性剂的药物组合物。这种干粉吸入器典型地以自由流动性粉末的形式给予活性剂,这种自由流动性粉末在吸气期间分散在患者的气流中。为了获得自由流动性粉末,典型地将活性剂与合适的赋形剂例如乳糖、淀粉、甘露糖醇、葡萄糖、聚乳酸(PLA)、聚丙交酯-共-乙交酯(PLGA)或其组合来进行配制。典型地,将活性剂微粉化,并与合适的载体组合,形成可呼吸尺寸的微粉化粒子的混合物,其中“微粉化粒子”或“微粉化形式”是指至少约90%的粒子具有小于约10微米的直径。
用于干粉吸入器中的代表性药物组合物包括具有约1微米和约100微米之间粒径的乳糖和式I化合物的1,2-乙烷二磺酸盐或其溶剂合物的微粉化粒子。
这种干粉制剂可以通过例如将乳糖与活性剂混合、然后干燥混合物组分来制备。或者,如果需要的话,可以不用赋形剂来配制活性剂。然后将药物组合物典型地加载到干粉分配器中,或加载到吸入药筒或胶囊中,供与干粉递送装置一起使用。
干粉吸入递送装置的例子包括Diskhaler(GlaxoSmithKline,Research Triangle Park,NC)(参见例如美国专利No.5,035,237);Diskus(GlaxoSmithKline)(参见例如美国专利No.6,378,519;Turbuhaler(AstraZeneca,Wilmington,DE)(参见例如美国专利No.4,524,769);Rotahaler(GlaxoSmithKline)(参见例如美国专利No.4,353,365)和Handihaler(Boehringer ingelheim)。合适DPI装置的进一步例子描述在美国专利Nos.5,415,162、5,239,993和5,715,810,以及其中引用的参考文献中。
在本发明的又一个具体实施方案中,包含活性剂的药物组合物是使用定量吸入器吸入给予的。这种定量吸入器使用压缩的推进剂气体典型地释放测定数量的活性剂或其药学可接受的盐。相应地,使用定量吸入器给予的药物组合物典型地包括在液化推进剂中的活性剂的溶液或悬浮液。可以采用任何合适的液化推进剂,包括氯氟烃,例如CCl3F,和氢氟烷(HFAs),例如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134a)和1,1,1,2,3,3,3-七氟-正丙烷,(HFA 227)。由于担忧氯氟烃影响臭氧层,通常优选包含HFAs的制剂。HFA制剂的额外任选组分包括共溶剂,例如乙醇或戊烷,和表面活性剂,例如脱水山梨糖醇三油酸酯,油酸,卵磷脂和甘油。参见,例如美国专利5,225,183,EP 0717987 A2,和WO 92/22286。
用于定量吸入器中的代表性药物组合物包含从约0.01%至约5%重量的式I化合物的1,2-乙烷二磺酸盐或其溶剂合物;从约0%至约20%重量乙醇;和从约0%至约5%重量表面活性剂;剩余部分是HFA推进剂。
通过将冷却或加压的氢氟烷加到包含活性剂、乙醇(如果存在)和表面活性剂(如果存在)的合适容器中,来典型地制备这种组合物。为了制备悬浮液,将活性剂微粉化,然后与推进剂组合。然后将制剂加载到气溶胶小罐中,其形成定量吸入器装置的一部分。专门为与HFA推进剂一起使用而开发的定量吸入器装置的例子提供于美国专利Nos.6,006,745和6,143,277中。或者,可以通过在活性剂的微粉化粒子上将表面活性剂涂层喷雾干燥来制备悬浮液制剂。参见,例如,WO 99/53901和WO 00/61108。
对于制备可呼吸粒子的方法、以及适合于吸入给药的制剂和装置的其它例子,参见美国专利Nos.6,268,533,5,983,956,5,874,063,和6,221,398,和WO 99/55319和WO 00/30614。
在另一个实施方案中,本发明的药物组合物适合于口服。用于口服的合适药物组合物可以是下列形式:胶囊,片剂,丸剂,锭剂,扁囊剂,糖衣丸,散剂,颗粒剂;在含水或非水液体中的溶液或悬浮液;或水包油或油包水液体乳剂;或酏剂或糖浆液;等等;各自包含预定数量的本发明盐作为活性组分。
当打算以固体剂型(即胶囊,片剂,丸剂等等)口服时,本发明的药物组合物典型地包括本发明的盐作为活性组分和一或多种药学可接受的载体,例如柠檬酸钠或磷酸二钙。任选地或者,这种固体剂型也可以包含:(1)填充剂或补充剂,例如淀粉,乳糖,蔗糖,葡萄糖,甘露糖醇,和/或硅酸;(2)粘合剂,例如羧甲基纤维素,藻酸盐,明胶,聚乙烯基吡咯烷酮,蔗糖和/或阿拉伯胶;(3)湿润剂,例如丙三醇;(4)崩解剂,例如琼脂,碳酸钙,马铃薯或木薯淀粉,海藻酸,某些硅酸盐,和/或碳酸钠;(5)溶液阻滞剂,例如石蜡;(6)吸收促进剂,例如季铵化合物;(7)润湿剂,例如鲸蜡醇和/或单硬脂酸甘油酯;(8)吸收剂,例如高岭土和/或膨润土;(9)润滑剂,例如滑石粉,硬脂酸钙,硬脂酸镁,固体聚乙二醇,十二烷基硫酸钠,和/或其混合物;(10)着色剂;和(11)缓冲剂。
释放剂、润湿剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和香味剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于本发明的药物组合物中。药学可接受的抗氧化剂的例子包括:(1)水溶性的抗氧化剂,例如抗坏血酸,盐酸半胱氨酸,硫酸氢钠,偏硫酸氢钠亚硫酸钠等等;(2)油溶性抗氧化剂,例如抗坏血酸棕榈酸酯,丁基羟基茴香醚(BHA),丁基化羟基甲苯(BHT),卵磷脂,没食子酸丙酯,α-生育酚,等等;和(3)金属螯合剂,例如柠檬酸,乙二胺四乙酸(EDTA),山梨糖醇,酒石酸,磷酸,等等。用于片剂、胶囊、丸剂等等的包衣剂包括肠衣使用的那些,例如邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP),聚乙酸乙烯酯邻苯二甲酸酯(PVAP),羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯,甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物,醋酸纤维素偏苯三酸酯(CAT),羧甲基乙基纤维素(CMEC),醋酸羟基丙基甲基纤维素琥珀酸酯(HPMCAS),等等。
如果需要的话,也可以以变化比例使用例如羟基丙基甲基纤维素、或其它聚合母体例如聚乳酸(PLA)或聚丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、脂质体和/或微球体来配制本发明的药物组合物,以提供缓慢或控制释放的活性组分。
此外,本发明的药物组合物可以任选包含遮光剂,并可以进行配制,以使它们在胃肠道的某一部分中只释放或优先释放活性组分,任选以延迟方式释放。可以使用的嵌入组合物的例子包括聚合物质和蜡。如果合适的话,活性组分还可以是与一或多种上述赋形剂的微胶囊化形式。
用于口服的合适液体剂型包括例如药学可接受的乳剂,微乳剂,溶液,悬浮液,糖浆和酏剂。这种液体剂型典型地包含活性组分和惰性稀释剂,例如,水或其它溶剂,增溶剂和乳化剂,例如乙醇,异丙醇,碳酸乙酯,乙酸乙酯,苯甲醇,苯甲酸苄酯,丙二醇,1,3-丁二醇,油类(尤其是棉籽、花生、玉米、胚芽、橄榄、蓖麻和芝麻油),丙三醇,四氢呋喃基醇,聚乙二醇和脱水山梨醇的脂肪酸酯,和其混合物。除了活性组分之外,悬浮液还可以包含悬浮剂,例如,乙氧基化异十八醇,聚氧化乙烯山梨糖醇和脱水山梨醇酯,微晶纤维素,偏氢氧化铝,膨润土,琼脂和黄芪胶,和其混合物。
当打算用于口服给药时,优选将本发明药物组合物包装在单位剂型中。例如,这种单位剂型可以是胶囊,片剂,丸剂等等。
还可以使用已知的透皮递送系统和赋形剂透皮给予本发明的盐。例如,本发明的化合物可以与渗透增强剂混合,并且引入到贴剂或类似的递送系统中,渗透增强剂例如丙二醇,聚乙二醇单月桂酸酯,氮杂环烷-2-酮等等。如果需要的话,包括胶凝剂、乳化剂和缓冲液的其它赋形剂,可以在这种透皮组合物中使用。
本发明的药物组合物也可以含有其它治疗剂,这种治疗剂与式I化合物的1,2-乙烷二磺酸盐或其溶剂合物共同给予。例如,本发明的药物组合物可以进一步包含一或多种选自下列的治疗剂:抗炎药(例如甾族抗炎药,例如皮质甾类;和非甾族抗炎药(NSAIDs),磷酸二酯酶IV抑制剂,抗感染药(例如抗生素或抗病毒剂),抗组胺剂,β2肾上腺素能受体激动剂,毒蝇碱性受体拮抗剂(即,抗胆碱能剂)等等。可以使用药学可接受盐或溶剂合物形式的其它治疗剂。另外,如果合适的话,可以使用旋光纯立体异构体形式的其它治疗剂。
如果需要的话,本发明的盐还可以与一种或多种其它治疗剂,如本文描述的那些组合给予。在该实施方案中,组分不是物理混合在一起,但以单独组合物的形式同时或顺序给予。例如,可以使用对于每种治疗剂采用独立隔室(例如泡眼包装)的吸入递送装置,通过吸入法,与甾族抗炎药例如皮质甾类同时或顺序给予本发明的盐。或者,可以从多个递送装置给予组合物,即每个治疗剂对应一个递送装置。
可以与本发明化合物组合使用的代表性β2肾上腺素能受体激动剂包括但不局限于:沙美特罗,沙丁氨醇,福莫特罗,沙甲胺醇,非诺特罗,特布他林,舒喘灵,异他林,奥西那林,比托特罗,吡布特罗,左沙丁胺醇等等,或其药学可接受的盐。可以与本发明化合物的组合使用的其它β2肾上腺素能受体激动剂包括但不局限于:3-(4-{[6-({(2R)-2-羟基-2-[4-羟基-3-(羟甲基)苯基]乙基}氨基)-己基]氧基}丁基)苯磺酰胺和3-(-3-{[7-({(2R)-2-羟基-2-[4-羟基-3-(羟甲基)苯基]乙基}氨基)庚基]氧基}丙基)苯磺酰胺和在2002年8月29日公开的WO02/066422中公开的相关化合物;3-[3-(4-{[6-([(2R)-2-羟基-2-[4-羟基-3-(羟甲基)苯基]乙基}氨基)己基]-氧基}丁基)苯基]咪唑烷-2,4-二酮和在2002年9月12日公开的WO 02/070490中公开的相关化合物;3-(4-{[6-({(2R)-2-[3-(甲酰氨基)-4-羟基苯基]-2-羟乙基}氨基)己基]氧基}丁基)苯磺酰胺,3-(4-{[6-({(2S)-2-[3-(甲酰氨基)-4-羟基苯基]-2-羟乙基}氨基)己基]氧基}丁基)-苯磺酰胺,3-(4-{[6-({(2R/S)-2-[3-(甲酰氨基)-4-羟基苯基]-2-羟乙基}氨基)己基]氧基}丁基)苯磺酰胺,N-(叔丁基)-3-(4-{[6-({(2R)-2-[3-(甲酰氨基)-4-羟基苯基]-2-羟乙基}氨基)己基]-氧基}丁基)苯磺酰胺,N-(叔丁基)-3-(4-{[6-({(2S)-2-[3-(甲酰氨基)-4-羟基苯基]-2-羟乙基}氨基)己基]氧基}丁基)苯磺酰胺,N-(叔丁基)-3-(4-{[6-({(2R/S)-2-[3-(甲酰氨基)-4-羟基苯基]-2-羟乙基}氨基)己基]氧基}丁基)苯磺酰胺和在2002年10月3日公开的WO 02/076933中公开的相关化合物;4-{(1R)-2-[(6-{2-[(2,6-二氯苄基)氧基]乙氧基}己基)氨基]-1-羟乙基}-2-(羟甲基)酚和在2003年3月27日公开的WO03/024439中公开的相关化合物;N-{2-[4-((R)-2-羟基-2-苯乙基氨基)苯基]乙基}-(R)-2-羟基-2-(3-甲酰氨基-4-羟基苯基)乙胺和在2003年6月10日颁发的美国专利No.6,576,793 B1中公开的相关化合物;N-{2-[4-(3-苯基-4-甲氧基苯基)氨基苯基]乙基}-(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2(1H)-喹啉(quinolinon)-5-基)乙胺和在2003年11月25日颁发的美国专利No.6,653,323 B2中公开的相关化合物;和其药学可接受的盐。在一个具体实施方案中,β2-肾上腺素受体激动剂是N-{2-[4-((R)-2-羟基-2-苯乙基氨基)苯基]乙基}-(R)-2-羟基-2-(3-甲酰氨基-4-羟基苯基)乙胺的晶状单盐酸盐。当采用时,β2-肾上腺素受体激动剂可以以治疗有效量存在于药物组合物中。典型地,β2-肾上腺素受体激动剂以足够提供每剂量约0.05μg至约500μg的数量存在。
可以与本发明化合物组合使用的代表性甾族抗炎药包括但不局限于:甲基泼尼松龙,泼尼松龙,地塞米松,丙酸氟替卡松,6,9-二氟-17-[(2-呋喃基羰基)氧基]-11-羟基-16-甲基-3-氧代雄甾-1,4二烯-17-硫代羟酸S-氟甲基酯,6,9-二氟-11-羟基-16-甲基-3-氧代-17-丙酰氧基-雄甾-1,4-二烯-17-硫代羟酸S-(2-氧代四氢呋喃-3S-基)酯,倍氯米松酯(例如17-丙酸酯或17,21-二丙酸酯),布地缩松,氟尼缩松,莫美他松酯(例如糠酸酯),曲安奈德,罗氟奈德,环索奈德,丙酸布替可特,RPR-106541,ST-126等等,或其药学可接受的盐。在一个具体实施方案中,甾族抗炎药是6α,9α-二氟-17α-[(2-呋喃基羰基)氧基]-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代雄甾-1,4-二烯-17β-硫代羟酸S-氟甲基酯或其药学可接受的盐或溶剂合物。当采用时,甾族抗炎药可以以治疗有效量存在于药物组合物中。典型地,甾族抗炎药以足够提供每剂量约0.05μg至约500μg的数量存在。
其它合适的组合包括,例如,其它抗炎药,例如NSAIDs(例如色甘酸二钠;萘多罗米钠;磷酸二酯酶(PDE)抑制剂(例如茶碱,PDE4抑制剂或混合的PDE3/PDE4抑制剂);白细胞三烯拮抗剂(例如孟鲁司特);白细胞三烯合成抑制剂;iNOS抑制剂;蛋白酶抑制剂,例如类胰蛋白酶和弹性蛋白酶抑制剂;β-2整联蛋白拮抗剂和腺苷受体激动剂或拮抗剂(例如腺苷2a激动剂);细胞因子拮抗剂(例如趋化因子拮抗剂,例如,白介素抗体(IL抗体),具体地说,IL-4疗法、IL-13疗法、或其组合);或细胞因子合成抑制剂。
例如,可以与本发明化合物组合用的代表性磷酸二酯酶-4(PDE4)抑制剂或混合的PDE3/PDE4抑制剂包括但不局限于:顺式4-氰基-4-(3-环戊基氧基-4-甲氧基苯基)环己烷-1-羧酸,2-甲氧甲酰-4-氰基-4-(3-环丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯基)环己烷-1-酮;顺式-[4-氰基-4-(3-环丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯基)环己烷-1-醇];顺式-4-氰基-4-[3-(环戊基氧基)-4-甲氧基苯基]环己烷-1-羧酸等等,或其药学可接受的盐。其它代表性的PDE4或混合PDE4/PDE3抑制剂包括AWD-12-281(elbion);NCS-613(INSERM);D-4418(Chiroscience andSchering-Plough);CI-1018或PD-168787(Pfizer);公开在WO99/16766(Kyowa Hakko)中的苯并二氧杂环戊二烯化合物;K-34(KyowaHakko);V-11294A(Napp);罗氟司特(Byk-Gulden);公开在WO99/47505(Byk-Gulden)中的二氮杂萘酮(pthalazinone)化合物;普马芬群(Byk-Gulden,现在的Altana);阿罗茶碱(Almirall-Prodesfarma);VM554/UM565(Vernalis);T-440(Tanabe Seiyaku);和T2585(TanabeSeiyaku)。
可以与本发明化合物组合使用的代表性毒蕈碱性拮抗剂(即抗胆碱能药),除本发明的化合物以外,包括但不局限于:阿托品,硫酸阿托品,氧阿托品,甲硝阿托品,氢溴酸后马托品,氢溴酸茛菪碱(d,l),氢溴酸东茛菪碱,异丙托溴铵,氧托溴铵,噻托溴胺,甲胺太林,溴丙胺太林,甲溴辛托品,克利溴铵,格隆溴铵(copyrrolate)(Robinul)),异丙碘铵,溴美喷酯,曲地氯胺(pathilone),甲硫己环铵,环喷托酯盐酸盐,托吡卡胺,盐酸苯海索,哌仑西平,替仑西平,AF-DX116和美索曲明等等,或其药学可接受的盐;或者,对于以盐形式列出的那些化合物,它们的可替换的药学上可接受的盐。
可以与本发明化合物组合使用的代表性抗组胺剂(即H1-受体拮抗剂)包括但不局限于:乙醇胺类,例如马来酸卡比沙明,氯马斯汀富马酸盐,盐酸苯海拉明和茶苯海明;乙二胺类,例如马来酸美吡拉敏,盐酸曲吡那敏和柠檬酸曲吡那敏;烷基胺类,例如氯苯那敏和阿伐斯汀;哌嗪类,例如盐酸羟嗪,羟嗪双羟萘酸盐,盐酸赛克力嗪,乳酸赛克力嗪,盐酸美克洛嗪和西替利嗪盐酸盐;哌啶类,例如阿司咪唑,左卡巴斯汀盐酸盐,氯雷他定或其descarboethoxy类似物,特非那定和非索非那定盐酸盐;氮斯汀盐酸盐;等等,或其药学可接受的盐;或者,对于以盐形式列出的那些化合物,它们的可替换的药学上可接受的盐。
与本发明化合物组合给予的其它治疗剂的合适剂量在大约0.05mg/天至约100mg/天的范围之内。
下列制剂举例说明了本发明代表性的药物组合物:
制剂实施例A
用于吸入给药的干粉制备如下:
代表性方法:将本发明的化合物微粉化,然后与乳糖共混。然后将这种共混的混合物加载到明胶吸入药筒中。使用粉末吸入器给予药筒中的内含物。
制剂实施例B
用于干粉吸入装置中的干粉制剂制备如下:
代表性方法:以1∶200的本发明微粉化盐与乳糖的容积配方(bulkformulation)比例来制备药物组合物。将组合物填充到干粉吸入装置中,其每剂量能够递送约10μg到约100μg之间的本发明化合物。
制剂实施例C
用于在定量吸入器中吸入给药的干粉制备如下:
代表性方法:将10克具有小于10微米平均粒径的微粉化粒子形
式的本发明化合物分散在由溶于200毫升软化水的0.2克卵磷脂形成的溶液中,制备含有5wt%本发明盐和0.1wt%卵磷脂的悬浮液。将悬浮液喷雾干燥,并将得到的物质微粉化为具有小于1.5微米平均直径的粒子。将该粒子加载到具有加压的1,1,1,2-四氟乙烷的药筒中。
制剂实施例D
用于定量吸入器中的药物组合物制备如下:
代表性方法:将5克具有小于10微米平均粒径的微粉化粒子形式的活性成分分散在由溶于100毫升软化水中的0.5克海藻糖和0.5克卵磷脂形成的胶体溶液中,制备含有5%本发明盐、0.5%卵磷脂和0.5%海藻糖的悬浮液。将悬浮液喷雾干燥,并将得到的物质微粉化为具有小于1.5微米平均直径的粒子。将该粒子加载到具有加压的1,1,1,2-四氟乙烷的小罐中。
制剂实施例E
用于雾化器吸入器中的药物组合物制备如下:
代表性方法:将0.5毫克本发明盐溶解在用柠檬酸酸化的1毫升0.9%氯化钠溶液中,制备用于雾化器中的含水气雾剂制剂。将混合物搅拌,并超声处理,直至活性组分溶解。通过缓慢加入NaOH,将溶液的pH值调节至约5的值。
制剂实施例F
用于口服的硬明胶胶囊制备如下:
成分 |
数量 |
本发明的盐乳糖(喷雾干燥的)硬脂酸镁 |
250mg200mg10mg |
代表性方法:将组分彻底地共混,然后加载到硬明胶胶囊中(每个胶囊含有460mg组合物)。
制剂实施例G
用于口服的悬浮液制备如下:
氯化钠对羟苯甲酸甲酯对羟苯甲酸丙酯砂糖山梨糖醇(70%溶液)Veegum K(Vanderbilt Co.)调味剂着色剂蒸馏水 |
2.0g0.15g0.05g25.5g12.85g1.0g0.035mL0.5mg适量至100mL |
代表性方法:将组分混合,形成每10毫升悬浮液含有100毫克活性组分的悬浮液。
制剂实施例H
可注射制剂制备如下:
成分 |
数量 |
本发明的盐乙酸钠缓冲溶液(0.4M)HCl(0.5N)或NaOH(0.5N)水(蒸馏,无菌的) |
0.2g2.0mL适量至pH4适量至20mL |
代表性方法:将上述组分共混,并使用0.5 N HCl或0.5 N NaOH将pH值调节至4±0.5。
实用性
式I的化合物既具有β2肾上腺素能受体激动剂活性,还具有毒蝇碱性受体拮抗剂活性,因此,预期本发明的式I化合物的1,2-乙烷二磺酸盐适用作治疗由β2肾上腺素能受体或毒蝇碱性受体介导的医学病症,即通过用β2肾上腺素能受体激动剂或毒蝇碱性受体拮抗剂治疗改善的医学病症的治疗剂。这种医学病症包括例如肺障碍或疾病,包括与可逆转性气道阻塞有关的那些障碍或疾病,例如慢性阻塞性肺病(例如慢性和气喘性支气管炎和肺气肿),哮喘,肺纤维化,过敏性鼻炎,鼻液溢等等。可以治疗的其它病症包括早产,抑郁症,充血性心力衰竭,皮肤病(例如炎症性、变应性、牛皮癣、和增生性皮肤病),需要降低胃蛋白酶酸性的病症(例如胃蛋白酶性和胃溃疡)和肌肉萎缩病。
相应地,在一个实施方案中,本发明涉及一种治疗肺疾病的方法,该方法包括给予需要治疗的患者治疗有效量的联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯的1,2-乙烷二磺酸盐或其溶剂合物。当用于治疗肺疾病时,典型地通过吸入法给予本发明盐,每天多剂量、单一日剂量或单一周剂量。通常,治疗肺疾病的剂量在约10微克/天至约200微克/天的范围。
当通过吸入法给药时,本发明的化合物典型地具有提供支气管扩张的效果。相应地,在本发明方法方面的另一个方面,涉及一种在需要支气管扩张的患者中提供支气管扩张的方法,该方法包括给予该患者产生支气管扩张量的联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]-哌啶-4-基酯的1,2-乙烷二磺酸盐或其溶剂合物。通常,用于提供支气管扩张的剂量在约10微克/天至约200微克/天的范围。
在一个实施方案中,本发明涉及治疗慢性阻塞性肺病或哮喘的方法,该方法包括给予需要治疗的患者治疗有效量的联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]-哌啶-4-基酯的1,2-乙烷二磺酸盐或其溶剂合物。当用于治疗COPD或哮喘时,典型地通过吸入法给予本发明盐,每天多剂量或单一日剂量。通常,治疗COPD或哮喘的剂量在约10微克/天至约200微克/天的范围。本文中使用的COPD包括慢性的阻塞支气管炎和肺气肿(参见例如Barnes,Chronic ObstructivePulmonary Disease,N Engl J Med 2000:343:269-78)。
当用于治疗肺疾病时,任选与其它治疗剂组合给予本发明的盐。相应地,在一个具体实施方案中,本发明的药物组合物和方法进一步包括治疗有效量的甾族抗炎药。本发明的1,2-乙烷二磺酸盐的性能和实用性,可以使用本领域技术人员众所周知的各种体外和体内试验来证明。例如,在下面实施例中进一步详细地描述了代表性的试验。
实施例
提供下列制备例和实施例,以说明本发明的具体实施方案。然而,这些具体实施方案无论如何不是想要限制本发明的范围,除非具体指明。
下列缩写具有下列含义,除非另有陈述,并且本文中使用的且没有定义的任何其它缩写具有它们的标准含义:
AC 腺苷酸环化酶
Ach 乙酰胆碱
ATCC 美国典型培养物保藏中心
BSA 牛血清白蛋白
cAMP 3′-5′环腺苷酸
CHO 中国仓鼠卵巢
cM5 克隆的黑猩猩M5受体
DCM 二氯甲烷(即氯化亚甲基)
DIPEA N,N-二异丙基乙胺
dPBS Dulbecco磷酸盐缓冲盐水
DMEM Dulbecco改良的伊格尔培养基
DMSO 二甲亚砜
EDTA 乙二胺四乙酸
Emax 最大效能
EtOAc 乙酸乙酯
EtOH 乙醇
FBS 胎牛血清
FLIPR 荧光成像板读数器
Gly 甘氨酸
HATU 六氟磷酸O-(7-氮杂苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’-四
甲基脲
HBSS Hank′s缓冲盐溶液
HEK 人胚肾细胞
HEPES 4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸
hM1 克隆的人M1受体
hM2 克隆的人M2受体
hM3 克隆的人M3受体
hM4 克隆的人M4受体
hM5 克隆的人M5受体
HPLC 高效液相色谱法
IBMX 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤
%Eff %效能
PBS 磷酸盐缓冲盐水
PyBOP 苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基六氟磷酸盐
rpm 每分钟转数
TFA 三氟乙酸
THF 氢呋喃
Tris 三(羟基甲基)氨基甲烷
除非另外指明,试剂、原料和溶剂是从商业供应商(例如Aldrich,Fluka,Sigma等等)处购买的,并且不用进一步纯化就可以使用。
在如下所述实施例中,使用具有Agilent供应的Zorbax Bonus RP2.1×50mm柱(C14柱)的Agilent(Palo Alto,CA)系列1100仪器进行HPLC分析,柱由Agilent提供,具有3.5微米粒径。通过214nm处的UV吸光度进行检测。经过6分钟用0.5毫升/分钟流速的10%-70%B获得HPLC 10-70数据。流动相A是2%-98%-0.1%ACN-H2O-TFA;流动相B是90%-10%-0.1%ACN-H2O-TFA。使用如上所述的移动相A和B,用5分钟梯度获得HPLC 5-35数据和HPLC 10-90数据。
用Applied Biosystems(Foster City,CA)API-150EX型仪器获得液相色谱法质谱测定(LCMS)数据。用经过5分钟梯度10%-90%流动相B获得LCMS 10-90数据。
使用来自Applied Biosystems的API 150EX制备型工作站系统进行小规模纯化。流动相是A:水+0.05%v/v TFA;B:乙腈+0.05%v/v TFA。对于小批试样(array)(典型地约3至50毫克回收试样大小),使用下列条件:20毫升/分钟流速;15分钟梯度和具有5微米粒子的20mm×50mm Prism RP柱(Thermo Hypersil-Keystone,Bellefonte,PA)。对于较大规模的纯化(典型地大于100毫克粗制样品),使用下列条件:60毫升/分钟流速;30分钟梯度和具有10微米粒子的41.4mm×250mm Microsorb BDS柱(Varian,Palo Alto,CA)。
使用Jasco Polarimeter(Model P-1010)、用钨卤素光源和589nm滤光镜、在20℃测定手性化合物的比旋光率(表示为[α]20D。以1mg/mL水典型地测定试验化合物的样品。
制备例1
4-氨基-5-氯-2-甲氧基苯甲酸甲酯
在0℃,向4-氨基-5-氯-2-甲氧基苯酸(1.008克,5.0mmol)在甲苯(9毫升)和甲醇(1毫升)混合物中的溶液中逐滴加入(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷(2.0M,在己烷中,3.0毫升,6.0mmol)。然后将反应混合物升至室温,并搅拌16小时。通过加入乙酸猝灭过量(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷,直至反应混合物的亮黄色消失。然后真空浓缩混合物,得到标题化合物,为灰白色固体,其不用进一步纯化就可以使用。
制备例2
4-丙烯酰基氨基-5-氯-2-甲氧基苯甲酸甲酯
向制备例2的粗品中加入二氯甲烷(10mL,0.5M)和三乙胺(2.1mL,15mmol)。将该混合物冷却至0℃,逐滴加入丙烯酰氯(812μL,10mmol),同时搅拌。2小时之后,在0℃,通过加入甲醇(约2mL)猝灭反应,并将得到的混合物在室温下搅拌15分钟,然后真空浓缩。将二氯甲烷(30毫升)和水(30毫升)加到残余物中,并彻底地将该混合物进行混合。分离各层,将水层用二氯甲烷(20毫升)提取。合并有机层,干燥(Na2SO4),过滤并真空除去溶剂,得到标题化合物,为褐色泡沫状固体,其不用进一步纯化就可以使用。
制备例3
联苯-2-基氨基甲酸哌啶-4-基酯
将联苯-2-异氰酸酯(97.5克,521mmol)和4-羟基-1-苄基哌啶(105克,549mmol)(两者都商业上得自于Aldrich,Milwaukee,WI)在70℃一起加热12小时,在此期间通过LCMS监测联苯-2-基氨基甲酸1-苄基哌啶-4-基酯的形成。然后将反应混合物冷却至50℃,加入乙醇(1L),然后慢慢地加入6M盐酸(191mL)。然后将反应混合物冷却至室温,加入甲酸铵(98.5克,1.56mol),将氮气剧烈鼓入溶液中20分钟。然后加入钯(10wt%(按干物质计算)活性炭上)(20克)。在40℃加热反应混合物12小时,然后通过硅藻土(Celite)垫过滤。然后减压除去溶剂,将1M盐酸(40毫升)加到粗品残余物中。然后加入氢氧化钠(10N),调节pH值至12。用乙酸乙酯(2×150mL)提取水层,干燥(硫酸镁),然后减压除去溶剂,得到标题化合物(155克,100%)。HPLC(10-70)Rt=2.52;MS m/z:[M+H+]C18H20N2O2计算值297.15;测定值297.3。
制备例4
4-{3-[4-(联苯-2-基氨甲酰氧基)哌啶-1-基]丙酰基氨基}-5-氯-2-甲氧基苯甲酸甲酯
向来自制备例2的粗品中加入制备例3的产物(1.33克,4.5mmol)和THF(22.5毫升)和甲醇(2.5毫升)的混合物。在50℃加热该混合物,搅拌16小时,而后真空除去溶剂。将残余物进行色谱法分离(硅胶;EtOAc),得到标题化合物(0.82克;Rf=0.4,29%产率,3步),为灰白色泡沫状的固体。MS m/z 566.4(M+H,C30H32ClN3O6的预期值565.20)。
制备例5
联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-羟甲基-5-甲氧基-苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯
在0℃,向制备例4的产物(0.82毫克,1.45mmol)在THF(4.5毫升)和甲醇(0.5毫升)混合物中的溶液中加入氢硼化锂(32毫克,1.45mmol)。将反应混合物升温至室温,并搅拌41小时。然后在0℃通过加入1N盐酸水溶液猝灭反应,直至没有观察到气泡,并搅拌该混合物10分钟。真空除去溶剂,并将残余物溶于乙腈(约2毫升)中。将此溶液通过制备型-RP-HPLC(梯度:2至50%乙腈的水溶液(含有0.05%TFA))纯化。收集合适的级分,合并,冻干,得到标题化合物为三氟乙酸盐。用乙酸异丙酯(10毫升)和1N氢氧化钠水溶液(10毫升)处理该盐,收集有机层,干燥(Na2SO4),过滤,真空除去溶剂,得到标题化合物(161毫克,21%产率),为白色泡沫状的固体。MS m/z538.4(M+H,C29H32ClN3O5的预期值537.20)。
制备例6
联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-甲酰基-5-甲氧基苯基-氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯
向制备例5的产物(161毫克,0.3mmol)的二氯甲烷(3毫升)溶液中加入二甲亚砜(213μl,3.0mmol)和二异丙基乙胺(261μl,1.5mmol)。将该混合物冷却至-20℃,慢慢地加入三氧化硫吡啶复合物(238毫克,1.5mmol)。30分钟之后,通过加入水(约3毫升)猝灭反应混合物。分离各层,并将有机层干燥(Na2SO4),过滤,真空除去溶剂,得到标题化合物为浅黄色固体。MS m/z 536.3(M+H,C29H30ClN3O5的预期值535.19)。
制备例7
8-苄氧基-5-(2-溴乙酰基)-1H-喹啉-2-酮
(a)8-乙酰氧基-1H-喹啉-2-酮
将8-羟基喹啉-N-氧化物(160.0克,1.0摩尔)(商业上得自于Aldrich,Milwaukee,WI)和乙酸酐(800毫升,8.4mol)在100℃加热3小时,然后在冰中冷却。在布氏漏斗中收集产物,用乙酸酐(2×100mL)洗涤,减压干燥,得到8-乙酰氧基-1H-喹啉-2-酮(144克)固体。
(b)5-乙酰基-8-羟基-1H-喹啉-2-酮
将氯化铝(85.7克,640mmol)的1,2-二氯乙烷(280毫升)浆液在冰中冷却,并加入来自步骤(a)的产物(56.8克,280mmol)。将混合物升温至室温,然后在85℃加热。30分钟之后,加入乙酰氯(1.5毫升,21mmol),并将该混合物额外加热60分钟。然后将反应混合物冷却,并在0℃加入1N盐酸(3L)中,同时进行很好的搅拌。搅拌2小时之后,在布氏漏斗中收集固体,用水(3×250mL)洗涤,减压干燥。将从几批中分离的粗品(135克)合并,用二氯甲烷(4L)研磨6小时。将得到的固体收集在布氏漏斗中,减压干燥,得到标题化合物(121克)。
(c)5-乙酰基-8-苄氧基-1H-喹啉-2-酮
向步骤(b)的产物(37.7克,186mmol)中加入N,N-二甲基甲酰胺(200毫升)和碳酸钾(34.5克,250mmol),而后加入苄基溴(31.8克,186mmol)。将混合物在室温下搅拌2.25小时,然后在0℃倾倒入饱和氯化钠(3.5L)中,搅拌1小时。收集产物,并在布氏漏斗上干燥1小时,将得到的固体溶于二氯甲烷(2L)中,用硫酸钠干燥该混合物。通过硅藻土垫过滤溶液,然后用二氯甲烷(5×200mL)洗涤。然后将合并的滤液浓缩至干,并将得到的固体用醚(500mL)研磨2小时。将产物收集在布氏漏斗中,用醚(2×250mL)洗涤,减压干燥,得到标题化合物(44克)粉末。
(d)8-苄氧基-5-(2-溴乙酰基)-1H-喹啉-2-酮
将步骤(c)的产物(20.0克,68.2mmol)溶于二氯甲烷(200mL)中,并冷却至0℃。通过注射器加入三氟化硼二乙基醚合物(10.4毫升,82.0mmol),并将该混合物升温至室温,得到稠的悬浮液。将该悬浮液在45℃(油浴)加热,并用40分钟加入溴(11.5克,72.0mmol)的二氯甲烷(100毫升)溶液。将混合物在45℃额外保持15分钟,然后冷却到室温。减压浓缩该混合物,然后用10%碳酸钠水溶液(200毫升)研磨1小时。将固体收集在布氏漏斗中,用水(4×100mL)洗涤,减压干燥。将两次操作的产物合并,进行纯化。将粗品(52克)用含50%甲醇的氯仿(500mL)研磨1小时。将产物收集在布氏漏斗中,用含50%甲醇的氯仿(2×50mL)和甲醇(2×50mL)洗涤。减压干燥固体,得到标题化合物(34.1克)粉末。
制备例8
8-苄氧基-5-[(R)-2-溴-1-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)乙基]-1H-喹啉-2-酮
(a)8-苄氧基-5-((R)-2-溴-1-羟乙基)-1H-喹啉-2-酮
将(R)-(+)-α,α-二苯基prolinol(30.0克,117mmol)和三甲基硼氧六环(11.1毫升,78mmol)在甲苯(300毫升)中混合,并在室温下搅拌30分钟。将混合物放置在150℃油浴中,并蒸馏出液体。以20毫升等份加入甲苯,并继续蒸馏4小时。总共加入300毫升甲苯。然后将混合物冷却至室温。将500μL等份蒸干并称重(246毫克),测定催化剂的浓度是1.8M。
将8-苄氧基-5-(2-溴乙酰基)-1H-喹啉-2-酮(90.0克,243mmol)放置在氮气氛围中,并加入四氢呋喃(900毫升),而后加入如上所述催化剂(1.8M,在甲苯中,15毫升,27mmol)。将悬浮液在冰/异丙醇浴中冷却至-10±5℃。用4小时加入甲硼烷(1.0M,在THF中,294毫升,294mmol)。然后在-10℃额外搅拌反应45分钟,然后慢慢地加入甲醇(250毫升)。真空浓缩混合物,并将残余物溶于沸腾乙腈(1.3L)中,趁热过滤,然后冷却至室温。过滤晶体,用乙腈洗涤,真空干燥,得到标题化合物(72.5克,196mmol,81%产率,95%ee,HPLC纯度95%)。
(b)8-苄氧基-5-[(R)-2-溴-1-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)乙基]-1H-喹啉-2-酮
向步骤(b)产物(70.2克,189mmol)中加入N,N-二甲基甲酰胺(260毫升),并将该混合物在冰浴中、在氮气氛围中冷却。用5分钟加入2,6-二甲基吡啶(40.3克,376mmol),然后慢慢地加入叔丁基二甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(99.8克,378mmol),同时保持温度低于20℃。将反应混合物升温至室温,保持45分钟。用10分钟将甲醇(45毫升)逐滴加到该混合物中,并将该混合物在乙酸乙酯/环己烷(1∶1,500毫升)和水/盐水(1∶1,500ml)之间分配。将有机物用水/盐水(1∶1,每次500毫升)再洗涤两次。减压蒸发合并的有机物,得到浅黄色油。将两个独立部分的环己烷(400毫升)加到油中,并继续蒸馏,直至形成稠白色浆液。将环己烷(300毫升)加到该浆液中,并过滤得到的白色晶体,用环己烷(300毫升)洗涤,减压干燥,得到标题化合物(75.4克,151mmol,80%产率,98.6%ee)。
制备例9A
8-苄氧基-5-[(R)-2-(N-苄基氨基)-1-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)乙基]-1H-喹啉-2-酮
将制备例8产物(1.00克,2.05mmol)和苄胺(493μl,4.51mmol)的DMSO(1.7mL)搅拌溶液在105℃加热4小时。使反应混合物冷却,然后用EtOAc(10毫升)稀释,用饱和氯化铵水溶液(5毫升)和1N氢氧化钠(5毫升)洗涤有机层,干燥(MgSO4),并减压除去溶剂。将粗品残余物用柱色谱法(50%EtOAc/己烷)纯化,获得标题化合物(700毫克,67%)。MS m/z:[M+H+]C31H38N2O3Si的计算值515.27;测定值515.5。
制备例9B
8-苄氧基-5-[(R)-2-(N-苄基氨基)-1-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)乙基]-1H-喹啉-2-酮
向500毫升三颈圆底烧瓶中加入8-苄氧基-5-[(R)-2-溴-1-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)乙基]-1H-喹啉-2-酮(43克,0.124摩尔,约95%手性纯度)、1-甲基-2-吡咯烷酮(210毫升)和苄胺(28.3克,0.37摩尔)。将得到的混合物用氮气充溢,然后在90℃搅拌6小时。然后将混合物冷却至室温,加入水(300毫升)和乙酸乙酯(300毫升)。分离各层,并将有机层用水(200毫升)、水和饱和氯化钠水溶液的1∶1混合物(200毫升)和水(200毫升)洗涤。然后用硫酸镁干燥有机层,过滤并减压浓缩,提供标题化合物橙色油。
向该橙色油中加入庚烷(200毫升)和乙酸乙酯(200毫升),并将得到的混合物加热至65℃,产生澄清溶液。将此溶液冷却至室温,并放置过夜(约16小时),此时形成沉淀。过滤收集沉淀,得到立体化学-不纯的标题化合物(8.85克,79.6%ee)。减压浓缩滤液,得到标题化合物(38.6克,99.4%ee)。将该物质与先前的批料(19.2克,99.5%ee)合并,加入庚烷(250毫升)和乙酸乙酯(100毫升)。将该混合物加热至80℃(混浊至澄清溶液),然后冷却至室温,并放置过夜。通过过滤收集得到的沉淀,得到标题化合物白色固体(36.8克,98.4%ee,99.9%化学纯度)。减压浓缩滤液,并将残余物溶于庚烷(100毫升)中。收集得到的固体,得到标题化合物褐色固体(24克,100%手性纯度,95%化学纯度)。
制备例10A
5-[(R)-2-氨基-1-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)乙基]-8-羟基-1H-喹啉-2-酮
将制备例9A产物(3.16克,6.15mmol)和钯(10wt%(按干物质计算)在活性炭上)(1.58克)的乙醇(62毫升)搅拌溶液放置在氢气氛围中24小时。将反应混合物通过硅藻土过滤,用甲醇(15毫升)洗涤,然后减压除去溶剂,得到标题化合物固体(1.52克,4.55mmol,74%)。
制备例10B
5-[(R)-2-氨基-1-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)乙基]-8-羟基-1H-喹啉-2-酮乙酸盐
将8-苄氧基-5-[(R)-2-(N-苄基氨基)-1-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)乙基]-1H-喹啉-2-酮(100克,194mmol)和乙酸(17.5毫升,291mmol)溶于甲醇(1L)中。将澄清溶液用氮气吹扫,然后加入炭上的氢氧化钯(20克,20wt%Pd(按干物质计算),湿的(约50%水))。在室温下,将氢气气泡通过该搅拌溶液6小时,在此期间出现稠浆液。然后将反应混合物用氮气吹扫,加入甲醇(1L)。将得到的混合物搅拌约30分钟(至溶解产物),然后通过硅藻土垫过滤混合物。减压浓缩滤液至约500毫升体积,并向得到的浆液中加入乙醇(500毫升)。将得到的混合物再一次减压浓缩至约500毫升体积,并通过过滤收集得到的沉淀,干燥,提供标题化合物黄白色固体(65g,85%产率,>98%纯度)。
制备例11
联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(4-{[(R)-2-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-2-氯-5-甲氧基-苯氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯
向含制备例6产物的二氯甲烷(0.5毫升)和甲醇(0.5毫升)的混合物中加入制备例10A的产物(124.1毫克,3.1mmol),并将得到的混合物在室温下搅拌1.5小时。加入三乙酰氧基氢硼化钠(190.7毫克,0.9mmol),并将得到的混合物在室温下搅拌15小时。通过加入水(约0.2毫升)将反应猝灭,真空浓缩混合物,得到标题化合物,其不用进一步纯化就可以使用。MS m/z 854.5(M+H,C46H56ClN5O7Si的预期值853.36)。
制备例12
联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)-乙基]哌啶-4-基酯
向制备例11产物的二氯甲烷(1.0毫升,0.3M)悬浮液中加入三乙胺三氢氟酸盐(245μL,1.5mmol)。在室温下搅拌该混合物45小时,然后真空浓缩该混合物。将残余物溶于DMF(0.5毫升)、乙腈/水(1∶1,含有0.1%TFA,0.6mL)、TFA(0.3毫升)和乙腈(约1毫升)的混合物中,并通过制备型-RP-HPLC(梯度:含2至50%乙腈的水(含有0.05%TFA))纯化该混合物。收集合适的级分并合并,冻干,得到标题化合物的二(三氟乙酸盐)(100毫克,34%产率,98.7%纯度,利用HPLC),为灰白色固体。MS m/z 740.5(M+H,C40H42ClN5O7的预期值739.28)。
实施例1
联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)-乙基]哌啶-4-基酯1,2-乙烷二磺酸盐
将1,2-乙烷二磺酸二水合物(3.8毫克,0.02mmol)的乙醇(0.2毫升)溶液慢慢地加到制备例12产物(14.3毫克,0.02mmol)在异丙醇和二氯甲烷(1毫升)的64∶1 v/v混合物中的溶液中。将得到的溶液在45℃至50℃加热约30分钟。然后将混合物慢慢地冷却至室温,此时溶液变得略微浑浊。使溶液在室温、在平缓氮气流下静置过夜。通过过滤收集得到的沉淀,干燥,提供标题化合物,为白色结晶固体(13毫克,72%产率)。
实施例2
联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)-乙基]哌啶-4-基酯1,2-乙烷二磺酸盐
在乙醇(5.36毫升)中制备联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)-乙基]哌啶-4-基酯(26.8mg,0.0362mmol)溶液,并在室温下搅拌,直至达到全部溶解(5分钟)。用大约一分钟,将1,2-乙烷二磺酸二水合物(8.2mg,0.0362mmol)的乙醇(0.2毫升)溶液慢慢地加到第一个溶液中。将得到的悬浮液搅拌五分钟,然后在氮气氛围中过滤分离。将得到的沉淀干燥,提供标题化合物,为白色固体(28.5毫克,85%产率)。
实施例3
联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)-乙基]哌啶-4-基酯1,2-乙烷二磺酸盐
将联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)-乙基]哌啶-4-基酯(5克,6.75mmol,>99%纯度)溶于异丙醇(100毫升)中,而后加入溶于水(20毫升)中的乙烷二磺酸二水合物(1.525毫克,6.75mmol)。将得到的浆液在室温搅拌1小时,然后在~30℃下过夜。分离标题化合物(6.0克)为白色粉末。将产物在含20%水的异丙醇(100毫升)中、在30℃下加热48小时。冷却至室温之后,通过过滤分离得到的沉淀,在空气中干燥2小时,得到标题化合物(5.4克)。
制备例13
4-丙烯酰基氨基-5-氯-2-甲氧基苯甲酸甲酯
向配备有顶部搅拌器、温度控制和加入漏斗的1升三颈圆底烧中加入4-氨基-5-氯-2-甲氧基苯甲酸甲酯(44.2克,200mmol)、二氯甲烷(500毫升)和二异丙基乙胺(104.5毫升,600mmol)。将得到的混合物在室温下搅拌,直至组分溶解,然后将该混合物冷却至0℃。然后逐滴加入丙烯酰氯(16.25毫升,200mmol),同时保持内部反应混合物温度低于10℃。加入总时间大约是30分钟。然后在约2小时期间内,慢慢地将反应混合物从0℃升温至室温。然后加入饱和碳酸氢钠水溶液(200毫升)和二氯甲烷(200毫升),并将该混合物搅拌15分钟。然后分离各层。用1M盐酸(200毫升)洗涤二氯甲烷层,然后减压浓缩至其原始体积的约三分之一,产生浓淤浆。过滤该浆液,用二氯甲烷(100毫升)洗涤滤饼,干燥,提供标题化合物,为灰白色固体(36克,67%产率,>98%纯度,利用HPLC)。
制备例14
4-{3-[4-(联苯-2-基氨甲酰氧基)哌啶-1-基]丙酰基氨基}-5-氯-2-甲氧基苯甲酸甲酯
向配备有顶部搅拌器、温度控制和回流冷却器的1升三颈圆底烧中加入联苯-2-基氨基甲酸哌啶-4-基酯(36.3克,122mmol)、二氯甲烷(500毫升)和异丙醇(100毫升)。将得到的混合物在室温下搅拌,直到组分溶解,然后加入制备例10的产物(30克,111.5mmol)。在室温下继续搅拌,直至组分溶解,然后回流加热(50℃至55℃)该混合物18小时。然后将反应混合物冷却到室温,并加入乙醇(200毫升)。减压浓缩该混合物至约150毫升的体积,产生稠浆液。过滤该浆液,用乙醇(50毫升)洗涤滤饼,干燥,提供标题化合物,为白色固体(58克,92%产率,99.5%纯度,利用HPLC)。
制备例15
联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-羟甲基-5-甲氧基-苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯
向2升圆底烧瓶中加入制备例14产物(40克,70.8mmol)和THF(400毫升)。将得到的混合物在室温下搅拌,直至组分溶解,然后用氮气吹扫烧瓶5分钟。然后将混合物冷却至0℃(内部温度),并通过附加的漏斗滴加氢化铝锂的1 M THF(106毫升,106mmol)溶液,同时保持内部反应混合物温度低于10℃。总加入时间大约是40分钟。然后在0℃搅拌该反应混合物1小时,然后加入1M氢氧化钠(200毫升),同时保持内部反应混合物温度低于15℃。然后分离各层,用饱和氯化钠水溶液(100毫升)洗涤THF层,用硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩,提供标题化合物,为白色固体(38克,100%产率,94%纯度,利用HPLC)。
制备例16
联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-甲酰基-5-甲氧基苯基-氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯
向1升圆底烧瓶中加入制备例15产物(28克,52mmol)和二氯甲烷(500毫升)。将得到的混合物在室温下搅拌,直到组分溶解,然后加入活化的氧化锰(IV)(45克,520mmol)。在氮气氛围中、在室温下搅拌该反应混合物12小时,然后通过硅藻土垫过滤。然后减压浓缩该混合物,并将残余物真空干燥过夜,提供标题化合物黄色固体(26克,93%产率,约93%纯度,利用HPLC)。
制备例17
联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(4-{[(R)-2-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-2-氯-5-甲氧基-苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯
向500毫升圆底烧瓶中加入制备例16产物(6克,11.2mmol)和二氯甲烷(50毫升)。将得到的混合物在室温下搅拌,直到组分溶解,然后加入制备例7的产物(6克,15.0mmol)和无水甲醇(50毫升)。在室温下、氮气氛围中搅拌该混合物2小时(明亮黄色至橙色溶液),然后将该混合物冷却到0至5℃。用10分钟、分几部分加入固体三乙酰氧基氢硼化钠(7.2克,34mmol),然后在约2小时期间内将该反应混合物慢慢地从0℃升温至室温。然后将混合物冷却至0℃,并加入1M氢氧化钠水溶液(50毫升)和二氯甲烷(150毫升)。彻底搅拌该混合物,然后分离各层。将有机层用饱和氯化钠水溶液(50毫升)洗涤,过滤,用硫酸钠干燥,过滤并减压浓缩,得到标题化合物黄色固体(10.1克,100%产率,87%纯度,利用HPLC)。
实施例4
联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)-乙基]哌啶-4-基酯1,2-乙烷二磺酸盐
向50毫升圆底烧瓶中加入制备例17产物(2.0克,2.5mmol)和二氯甲烷(10毫升)。将得到的混合物在室温下搅拌,直到组分溶解,然后加入三乙胺三氢氟酸盐(1.2毫升,7.5mmol),并将得到的混合物在25℃搅拌20小时。然后加入1,2-乙烷二磺酸二水合物(0.56克,2.5mmol)的甲醇(10毫升)溶液,并将该混合物在30℃搅拌2小时,此时形成稠的白色浆液。慢慢地过滤浆液,用甲醇(10毫升)洗涤滤饼,空气干燥2小时,然后真空干燥过夜,提供标题化合物细白色粉末(1.5克,>98%纯度,利用HPLC)。
实施例5
联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)-乙基]哌啶-4-基酯1,2-乙烷二磺酸盐的纯化
向在实施例4中制备的联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)-乙基]哌啶-4-基酯1,2-乙烷二磺酸盐(80克)中加入含20%水的异丙醇溶液(按体积)(800毫升)。将得到的浆液在室温下放置过夜,然后过滤,提供具有改进晶性和纯度的标题化合物(74克)。
制备例18
联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)-乙基]哌啶-4-基酯1,2-乙烷二磺酸盐的晶种
步骤(a)
在~60℃,将在实施例4中制备的联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)-乙基]哌啶-4-基酯1,2-乙烷二磺酸盐(100毫克)溶于含13%水的甲醇(20毫升)中。在密闭容器中,使得到的澄清溶液冷却至室温。48小时之后,通过过滤分离所得到的片状晶体。
步骤(b)
在60-65℃,将在实施例4中制备的联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)-乙基]哌啶-4-基酯1,2-乙烷二磺酸盐(1.0克)溶于含15%水的甲醇(100毫升)中。将清澈的搅拌溶液冷却至30℃,然后加入步骤(a)的晶状产物(4.2毫克)。将该溶液冷却至20℃,并搅拌2小时。通过过滤分离得到的沉淀,并空气干燥1小时,提供标题化合物(680毫克)。
步骤(c)
重复步骤(b)的程序,将步骤(a)的产物替换为步骤(b)的产物(20毫克),提供标题化合物(690毫克)。
步骤(d)
在60-65℃,将在实施例4中制备的联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)-乙基]哌啶-4-基酯1,2-乙烷二磺酸盐(10克)溶于含15%水的甲醇(1L)中。将清澈的搅拌溶液冷却至30℃,然后加入步骤(c)的晶状产物(4.2毫克)。将溶液冷却至20℃,并搅拌18小时。通过过滤分离得到的沉淀,并空气干燥2小时,提供标题化合物(5.5克)。
实施例6
使用晶种进行联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)-乙基]哌啶-4-基酯1,2-乙烷二磺酸盐的重结晶
向12升圆底烧瓶中加入实施例5产物(60克,64.5mmol)、水(0.9L)和甲醇(5.1L)。将得到的混合物从25℃加热至61-65℃,同时搅拌,直至组分溶解,并在60-65℃额外搅拌20分钟。将混合物冷却至30℃,然后加入制备例18的产物(2克,2.15mmol)。将该混合物慢慢地冷却至20℃,并将得到的浆液在30℃额外搅拌2小时。用甲醇(500毫升)过滤产物,空气干燥2小时,然后在25-30℃真空干燥18小时,提供标题化合物(43克,72%产率,99.2%纯度)。
实施例7
热分析
使用带有热分析控制器的TA Instruments Model Q-10模件进行差示扫描量热法(DSC)。收集数据并使用TA Instruments ThermalSolutions软件进行分析。将约1毫克样品准确地称重到带有盖的铝盘中。使用5℃/分钟的线型加热装置(ramp)、从室温至大约300℃进行样品评价。在使用期间,将DSC小室用干燥氮气吹扫。实施例6的联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯的晶状1,2-乙烷二磺酸盐的代表性DSC图显示在图1中,实施例2的样品的代表性DSC图显示在图2中。
使用具有高分辨率能力的TA Instruments Model Q-50模件进行热重量分析(TGA)。收集数据并使用TA Instruments ThermalSolutions软件进行分析。将重约10毫克的样品放置到铂盘上,并用高分辨-加热速率从室温至300℃进行扫描。在使用期间,将平衡室和加热炉室用氮气流吹扫。实施例6的晶状联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯的1,2-乙烷二磺酸盐样品的代表性TGA图显示在图1中。
DSC图证明,本发明的1,2-乙烷二磺酸盐具有出色的热稳定性,分别具有大约239℃和大约219℃的熔点,并且低于约200℃没有出现热分解。
实施例8
粉末X射线衍射
用Thermo ARL X-射线衍射仪X′TRA型(Thermo ARL SA,瑞士)、使用Cu Kα辐射、在1.542(45 kV,40mA)、用Si(Li)固态探测器获得粉末X射线衍射图。分析典型地在扫描速率2°/分钟、在2至30°的2θ角范围内以每点0.03°步长进行。将接受时的或研磨至细粉末的样品,轻轻地装到一个设计适合用于分析的仪器顶部加载的样品杯定制的小体积插入物中。该仪器每周用硅金属标准标定,至±0.02°2θ角内。实施例6的联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯的晶状1,2-乙烷二磺酸盐的代表性PXRD图形显示在图3中,实施例2的样品的代表性图形显示在图4中。
实施例9
红外分析
使用配备有Nicolet衰减全反射(ATR)样品承载器的Avatar 360FT-IR光谱仪在4000至675cm-1频段下测定红外(IR)吸收光谱。实施例6样品的晶状联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯的1,2-乙烷二磺酸盐的样品的代表性IR吸收光谱在704±1,748±1,768±1,841±1,900±1,1055±1,1104±1,1166±1,1218±1,1294±1,1408±1,1522±1,1609±1,1655±1,和1701±1处具有显著的吸收谱带,如图5所示。
实施例10
动态水份吸收评定
使用VTI大气微量天平,SGA-100系统(VTI公司,Hialeah,FL33016)进行制备例18的晶状联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯的1,2-乙烷二磺酸盐的手工研磨样品的动态水份吸收(DMS)评定(又名水份吸收-解吸特性)。使用大约10毫克试样量,开始分析时将湿度设置在环境值。典型的DMS分析由三次扫描组成:环境至2%相对湿度(RH),2%RH至90%RH,90%RH至5%RH,以5%RH/步的扫描速率扫描。每两分钟测定质量,当对于5个连续点样品质量稳定在0.01%之内时,将RH转换为下一个值(+/-5%RH)。代表性的DMS扫描图如图6所示。
DMS图证明本发明的1,2-乙烷二磺酸盐具有可逆吸收/解吸特性和适度的(<9%)吸湿性。在40%RH至75%RH的湿度范围内该盐具有小于2.5%的增重。这种可逆水份吸收/解吸特性证明本发明的晶状盐具有可接受的吸湿性且不潮解。
实施例11
元素分析和反离子比例
使用Flash EA 1112元素分析仪(CE Elantech,Lakewood,NJ),通过燃烧分析,测定了实施例6的晶状联苯-2-基氨基甲酸1-[2-(2-氯-4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}-5-甲氧基苯基氨甲酰基)乙基]哌啶-4-基酯的1,2-乙烷二磺酸盐样品的碳、氢、氮和硫的下面元素百分数:碳52.95%,氢5.43%,氮6.83%,和硫6.87%。以所测定的硫的重量百分数计算,在晶状样品中1,2-乙烷二磺酸的重量百分数是20.4%,其等于理论上的重量百分数20.4%,提供1∶1的反离子比例。
制备物A
细胞培养和来自表达人β1、β2或β3肾上腺素能受体的细胞的膜制备物
在存在500μg/mL遗传霉素下,使分别地稳定表达克隆的人β1、β2或β3肾上腺素能受体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系在有10%FBS的Hams F-12培养基中生长至接近汇合。用在PBS中的2mM EDTA提起细胞单层。通过在1000rpm离心来沉淀细胞,将细胞沉淀在-80℃冷冻储存或立即制备膜供使用。对于β1和β2受体表达性膜的制备,将细胞沉淀再混悬在细胞溶解缓冲液(10mM HEPES/HCl,10mMEDTA,pH7.4,在4℃)中且利用紧密适合的Dounce玻璃匀浆器在冰上匀化(冲击30次)。对于更蛋白酶敏感的β3受体表达性膜,使细胞沉淀物在每50mL缓冲液(Roche Catalog No.1697498,Rochemolecular Biochemicals,Indianapolis,IN)补充有一片“有2mM EDTA的完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒片”的细胞溶解缓冲液(10mM Tris/HCl,pH7.4)中匀化。将该匀浆物在20,000X g离心,并用细胞溶解缓冲液通过如上所述再混悬和离心来洗涤一次得到的沉淀。然后将最终的沉淀再混悬在冰冷的结合试验缓冲液(75mM Tris/HClpH 7.4,12.5mMMgCl2,1mM EDTA)中。通过在Lowry等,1951,Journal ofBiological Chemistry,193,265;和Bradford,Analytical Biochemistry,1976,72,248-54中描述的方法,测定膜混悬液的蛋白质浓度。将所有膜以等分试样在-80℃冷冻储存或立即使用。
制备物B
细胞培养和来自表达人M1、M2、M3和M4毒蕈碱性受体的细胞的膜制备物
使分别地稳定表达克隆的人hM1、hM2、hM3和hM4毒蕈碱性受体亚型的CHO细胞系在补充有10%FBS和250μg/mL遗传霉素的HAM′s F-12培养基中生长至接近汇合。使细胞在5%CO2,37℃培养箱中生长并用在dPBS中的2mM EDTA提起它。通过在650X g离心5分钟收集细胞,将细胞沉淀在-80℃冷冻储存或立即制备膜供使用。至于膜制备,将细胞沉淀再混悬在细胞溶解缓冲液中并用PolytronPT-2100组织破裂仪(Kinematica AG;20秒X2次破裂)匀浆。在4℃在40,000X g离心粗制膜15分钟。然后将膜沉淀用再混悬缓冲液再混悬,并再次用Polytron组织破裂仪匀浆。通过在Lowry等,1951,Journal of Biochemistry,193,265中描述的方法来测定膜混悬液的蛋白质浓度。将所有膜以等分试样在-80℃冷冻储藏或立即使用。制备的hM5受体膜的等分试样直接购自Perk in Elmer且储存在-80℃直到使用。
试验检测方法A
人β1、β2和β3肾上腺素能受体的放射配体结合试验
在96孔微量滴定板中以100μL的总试验体积进行结合试验,试验缓冲液(75mM Tris/HCl pH 7.4,在25℃,12.5mM MgCl2,1mMEDTA,0.2%BSA)中有10-15μg包含人β1、β2或β3肾上腺素能受体的膜蛋白质。测定放射配体Kd值的饱和结合研究是利用对于β1和β2受体的[3H]-二氢阿普洛尔(NET-720,100 Ci/mmol,PerkinElmer LifeSciences Inc.,Boston,MA)和[125I]-(-)-碘氰基吲哚洛尔(NEX-189,220Ci/mmol,PerkinElmer Life Sciences Inc.,Boston,MA),以0.01nM至20nM范围内的10或11个不同浓度进行的。对于在10pM至10μM范围内的10或11个不同浓度的试验化合物,测定试验化合物Ki值的置换试验是用1nM[3H]-二氢阿普洛尔和0.5nM[125I]-(-)-碘氰基吲哚洛尔进行的。在10μM普萘洛尔存在下,测定非特异性结合。将试验物在37℃培养1小时,然后对于β1和β2受体通过GF/B玻璃纤维滤板或对于β3受体通过GF/C玻璃纤维滤板(Packard BioScience Co.,Meriden,CT)快速过滤来终止结合反应,所述玻璃纤维滤板预先浸在0.3%聚乙烯亚胺中。用过滤缓冲液(75mM Tris/HCl pH 7.4在4℃,12.5mM MgCl2,1mM EDTA)洗涤滤板三次,来除去未结合放射性。然后干燥该板,加入50μl Microscint-20液体闪烁液(PackardBioScience Co.,Meriden,CT)并在Packard Topcount液体闪烁计数仪(Packard BioScience Co.,Meriden,CT)中计数该板。利用一位点竞争的3-参数模型用 GraphPad Prism软件包(GraphPadSoftware,Inc.,San Diego,CA)通过非线性回归分析来分析结合数据。当在10μM普萘洛尔存在下测定时,将曲线最小值固定为非特异性结合的值。利用Cheng-Prusoff方程式(Cheng Y和Prusoff WH.,Biochemical Pharmacology,1973,22,23,3099-108),从观察到的IC50值和放射配体的Kd值计算试验化合物的Ki值。
在这一试验中,较低的Ki值表明试验化合物对受试的受体具有较高的结合亲和性。当在这一试验中测试时,发现式I的化合物对人β2肾上腺素能受体具有小于10nM的Ki值。
试验检测方法B
对毒蕈碱性受体的放射配体结合试验
在96孔微量滴定板中以100μl的总试验体积进行克隆的人毒蕈碱性受体的放射配体结合试验。将稳定表达hM1、hM2、hM3、hM4或hM5毒蕈碱亚型的CHO细胞膜稀释在试验缓冲液中至下述特定的靶蛋白浓度(μg/孔):对于hM1 10μg,对于hM2 10-15μg,对于hM310-20μg,对于hM4 10-20μg以及对于hM5 10-12μg,得到相似的信号(cpm)。在试验板加入之前,利用Polytron组织破裂仪短暂地匀化该膜(10秒)。测定放射配体KD值的饱和结合研究是利用在0.001nM-20nM浓度的L-[N-甲基-3H]氯甲东茛菪碱([3H]-NMS)(TRK666,84.0Ci/mmol,Amersham Pharmacia Biotech,Buckinghamshire,England)进行的。测定试验化合物Ki值的置换试验是用1nM[3H]-NMS和11个不同试验化合物浓度进行的。首先将试验化合物溶解在稀释缓冲液中至浓度为400μM,然后用稀释缓冲液连续地稀释5×至最终浓度为10pM至100μM。添加至试验板的顺序和体积如下:25μL放射配体,25μL稀释的试验化合物和50μL膜。在37℃培养试验板60分钟。通过经在1%BSA中预处理的GF/B玻璃纤维滤板(PerkinElmer Inc.,Wellesley,MA)快速过滤来终止结合反应。用洗涤缓冲液(10mM HEPES)冲洗滤板三次来除去未结合放射性。然后空气干燥该板,并向每个孔加入50μL Microscint-20液体闪烁液(Perkin Elmer Inc.,Wellesley,MA)。然后在PerkinElmer Topcount液体闪烁计数仪(PerkinElmer Inc.,Wellesley,MA)中计数该板。利用一位点竞争模型用GraphPad Prism软件包(GraphPadSoftware,Inc.,San Diego,CA)通过非线性回归分析来分析结合数据。利用Cheng-Prusoff方程式(Cheng Y;Prusoff WH.(1973)BiochemicalPharmacology,22(23):3099-108),从观察到的IC50值和放射配体的KD值计算试验化合物的Ki值。将Ki值转化成pKi值来确定几何平均数和95%置信区间。然后将这些概括的统计数字再转化回Ki值用于数据报告。
在这一试验中,较低的Ki值表明试验化合物对受试的受体具有较高的结合亲和性。在这一试验中测试时,发现式I化合物对于人M2和M3毒蕈碱性受体具有小于10nM的Ki值。
试验检测方法C
在异源性表达人β1、β2或β3肾上腺素能受体的CHO细胞系中的全细胞cAMP快速板(flashplate)试验
按照生产商的用法说明,利用有[125I]-cAMP的快速板腺苷酸环化酶激活试验系统,以放射免疫测定法格式进行cAMP试验(NENSMP004,PerkinElmer Life Sciences Inc.,Boston,MA)。对于β受体激动剂效能(EC50)的测定,使稳定表达克隆的人β1、β2或β3肾上腺素能受体的CHO-K1细胞系在补充有10%FBS和遗传霉素(250μg/ml)的HAM’s F-12培养基中生长至接近汇合。用PBS冲洗细胞,并在包含2mM EDTA或胰蛋白酶-EDTA溶液(0.05%胰蛋白酶/0.53mMEDTA)的dPBS(Dulbecco′s磷酸盐缓冲盐水,无CaCl2和MgCl2)中分离细胞。在Coulter细胞计数器中计数细胞后,通过在1000rpm离心来沉淀细胞和再混悬在预先暖至室温的包含IBMX的刺激缓冲液(PerkinElmer试剂盒)中至浓度为每毫升1.6×106至2.8×106个细胞。在这一试验中使用每孔大约60000-80000个细胞。将受试化合物(10mM在DMSO中)在Beckman Biomek-2000中稀释在包含0.1%BSA的PBS中,并在100μM-1pM的11个不同浓度下试验。将反应物在37℃培养10分钟,并通过加入包含[125I]-cAMP的100μL冷检测缓冲液(NEN SMP004,PerkinElmer Life Sciences,Boston,MA)来停止反应。基于样本观察到的计数和在生产商用户手册中描述的cAMP标准品来计算产生的cAMP的量(pmol/孔)。使用GraphPadPrism软件包(GraphPad Software,Inc.,San Diego,CA),用sigmoidal方程式,通过非线性回归分析来分析数据。使用Cheng-Prusoff方程式(Cheng Y和Prusoff WH.,Biochemical Pharmacology,1973,22,23,3099-108)来计算EC50值。
在这一试验中,较低的EC50值表明受试化合物在受试的受体上具有较高的功能活性。当在该试验中测试时,发现式I化合物对于β2肾上腺素能受体具有小于约10nM的EC50值。
试验检测方法D
对毒蕈碱性受体亚型的拮抗作用的功能试验
A.激动剂介导的[35S]GTPγS结合的阻滞
通过测定化合物在表达hM2受体的CHO-K1细胞中阻滞氧化震颤素刺激的[35S]GTPγS的结合的能力,来测定受试化合物的功能效力。
在使用时,解冻冷冻的膜,然后稀释在每孔有5-10μg蛋白质的最终靶组织浓度的试验缓冲液中。利用Polytron PT-2100组织破裂仪短暂地匀化膜,然后加到试验板中。
在每个试验中,测定激动剂氧化震颤素刺激[35S]GTPγS结合的EC90值(对于90%最大响应的有效浓度)。
为测定试验化合物抑制氧化震颤素-刺激的[35S] GTPγS结合的能力,将下述物质加入96孔板的每个孔中:25μL含有[35S]GTPγS(0.4nM)的试验缓冲液,25μL氧化震颤素(EC90)和GDP(3μM),25 μL稀释的受试化合物和25μL表达hM2受体的CHO细胞膜。然后在37℃培养试验板60分钟。利用PerkinElmer 96-孔收获仪经1%BSA预处理的GF/B滤器过滤试验板。用冰冷的冲洗缓冲液冲洗板3×3秒,然后空气或真空干燥。将Microscint-20闪烁液(50μL)加入每个孔中,密封每个板,并在Topcounter(PerkinElmer)上计数放射性。用GraphPad Prism软件包(GraphPad Software,Inc.,San Diego,CA),利用非线性回归、一位点竞争方程式,通过非线性回归分析来分析数据。使用Cheng-Prusoff方程式来计算Ki,分别利用试验化合物的浓度-响应曲线的IC50值和试验中的氧化震颤素浓度作为KD和[L],配体浓度。
在这一试验中,较低的Ki值表明受试化合物在受试的受体上具有较高的功能活性。当在该试验中测试时,发现式I的化合物对于在表达hM2受体的CHO-K1细胞中氧化震颤素-刺激的[35S]GTPγS结合的阻滞具有小于约10nM的Ki值。
B.经由FLIPR试验的激动剂-介导的钙释放的阻滞
与Gq蛋白偶联的毒蕈碱性受体亚型(M1、M3和M5受体),在激动剂结合受体时激活磷脂酶C(PLC)通路。结果,活化的PLC将磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)水解成二酰基甘油(DAG)和磷脂酰-1,4,5-三磷酸(IP3),IP3又从细胞内存储处即内质网和肌质网产生钙释放。FLIPR(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)试验通过使用当游离钙结合时发荧光的钙敏感性染料(Fluo-4AM,Molecular Probes,Eugene,OR),来利用细胞内钙的这一增加。用FLIPR实时测定该荧光事件,其检测到用人M1和M3以及黑猩猩M5受体克隆的细胞单层的荧光变化。通过拮抗剂抑制激动剂介导的细胞内钙增加的能力,能测定拮抗剂效能。
对于FLIPR钙刺激试验,在进行试验前的晚上,将稳定表达hM1、hM3和cM5受体的CHO细胞接种入96-孔FLIPR板。通过Cellwash(MTX Labsystems,Inc.)用FLIPR缓冲液(10mM HEPES,pH7.4,2mM氯化钙,在无钙和镁的Hank′s缓冲盐溶液(HBSS)中的2.5mM丙璜舒)洗涤接种的细胞两次,来除去生长培养基留下50μL/孔的FLIPR缓冲液。然后用50μL/孔的4μM FLUO-4AM(制成2X溶液)在37℃,5%二氧化碳下培养细胞40分钟。在染料培养期后,用FLIPR缓冲液洗涤细胞两次,留下50μL/孔的终体积。
为测定拮抗剂效力,首先测定氧化震颤素的细胞内Ca2+释放的剂量依赖性刺激,以使随后可以测量在EC90浓度下抗氧化震颤素刺激的拮抗剂效力。首先用化合物稀释缓冲液培养细胞20分钟,随后加入激动剂,这是通过FLIPR进行的。按照在FLIPR测量中的详细方法和下面的数据归纳部分,结合公式ECF=((F/100-F)^1/H)*EC50,产生氧化震颤素的EC90值。在刺激板中制备3X ECF的氧化震颤素浓度,以便将EC90浓度的氧化震颤素加入拮抗剂抑制试验板的每个孔中。
用于FLIPR的参数是:曝光时长为0.4秒,激光强度为0.5瓦特,激发波长为488nm和发射波长为550nm。通过在添加激动剂前测量荧光变化10秒钟来确定基线。在激动剂刺激后,FLIPR每0.5至1秒连续地测量荧光变化1.5分钟来捕捉最大荧光变化。
荧光变化被表示为每孔最大荧光减去基线荧光。利用sigmoidal剂量-响应的嵌入模型,用GraphPad Prism(GraphPad Software,Inc.,San Diego,CA)通过非线性回归,对药物浓度的对数分析原始数据。按照Cheng-Prusoff方程式(Cheng&Prusoff,1973),利用氧化震颤素EC50值作为KD和配体浓度的氧化震颤素EC90,通过Prism确定拮抗剂Ki值。
在这一试验中,较低的Ki值表明受试化合物在受试的受体上具有较高的功能活性。在该试验中测试时,发现式I化合物对于阻滞在稳定地表达hM1、hM3和cM5受体的CHO细胞中激动剂介导的钙释放具有小于约10nM的Ki值。
试验检测方法E
用内源性表达人β2肾上腺素能受体的肺上皮细胞系的全细胞cAMP快速板试验
为了测定在表达β2肾上腺素能受体内源性水平的细胞系中激动剂效力和功效(内在活性),采用人肺上皮细胞系(BEAS-2B)(ATCCCRL-9609,美国典型培养物保藏中心,Manassas,VA)(January B,等British Journal of Pharmacology,1998,123,4,701-11)。使细胞在完全、无血清的培养基(包含肾上腺素和维A酸的LHC-9培养基,cat#181-500,Biosource International,Camarillo,CA)中生长至75%-90%汇合。在试验前一天,将培养基转换成LHC-8(无肾上腺素或维A酸cat#141-500,Biosouree International,Camarillo,CA)。
按照生产商的说明利用有[125I]-cAMP的快速板腺苷酸环化酶激活试验系统(NEN SMP004,PerkinElmer Life SciencesInc.,Boston,MA),以放射免疫测定法格式进行cAMP试验。
在试验当天,用PBS冲洗细胞,通过用在PBS中的5mM EDTA刮而提起细胞并计数。通过在1000rpm离心来沉淀细胞,并再混悬在预先暖至37℃的刺激缓冲液中,最终浓度为600,000细胞/mL。在这一试验中,以100000-120000细胞/孔的最终浓度使用细胞。在BeckmanBiomek-2000中,将受试化合物连续稀释入试验缓冲液(75mMTris/HCl pH 7.4在25℃,12.5 mM MgCl2,1mM EDTA,0.2%BSA)。在试验中在10μM-10pM的11个不同浓度下测试受试化合物。在37℃培养反应10分钟,并通过添加100μL冰冷的检测缓冲液来停止反应。密封板,在4℃培养过夜并在次日早晨在Topcount闪烁计数器(Packard BioScience Co.,Meriden,CT)中计数。基于样本观察到的计数和在生产商用户手册中描述的cAMP标准品,来计算每毫升反应产生的cAMP的量。用GraphPad Prism软件包(GraphPadSoftware,Inc.,San Diego,CA),用sigmoidal剂量-响应的4-参数模型,通过非线性回归分析来分析数据。
在这一试验中,较低的EC50值表明受试化合物在受试的受体上具有较高的功能活性。在该试验中测试时,发现式I化合物对于β2肾上腺素能受体具有小于约10nM的EC50值。
试验检测方法F
乙酰胆碱诱导的或组胺诱导的支气管收缩的豚鼠模型中支气管保护的持续时间
采用这些体内试验来评价既显示毒蕈碱性受体拮抗剂活性又显示β2肾上腺素能受体激动剂活性的受试化合物的支气管保护作用。为分离乙酰胆碱诱导的支气管收缩模型中的毒蕈碱拮抗剂活性,在给药乙酰胆碱前,给予动物心得安—一种阻断β受体活性的化合物。在组胺诱导的支气管收缩模型中支气管保护的持续时间反映了β2肾上腺素能受体激动剂的活性。
通过笼子卡片单个鉴别重250-350g的6只雄性豚鼠(Duncan-Hartley(HsdPoc:DH)Harlan,Madison,WI)的组。在整个研究中,允许动物随意接触食物及水。
在全身体暴露给药室(R&S Molds,San Carlos,CA)中经10分钟通过吸入给予试验化合物。安排给药室,以便从中央总管能同时给予6个单独的室气雾剂。将豚鼠暴露于受试化合物或载体(WFI)的气雾剂中。这些气雾剂产生自水溶液,使用LC Star雾化器装置(22F51型,PARI Respiratory Zquipment,Inc.Midlothian,VA)在22psi的压力下由气体混合物(CO2=5%,O2=21%和N2=74%)驱动。在该操作压力通过雾化器的气体流量是大约3L/分钟。通过正压将产生的气雾剂驱赶入室。在给药雾化的溶液过程中不使用稀释空气。在10分钟雾化期间,大约1.8mL的溶液被雾化。通过比较填充的雾化器雾化前和雾化后的重量来重量分析地计算该值。
在给药后1.5、24、48和72小时,利用全身体积扫描术评价经由吸入给予的受试化合物的支气管保护作用。
在肺评价开始前四十五分钟,用氯胺酮(43.75mg/kg),甲苯噻嗪(3.50mg/kg)和乙酰丙嗪(1.05mg/kg)肌内注射来麻醉每只豚鼠。在手术位置备皮并用70%乙醇清洁后,做颈腹面的2-3cm正中切口。然后分离颈静脉并插入充满盐水的聚乙烯导管(PE-50,Becton Dickinson,Sparks,MD)以使得静脉内输注在盐水中的乙酰胆碱(Ach)或组胺。然后解剖使开气管游离并插入14G特氟隆管(#NE-014,Small Parts,Miami Lakes,FL)。如果需要,通过进一步肌内注射前面提及的麻醉混合物来维持麻醉。监测麻醉深度,如果动物对掐它的爪响应或如果呼吸速度大于100次呼吸/分钟,就进行调节。
一旦完成插管,就将动物置于体积扫描器(#PLY 3114,BuxcoElectronics,Inc.,Sharon,CT)中并插入食管压力导管(PE-160,BectonDickinson,Sparks,MD)来测量肺驱动压(压力)。将特氟隆气管导管连接至体积扫描器的开口以使豚鼠能呼吸来自室外的空气。然后密封室。使用加热灯维持体温,并利用10mL校准注射器(#5520 Series,Hans Rudolph,Kansas City,MO)用4mL空气,使豚鼠的肺膨胀3次以确保下气道不塌陷且该动物不会通气过度。
一旦测定顺应性基线值在0.3-0.9mL/cm水范围内,且阻力基线值在0.1-0.199cm水/mL/秒范围内,就开始肺评价。Buxco肺测量计算机程序使得能够收集和导出肺的值。
开始这一程序来启动试验方案和数据收集。通过Buxco压力传感器,测量随每次呼吸在体积扫描器内发生的体积随时间的变化。通过对时间将该信号积分,计算每次呼吸的流量测量值。通过Buxco(MAX2270)前置放大器将该信号和利用Sensym压力传感器(#TRD4100)收集的肺驱动压力变化连接至数据收集界面(#’s SFT3400和SFT3813)。从这两个输入导出所有其它肺参数。
收集基线值5分钟,之后用Ach或组胺攻击豚鼠。在评价毒蕈碱拮抗剂作用时,在用Ach攻击前15分钟,给予普萘洛尔(5mg/Kg,iv)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。从试验开始,以下述剂量和规定的时间从注射器泵(sp210iw,World Precision Instruments,Inc.,Sarasota,FL)静脉内输注Ach(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)(0.1mg/mL)1分钟:在第5分钟1.9μg/分钟,在第10分钟3.8μg/分钟,在第15分钟7.5μg/分钟,在第20分钟15.0μg/分钟,在第25分钟30μg/分钟和在第30分钟60μg/分钟。或者,在不用β阻断化合物预处理的乙酰胆碱攻击模型中评价受试化合物的支气管保护作用。
在评价受试化合物的β2肾上腺素能受体激动剂作用时,从试验开始,以下述剂量和规定的时间从注射器泵静脉内输注组胺(25μg/mL)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)1分钟:在第5分钟0.5μg/分钟,在第10分钟0.9μg/分钟,在第15分钟1.9μg/分钟,在第20分钟3.8μg/分钟,在第25分钟7.5μg/分钟和在第30分钟15μg/分钟。如果在每次Ach或组胺剂量后3分钟,阻力或顺应性不返回基线值,则从10mL校正注射器用4mL空气膨胀豚鼠的肺3次。记录的肺参数包括呼吸频率(呼吸/分钟)、顺应性(mL/cm水)和肺阻力(cm水/mL/秒)。一旦在该方案的第35分钟完成肺功能测定,就从体积扫描器中移开豚鼠并通过二氧化碳窒息来处死豚鼠。
以两种方式中的一种来评价数据:
(a)从“压力变化”与“流量变化”的比值计算肺阻力(RL,cm水/mL/秒)。计算介质和受试化合物组对ACh(60μg/min,IH)的RL响应。计算在介质处理动物中在每个处理前时间的平均ACh响应,并用来计算在相应的处理前时间在每个受试化合物剂量下的ACh响应的抑制百分率。利用GraphPad Prism,用于Windows的3.00版(GraphPad Software,San Diego,California)使‘RL’的抑制剂量响应曲线与四参数逻辑方程式拟合,来估计支气管保护ID50(抑制ACh(60μg/分钟)支气管收缩剂响应50%所需的剂量)。使用的方程式如下:
Y=Min+(Max-Min)/(1+10((log ID50-X)*希尔斜率))
其中X是剂量的对数,Y是响应(ACh诱导的RL增加的抑制百分率)。Y在Min起始并渐进靠近Max,具有S形状。
(b)量PD2,其被定义为引起基线肺阻力加倍需要的Ach或组胺的量,利用下述方程式(衍生自临床中用于计算PC20值的方程式(见Am.Thoracic Soc,2000),利用一系列Ach或组胺攻击期间从流量和压力衍生的肺阻力值来计算:
其中:
C1=C2前的Ach或组胺的浓度
C2=导致肺阻力(RL)至少2倍增加的Ach或组胺的浓度。
R0=基线RL值
R1=C1后的RL值
R2=C2后的RL值
利用双尾-Students t-检验进行该数据的统计学分析。P值<0.05被认为显著。
在该试验中测试时,式I化合物产生抗MCh诱导的支气管收缩和His诱导的支气管收缩的剂量-依赖性支气管保护作用。另外,在这一试验中,式I化合物具有至少约24小时的支气管保护活性的持续时间(PD T1/2)。
虽然本发明用具体方面或它的实施方案作了描述,但是本领域普通技术人员应该理解,在不偏离本发明真实精神和范围的情况下可以做各种改变或可以做等同替换。此外,在申请的专利状态和规则允许的范围,本文引用的出版物,专利和专利申请都被完全引入至相同的范围作为参考,似乎每篇文章都是被本文单独引入作为参考。