NO338770B1

NO338770B1 - Krystallinsk form av en bifenylforbindelse, fremgangsmåte for fremstilling derav, farmasøytisk preparat samt anvendelse

Info

Publication number: NO338770B1
Application number: NO20071307A
Authority: NO
Inventors: Robert S Chao; Miroslav Rapta; Pierre-Jean Colson
Original assignee: Theravance Respiratory Co Llc
Priority date: 2004-08-16
Filing date: 2007-03-09
Publication date: 2016-10-17
Also published as: JP5032990B2; AU2005277601B2; NO20071307L; US8101766B2; US20060035931A1; RU2381223C2; US7521558B2; RU2007109598A; EP1778672A1; US8754223B2; BRPI0514413C1; AR051003A1; TW200613296A; KR20070057832A; AU2005277601A1; SI1778672T1; IL180853A0; PL1778672T3; CA2575874A1; DK1778672T3

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye krystallinske 1,2-etandisulfonsyresalter av en bifenylforbindelse som ventes å være nyttig som terapeutiske midler for behandling av pulmonare sykdommer. Foreliggende oppfinnelse vedrører også farmasøytiske preparater omfattende slike krystallinske forbindelser eller fremstilt fra slike krystallinske forbindelser, fremgangsmåter og mellomprodukter for fremstilling av slike krystallinske forbindelser og er nyttig i fremgangsmåter for anvendelse av slike krystallinske forbindelser for behandling av en pulmonar sykdom.

US-patentsøknad nr. 10/779.157 (US 2004/0167167), inngitt 13. februar 2004, tilhørende søkeren, beskriver nye bifenylforbindelser som er nyttige som terapeutiske midler for behandling av pulmonarsykdommer, så som kronisk obstruktiv pulmonar sykdom (COPD) og astma. Spesielt er forbindelsen bifenyl-2-ylkarbaminsyre l-[2-(2-klor-4- {[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-1,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-ylester spesifikt beskrevet i disse søknadene som innehavende både muskarinisk antagonist og P2adrenergisk reseptoragonistaktivitet. Den kjemiske strukturen av bifenyl-2-ylkarbaminsyre l-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksyfenylcarbamoyl)etyl]piperidin-4-ylester er representert ved formel I:

Terapeutiske midler som er nyttige for behandling av pulmonarlidelser administreres fordelaktig direkte inn i respirasjonskanalen ved inhalering. I dette henseendet er flere typer farmasøytiske inhalatoringsinnretninger utviklet for administrering av terapeutiske midler ved inhalering, innbefattende tørrpulverinhalatorer (DPI), inhalatorer med utmålt dose (MDI) og forstøvningsinhalatorer. Når det fremstilles farmasøytiske preparater og formuleringer for anvendelse i slike innretninger, er det meget ønskelig å ha en krystallinsk form av det terapeutiske midlet som verken er hygroskopisk eller har tendens til å absorbere vann fra atmosfæren og som har et relativt høyt smeltepunkt

(dvs. høyere enn ca. 150°C) for derved å tillate materialet å findeles uten betydelig dekomponering eller tap av krystallinitet.

Ingen krystallinske saltformer av forbindelsen av formel I er tidligere rapportert. Følgelig foreligger det et behov for en stabil, krystallinsk saltform som ikke har tendens til å absorbere vann fra atmosfæren av forbindelsen med formel I som har et akseptabelt nivå av hygroskopisitet og et relativt høyt smeltepunkt.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer krystallinske 1,2-etandisulfonsyresalter av bifenyl-2-ylkarbaminsyrel-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin- 5 -yl)etylamino] metyl} -5 -metoksyfenylkarbamoyl)etyl] piperidin-4-yl ester eller et solvat derav.

Overraskende er slike krystallinske 1,2-etandisulfonsyresalter av forbindelsen av formel I funnet å ikke ha tendens til å absorbere fuktighet, selv når de eksponeres mot atmosfærisk fuktighet. I tillegg har slike krystallinske salter et akseptabelt nivå av hygroskopisitet og et meget høyt smeltepunkt, for eksempel høyere enn ca. 215°C. I en spesiell utførelsesform har et krystallinsk salt ifølge foreliggende oppfinnelse et smeltepunkt på høyere enn ca. 230°C. Blant andre anvendelser er et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av forbindelsen av formel I nyttig for fremstilling av farmasøytiske preparater som ventes å være anvendbare for behandling av pulmonarsykdommer. Ifølge et annet preparattrekk vedrører foreliggende oppfinnelse følgelig et farmasøytisk preparat omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer og et 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbaminsyrel-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin- 5 -yl)etylamino] metyl} -5 -metoksyfenylkarbamoyl)etyl] piperidin-4-yl ester eller et solvat derav.

I en spesiell utførelsesform omfatter det farmasøytiske preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse et steroidalt anti-inflammatorisk middel, så som et kortekosteroid; eller en fosfodiesterase-4 inhibitor; eller en kombinasjon derav.

I nok en utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en kombinasjon omfattende: (a) et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbaminsyrel-[2-(2-klor

-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin-5-yl)ethylamino]-metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-ylester eller et solvat derav; og

(b) et steroidalt anti-inflammatorisk middel.

Forbindelsen av formel I har både muskarinisk antagonist og fø adrenergisk reseptor agonistaktivitet. Følgelig kan et 1,2-etandisulfonsyresalt ifølge foreliggende oppfinnelse ventes å være nyttige som et terapeutisk middel for behandling av pulmonarsykdommer, så som astma og kronisk obstruktiv pulmonar sykdom.

Følgelig kan foreliggende oppfinnelse, ifølge et av dens fremgangsmåtetrekk, anvendes i behandling av en pulmonar sykdom, hvor anvendelsen omfatter administrering til en pasient som har behov for behandling av en terapeutisk effektiv mengde av et 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbaminsyrel-[2-(2-klor -4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-1,2-dihydroquinolin-5-yl)ethylamino]metyl} -5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-ylester eller et solvat derav.

I tillegg kan foreliggende oppfinnelse anvendes i en fremgangsmåte for å frembringe bronkodilatering i en pasient, hvor fremgangsmåten omfatter administrering ved inhalering til pasienten av en bronkodilatasjonsfrembringende mengde av et 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbaminsyre l-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-1,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl} -5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]-piperidin-4-ylester eller et solvat derav.

Foreliggende oppfinnelse kan også anvendes i en fremgangsmåte for behandling av en kronisk obstruktiv pulmonarsykdom eller astma, hvor fremgangsmåten omfatter administrering til en pasient som har behov for behandling av en terapeutisk effektiv mengde av et 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbaminsyrel-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-1,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl} -5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-ylester eller et solvat derav.

Foreliggende oppfinnelse er også rettet mot fremgangsmåter for fremstilling av et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av forbindelsen med formel I. Ifølge et annet av dens fremgangsmåtetrekk tilveiebringer foreliggende oppfinnelse videre en fremgangsmåte for fremstilling av et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbamin syrel-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-ylester eller et solvat derav; hvor fremgangsmåten omfatter at bifenyl-2-ylkarbaminsyre l-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-1,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl} -5- metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-ylester bringes i kontakt med 1,2-etandisulfonsyre

I nok et av dens fremgangsmåtetrekk tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av en forbindelse av formel I, hvor fremgangsmåten omfatter:

( a) en forbindelse av formel II:

hvori R<la>,Rlbog R<lc>uavhengig av hverandre er valgt fra Cm alkyl, fenyl, -Cm alkyl-(fenyl), eller en av R<la>,Rlb og R<lc>er -0-(Cm alkyl); bringes i kontakt med fluoridion; og (b) produktet fra trinn (b) bringes i kontakt med 1,2-etandisulfonsyre eller et hydrat derav; for å danne et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av en forbindelse av formel I, hvori trinn (a) og (b) gjennomføres i den samme reaksjonsbeholderen uten isolering av produktet fra trinn (a).

Ifølge et annet av dens fremgangsmåtetrekk tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av en forbindelse av formel I som har et smeltepunkt høyere enn ca. 230°C, hvor fremgangsmåten omfatter tilsetning av en kimkrystall av et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av en forbindelse av formel I til en oppløsning omfattende et 1,2-etandisulfonsyresalt av en forbindelse av formel I oppløst i et inert fortynningsmiddel, hvor kimkrystallen har et smeltepunkt høyere enn ca. 230°C.

Denne fremgangsmåten kan også anvendes for å omkrystallisere et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av en forbindelse av formel I for å tilveiebringe en krystallinsk form som har et smeltepunkt høyere enn ca. 230°C. Følgelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse videre en fremgangsmåte for fremstilling av et krystallinsk 1,2-etandisul fonsyresalt av en forbindelse av formel I som har et smeltepunkt høyere enn ca. 230°C, hvor fremgangsmåten omfatter: (a) oppløsning av et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av en forbindelse av formel I i et inert fortynningsmiddel ved en første temperatur; (b) avkjøling av produktet fra trinn (a) til en andre temperatur; og (c) tilsetning av en kimkrystall av et 1,2-etandisulfonsyresalt av en forbindelse av formel I;

hvori kimkrystallen har et smeltepunkt høyere enn ca. 230°C, hvor den første temperaturen er en temperature tilstrekkelig til å oppløse 1,2-etandisulfonsyresaltet, og den andre temperaturen er under en temperatur hvorved kimkrystallen fullstendig oppløses når den tilsettes til produktet av trinn(b).

I tillegg kan foreliggende oppfinnelse anvendes i en fremgangsmåte for rensing av bifenyl -2-ylkarbaminsyrel-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin- 5 -yl)etylamino] metyl} -5 -metoksyfenylkarbamoyl)etyl] piperidin-4-yl ester; hvor fremgangsmåten omfatter dannelse av et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbaminsyrel -[2-(2-klor-4- {[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-1,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl} -5metoksyfenylkarbamoyl) etyl]piperidin-4-yl ester.

Foreliggende oppfinnelse er også rettet mot et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbaminsyrel-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin- 5 -yl)etylamino] metyl} -5 -metoksyfenylkarbamoyl)etyl] piperidin-4-yl ester eller et solvat derav for anvendelse innenfor terapi eller som en medisin.

I tillegg er foreliggende oppfinnelse rettet mot anvendelsen av et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbaminsyrel -[2-(2-klor-4- {[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-1,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl} -5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-ylester eller et solvat derav for fremstilling av et medikament, spesielt for fremstilling av et medikament for behandling av en pulmonar sykdom.

Foreliggende oppfinnelse er også rettet mot anvendelsen av:

(a) et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbaminsyrel-[2-(2-klor -4- {[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l ,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl} - 5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-ylester eller et solvat derav; og (b) et steroidalt anti-inflammatorisk middel;

ved fremstillingen av et medikament for behandling av en pulmonar sykdom.

Det krystallinske 1,2-etandisulfonsyresaltet av bifenyl-2-ylkarbaminsyrel-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-yl ester eller et solvat derav kan anvendes i findelt form; og farmasøytiske preparater kan omfatte en farmasøytisk akseptabel bærer og et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbaminsyrel-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]-piperidin-4-ylester eller et solvat derav, i findelt form.

Forskjellige trekk ved foreliggende oppfinnelse illustreres ved referanse til de ledsagende tegninger. Fig. 1 viser et differentielt sveipkalorimetri (DSC) opptak og en registrering fra en termigravimetrisk analyse (TGA) og fig. 2 viser et DSC opptak for prøver av et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbaminsyrel-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksy fenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-ylester ifølge foreliggende oppfinnelse. Fig. 3 og 4 viser røntgenpulverdiffraksjonsmønstre (PXRD) for prøver av et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbamsyrel -[2-(2-klor-4- {[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-ylester ifølge foreliggende oppfinnelse. Fig. 5 viser et infrarødt (IR) absorpsjonsspektrum for et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbaminsyrel -[2-(2-klor-4- {[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-1,2-dihydroquinolin-5 -yl)etylamino]mety 1} - 5 -metoksyfenylkarbamoyl)ethyl] - piperidin-4-ylester ifølge foreliggende oppfinnelse. Fig. 6 viser et opptak av en dynamisk fuktighetssorpsjons (DMS) kurve for et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbaminsyrel-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-

hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin-5-yl)e1ylamino]me1yl}-5-m fenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-ylester ifølge foreliggende oppfinnelse.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer krystallinske 1,2-etandisulfonsyresalter av bifenyl-2-ylkarbamisyrel-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin- 5 -yl)etylamino] metyl} -5 -metoksyfenylkarbamoyl)etyl] piperidin-4-yl ester eller et solvat derav. Det aktive terapeutiske midlet i disse saltene (dvs. forbindelsen av formel I) inneholder et chiralt sentrum som har ( R) konfigurasjon. Fagmannen vil imidlertid forstå at mindre mengder av ( S) stereoisomeren kan være tilstede i preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse med mindre annet er angitt, forutsatt at anvendeligheten av preparatet som helhet ikke elimineres ved nærværet av en slik isomer.

Forbindelsen av formel I er navngitt ved å anvende kommersielt tilgjengelig AutoNom software (MDL, SanLeandro, California). I tillegg betegnes 1,2-etandisulfonsyresaltene også i noen tilfeller som edisylatsalter eller edisilatsalter.

Ved beskrivelse av forbindelsene, sammensetningene, metodene og fremgangsmåetne ifølge foreliggende oppfinnelse, har følgende betegnelser følgende betydnigner med mindre annet er angitt.

Betegnelsen "smeltepunkt" som anvendt her, betyr temperaturen hvorved den maksimale endoterme varmestrømmen observers ved differensiell sveipkalorimetri.

Betegnelsen "findelt form" betyr en form av partikler hvori minst ca.90% av partiklene har en diameter på mindre enn ca. 10 um.

Betegnelsen "solvat" betyr et kompleks eller aggregat dannet ved et eller flere molekyler av et oppløst stoff, dvs. et 1,2-etandisulfonsyresalt av forbindelsen av formel I, og et eller flere molekyler av et oppløsningsmiddel. Slike solvater har typisk et i det vesentlige fiksert molforhold mellom oppløst stoff og oppløsningsmiddel. Denne betegnelsen omfatter også klatrater, innbefattende klatrater med vann. Representative oppløsningsmidler omfatter, eksempelvis, vann, metanol, etanol, isopropanol, eddiksyre og lignende. Når oppløsningsmidlet er vann, er det dannede solvatet et hydrat.

Betegnelsen "terapeutisk effektiv mengde" betyr en mengde som er tilstrekkelig til å bevirke behandling når den administreres til en pasient som har behov for behandling. Betegnelsen "behandle" eller "behandling" som anvendt her, betyr behandlingen eller bearbeidelsen av en sykdom eller medisinsk tilstand (så som COPD) i en pasient, så som et pattedyr (spesielt et menneske) som omfatter: (a) forebyggelse av at sykdommen eller den medisinske tilstanden finner sted, dvs. profylaktisk behandling av en pasient; (b) letting av sykdommen eller den medisinske tilstanden, dvs. eliminering eller forårsake tilbakegang av sykdommen eller den medisinske tilstanden i en pasient; (c) undertrykke sykdommen eller den medisinske tilstanden, dvs. retardere eller stoppe utviklingen av sykdommen eller den medisinske tilstanden i en pasient; eller (d) opphevelse av symptomene på sykdommen eller den medisinske tilstanden i en pasient.

Betegnelsen "enhetsdoseform" refererer til en fysikalsk adskilt enhet egnet for dosering til en pasient, dvs. hver enhet inneholdende en på forhånd bestemt mengde av et salt ifølge oppfinnelsen beregnet for å fremkalle den ønskede terapeutiske effekten enten alene eller i kombinasjon med en eller flere ytterligere enhter. For eksempel kan slike enhetsdoseformer være tørrpulverinhalatorkapsler, en utmålt dose fra en inhalator med utmålt dose, kapsler, tabletter, piller og lignende.

1,2-Etandisulfonsyresalter ifølge oppfinnelsen

Et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbamsyrel-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-1,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl} -5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-ylester ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles fra bifenyl-2-ylkarbaminsyrel -[2-(2-klor-4- {[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]-piperidin-4-ylester og 1,2-etandisulfonsyre eller et hydrat derav.

Et 1,2-etandisulfonsyresalt ifølge foreliggnde oppfinnelse inneholder typisk mellom ca. 0,90 og ca. 1,10 molar ekvivalenter av 1,2-etandisulfonsyre pr. molar ekvivalent av forbindelsen av formel I; innbefattende mellom ca. 0,95 og ca. 1,05 molar ekvivalenter av 1,2-etandisulfonsyre pr. molar ekvivalent av forbindelsen av formel 1.1 en spesiell utførelsesform inneholder 1,2-etandisulfonsyresaltet ifølge oppfinnelsen ca. 1 molar ekvivalent av 1,2-etandisulfonsyre pr. molar ekvivalent av forbindelsen av formel I.

Det molare forholdet mellom 1,2-etandisulfonsyre og bifenyl-2-ylkarbaminsyrel-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]-metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-ylester kan enkelt bestemmes ved forskjellige fremgangsmåter som er tilgjengelige for fagmannen. For eksempel kan slike molforhold lett bestemmes ved hjelp av<X>H NMR. Alternativt kan elementanalyse og HPLC fremgangsmåter anvendes for å bestemme molforholdet.

Bifenyl-2-ylkarbamisyrel -[2-(2-klor-4- {[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-1,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]-piperidin-4-yl esteren anvendt i foreliggende oppfinnelse kan lett fremstilles fra kommersielt tilgjengelige utgangsmaterialer og reagenser ved å anvende fremgangsmåtene beskrevet i eksemplene nedenfor, eller ved å anvende fremgangsmåter beskrevet i den andre US-søknaden tilhørende søkeren beskrevet innledningsvis.

1,2-etandisulfonsyre er kommersielt tilgjengelig fra, for eksempel, Alfa Chemicals Ltd., Berkshire, GB. I en utførelsesform er 1,2-etandisulfonsyren anvendt ved fremstillingen av saltene ifølge oppfinnelsen et dihydrat. I en spesiell utførelsesform har 1,2-etandisulfonsyredihydratet en renhet større enn eller lik 97% (som bestemt ved hjelp av HPLC). Om ønsket, kan 1,2-disulfonsyredihydratet anvendt ved foreliggende oppfinnelse være omkrystallisert fra, for eksempel, eddiksyre og eddiksyreanhydrid før anvendelse.

For å fremstille et krystallinsk salt ifølge foreliggende oppfinnelse, bringes bifenyl-2-ylkarbaminsyrel-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydro-quinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-ylesteren typisk i kontakt med ca. 0,75 til ca. 1,3 molar ekvivalenter av 1,2-etandisulfonsyrene eller et hydrat derav. Generelt gjennomføres denne reaksjonen i et inert fortynningsmiddel ved en temperatur varierende fra ca. 0°C til ca.60°C; innbefattende ca. 20°C til ca. 55°C, så som ca. 25°C til ca. 50°C. Egnede inerte fortynningsmidler for denne reaksjonen omfatter, men er ikke begrenset til, metanol, etanol, isopropanol, isobutanol, etylacetat, diklormetan og lignende eventuelt inneholdende vann. I en spesiell utfør-elsesform tilsettes en oppløsning av 1,2-etandisulfonsyredihydrat i etanol til ca. et fem ganger større volum av bifenyl-2-ylkarbaminsyrel-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-1,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl} -5-metoksyenylkarba- moyl)etyl]piperidin-4-ylester i en blanding av isopropanol og diklormetan (64:1). I en spesiell utførelsesform omfatter oppløsningen av 1,2-etandisulfonsyredihydratet vann eller etanol som fortynningsmiddel og bifenyl-2-ylkarbaminsyre l-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksy fenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-ylesteroppløsningen omfatter isopropanol elleretanol som fortynningsmiddel.

Alternativt kan et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av en forbindelse av formel I fremstilles ved å bringe i kontakt et silylbeskyttet derivat av forbindelsen av formel I (dvs. en forbindelse av formel II) med en kilde for fluoridion og deretter, i den samme reaksjonsbeholderen, bringes produktet i kontakt med 1,2-etandisulfonsyre eller et hydrat derav. I en spesiell utførelsesform er den silylbeskyttende gruppen en tert-butyldimetylsilylgruppe. Andre egnede silylbeskyttende grupper omfatter tert- butyl difenylsilyl, difenylmetylsilyl, di-ferf-buylmetylsilyl,ferf-butoksydifenylsilyl og lignende. Fluoridionkilden anvendt i denne fremgangsmåten kan være en hvilken som helst reagens inneholdende eller omfattende fluoridion eller hydrogenfluorid. I en spesiell utførelsesform er fluoridionkilden trietylamintrihydrofluorid. Andre egnede kilder for fluoridion omfatter tetrabutylammoniumfluorid, kaliumfluorid med 18-krone-6, hydrogenfluorid, pyridinhydrofluorid og lignende.

Generelt gjennomføres denne fremgangsmåten i et inert fortynningsmiddel ved en temperatur varierende fra ca. 0°C til ca. 50°C; innbefattende ca. 20°C til ca. 35°C, så som ca. 25°C til ca. 30°C. Egnede inerte fortynningsmidler for denne reaksjonen omfatter, men er ikke begrenset til, diklormetan, metanol og blandinger derav. I en spesiellt utførelsesform bringes en oppløsning av bifenyl-2-ylkarbaminsyrel-[2-(4-{[(i?)-2-(et/*Nbutyldimetylsilanyloksy)-2-(8-hydroksy-2-okso-1,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-2-klor-5-metoksy-fenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-ylester i kontakt med ca. 2.5 til ca. 3,0 molar ekvivalenter av trietylamintrihydrofluorid i diklor metan ved omgivelsestemperatur i ca. 12 til 24 timer eller inntil fjernelse av silyl-gruppen er i det vesentlige fullstendig. Til den resulterende oppløsningen tilsettes, uten isolering av reaksjonsproduktet, ca. 0,9 til ca. 1,1 molar ekvivalenter av 1,2-etandisulfonsyredihydrat i metanol og denne blandingen oppvarmes ved ca. 25°C til ca. 35°C i ca. 2 til ca. 6 timer. Ved fullførelse av reaksjonen isoleres et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbaminsyre l-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-1,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl} -5-metoksyfenylkarba moyl)etyl]piperidin-4-ylester fra reaksjonsblandingen ved en hvilken som helst konvensjonell fremgangsmåte, så som utfelling, konsentrasjon, sentrifugering og lignende.

Eventuelt kan et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt ifølge foreliggende oppfinnelse renses ytterligere ved omrøring eller oppslemming av saltet i isopropanol inneholdende ca. 15% til ca. 25%, innbefattende ca. 20%, vann, uttrykt ved volum. I en spesiell utførelsesform anvendes ca. 10 ml av isopropanol/vannblandingen pr. gram av 1,2-etandisulfonsyresaltet.

En fremgangsmåte for fremstilling av et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt ifølge foreliggende oppfinnelse kan eventuelt innbefatte anvendelsen av en kimkrystall for å fremstille hovedsakelig et spesielt krystallinsk salt. Ved å anvende en kimkrystall av for eksempel et høyere smeltende krystallinsk salt (dvs. høyere enn ca. 230°C), kan det fremstilles et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av en forbindelse av formel I som har i det vesentlige det samme smeltepunktet som kimkrystallen. Slike kimkrystaller kan anvendes ved innledningsvis dannelse av det krystallinske saltet eller de kan anvendes for å omkrystallisere et krystallinsk eller delvis krystallinsk salt.

Typisk fremstilles kimkrystaller i liten skala ved langsom krystallisasjon uten omrøring og ved å anvende avkjøling. For å oppnå kimkrystaller, blir det krystallinske saltet som en illustrasjon typisk oppløst i et inert fortynningsmiddel ved en temperatur som er tilstrekkelig til å tilveiebringe oppløsning. I den innledende fremgangsmåten for å oppnå kimkrystaller, anvendes generelt en liten mengde, typisk mindre enn 10 g, innbefattende mindre enn 5 g, så som mindre enn 1 g, av det krystallinske saltet. I en spesiell utførelsesform anvendes metanol inneholdende ca. 12% til ca. 20% vann, innbefattende ca. 13% til ca. 15% vann, som fortynningsmiddel ved en temperatur varierende fra ca. 60°C til ca.70°EC, så som ca. 60°C til ca. 65°C. Oppløsningen tillates å avkjøles til romtemperatur. Etter ca. 1 dag til ca. 3 dager isoleres de resulterende krystaller ved filtrering eller annen konvensjonell fremgangsmåte. Alternativt kan kimkrystaller oppnås fra en forutgående fremstilling av krystallinsk material.

I rekrystallisasjonsfremgangsmåten ved anvendelse av kimkrystaller, oppløses et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt ifølge foreliggende oppfinnelse i et inert fortynningsmiddel som i fremgangsmåten for å oppnå kimkrystaller, typisk metanol inneholdende 15% vann, ved en temperatur varierende fra ca. 60°C til ca. 65°C. Oppløsningen tillates å avkjøles til en temperatur hvorved kimkrystallene ikke oppløses, for eksempel til en temperatur i området fra ca. 30°C til ca. 40°C, og deretter tilsettes kimkrystallene. Typisk er forholdet mellom vekten av kimkrystaller til vekten av krystallinsk salt i oppløsningen mellom ca. 1:5 og ca. 1:35. Oppløsningen avkjøles til en temperatur hvorved krystallisasjon finner sted, for eksempel til ca. 20°C og omrøres i ca. 2 timer til ca. 24 timer. De resulterende krystaller isoleres ved konvensjonelle fremgangsmåter. For å oppnå tilstrekkelig kimkrystaller til å fremstille store porsjoner av materiale, kan omkrystallisasjonsprosessen utføres suksessivt ved anvendelse av krystallene oppnådd ved en første omkrystallisasjon som kimkrystaller for et etterfølgende omkrystallisa-sjonstrinn. Det vil være åpenbart at de spesifikke temperaturene hvorved trinnene av omkrystallisasjonsfremgangsmåten utføres, velges avhengig av karakteren av fortynningsmidlet og konsentrasjonen av det krystallinske saltet i fortynningsmidlet. I tillegg kan omkrystallisasjonsfremgangsmåten gjennomføres ved å anvende enten fordamping eller et anti-oppløsningsmiddel for å lette krystallisasjon i stedet for avkjøling.

Blant andre fordeler er det oppdaget at dannelse av et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av forbindelsen av formel I er nyttig for rensing av forbindelsen av formel I. Generelt har et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt ifølge oppfinnelsen en renhet større enn 95%; og typisk større enn 98%, bestemt ved høy-ytelses væskekromatorgrafi.

Det krystallinske 1,2-etandisulfonsyresaltet ifølge foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet ved et meget høyt smeltepunkt som bestemt ved differential sveipkalorimetri (DSC) opptak som viser en topp i endoterm varmestrøm i området på ca. 215°C til ca. 240°C. Det er observert at smeltepunkttemperaturen av det krystallinske saltet er avhengig av fremgangsmåten hvorved det krystallinske saltet ble dannet. Kimkrystallene dannet ved langsom krystallisasjon uten omrøring og uten tilført avkjøling viser smeltepunkter som er høyere enn ca. 230°C. Krystallinske salter dannet ved en fremgangsmåte omfattende omkrystallisasjon med slike kimkrystaller viser typiske smeltepunkter i området på ca. 230°C til ca. 245°C, som vist, for eksempel, i fig. 1. Krystallinske salter dannet uten en kimkrystall som har et smeltepunkt i løpet avca. 230°C viser typiske smeltepunkter i området på ca. 215°C til ca. 229°C, som vist for eksempel i fig. 2.1 spesielle utførelsesformer tilveiebringer oppfinnelse derfor krystallinske 1,2-etandisulfonsyresalter av forbindelsen av formel I som har et DSC spor i temperaturområdet i løpet avca. 200°C som er tilstrekkelig i overensstemmelse med sporet vist i fig. 1 eller med det vist i fig. 2.

I en annen utførelsesform er det krystallinske 1,2-etandisulfonsyresaltet ifølge foreliggende oppfinnelse kjennetegnet ved et røntgenpulverdiffraksjons (PXRD) mønster som har signifikante topper ved 29 verdier på 5,0 ± 0,3, og 15,0 ± 0,3. Subtile forskjeller kan observers mellom topposisjonene i PXRD spekteret av et krystallinsk salt fremstilt ved omkrystallisasjon fra en kimkrystall med høyt smeltepunkt, som vist i fig. 3 og det av et salt fremstilt uten anvendelse av en slik kimkrystall, som vist i fig. 4.1 separate utfør-elsesformer er følgelig det krystallinske 1,2-etandisulfonsyresaltet av forbindelse med formel I kjennetegnet ved et røntgenpulverdiffraksjonsmønster hvori topposisjonene er i det vesentlige i samsvar med de vist i fig. 3 eller med de vist i fig. 4.

I en annen utførelsesform er det krystallinske 1,2-etandisulfonsyresaltet av forbindelsen av formel I kjennetegnet ved sitt infrarøde (IR) absorpsjonsspektrum som viser signifikante absorpsjonsbånd ved ca. 704, 748, 768, 841, 900, 1055, 1104, 1166, 1218, 1294, 1408, 1522, 1609, 1655 og 1701 cm"1, som vist i fig. 5.

Et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av forbindelsen av formel I er demonstret å ha en reversibel sorpsjons/desorpsjonsprofil med et akseptabelt, moderat nivå av hygroskopisitet (dvs. mindre enn ca. 2,5 vekt-% økning i fuktighetsområdet på 40% relativ fuktighet til 75% relativ fuktighet).

Disse egenskapene av saltene ifølge foreliggende oppfinnelse illustreres ytterligere i eksemplene nedenfor.

Farmasøytiske preparater og formuleringer

1,2-etandisulfonsyresaltet av forbindelsen av formel I administreres typisk til en pasient i form av et farmasøytisk preparat eller formulering. Slike farmasøytiske preparater kan administreres til pasienten ved en hvilken som helst akseptabel administrasjonsmåte innbefattende, men ikke begrenset til, inhalert, oral, nasal, topisk (innbefattende transdermal) og parenterale administrasjonsmåter. Imidlertid vil det være åpenbart for fagmannen at, når det krystallinske saltet ifølge foreliggende oppfinnelse er formulert, er det ikke lenger nødvendigvis i krystallinsk form, dvs. saltet kan være oppløst i en egnet bærer.

Ifølge et av preparattrekkene, er foreliggende oppfinnelse følgelig rettet mot et farma-søytisk preparat omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer bærereller et hjelpestoff og et 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbaminsyre l-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5- metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-ylester eller et solvat derav. Eventuelt kan slike farmasøytiske preparater inneholde andre terapeutiske og/eller formuleringsmidler om ønsket.

De farmasøytiske preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder typisk en terapeutisk effektiv mengde av et 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbamisyre 1-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin-5-yl)etyl-amino]metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-ylester eller et solvat derav. Typiisk vil slike farmasøytiske preparater inneholde fra ca. 0,01 til ca. 95 vekt-% aktivt middel, innbefattende fra ca. 0,01 til ca. 30 vekt-%, så som fra ca. 0,01 til ca. 10 vekt-% av det aktive midlet.

En hvilken som helst konvensjonell bærer eller hjelpestoff kan anvendes i de farma-søytiske preparatene ifølge oppfinnelsen. Valget av en spesiell bærer eller hjelpestoff, eller kombinasjoner av bærere eller hjelpestoff, vil avhenge av administrasjonsmåten som anvendes for å behandle en spesiell pasient eller typen medisinsk tilstand eller sykdomstilstand. I dette henseendet er fremstillingen av et egnet farmasøytisk preparat for en spesiell administrasjonsmåte innenfor kunnskapene til en gjennomsnittlig fagmann. I tillegg er bestanddelene for slike preparater kommersielt tilgjengelige fra, for eksempel, Sigma, P.O. Boks 14508, St. Louis, MO 63178. Som en illustrasjon, er videre konvensjonelle formuleringsteknikker beskrevet i Remington: The Science and Practice ofPharmacy, 20. utg., Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland

(2000); og H.C. Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7. utg., Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (1999).

Representative eksempler på materialer som kan tjene som farmasøytisk akseptable bærere omfatter, men er ikke begrenset til, følgende: (1) sukre, slik som laktose, glukose og sukrose; (2) stivelser, slik som maisstivelse og potetstivelse; (3) cellulose og dets derivater, slik som natriumkarboksymetylcellulose, etylcellulose og celluloseacetat; (4) pulverisert tragakant; (5) malt; (6) gelatin; (7) talk; (8) hjelpestoffer, så som kakaosmør og suppositorievokser; (9) oljer, så som peanøttolje, bomullsfrøolje, tistelolje, sesamolje, olivenolje, maisolje og soyabønneolje; (10) glykoler, så som propylenglykol; (11) polyoler, så som glycerol, sorbitol, mannitol og polyetylenglykol; (12) estere, så som etyloleat og etyllaurat; (13) agar; (14) bufrende midler så som magnesiumhydroksid og aluminumhydroksid; (15) alginsyre; (16) pyrogenfritt vann; (17) isotonisk saltvann; (18) Ringers oppløsning; (19) etylalkohol; (20) fosfatbufferoppløsninger; (21) komprimerte drivgasser, så som klorfluorkarboner og hydrofluorkarboner; og (22) andre ikke-toksiske kompatible stoffer som anvendes i farmasøytiske preparater.

De farmasøytiske preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles typisk ved grundig og intim blanding eller sammenblanding av et salt ifølge oppfinnelsen med en farmasøytisk akseptabel bærer og en eller flere valgfrie bestanddeler. Om nødvendig eller ønsket, kan den resulterende uniformt blandede blandingen deretter formes eller skilles i tabletter, kapsler, piller, beholdere, patroner, avgivelsesinnretninger og lignende ved anvendelse av konvensjonelle fremgangsmåter og utstyr.

I en utførelsesform er de farmasøytiske preparatene ifølge oppfinnelsen hensiktsmessige for inhalator t administrasjon. Egnede farmasøytiske preparater for inhalert administrasjon vil typisk være i form av en aerosol eller et pulver. Slike preparater administreres generelt ved anvendelse av velkjente avleveringsinnretninger, så som en forstøvningsinhalator, en inhalator med utmålt dose (MDI), en tørrpulverinhalator (DPI) eller en lignende avleveringsinnretning.

I en spesifikk utførelsesform av foreliggende oppfinnelse administreres det farmasøytiske preparatet omfattende det aktive midlet ved inhalering ved anvendelse av en forstøvningsinhalator. Slike forstøvningsinnretninger produserer typisk en strøm av høyhastighetsluft som forårsaker at det farmasøytiske preparatet omfattende det aktive midlet sprayes som en tåke som føres inn i pasientens åndedrettskanal. Når det følgelig formuleres for anvendelse i en forstøvningsinhalator, er det aktive midlet typisk oppløst i en egnet bærer for å danne en oppløsning. Egnede forstøvningsinnretninger foreligger kommersielt, for eksempel, fra PARI GmbH (Starnberg, Tyskland). Andre forstøvnings-innretninger omfatter Respimat (Boehringer Ingelheim) og er beskrevet, for eksempel, i US-patentnr. 6.123.068 og WO 97/12687.

Et representativt farmasøytisk preparat for anvendelse i en forstøvningsinhalator omfatter en vandig oppløsning omfattende fra ca. 0,05 ug/ml til ca. 10 mg/ml av et 1,2-etandisulfonsyresalt av forbindelsen av formel I eller et solvat derav. I en utførelsesform er den vandige forstøvningsformuleringen isotonisk. I en utførelsesform har den vandige forstøvningsformuleringen en pH i området på fra ca. 4 til ca. 6.1 en spesiell utførelsesform er den vandige forstøvningsformuleringenr bufret med citratbuffer til en pH på ca. 5.1 en annen spesiell utførelsesform inneholder den vandige forstøvnings-formuleringen fra ca. 0,1 mg/ml til ca. 1,0 mg/ml fri base ekvivalenter av bifenyl-2-ylkarbaminsyre 1 - [2-(2-klor-4- {[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-1,2-dihydro-quinolin-5 -y l)etylamino] metyl} -5 -metoksy fenylkarbamoy l)ety 1] piperidin-4-y 1 ester.

I en annen spesifikk utførelsesform av foreliggende oppfinnelse administreres det farmasøytiske preparatet omfattende det aktive midlet ved inhalering ved anvendelse av en tørrpulverinhalator. Slike tørrpulverinhalatorer administrerer typisk det aktive midlet som et frittflytende pulver som avleveres i pasientens luftstrøm under innånding. For å oppnå et frittflytende pulver, er det aktive midlet typisk formulert med et egnet hjelpestoff, så som laktose, stivelse, mannitol, dekstrose, polymelkesyre (PLA), polymlaktid-ko-glykolid (PLGA) eller kombinasjoner derav. Typisk er det aktive midlet findelt og kombinert med en egnet bærer for å danne en blanding av findelte partikler av respirer-bar størrelse, hvor "findelte partikler" eller "findelt form" betyr at minst ca. 90% av partiklene har en diameter på mindre enn ca. 10 um.

Et representativt farmasøytisk preparat for anvendelse i en tørrpulverinhalator omfatter laktose som har en partikkelstørrelse mellom ca. 1 um og ca. 100 um og findelte partiklerl av et 1,2-etandisulfonsyresalt av forbindelse av formel I eller et solvat derav.

En slik tørrpulverformulering kan fremstilles for eksempel ved å kombinere laktosen med det aktive midlet og deretter tørrblande komponentene. Om ønsket, kan det aktive midlet alternativt formuleres uten et hjelpestoff. Det farmasøytiske preparatet helles typisk i en tørrpulveravleveringsinnretning, eller i inhaleringspatroner eller kapsler for anvendelse med en tørrpulveravleveringsinnretning.

Eksmpler på tørrpulverinhalatoravleveringsinnretninger omfatter Diskhaler (Glaxo SmithKline, Research Triangle Park, NC) (se for eksempel US-patent nr. 5.035.237); Diskus (GlaxoSmithKline) (se for eksempel US-patent nr. 6.378.519; Turbuhaler (AstraZeneca, Wilmington, DE) (se for eksempel US-patent nr. 4.524.769); Rotahaler (GlaxoSmithKline) (se for eksempel US-patent nr. 4.353.365) og Handihaler (Boehringer Ingelheim). Ytterligere eksempler på egnede DPI innretninger er beskrevet i US-patenter nr. 5.415.162, 5.239.993 og 5.715.810 og referanser sitert deri.

I nok en spesifikk utførelsesform av oppfinnelsen administreres det farmasøytiske preparatet omfattende det aktive midlet ved inhalering ved anvendelse av en inhalator med utmålt dose. Slike inhalatorer med utmålt dose avgir typisk en utmålt mengde av det aktive midlet eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav ved anvendelse av komprimert drivmiddelgass. Følgelig omfatter farmasøytiske preparater som administreres ved anvendelse av en inhalator med utmålt dose typisk en oppløsning eller suspensjon av det aktive middel i et flytendegjort drivmidde. Hvilket som helst egnet flytendegjort drivmiddel kan anvendes innbefattende klorfluorkarboner, så som CC13F, og hydrofluoralkaner (HFA'er), så som 1,1,1,2-tetrafluoretan (HFA 134a) og 1,1,1,2,3,3,3-heptafluor-H-propan, (HFA 227). På grunn av bekymringer vedrørende klorfluorkarboners påvirkning av ozonlaget er formuleringer inneholdende HFA'er generelt foretrukket. Ytterligere eventuelle komponenter av HFA formuleringer omfatter ko-oppløsningsmidler, så som etanol eller pentan, og overflateaktive midler, så som sorbitantrioleat, oleinsyre, lecitin og glycerol. Se for eksempel US-patent nr. 5.225.183, EP 0717987 A2 og WO 92/22286.

Et representativt farmasøytisk preparat for anvendelse i en inhalator med utmålt dose omfatter fra ca. 0,01 til ca. 5 vekt-% av et 1,2-etandisulfonsyresalt av en forbindelse av formel I, eller et solvat derav; fra ca. 0 til ca. 20 vekt-% etanol; og fra ca. 0 til ca. 5 vekt-% overflateaktivt middel; idet det gjenværende utgjøres av et HFA drivmiddel.

Slike preparater fremstilles typisk ved å tilsette avkjølt eller trykksatt hydrofluoralkan til en egnet beholder inneholdende det aktive midlet, etanol (om tilstede) og det overflateaktive midlet (om tilstede). For å fremstille en suspensjon, findeles det aktive midlet og kombineres deretter med drivmidlet. Formuleringen fylles deretter i en aerosol beholder, som utgjør en del av en inhalatorinnretning med utmålt dose. Eksempler på inhalator-innretninger med utmålt dose utviklet spesifikt for anvendelse med HFA drivmidler er angitt i US-patenter nr. 6.006.745 og 6.143.277. Alternativt kan en suspensjonsformu-lering fremstilles ved spraytørking av et belegg av overflateaktivt middel på findelte partikler av det aktive midlet. Se for eksempel WO 99/53901 og WO 00/61108.

For ytterligere eksempler på fremgangsmåter for fremstilling av respirerbare partikler, og formuleringer og innretninger som er egnet for inhaleringsdosering, se US-patenter nr. 6.268.533, 5.983.956, 5.874.063 og 6.221.398, og WO 99/55319 og WO 00/30614.

I en annen utførelsesform er de farmasøytiske preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse egnede for oral administrering. Egnede farmasøytiske preparater for oral administrering kan være i form av kapsler, tabletter, piller, pastiller, drops, drageer, pulvere, korn; eller som en oppløsning eller en suspensjon i en vandig eller ikke-vandig væske; eller som en olje-i-vann eller vann-i-oljeflytende emulsjon; eller som en eliksir eller sirup og lignende, hver inneholdende en på forhånd bestemt mengde av et salt ifølge foreliggende oppfinnelse som en aktiv bestanddel.

Når de er ment for oral administrasjon i en fast doseringsform (dvs. som kapsler,

tabletter, piller og lignende), vil de farmasøytiske preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse typisk omfatte et salt ifølge foreliggende oppfinnelse som den aktive bestanddel og et eller flere farmasøytisk akseptable bærere, så som natriumcitrat eller dikalsium-fosfat. Eventuelt eller alternativt kan slike faste doseringsformer også omfatte:

(1) fyllstoffer eller drøyemidler, så som stivelser, laktose, sukrose, glukose, mannitol, og/eller kiselsyre; (2) bindemidler, så som karboksymetylcellulose, alginater, gelatin, polyvinylpyrrolidon, sukrose og/eller acacia; (3) fuktiggjørende midler, så som glycerol; (4) sprengmidler, så som agar-agar, kalsiumkarbonat, potet- eller tapiokastivelse, alginsyre, visse silikater og/eller natriumkarbonat; (5) oppløsningretarderende midler, så som paraffin; (6) absorpsjonsakseleratorer, så som kvaternære ammoniumforbindelser; (7) fuktemidler, så som cetylalkohol og/eller glycerolmonostearat; (8) absorbsjons-midler, så som kaolin og/eller bentonittleire; (9) smøremidler, så som talk, kalsium-stearat, magnesiumstearat, faste polyetylenglykoler, natriumlaurylsulfat og/eller blandinger derav; (10) fargemidler; og (11) bufrende midler. Frigjøringsmidler, fuktemidler, beleggingsmidler, søtningsmidler, smaksmidler og parfymerende midler, konserveringsmidler og antioksidanter kan også være tilstede i de farmasøytiske preparatene ifølge oppfinnelsen. Eksempler på farmasøytisk akseptable antioksidanter omfatter: (1) vannoppløselige antioksidanter, så som askorbinsyre, cysteinhydroklorid, natriumbisulfat, natriummetabisulfatnatriumsulfitt og lignende; (2) oljeoppløselige antioksidanter, så som askorbylpalmitat, butylert hydroksyanisol (BHA), butylert hydroksytoluen (BHT), lecitin, propylgallat, alfa-tokoferol og lignende; og (3) metallchelaterende midler, så som sitronsyre, etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), sorbitol, vinsyre, fosforsyre og lignende. Beleggingsmidler for tabletter, kapsler, piller og lignende omfatter de anvendt for enteriske belegg, så som cellulose acetatftalat (CAP), polyvinylacetatftalat (PVAP), hydroksypropylmetylcelluloseftalat, metakrylsyre-metakrylsyreesterkopolymerer, celluloseacetattrimellitat (CAT), karb-oksymetyletylcellulose (CMEC), hydroksypropylmetylcelluloseacetatsuccinat (HPMCAS) og lignende.

Om ønsket, kan de farmasøytiske preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse også formuleres for å tilveiebringe langsom eller kontrollert frigivelse av den aktive bestanddelen ved for eksempel å anvende hydroksypropylmetylcellulose i varierende andeler; eller andre polymermatrikser, så som polymelkesyre (PLA) eller polylaktid-ko-glykolid (PLGA), liposomer og/eller mikrosfærer.

I tillegg kan de farmasøytiske preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse eventuelt inneholde opakifiserende midler og kan formuleres slik at de frigir den aktive bestanddelen bare, eller fortrinnsvis, i en viss del av gastrointestinalkanalen, eventuelt på en forsinket måte. Eksempler på innstøpingspreparater som kan anvendes omfatter polymere stoffer og vokser. Den aktive bestanddelen kan også være i mikroinnkapslet form, om aktuelt, med et eller flere av de ovenfor angitte hjelpestoffene.

Egnede flytende doseringsformer for oral administrering omfatter eksempelvis farmasøytisk akseptable emulsjoner, mikroemulsjoner, oppløsninger, suspensjoner, siruper og eliksirer. Slike flytende doseringsformer omfatter typisk den aktive bestanddelen og et inert fortynningsmiddel, så som for eksempel vann eller andre oppløsningsmidler, oppløseliggj ørende midler og emulgeringsmidler, så som etylalkohol, isopropylalkohol, etylkarbonat, etylacetat, benzylalkohol, benzylbenzoat, propylenglykol, 1,3-butylenglykol, oljer (spesielt bomullsfrø, jordnøtt, mais, kim, oliven, risinus og sesamolje), glycerol, tetrahydrofurylalkohol, polyetylenglykoler og fettsyreestere av sorbitan og blandinger derav. Suspensjoner kan, i tillegg til den aktive bestanddelen, inneholde suspenderende midler så som, for eksempel, etoksylerte isostearylalkoholer, polyoksyetylensorbitol og sorbitanestere, mikrokrystallinsk cellulose, aluminummetahydroksid, bentonitt, agar-agar og tragakant og blandinger derav.

Når de er ment for oral administrering, er de farmasøytiske preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse fortrinnsvis forpakket i en enhetsdoseform. For eksempel, kan slike enhetsdoseformer være kapsler, tabletter, piller og lignende.

Saltene ifølge oppfinnelsen kan også administreres transdermalt ved å anvende kjente transdermale avleveringssystemer og hjelpestoffer. For eksempel kan en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse administreres med permeasjonsfremmende midler, så som propylenglykol, polyetylenglykolmonolaurat, azacykloalkan-2-oner og lignende, og inkorporeres i et plaster eller tilsvarende avleveringssystem. Ytterligere hjelpestoffer omfatter gelleringsmidler, emulgeringsmidler og buffere, som kan anvendes i slike transdermale preparater om ønsket.

De farmasøytiske preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også inneholde andre terapeutiske midler som samadministreres med et 1,2-etandisulfonsyresalt av forbindelse av formel I eller solvat derav. For eksempel kan de farmasøytiske preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse videre omfatte et eller flere terapeutiske midler valgt fra anti-inflammatoriske midler (for eksempel steroidale anti-inflammatoriske midler, så som kortikosteroider; og ikke-steroidale anti-inflammatoriske midler (NSATD'er), fosfodiesterase IV inhibitorer, antiinfektive midler (for eksempel antibiotika eller antivirale midler), antihistaminer, P2adrenergiske reseptoragonister, muskariniske reseptorantagonister (dvs. antikolinergiske midler) og lignende. De andre terapeutiske midlene kan anvendes i form av farmasøytisk akseptable salter eller solvater. I tillegg, om aktuelt, kan de andre terapeutiske midlene anvendes som optisk rene stereoisomerer.

Om ønsket, kan saltene ifølge oppfinnelsen også administreres i kombinasjon med et annet terapeutisk middel eller -midler, så som beskrevet heri. I denne utførelsen er komponentene ikke fysisk blandet sammen, men administreres samtidig eller trinnsvis som separate preparater. For eksempel kan et salt ifølge foreliggende oppfinnelse administreres ved inhalering samtidig med eller trinnsvis sammen med et steroidalt anti-inflammatorisk middel, så som et kortikosteroid, ved anvendelse av en inhaleringsav-leveringsinnretning som anvender separate kamre (for eksempel blærepakninger) for hvert terapeutisk middel. Alternativt kan kombinasjonen administreres fra flere avleverignsinnretninger, dvs. en avleveringsinnretning for hvert terapeutisk middel.

Representative P2adrenergiske reseptoragonister som kan anvendes i kombinasjon med forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter, men er ikke begrenset til, salmeterol, salbutamol, formoterol, salmefamol, fenoterol, terbutalin, albuterol, isoetarin, metaproterenol, bitolterol, pirbuterol, levalbuterol og lignende, eller farmasøytisk akseptable salter derav. Andre P2adrenergiske reseptoragonister som kan anvendes i kombinasjon med forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter, men er ikke begrenset til, 3-(4-{[6-({(2R)-2-hydroksy-2-[4-hydroksy-3-(hydroksy-metyl)fenyl]etyl}amino)-heksyl]oksy}butyl)benzensulfonamid og 3-(-3-{[7-({(2R)-2-hydroksy-2- [4-hydroksy-3 -(hydroksymetyl)fenyl] etyl} amino)heptyl] oksy } propyl) benzensulfonamid og beslektede forbindelser beskrevet i WO 02/066422, publisert 29. august, 2002; 3-[3-(4-{[6-([(2R)-2-hydroksy-2-[4-hydroksy-3-(hydroksymetyl)fenyl]-etyl}amino)heksyl]-oksy}butyl)fenyl]imidazolidin-2,4-dion og beslektede forbindelser beskrevet i WO 02/070490, publisert 12. september 12, 2002; 3-(4-{[6-({(2R)-2-[3-(formylamino)-4-hydroksyfenyl ]-2-hydroksyetyl}amino)heksyl]oksy}butyl)benzensulfonamid, 3-(4-{[6-({(2S)-2-[3-(formylamino)-4-hydroksyfenyl]-2-hydroksyetyl}-amino)heksyl]oksy}butyl)-benzensulfonamid, 3-(4- {[6-({(2R/S)-2-[3-(formylamino)-4-hydroksyfenyl]-2-hydroksyetyl}amino)heksyl]oksy}butyl)benzensulfonamid, N-( tert-butyl)-3 -(4- {[6-( {(2R)-2- [3 -(formylamino)-4-hydroksy fenyl ] -2-hydroksyetyl} amino)-heksyl]-oksy}butyl)benzensulfonamid, A^-(te/-r-butyl)-3-(4-{[6-({(2S)-2-[3-(formyl-amino)-4-hydroksyfenyl]-2-hydroksyetyl}amino)heksyl]oksy}butyl)benzensulfonamid, ^-(te/-r-butyl)-3-(4-{[6-({(2R/S)-2-[3-(formylamino)-4-hydroksyfenyl]-2-hydroksy-etyl}amino)heksyl]oksy}butyl)benzensulfonamid og beslektede forbindelser beskrevet i WO 02/076933, publisert 3. oktober 2002; 4-{(lR)-2-[(6-{2-[(2,6-diklorbenzyl)oksy]-etoksy}heksyl)amino]-l -hydroksyetyl} -2-(hydroksymetyl)fenol og beslektede forbindelser beskrevet i WO 03/024439, publisert 27. mars 2003; A^-{2-[4-((i?)-2-hydroksy-2-fenyletylamino)fenyl]etyl}-(i?)-2-hydroksy-2-(3-formamido-4-hydroksy fenyl)etylamin og beslektede forbindelser beskrevet i US-patent nr. 6.576.793 Bl, meddelt 10. juni 2003; A^-{2-[4-(3-fenyl-4-metoksyfenyl)aminofenyl]etyl}-(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2(l//)-quinolinon-5-yl)etylamin og beslektede forbindelser beskrevet i US-patent nr. 6.653.323 B2, meddelt 25. november 2003; og farmasøytisk akseptable salter derav. I en spesiell utførelsesform er P2-adrenoreseptoragonisten et krystallinsk monohydrokloridsalt av A^-{2-[4-((i?)-2-hydroksy-2-fenyletylamino)fenyl]-etyl}-(i?)-2-hydroksy-2-(3-formamido-4-hydroksyfenyl)etylamin. Når den anvendes, vil P2-adrenoreseptoragonisten være tilstede i det farmasøytiske preparatet i en terapeutisk effektiv mengde. Typisk vil P2-adrenoreseptoragonisten være tilstede i en mengde som er tilstrekkelig for å tilveiebringe ca. 0,05 ug til ca. 500 ug pr. dose.

Representative steroidale anti-inflammatoriske midler som kan anvendes i kombinasjon med forbindelsene ifølge oppfinnelsen omfatter, men er ikke begrenset til, metylpredni-solon, prednisolon, deksametason, flutikasonpropionat, 6,9-difluor-17-[(2-furanylkarbo-ny l)oksy] -11 -hydroksy-16-mety 1-3 -oksoandrosta-1,4-dien-17-karbotioinsyre Æ-fluormetylester, 6,9-difluor-11 -hydroksy-16-metyl-3-okso-17-propionyloksy-androsta-1,4-dien-17-karbotioinsyre 5'-(2-oksotetrahydrofuran-3S-yl) ester, beklometasonestere (for eksempel 17-propionatesteren eller 17,21-dipropionatesteren), budesonid, flunisolid, mometasonestere (for eksempel furoatesteren), triamcinolonacetonid, rofleponid, ciklesonid, butiksokortpropionat, RPR-106541, ST-126 og lignende, eller farmasøytisk akseptable salter derav. I en spesiell utførelsesform er det steroidale anti-inflammatoriske midlet 6a,9a-difluor-17a -[(2-furanylkarbonyl)oksy]-lip-hydroksy-16a-metyl-3-oksoandrosta-l,4-diene-17P-karbotioinsyre Æ-fluormetylester eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller solvat derav. Når det anvendes, vil det steroidale anti-inflammatoriske midlet være tilstede i det farmasøytiske preparatet i en terapeutisk effektiv mengde. Typisk vil det steroidale anti-inflammatoriske midlet være tilstede i en mengde tilstrekkelig til å tilveiebringe fra ca. 0,05 ug til ca. 500 ug pr. dose.

Andre egnede kombinasjoner omfatter, for eksempel, andre anti-inflammatoriske midler, for eksempel, NSAID'er (så som natriumkromoglykat; nedokromilnatrium; fosfodiesterase (PDE) inhibitorer (for eksempel teofyllin, PDE4 inhibitorer eller blandede PDE3/PDE4 inhibitorer); leukotrienantagonister (for eksempel monteleukast); inhibitorer av leukotriensyntese; iNOS inhibitorer; proteaseinhibitorer, så som tryptase og elastaseinhibitorer; beta-2 integrinantagonister og adenosinreseptoragonister eller antagonister (for eksempel adenosin 2a agonister); cytokinantagonister (for eksempel kemokinantagonister så som, et interleukin antistoff ( IL antistoff), spesifikt en IL-4 terapi, en IL-13 terapi eller en kombinasjon derav); eller inhibitorer av cytokinsyntese.

For eksempel kan representative fosfodiesterase-4 (PDE4) inhibitorer eller blandede PDE3/PDE4 inhibitorer som kan anvendes i kombinasjn med forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatte, men ikke være begrenset til, cis 4-cyano-4-(3-cyklo-pentyloksy-4-metoksyfenyl)cykloheksan-1 -karboksylsyre, 2-karbometoksy-4-cyano-4-(3-cyklopropylmetoksy-4-difluormetoksyfenyl)cykloheksan-l-on; cz's-[4-cyano-4-(3-cyklopropylmetoksy-4-difluormetoksyfenyl)cykloheksan-l-ol]; cz's-4-cyano-4-[3-(cyklopentyloksy)-4-metoksyfenyl]cykloheksan-l -karboksylsyre og lignende, eller farmasøytisk akseptable salter derav. Andre representative PDE4 eller blandede PDE4/PDE3 inhibitorer omfatter AWD-12-281 (elbion); NCS-613 (INSERM); D-4418 (Chiroscience og Schering-Plough); CI-1018 eller PD-168787 (Pfizer); benzodioksol forbindelser beskrevet i W099/16766 (Kyowa Hakko); K-34 (Kyowa Hakko); V-11294A (Napp); roflumilast (Byk-Gulden); ftalazinonforbindelser beskrevet i WO99/47505 (Byk-Gulden); Pumafentrine (Byk-Gulden, nå Altana); arofyllin (Almirall-Prodesfarma); VM554/UM565 (Vernalis); T-440 (Tanabe Seiyaku); og T2585 (Tanabe Seiyaku).

Representative muskarinantagonister (dvs. antikolinergiske midler) som kan anvendes i kombinasjon med, og i tillegg til, forbindelsene ifølge oppfinnelsen omfatter, men er ikke begrenset til, atropin, atropinsulfat, atropinoksid, metylatropinnitrat, homatropin hydrobromid, hyoscyamin ( d, 1) hydrobromid, skopolaminhydrobromid, ipratropium bromid, oksitropiumbromid, tiotropiumbromid, metantelin, propantelinbromid, anisotropinmetylbromid, klidiniumbromid, copyrrolat (Robinul), isopropamidjodid, mepenzolatbromid, tridiheksetylklorid (Pathilone), heksocykliummetylsulfat, cyklo-pentolathydroklorid, tropikamid, triheksyfenidylhydroklorid, pirenzepin, telenzepin, AF-DKS 116 og metoktramin og lignende, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav; eller, for de forbindelsene angitt som et salt, alternativt farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Representative antihistaminer (dvs. Hi-reseptorantagonister) som kan anvendes i kombinasjon med forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter, men er ikke begrenset til, etanolaminer, så som karbinoksaminmaleat, klemastinfumarat, difenyl hydraminhydroklorid og dimenhydrinat; etylendiaminer, så som pyrilaminamleat, tripelennaminhydroklorid og tripelennamincitrat; alkylaminer, så som klorfeniramin og akrivastin; piperaziner, så som hydroksysinkhydroklorid, hydroksysinkpamoat, cyklizinhydroklorid, cyklizinlaktat, meklizinhydroklorid og cetirizinhydroklorid; piperidiner, så som astemizol, levocabastinhydroklorid, loratadin eller dets deskarbo-etoksyanalog, terfenadin og feksofenadinhydroklorid; azelastinhydroklorid; og lignende, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav; eller, for de forbindelsene som er oppført som et salt, alternativt farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Egnede doser for de andre terapeutiske midlene administrert i kombinasjon med en forbindelse ifølge oppfinnelse er i området på ca. 0,05 mg/dag til ca. 100 mg/dag.

De følgende formuleringene illustrerer representative farmasøytiske preparater ifølge foreliggende oppfinnelse:

Formuleringseksempel A

Et tørt pulver for administrasjon ved inhalering fremstilles som følger:

Representativ fremgangsmåte: Forbindelsen ifølge oppfinnelsen findeles og blandes deretter med laktose. Denne blandede blandingen fylles deretter i en gelatininhalerings-patron. Innholdet av patronen administreres ved anvendelse av en pulverinhalator.

Formuleringseksempel B

En tørrpulverformulering for anvendelse i en tørrpulver inhaleringsinnretning fremstilles som følger: Representativ fremgangsmåte: Et farmasøytisk preparat fremstilles som har et bulk formuleringsforhold mellom findelt salt ifølge oppfinnelsen og laktose på 1:200. Sammensetningen pakkes i en tørrpulver inhaleringsinnretning som er i stand til å avlevere mellom ca. 10 \ ig og ca. 100 ug av forbindelsen ifølge oppfinnelsen pr. dose.

Formuleringseksempel C

Et tørt pulver for administrering ved inhalering i en inhalator med utmålt dose fremstilles som følger: Representativ fremgangsmåte: En suspensjon inneholdende 5 vekt-% av et salt ifølge oppfinnelsen og 0,1 vekt-% lecitin fremstilles ved å dispergere 10 g av forbindelsen ifølge oppfinnelse som findelte partikler med midlere størrelse mindre enn 10 um i en oppløsning dannet fra 0,2 g lecitin oppløst i 200 ml demineralisert vann. Suspensjonen spraytørkes og det resulterende materialet findeles til partikler som har en midlere diameter mindre enn 1,5 um. Partiklene fylles i patroner med trykksatt 1,1,1,2-tetrafluoretan.

Formuleringseksempel D

Et farmasøytisk preparat for anvendelse i en inhalator med utmålt dose fremstilles som følger: Representativ fremgangsmåte: En suspensjon inneholdende 5% salt ifølge oppfinnelsen, 0,5% lecitin og 0,5% trehalose fremstilles ved å dispergere 5 g aktiv bestanddel som findelte partikler med midlere størrelse mindre enn 10 m i en kolloidal oppløsning dannet fra 0,5 g trehalose og 0,5 g lecitin oppløst i 100 ml demineralisert vann. Suspensjonen spraytørkes og det resulterende materialet findeles til partikler som har en midlere diameter mindre enn 1,5 um. Partiklene fylles i beholdere med trykksatt 1,1,1,2-tetrafluoretan.

Formuleringseksempel £

Et farmasøytisk preparat for anvendelse i en forstøvningsinhalator fremstilles som følger: Representativ fremgangsmåte: En vandig aerosolformulering for anvendelse i en forstøver fremstilles ved å oppløse 0,5 mg av saltet ifølge oppfinnelsen i 1 ml av 0,9% natriumkloridoppløsning surgjort med sitronsyre. Blandingen omrøres og lydbehandles inntil den aktive bestanddelen er oppløst. pH av oppløsningen justeres til en verdi på ca. ca. 5 ved langsom tilsetning av NaOH.

Formuleringseksempel F

Hardgelatinkapsler for oral administrering fremstilles som følger:

Representativ fremgangsmåte: Bestanddelene blandes grundig og fylles deretter i en hardgelatinkapsel (460 mg sammensetning pr. kapsel).

Formuleringseksempel G

En suspensjon for oral administrering fremstilles som følger:

Representativ fremgangsmåte: Bestanddelene blandes for å danne en suspensjon inneholdende 100 mg aktiv bestanddel pr. 10 ml suspensjon.

Formuleringseksempel H

En injeksjonsformulering fremstilles som følger:

Representativ fremgangsmåte: Bestanddelene ovenfor blandes og pH justeres til 4 0,5 ved anvendelse av 0,5 N HC1 eller 0,5 N NaOH.

Anvendelighet

Forbindelsene av formel I har både P2adrenergisk reseptoragonist- og muskarinisk reseptorantagonistaktivitet og derfor forventes et 1,2-etandisulfonsyresalt av forbindelsen med formel I ifølge foreliggende oppfinnelse å være nyttig som et terapeutisk middel for behandling av medisinske tilstander som formidles av fø adrenergiske reseptorer eller muskariniske reseptorer, dvs. medisinske tilstander som lettes ved behandling med en P2adrenergisk reseptoragonist eller en muskarinisk reseptorantagonist. Slike medisinske tilstander omfatter, eksempelvis, pulmonare lidelser eller sykdommer omfattende de forbundet med reversibel luftveisobstruksjon, så som kronisk obstruktiv pulmonar sykdom (for eksempel kronisk og "wheezy" bronkitt og emfysem), astma, pulmonar fibrose, allergisk rhinitt, rhinorrhea og lignende. Andre tilstander som kan behandles omfatter for tidlige veer, depresjon, kongistiv hjertesvikt, hudsykdommer (for eksempel inflammatoriske, allergiske, psoriatiske og proliferative hudsykdommer, lidelser hvor reduksjon av peptisk surhet er ønskelig (for eksempel peptisk og gastrisk sårdannelse) og muskelsvinnsykdom.

Følgelig kan foreliggende oppfinnelse anvendes i en fremgangsmåte for behandling av en pulmonar sykdom, hvor fremgangsmåten omfatter administrasjon til en pasient som har behov for behandling av en terapeutisk effektiv mengde av et 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbaminsyre l-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-1,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl} -5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-ylester eller et solvat derav. Når det benyttes for behandling av en pulmonar sykdom, vil saltet ifølge foreliggende oppfinnelse følgelig bli administrert ved inhalering i flere doser pr. dag, i en enkelt daglilg dose eller en enkelt ukentlig dose. Generelt vil dosen for behandling av en pulmonar sykdom variere fra ca. 10 ug/dag til ca. 200 ug/dag.

Når de administreres ved inhalering, har forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse typisk effekten av å tilveiebringe bronkodilatering. Følgelig er foreliggende oppfinnelse i et annet fremgangsmåtetrekk, rettet mot en fremgangsmåte for tilveiebringelse av bronkodilatering i en pasient som har behov for bronkodilatering, hvor fremgangsmåten omfatter administrering til pasienten av en bronkodilateringsfrembringende mengde av et 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbamnsyre l-[2-(2-klor-4-{[(R)-2-hydroksy -2-(8-hydroksy-2-okso-1,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl} -5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-ylester eller et solvat derav. Generelt vil dosen for tilveiebringelse av bronkodilatering variere fra ca. 10 ug/dag til ca. 200 ug/dag.

Foreliggende oppfinnelse kan også anvendes i en fremgangsmåte for behandling av kronisk obstruktiv pulmonar sykdom eller astma, hvor fremgangsmåten omfatter administrering til en pasient som har behov for behandling av en terapeutisk effektiv mengde av et 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbaminsyrel-[2-(2-klor -4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]-piperidin-4-ylester eller et solvat derav. Når det benyttes for å behandle en COPD eller astma, vil saltet ifølge oppfinnelsen typisk bli administrert ved inhalering i flere doser pr. dag eller i en enkelt daglig dose. Generelt vil dosen for behandling av COPD eller astma variere fra ca. 10 ug/dag til ca. 200 ug/dag. Slik betegnelsen her benyttes, omfatter COPD kronisk obstruktiv bronkitt og emfysem (se for eksempel Barnes, Chronic Obstruktive Pulmonary Disease, NEngl JMed 2000: 343:269-78).

Når det anvendes for behandling av en pulmonary sykdom, blir saltet ifølge oppfinnelsen eventuelt administrert i kombinasjon med andre terapeutiske midler. I en spesiell utførelsesform omfatter følgelig de farmasøytiske preparatene og fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen ytterligere en terapeutisk effektiv mengde av et steroidalt anti-inflammatorisk middel. Egenskapene og anvendeligheten av 1,2-etandisulfonsyresaltene ifølge oppfinnelsen kan demonstreres ved å anvende forskjellige in vitro og in vivo analyser som er velkjente for fagmannen. For eksempel er representative analyser beskrevet i ytterligere detalj i de følgende eksemplene.

EKSEMPLER

De følgende fremstillingene og eksemplene er tilveiebrakt for å illustrere spesifikke utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse.

De følgende forkortelsene har de følgende betydningene med mindre annet er angitt og hvilke som helst andre forkortelser anvendt heri og som ikke er definert har standard betydningen:

AC adenylylcyklase

Ach acetylkolin

ATCC American Type Culture Collection BSA bovint serumalbumin

cAMP 3'-5' cyklisk adenosinmonofosfat CHO Kinesisk hamsterovarie

cM5klonet chimpanse M5reseptor DCM diklormetan (dvs. metylenklorid)

DIPEA iV,iV-diisopropyletylamin

dPBS Dulbeccos fosfatbufrede saltvannsoppløsning DMEM Dulbeccos Modifiserte Eagles Medium DMSO dimetylsulfoksid

EDTA etylendiamintetraeddiksyre Emaks maksimal virkningsfullhet EtOAc etylacetat

EtOH etanol

FBS fetalt bovint serum

FLIPR fluormetrisk bildedannelsesplateleser

Gly glycin

HATU 0-(7-azabenzotriazol-1 - yl- N, N, N', N-tetrametyluroniumheksafluorfosfat HB SS Hanks bufrede saltoppløsning HEK humane embryoniske nyreceller HEPES 4-(2-hydroksyetyl)-1 -piperazinetansulfonsyre hMiklonet human Mi reseptor hM2klonet human M2reseptor I1M3klonet human M3reseptor

I1M4klonet human M4reseptor

I1M5 klonet human M5reseptor HPLC høy-ytelsesvæskekromatografi

IBMKS 3 -isobutyl-1 -mety lkxantin

%Eff % virkningsgrad

PBS fosfatbufret saltvannsoppløsning

PyBOP benzotriazol-1 -yloksytripyrrolidinofosfoniumheksafluorfosfat

opm omdreininger pr. minutt

TFA trifluoreddiksyre

THF tetrahydrofuran

Tris tris(hydroksymetyl)aminometan

Med mindre annet er angitt, blir reagenser, utgangsmaterialer og oppløsningsmidler innkjøpt fra kommersielle leverandører (så som Aldrich, Fluka, Sigma og lignende) og ble anvendt uten ytterligere rensing.

I eksemplene beskrevet nedenfor ble HPLC analyse gjennomført ved anvendelse av et Agilent (Palo Alto, CA) Serie 1100 instrument med Zorbax Bonus RP 2,1 50 mm kolonner, levert av Agilent, (en C14 kolonne), som har en 3,5 mikrometer partikkel-størrelse. Deteksjon ble utført ved UV absorbans ved 214 nm. HPLC 10-70 data ble oppnådd med en strømningstrate på 0,5 ml/minutt av 10%-70% B i løpet av 6 minutter. Mobilfase A var 2% - 98% - 0,1% ACN-H20-TFA; og mobilfase B var 90% - 10% - 0,1% ACN-H2O-TFA. Ved anvendelse av de mobile fasene A og B beskrevet ovenfor, ble HPLC 5-35 data og HPLC 10-90 data oppnådd med en 5 minutters gradient.

Væskekromatografi massespektrometri (LCMS) data ble oppnådd med et Applied Biosystems (Foster City, CA) modell API-150EX instrument. LCMS 10-90 data ble oppnådd med en 10% - 90% mobilfase B i løpet av en 5 minutters gradient.

Småskalarensing ble utført ved anvendelse av et API 150EX Prep Workstation system fra Applied Biosystems. Den mobile fase var A: vann + 0,05% v/v TFA; og B: acetonitril + 0,05% v/v TFA. For rekker (typisk ca. 3 til 50 mg utvunnet prøvestørrelse) ble følgende betingelser anvendt: 20 ml/min strømningsrate; 15 min gradienter og en 20 mm x 50 mm Prism RP kolonne med 5 mikrometer partikler (Thermo Hypersil-Keystone, Bellefonte, PA). For større skalarensinger (typisk mer enn 100 mg rå prøve), ble følgende betingelser anvendt: 60 ml/min strømningsrate; 30 min gradienter og en 41,4 mm x 250 mm Microsorb BDS kolonne med 10 mikrometer partikler (Varian, Palo Alto, CA).

Den spesifikke rotasjonen for kirale forbindelser (indikert som [oc]<20>d) ble målt ved anvendelse av et Jasco Polarimeter (Modell P-1010) med en wolfram halogenlyskilde og et 589 nm filter ved 20°C. Prøver av forsøksforbindelser ble typisk målt ved 1 mg/ml vann.

Fremstilling 1

Metyl 4-Amino-5-klor-2-metoksybenzoat

Til en oppløsning av 4-amino-5-klor-2-metoksybenzosyre (1,008 g, 5,0 mmol) i en blanding av toluen (9 ml) og metanol (1 ml) ved 0°C ble det dråpevis tilsatt (trimetyl-silyl)diazometan (2,0 M i heksan, 3,0 ml, 6,0 mmol). Reaksjonsblandingen ble deretter oppvarmet til romtemperatur og omrøt i 16 timer. Overskudd (trimetylsilyl)diazometan ble "slukket" ved tilsetning av eddiksyre inntil den klart gule fargen av reaksjonsblandingen forsvant. Blandingen ble deretter konsentrert i vakuum for å gi forbindelsen i overskriften som et beieg-hvitt faststoff som ble anvendt uten ytterligere rensing.

Fremstilling 2

Metyl 4-Akryloylamino-5-klor-2- metoksybenzoat

Til rått produkt fra fremstilling 2 ble det tilsatt diklormetan (10 ml, 0,5 M) og trietyl-amin (2,1 ml, 15 mmol). Denne blandingen ble avkjølt til 0°C og akryloylklorid (812

\ iX, 10 mmol) ble tilsatt dråpevis under omrøring. Etter 2 timer ble reaksjonsblandingen stoppet ved tilsetning av metanol (ca. 2 ml) ved 0°C og den resulterende blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 15 minutter og deretter konsentrert i vakuum. Diklormetan (30 ml) og vann (30 ml) ble tilsatt til resten, og denne blandingen ble blandet grundig. Lagene ble separert og det vandige laget ble ekstrahert med diklormetan (20 ml). De organiske lagene ble kombinert, tørket (Na2S04), filtrert og oppløsningsmidlet ble fjernet i vakuum for å gi tittelforbindelsen som et brunt, skummet faststoff som ble anvendt uten ytterligere rensing.

Fremstilling 3

Bifenyl-2-ylkarbaminsyre piperidin-4-ylester

Bifenyl-2-isocyanat (97,5 g, 521 mmol) og 4-hydroksy-l-benzylpiperidin (105 g, 549 mmol), begge kommersielt tilgjengelig fra Aldrich, Milwaukee, WI, ble oppvarmet sammen ved 70°C i 12 timer, under denne tiden ble dannelsen av bifenyl-2-ylkarbamin syre l-benzylpiperidin-4-ylester overvåket ved hjelp av LCMS. Reaksjonsblandingen ble deretter avkjølt til 50°C og etanol (1 L) ble tilsatt, og deretter ble 6M saltsyre (191 ml) tilsatt langsomt. Reaksjonsblandingen ble deretter avkjølt til romtemperatur og ammoniumformat (98,5 g, 1,56 mol) ble tilsatt og nitrogengass ble boblet gjennom oppløsningen kraftig i 20 minutter. Palladium (10 vekt-% (tørrbasis) på aktivert karbon)

(20 g) ble deretter tilsatt. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet ved 40°C i 12 timer og deretter filtrert gjennom en pute av celitt. Oppløsningsmidlet ble deretter fjernet under redusert trykk og IM saltsyre (40 ml) ble tilsatt til den rå resten. Natriumhydroksid (ION) ble deretter tilsatt for å justere pH til 12. Det vandige laget ble ekstrahert med etyl acetat (2 x 150 ml) og tørket (magnesiumsulfat), og deretter ble oppløsningsmidlet fjernet under redusert trykk for å gi forbindelsen i overskriften (155 g, 100%). HPLC (10-70) Rt = 2,52; MS m/ z: [M + H<+>] beregnet for Ci8H2oN202297,15; funnet 297,3.

Fremstilling 4

Metyl 4-{3-[4-(Bifenyl-2-ylkarbamoyloksy)piperidin-l-yl]propionylamino}-5-klor-2-metoksybenzoat

Til råproduktet fra fremstilling 2 ble det tilsatt produktet fra fremstilling 3 (1,33 g, 4,5 mmol) og en blanding av THF (22,5 ml) og metanol (2,5 ml). Denne blandingen ble oppvarmet ved 50°C under omrøring i 16 timer og deretter ble oppløsningsmidlet fjernet i vakuum. Resten ble kromatografert (silikagel; EtOAc) for å forbindelsen i overskriften (0,82 g; Rf - 0,4, 29% utbytte i løpet av3 trinn) som et beige-hvitt skummet faststoff. MS m/ z 566,4 (M+H, ventet 565,20 for C30H32CIN3O6).

Fremstilling 5

Bifenyl-2-ylkarbaminsyre l-[2-(2-klor-4-hydroksymetyl-5-metoksy-fenyl karbamoyl)etyl] piperidin-4-yl Ester

Til en oppløsning av produktet fra fremstilling 4 (0,82 mg, 1,45 mmol) i en blanding av THF (4,5 ml) og metanol (0,5 ml) ved 0°C ble det tilsatt litiumborhydrid (32 mg, 1,45 mmol). Reaksjonsblandingen ble tillatt å oppvarmes til romtemperatur og ble omrørt i 41 timer. Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av IN vandig saltsyre ved 0°C inntil bobling ikke lenger ble observert og denne blandingen ble omrørt i 10 minutter. Oppløsningsmidlet ble fjernet i vakuum og resten ble oppløst i acetonitril (ca. 2 ml). Denne oppløsningen ble renset ved hjelp av prep-RP-HPLC (gradient: 2 til 50% acetonitril i vann med 0,05% TFA). De egnende fraksjonene ble samlet og kombinert og lyofilisert for å gi forbindelsen i overskriften som et trifluoracetatsalt. Dette saltet ble behandlet med isopropylacetat (10 ml) og IN vandig natriumhydroksid (10 ml) og det organiske laget ble samlet, tørket (Na2S04), filtrert og oppløsningsmidlet ble fjernet i vakuum for å gi forbindelsen i overskriften (161 mg, 21% utbytte) som et hvitt, skumformig faststoff. MS m/ z 538,4 (M+H, ventet 537,20 for C29H32CIN3O5).

Fremstilling 6

Bifenyl-2-ylkarbaminsyre l-[2-(2-klor-4-formyl-5-metoksyfenyl-karbamoyl) etyl] piperidin-4-ylester

Til en oppløsning av produktet fra fremstilling 5 (161 mg, 0,3 mmol) i diklormetan (3 ml) ble det tilsatt dimetylsulfoksid (213 uL, 3,0 mmol) og diisopropyletylamin (261 uL, 1,5 mmol). Denne blandingen ble avkjølt til -20°C og svoveltrioksidpyridinkompleks (238 mg, 1,5 mmol) ble langsomt tilsatt. Etter 30 minutter ble reaksjonsblandingen stoppet ved tilsetning av vann (ca. 3 ml). Lagene ble separert og det organiske laget ble tørket (Na2SC>4), filtrert og oppløsningsmidlet ble fjernet i vakuum for å gi forbindelsen i overskriften som et lyst gult faststoff. MS m/ z 536,3 (M+H, ventet 535.19 for C29H3oClN305).

Fremstilling 7

8-Benzyloksy-5-(2-bromacetyl)-lfl-quinolin-2-on

(a) 8-Acetoksy-l/Z-quinolin-2-on

8-Hydroksyquinolin-iV-oksid (160,0 g, 1,0 mol), kommersielt tilgjengelig fra Aldrich, Milwaukee, WI, og eddiksyreanhydrid (800 ml, 8,4 mol) ble oppvarmet ved 100°C i 3 timer og deretter avkjølt i is. Produktet ble samlet på en Buchner-trakt, vasket med eddiksyreanhydrid (2 x lOOml) og tørket under redusert trykk for å gi 8-acetoksy-li7-quinolin-2-on (144 g) som et faststoff.

(b) 5-Acetyl-8-hydroksy-l/Z-quinolin-2-on

En oppslemming av aluminumklorid (85,7 g, 640 mmol) i 1,2-dikloretan (280 ml) ble avkjølt i is, og produktet fra trinn (a) (56,8 g, 280 mmol) ble tilsatt. Blandingen ble oppvarmet til romtemperatur og deretter oppvarmet ved 85°C. Etter 30 minutter ble acetylklorid (1,5 ml, 21 mmol) tilsatt, og blandingen ble oppvarmet ytterligere 60 minutter. Reaksjonsblandingen ble deretter avkjølt og tilsatt til IN saltsyre (3 L) ved 0°C under god omrøring. Etter omrøring i 2 timer ble de faste stoffene samlet på en Buchner-trakt, vasket med vann (3 x 250 ml) og tørket under redusert trykk. Råproduktet isolert fra flere porsjoner (135 g) ble kombinert og triturert med diklormetan (4 1) i 6 timer. Det resulterende faste stoffet ble samlet å en Buchner-trakt og tørket under redusert trykk for å gi forbindelsen i overskriften (121 g).

(c) 5-Acetyl-8-benzyloksy-lfl-quinolin-2-on

Til produktet fra trinn (b) (37,7 g, 186 mmol) ble det tilsatt ACiV-dimetylformamid (200 ml) og kaliumkarbonat (34,5 g, 250 mmol) etterfulgt av benzylbromid (31,8 g, 186 mmol). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2,25 timer og deretter helt i mettet natriumklorid (3,51) ved 0°C og omrørt i 1 time. Produktet ble samlet og tørket på en Buchner-trakt i 1 time, og de resulterende faste stoffene ble oppløst i diklormetan (2 1) og denne blandingen ble tørket i løpet avnatriumsulfat. Oppløsningen ble filtrert gjennom en pute av celitt som deretter ble vasket med diklormetan (5 x 200 ml). Det kombinerte filtratet ble deretter konsentrert til tørrhet og de resulterende faste stoffene ble triturert med eter (500 ml) i 2 timer. Produktet ble samlet på en Buchner-trakt, vasket med eter (2 x 250 ml) og tørket under redusert trykk for å gi forbindelsen i overskriften (44 g) som et pulver.

(d) 8-Benzyloksy-5-(2-bromacetyl)-lfl-quinolin-2-on

Produktet fra trinn (c) (20,0 g, 68,2 mmol) ble oppløst i diklormetan (200 ml) og avkjølt til 0°C. Bortrifluoriddietyleterat (10,4 ml, 82,0 mmol) ble tilsatt ved hjelp av en sprøyte og blandingen ble oppvarmet til romtemperatur for å gi en tykk suspensjon. Suspensjonen ble oppvarmet ved 45°C (oljebad) og en oppløsning av brom (11,5 g, 72,0 mmol) i diklormetan (100 ml) ble tilsatt i løpet av 40 minutter. Blandingen ble holdt ved 45°C i ytterligere 15 minutter og deretter avkjølt til romtemperatur. Blandingen ble konsentrert under redusert trykk og deretter triturert med 10% vandig natriumkarbonat (200 ml) i 1 time. De faste stoffene ble samlet på en Buchner-trkt, vasket med vann (4 x 100 ml) og tørket under redusert trykk. Produktet fra to gjennomkjøringer ble kombinert for rensing. Råproduktet (52 g) ble triturert med 50% metanol i kloroform (500 ml) i 1 time. Produktet ble samlet på en Buchner-trakt og vasket med 50% metanol i kloroform (2 x 50 ml) og metanol (2 x 50 ml). Det faste stoffet ble tørket under redusert trykk for å gi forbindelsen i overskriften (34,1 g) som et pulver.

Fremstilling 8

8-Benzyloksy-5-[(i?)-2-brom-l-(tert-butyldimetylsUanyloksy)etyl]-lfl-quinolin-2-on (a) 8-Benzyloksy-5-((i?)-2-brom-l-hydroksyetyl)-lH-quinolin-2-on (i?)-(+)-a,a-difenylprolinol (30,0 g, 117 mmol) og trimetylboroksin (11,1 ml, 78 mmol) ble kombinert i toluen (300 ml) og omrørt ved romtemperatur i 30 minutter. Blandingen ble plassert i et oljebad ved 150°C og væske ble avdestillert. Toluen ble tilsatt i 20 ml porsjoner og destillasjon ble fortstt i 4 timer. Totalt 300 ml toluen ble tilsatt. Blandingen ble deretter avkjølt til romtemperatur. En 500 ul porsjon ble inndampet til tørrhet og veid (246 mg) for å bestemme at konsentrasjonen av katalysatoren var 1,8 M.

8-Benzyloksy 5-(2-bromacetyl)-li/-quinolin-2-on (90,0 g, 243 mmol) ble plassert under nitrogen og tetrahydrofuran (900 ml) ble tilsatt etterfulgt av katalysatoren beskrevet ovenfor (1,8 M i toluen, 15 ml, 27 mmol). Suspensjonen ble avkjølt til -10±5°C i et

is/isopropanolbad. Boran (1,0 M i THF, 294 ml, 294 mmol) ble tilsatt i løpet av 4 timer. Reaksjonen ble deretter omrørt ytterligere 45 minutter ved -10 °C og deretter ble metanol (250 ml) langsomt tilsatt. Blandingen ble konsentrert under vakuum og resten ble oppløst i kokende acetonitril (1,3 1), filtrert i varm tilstand og deretter avkjølt til romtemperatur. Krystallene ble filtrert, vasket med acetonitril og tørket under vakuum for å gi forbindelsen i overskriften (72,5 g, 196 mmol, 81% utbytte, 95% ee, 95% ren ved HPLC).

(b) 8-Benzyloksy-5-[(i?)-2-brom-l-(tetr-butyldimetylsUanyloksy)etyl]-lfl-quinolin-2-on

Til produktet fra trinn (b) (70,2 g, 189 mmol) ble det tilsatt N,iV-dimetylformamid

(260 ml) og denne blandingen ble avkjølt i isbad under nitrogen. 2,6-Lutidin (40,3 g, 376 mmol) ble tilsatt tilsatt i løpet av 5 minutter og deretter ble ferr-butyldimetylsilyl-trifluormetansulfonat (99,8 g, 378 mmol) langsomt tilsatt mens temperaturen ble holdt under 20°C. Blandingen ble tillatt å oppvarmes til romtemperatur i 45 minutter. Metanol (45 ml) ble tilsatt dråpevis til blandingen i løpet av 10 minutter, og blandingen ble fordelt mellom etylacetat/cykloheksan (1:1, 500 ml) og vann/saltvannsoppløsning (1:1, 500 ml). De organiske bestanddelene ble vasket ytterligere to ganger med vann/salt-vannsoppløsning (1:1, 500 ml hver gang). De kombinerte ekstraktene ble inndampet under redusert trykk for å gi en lys gul olje. To separate porsjoner av of cykloheksan (400 ml) ble tilsatt til oljen og destillasjon fortsatt inntil det var dannet en tykk hvit oppslemming. Cykloheksan (300 ml) ble tilsatt til oppslemmingen og det resulterende hvite krystallene ble filtrert, vasket med cykloheksan (300 ml) og tørket under redusert trykk for å gi forbindelsen i overskriften (75,4 g, 151 mmol, 80% utbytte, 98,6 % ee).

Fremstilling 9A

8-Benzyloksy-5-[(J?)-2-(A^-benzylamino)-l-(tert-butyldimetylsilanyloksy)etyl]-LH-quinolin-2-on

En omrørt oppløsning av produktet fra fremstilling 8 (1,00 g, 2,05 mmol) og benzylamin (493 ul, 4,51 mmol) i DMSO (1,7 ml) ble oppvarmet ved 105°C i 4 timer. Reaksjonsblandingen ble tillatt å avkjøles og ble deretter fortynnet med EtOAc (10 ml) og det organiske laget ble vasket med mettet, vandig ammoniumkloridoppløsning (5 ml) og IN natriumhydroksid (5 ml), tørket (MgSCU) og oppløsningsmiddel fjernet under redusert trykk. Den rå resten ble renset ved kolonnekromatografi (50% EtOAc/- heksaner) for å gi forbindelsen i overskriften (700 mg, 67%). MS m/ z: [M + H<*>] beregnet for CsiHgg^OsSi 515,27; funnet 515,5.

Fremstilling 9B

8-Benzyloksy-5-[(i?)-2-(A'-benzylammo)-l-(tert-butyldimetylsilanyloksy)etyl]-l/r-quinolin-2-on

Til en 500 ml trehalset, rundbunnet kolbe ble det tilsatt 8-benzyloksy-5-[(i?)-2-brom-l-(ferf-butyldimetylsilanyloksy)etyl]-l//-quinolin-2-on (43 g, 0,124 mol, ca. 95% kiral renhet), l-metyl-2-pyrrolidinon (210 ml) og benzylamin (28,3 g, 0,37 mol). Den resulterende blandingen ble spylt med nitrogen og deretter omrørt ved 90°C i 6 timer. Blandingen ble deretter avkjølt til romtemperatur, og vann (300 ml) og etylacetat (300 ml) ble tilsatt. Lagene ble separert og det organiske laget ble vasket med vann (200 ml), en 1:1 blanding av vann og vandig, mettet natriumkloridoppløsning (200 ml) og vann (200 ml). Det organiske laget ble deretter tørket over magnesiumsulfat, filtrert og konsentrertd under redusert trykk for å gi forbindelsen i overskriften som en orange olje.

Til den orange olje ble det tilsatt heptan (200 ml) og etylacetat (200 ml) og den resulterende blandingen ble oppvarmet til 65°C for å danne en klar oppløsning. Denne oppløsning ble avkjølt til romtemperatur og tillatt å stå over natten (ca. 16 timer), ved hvilket tidspunkt en utfelling var dannet. Utfellingen ble samlet ved filtrering for å gi stereokjemisk-uren forbindelse i overskriften (8,85 g, 79,6% ee). Filtratet ble konsentrert under redusert trykk for å gi forbindelsen i overskriften (38,6 g, 99,4% ee). Dette materialet ble kombinert med en forutgående porsjon av materiale (19,2 g, 99,5% ee) og heptan (250 ml) og etylacetat (100 ml) ble tilsatt. Denne blandingen ble oppvarmet til 80°C (uklar til klar oppløsning) og deretter avkjølt til romtemperatur og tillatt å stå over natten. Den resulterende utfellingen ble samlet ved filtrering for å gi forbindelsen som et hvitt faststoff (36,8 g. 98,4% ee, 99,9% kjemisk renhet). Filtratet ble konsentrert under redusert trykk og resten ble oppløst i heptan (100 ml). De resulterende faste stoffene ble samlet for å gi forbindelsen i overskriften som et lysebrunt faststoff (24 g, 100% kiral renhet, 95% kjemisk renhet).

Fremstilling 10A

5-[(i?)-2-Amino-l-(etrt-butyldimetylsilanyloksy)etyl]-8-hydroksy-lH-quinolin-2-one

En omrørt oppløsning av produktet fra fremstilling 9A (3,16 g, 6,15 mmol) og palladium (10 vekt-% (tørr basis) på aktivert karbon) (1,58 g) i etanol (62 ml) ble plassert under en hydrogen atmosfære i 24 timer. Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom celitt, vasket med metanol (15 ml), og deretter ble oppløsningsmidlet fjernet under redusert trykk for å gi forbindelsen i overskriften som et faststoff (1,52 g, 4,55 mmol, 74%).

Fremstilling 10B

5-[(i?)-2-Amino-l-(etr^butyldimetylsUanyloksy)etyl]-8-hydroksy-lH-quinolin-2-on eddiksyresalt

8-Benzyloksy-5-[(i?)-2-(A'-benzylamino)-l-(te/*Nbutyldimetylsilanyloksy)etyl]-l//- quinolin-2-on (100 g, 194 mmol) og eddiksyre (17,5 ml, 291 mmol) ble oppløst i metanol (1 L). Den klare oppløsningen ble spylt med nitrogen og deretter ble palladium hydroksid på karbon (20 g, 20 vekt-% Pd (tørr basis), våt (ca. 50% vann)) ble tilsatt. Hydrogengass ble boblet gjennom den omrørte oppløsningen ved romtemperatur i 6 timer, under denne tiden dannet det seg en tykk oppslemming. Reaksjonsblandingen

ble deretter spylt med nitrogen og metanol (IL) ble tilsatt. Den resulterende blandingen ble omrørt i ca. 30 minutter (for å oppløse produktet) og deretter ble blandingen filtrert gjennom en pute av celitt. Filteratet ble konsentrert under redusert trykk til et volum på ca. 500 ml og, til den resulterende oppslemmingen, ble det tilsatt etanol (500 ml). Den resulterende blandingen ble igjen konsentrert under redusert trykk til et volum på ca. 500 ml, og den resulterende utfellingen ble samlet ved filtrering og tørket for å tilveiebringe forbindelsen i overskriften som et gulhvitt faststoff (65 g, 85% utbytte, >98% renhet).

Fremstilling 11

Bifenyl-2-yl karbamin s\ rel -[ 2-(4-{[(i?)-2-(tert-Buryldimetylsilanyloksy)-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-2-klor-5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-yl ester

Til produktet fra fremstilling 6 i en blanding av diklormetan (0,5 ml) og metanol (0,5 ml) ble det tilsatt produktet fra fremstilling 1 OA (124,1 mg, 3,1 mmol) og den resulterende blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 1,5 timer. Natriumtriacetoksyborhydrid (190,7 mg, 0,9 mmol) ble tilsatt og den resulterende blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 15 timer. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av vann (ca. 0,2 ml) og blandingen ble konsentrert i vakuum for å gi forbindelsen i overskriften som ble anvendt uten ytterligere rensing. MS m/ z 854.5 (M+H, ventet 853,36 for C46H56CIN5O7SO.

Fremstilling 12

Bifenyl-2-ylkarbaminsyre l-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)-etyl]-piperidin-4-ylester

Til en suspensjon av produktet fra fremstilling 11 i diklormetan (1,0 ml, 0,3 M) ble det tilsatt trietylamintrihydrofluorid (245 ul, 1,5 mmol). Denne blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 45 timer, og deretter ble blandingen konsentrert i vakuum. Resten ble oppløst i en blanding av DMF (0,5 ml), acetonitril/vann (1:1, med 0,1% TFA, 0,6 ml), TFA (0,3 ml) og acetonitril (ca. 1 ml), og denne blandingen ble renset ved prep-RP-HPLC (gradient: 2 til 50% acetonitril i vann med 0,05% TFA). De egnede fraksjonene ble samlet og kombinert og lyofilisert for å gi ditrifluoracetatsaltet av forbindelsen i overskriften (100 mg, 34% utbytte, 98,7% rent ved HPLC) som et beigehvitt faststoff. MS m/ z 740,5 (M+H, ventet 739,28 for C40H42CIN5O7).

Eksempel 1

Bifenyl-2-ylkarbaminsyre l-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)-etyl]-piperidin-4-ylester 1,2-etandisulfonsyresalt

En oppløsning av 1,2-etandisulfonsyredihydrat (3,8 mg, 0,02 mmol) i etanol (0,2 ml) ble langsomt tilsatt til en oppløsning av produktet fra fremstilling 12 (14,3 mg, 0,02 mmol) i en 64:1 v/v blanding av isopropanol og diklormetane (1 ml). Den resulterende oppløsningen ble oppvarmet ved 45°C til 50°C i ca. 30 minutter. Blandingen ble deretter langsom avkjølt til romtemperatur ved hvilket tidspunkt oppløsningen ble svakt uklar. Oppløsningen ble tillatt å stå ved romtemperatur under en forsiktig strøm av nitrogen over natten. Den resulterende utfellingen ble samlet ved filtrering og tørket for å tilveiebringe forbindelsen i overskriften som et hvitt, krystallinsk faststoff (13 mg, 72 % utbytte).

Eksempel 2

En oppløsning av bifenyl-2-ylkarbaminsyre l-[2-(2-klor-4-{[(r)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-1,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl} -5-metoksyfenylkarbamoyl)-etyl]piperidin-4-ylester, (26,8 mg, 0,0362 mmol) ble fremstilt i etanol (5,36 ml) og omrørt ved romtemperatur inntil fullstendig oppløsning var oppnådd (5 min). En oppløsning av 1,2-etandisulfonsyredihydrat (8,2 mg, 0,0362 mmol) i etanol (0,2 ml) ble langsomt tilsatt til den første oppløsning i løpet av ca. ett minut. Den resulterende suspensjon ble omrørt i fem minutter, deretter isolert ved filtrering under nitrogen. Den resulterende utfellingen ble tørket for å tilveiebringe forbindelsen i overskriften som et hvitt faststoff (28,5 mg, 85% utbytte).

Eksempel 3

Bifenyl-2-ylkarbaminsyre 1 - [2-(2-klor-4- {[(r)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-1,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)-etyl]piperidin-4-yl ester (5 g, 6,75 mmol, >99% rent) ble oppløst i isopropanol (100 ml), etterfulgt av tilsetning av etandisulfonsyredihydrat (1,525 mg, 6,75 mmol) oppløst i vann (20 ml). Den resulterende oppslemmingen ble omrørt ved romtemperatur i 1 time, og deretter ved -30 °C over natten. Forbindelsen i overskriften (6,0 g) ble isolert som et hvitt pulver. Produktet ble oppvarmet i 20% vann i isopropanol (100 ml) ved 30°C i 48 timer. Etter avkjøling til romtemperatur ble den resulterende utfellingen isolert ved filtrering og tørket i luft i 2 timer for å gi forbindelsen i overskriften (5,4 g).

Fremstilling 13

Metyl 4-akryloylamino-5-klor-2-metoksybenzoat

Til en 1-liters trehalset, rundbunnet kolbe utstyrt med ørerører, temperaturkontroll og tilsatstrakt ble det tilsatt metyl 4-amino-5-klor-2-metoksybenzoat (44,2 g, 200 mmol), diklormetan (500 ml) og diisopropyletylamin (104,5 ml, 600 mmol). Den resulterende blandingen ble rørt ved romtemperatur inntil bestanddelene var oppløst og deretter ble blandingen avkjølt til 0°C. Akryloylklorid (16,25 ml, 200 mmol) ble deretter dråpevis tilsatt mens den indre reaksjonsblandingstemperaturen ble holdt under 10°C. Den samlede tiden for tilsats var ca. 30 minutter. Reaksjonsblandingen ble deretter langsomt oppvarmet fra 0°C til romtemperatur over et tidsrom på ca. 2 timer. Vandig, mettet natriumbikarbonatoppløsning (200 ml) og diklormetan (200 ml) ble deretter tilsatt og denne blandingen ble omrørt i 15 minutter og deretter ble lagene separert. Diklormetan laget ble vasket med 1 M saltsyre (200 ml) og deretter konsentrert under redusert trykk til ca. en tredjedel av det opprinnelige volumet, hvilket resulterte i en tykk oppslemming. Oppslemmingen ble filtrert og filterkaken ble vasket med diklormetan (100 ml) og tørket for å tilveiebringe forbindelsen i overskriften som et beigehvitt faststoff (36 g, 67 % utbytte, >98% renhet ved HPLC).

Fremstilling 14

Til en 1-liters trehalset, rundbunnet kolbe utstyrt med ørerører, temperaturkontroll og

tilbakeløpskjøler ble det tilsatt bifenyl-2-ylkarbaminsyrepiperidin-4-ylester (36,3 g, 122 mmol), diklormetan (500 ml) og isopropanol (100 ml). Den resulterende blandingen ble omrørt ved romtemperatur inntil bestanddelene var oppløst og deretter ble produktet fra fremstilling 10(30g, 111,5 mmol) tilsatt. Omrøring ble fortsatt ved romtemperatur inntil bestanddelene var oppløst, og blandingen ble deretter oppvarmet under tilbakeløp

(50°C til 55°C) i 18 timer. Reaksjonsblandingen ble deretter avkjølt til romtemperatur og etanol (200 ml) ble tilsatt. Denne blandingen ble konsentrert under redusert trykk til et volum på ca. 150 ml, hvilket resulterte i en tykk oppslemming. Oppslemmingen ble filtrert, og filterkaken ble vasket med etanol (50 ml) og tørket for å tilveiebringe forbindelsen i overskriften som et hvitt faststoff (58 g, 92% utbytte, 99,5% rent ved

HPLC).

Fremstilling 15

Bifenyl-2-ylkarbaminsyre l-[2-(2-klor-4-hydroksymetyl-5-metoksy-fenyl-karbamoyl)etyl]piperidin-4-ylester

Til en 2-liters rundbunnet kolbe ble det tilsatt produktet fra fremstilling 14 (40 g, 70,8 mmol) og THF (400 ml). Den resulterende blandingen ble omrørt ved romtemperatur inntil bestanddelene var oppløst og deretter ble kolben spylt med nitrogen i 5 minutter. Blandingen ble deretter avkjølt 0°C (indre temperatur) og en 1 M oppløsning av litium aluminumhydrid i THF (106 ml, 106 mmol) ble dråpevis tilsatt ved hjelp av dråpetrakt mens den indre temperaturen av reaksjonsblandingen ble holdt under 10°C. Den samlede tilsetningstiden var ca. 40 minutter. Reaksjonsblandingen ble deretter omrørt I 1 time ved 0°C og deretter ble 1 M natriumhydroksid (200 ml) tilsatt mens den indre temperaturen av reaksjonsblandingen ble holdt under 15°C. Lagene ble deretter separert og THF laget ble vasket med vandig, mettet natriumkloridoppløsning (100 ml), tørket over natriumsulfat, filtrert og konsentrert under redusert trykk for å tilveiebringe forbindelsen i overskriften som et hvitt faststoff (38 g, 100% utbytte, 94% rent ved

HPLC).

Fremstilling 16

Bifenyl-2-ylkarbaminsyre l-[2-(2-klor-4-formyl-5-metoksyfenyl-karbamoyl)-etyl] piperidin-4-ylester

Til en 1-liters rundbunnet kolbe ble det tilsatt produktet fra fremstilling 15 (28 g, 52 mmol) og diklormetan (500 ml). Den resulterende blandingen ble omrørt ved romtemperatur inntil bestanddelene var oppløst og deretter ble det tilsatt aktivert mangan(IV) oksid (45 g, 520 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur under nitrogen i 12 timer og deretter filtrert gjennom en pute av celitt. Blandingen ble deretter konsentrert under redusert, og resten ble tørket over natten under vakuum for å tilveiebringe forbindelsen i overskriften som et gult faststoff (26 g, 93% utbytte, ca. 93% renhet ved HPLC).

Fremstilling 17

Bifenyl-2-ylkarbaminsyre l-[2-(4-{[(Æ)-2-(tert-Buryldimerylsilanyloksy)-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-2-klor-5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-yl ester

Til en 500 ml rundbunnet kolbe ble det tilsatt produktet fra fremstilling 16 (6 g, 11,2 mmol) og diklormetan (50 ml). Den resulterende blandingen ble omrørt ved romtemperatur inntil bestanddelene var oppløst og deretter ble produktet fra fremstilling 7 (6 g, 15,0 mmol) og tørr metanol (50 ml) tilsatt. Denne blandingen ble omrørt ved romtemperatur under nitrogen i 2 timer (klart gul til orange oppløsning) og deretter ble blandingen avkjølt til 0 til 5°C. Fast natriumtriacetoksyborhydrid (7,2 g, 34 mmol) ble tilsatt i porsjoner i løpet av en 10 minutters periode og deretter ble reaksjonsblandingen langsomt oppvarmet fra 0°C til romtemperatur over et tidsrom på ca. 2 timer. Blandingen ble deretter avkjølt til 0°C og 1 M vandig natriumhydroksidoppløsning (50 ml) og diklormetan (150 ml) ble tilsatt. Blandingen ble omrørt grundig, og deretter ble lagene separert. Det organiske laget ble vasket med vandig, mettet natriumkloridoppløsning (50 ml), filtrert, tørket over natriumsulfat, filtrert og konsentrert under redusert trykk for å gi forbindelsen som et gult faststoff (10,1 g, 100% utbytte, 87% renhet ved HPLC).

Eksempel 4

Til en 50 ml rundbunnet kolbe ble det tilsatt produktet fra fremstilling 17 (2,0 g, 2,5 mmol) og diklormetan (10 ml). Den resulterende blandingen ble omrørt ved romtemperatur inntil bestanddelene var oppløst, og deretter ble trietylamintrihydrofluorid (1,2 ml, 7,5 mmol) tilsatt og den resulterende blandingen ble omrørt ved 25°C i 20 timer. En oppløsning av 1,2-etandisulfonsyredihydrat (0,56 g, 2,5 mmol) i metanol (10 ml) ble deretter tilsatt og denne blandingen ble omrørt ved 30°C i 2 timer, ved hvilket tidspunkt det var dannet en tykk hvit oppslemming. Oppslemmingen ble langsomt filtrert, og filterkaken ble vasket med metanol (10 ml), lufttørket i 2 timer og deretter tørket over natten under vakuum for å tilveiebringe forbindelsen i overskriften som et fint, hvitt pulver (1,5 g, >98% renhet ved HPLC).

Eksempel 5

Rensing av bifenyl-2-ylkarbamibsyre l-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)-etyl]piperidin-4-ylester 1,2-Etandisulfonsyresalt Til bifenyl-2-ylkarbaminsyre 1 -[2-(2-klor-4- {[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)-etyl]piperidin-4-ylester 1,2-etandisulfonsyresalt, fremstilt som i eksempel 4 (80 g) ble det tilsatt en oppløsning av 20% vann i isopropanol uttrykt ved volum (800 ml). Den resulterende oppslemmingen ble hensatt ved romtemperature over natten og deretter filtrert for å tilveiebringe forbindelsen i overskriften som har en forbedret krystallinitet og renhet (74

<g>)<.>

Fremstilling 18

Kimkrystaller av bifenyl-2-ylkarbaminsyre l-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksyfenyl karbamoyl)-etyl]piperidin-4-ylester 1,2-Etandisulfonsyresalt

Trinn (a)

Bifenyl-2-ylkarbaminsyre 1 -[2-(2-klor-4- {[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-1,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)-etyl]piperidin-4-yl ester 1,2-etandisulfonsyresalt, fremstilt som i eksempel 4 (100 mg) ble oppløst i 13% vann i metanol (20 ml) ved -60 °C. Den resulterende, klare oppløsning ble tillatt å avkjøles til romtemperatur i en lukket beholder. Etter 48 timer ble de resulterende plate-lignende krystallene isolert ved filtrering.

Trinn (b)

Bifenyl-2-ylkarbaminsyre 1 -[2-(2-klor-4- {[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-1,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)-etyl]piperidin-4-yl ester 1,2-etandisulfonsyresalt, fremstilt som i eksempel 4 (1,0 g) ble oppløst i 15% vann i metanol (100 ml) ved 60-65°C. Den klare, omrørte oppløsningen ble tillatt å avkjøles til 30°C, og deretter ble det krystallinske produktet fra trinn (a) (4,2 mg) tilsatt. Oppløs-ningen ble avkjølt til 20°C og omrørt i 2 timer. Den resulterende utfellingen ble isolert ved filtrering og tørket i luft i 1 time for å tilveiebringe forbindelsen i overskriften (680 mg).

Trinn (c)

Fremgangsmåten fra trinn (b) ble gjentatt idet produktet fra trinn (b) (20 mg) ble anvendt i stedet for produktet fra trinn (a), for å tilveiebringe forbindelsen i overskriften (690 mg).

Trinn (d)

Bifenyl-2-ylkarbaminsyre 1 -[2-(2-klor-4- {[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-1,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)-etyl]piperidin-4-yl ester 1,2-etandisulfonsyresalt, fremstilt som i eksempel 4 (10 g) ble oppløst i 15% vann i metanol (IL) ved 60-65°C. Den klare, omrørte oppløsningen ble tillatt å avkjøles til 30°C, og deretter ble det krystallinske produktet fra trinn (c) (4,2 mg) tilsatt. Oppløs-ningen ble avkjølt til 20°C og omrørt i 18 timer. Den resulterende utfellingen ble isolert ved filtrering og tørket i luft i 2 timer for å tilveiebringe forbindelsen i overskriften (5,5

<g>)<.>

Eksempel 6

Omkrystallisasjon av bifenyl-2-ylkarbaminsyre l-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksyfenyl karbamoyl)-etyl]piperidin-4-ylester 1,2-Etandisulfonsyresalt ved anvendelse av kimkrystaller

Til en 12 L rundbunnet kolble ble det tilsatt produktet fra eksempel 5 (60 g, 64,5 mmol), vann (0,9 1) og metanol (5,1 1). Den resulterende blandingen ble oppvarmet fra 25°C til 61-65°C med omrøring inntil bestanddelene var oppløst og omrørt ytterligere i 20 minutter ved 60-65°C. Blandingen ble tillatt å avkjøles til 30°C og deretter ble produktet fra fremstilling 18 (2 g, 2,15 mmol) tilsatt. Denne blandingen ble langsomt avkjølt til 20°C og den resulterende oppslemmingen ble omrørt i ytterligere 2 timer ved 30°C. Produktet ble filtrert med metanol (500 ml) og tørket i luft i 2 timer og deretter i vakuum ved 25-30°C i 18 timer for å tilveiebringe forbindelsen i overskriften (43 g, 72% utbytte, 99,2 % renhet).

Eksempel 7

Termisk analyse

Differentiell sveipkalorimetri (DSC) ble utført ved å anvende en TA Instruments Model Q-10 modul med en Thermal Analyst kontrollinnretning. Data ble samlet og analysert ved å anvende TA Instruments Thermal Solutions software. En prøve på ca. 1 mg ble nøyaktig innveid i en aluminumbeholder med lokk. Prøven ble evaluert ved å anvende en lineær oppvarmingsrampe på 5°C/minurt fra romtemperatur til ca. 300°C. DSC cellen ble spylt med tørr nitrogen under anvendelse. Et representativt DSC spor for en prøve av et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkrbaminsyre l-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]-metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-ylester fra eksempel 6 er vist i fig. 1 og et representativt DSC spor for en prøve av eksempel 2 er vist i fig. 2.

Termogravimetrisk analyse (TGA) ble utført ved å anvende en TA Instruments Model Q-50 modul utstyrt med høy oppløsningsevne. Data ble samlet og analysert ved anvendelse av TA Instruments Thermal Solutions software. En prøve med vekt ca. 10 mg ble plassert på en platinabeholder og scannet med en høyoppløsnings oppvarmings-rate fra romtemperatur til 300°C. Vekt- og ovnskamrene ble spylt med nitrogenstrøm under anvendelse. Et representativt TGA spore for en prøve av et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbaminsyre l-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-1,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl} -5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-ylester av eksempel 6 er vist i fig. 1.

DSC spor demonstrerer at et 1,2-etandisulfonsyresalt ifølge foreliggende oppfinnelse har utmerket termisk stabilitet med smeltepunkter ved henholdsvis ca. 239°C og ved ca. 219°C, og ingen termisk dekomponering under ca. 200°C.

Eksempel 8

Røntgenpulverdiffraksjon

Røntgenpulverdiffraksjonsmønstre ble oppnådd med en Thermo ARL X-Ray Diffractometer Model XTRA (Thermo ARL SA, Sveis) ved anvendelse av Cu Ka stråling ved 1,542 Å (45 kV, 40 mA) med en Si(Li) faststoffdetektor. Analysen ble typisk utført ved en sveiprate på 27minutt med en trinnstørrelse på 0,03° pr. punkt over et område på 2 til 30° i to-theta-vinkel. Prøver, enten som mottatt eller malt til et fint pulver, ble forsiktig pakket i en tilpasset voluminnsetting utformet for å passe inn i instrumentets toppfyllings prøvekopp for analyse. Instrumentet ble kalibrert ukentlig til en silisiummetallstandard, innenfor ±0,02° to-theta-vinkel. Et representativt PXRD mønster for en prøve av et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbamin syre 1 - [2-(2-klor-4- {[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-1,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-ylester av eksempel 6 er vist i fig. 3 og mønsteret for en prøve fra eksempel 2 er vist i fig. 4.

Eksempel 9

Infrarød analyse

Det infrarøde (IR) absorpsjonsspekteret ble bestemt over frekvensområdet 4000 til

675 cm"<1>ved anvendelse av et Avatar 360 FT-IR spektrometer utstyrt med en Nicolet attenuated total reflection (ATR) prøveholder. Et representativt IR absorpsjonsspektrum for en prøve av et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarba-minsyre 1 -[2-(2-klor-4- {[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l ,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-ylester for en prøve av eksempel 6 hadde signifikante absorpsjonsbånd ved 704±1, 748±1, 768±1, 841=1=1, 900±1, 1055±1, 1104±1, 1166±1, 1218±1, 1294±1, 1408±1, 1522±1, 1609±1, 1655±1, og 1701=1=1, som vist i fig. 5.

Eksempel 10

Dynamisk fuktighetssorpsjonsbedømmelse

En dynamisk fuktighetssorpsjon (DMS) bedømmelse (også kjent som en fuktighets sorpsjon-desorpsjonsprofil) ble utført for en håndmalt prøve av krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbaminsyre l-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-1,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl} -5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-ylester fra fremstilling 18 ved å anvende en VTI atmosfærisk mikrovekt, SGA-100 system (VTI Corp., Hialeah, FL 33016). En prøvestørrelse på ca. 10 mg ble anvendt og fuktigheten ble innstilt ved omgivelsesverdi ved starten av analysen. En typisk DMS analyse besto av tre sveip: omgivelse til 2% relativ fuktighet (RH), 2% RH til 90% RH, 90% RH til 5% RH ved en sveiprate på 5% RH/trinn. Massen ble målt hvert andre minutt og RH ble endret til den neste verdien (+/- 5% RH) når massen av prøven var stabil til innenfor 0,01% for 5 etter hverandre følgende punkter. Et representativt DMS spor er vist i fig. 6.

DMS sporet demonstrerer at et 1,2-etandisulfonsyresalt ifølge foreliggende oppfinnelse har en reversibel sorpsjon/desorpsjonsprofil med moderat (< 9%) hygroskopisitet. Saltet har mindre enn 2,5% vektøkning i fuktighetsområdet på 40% RH til 75% RH. Den reversible fuktighetsorpsj on/des orpsjonsprofilen demonstrerer at et krystallinsk salt ifølge foreliggende oppfinnelse har en akseptabel hygroskopisitet og er ikke fuktighets-tiltrekkende.

Eksempel 11

Elementanalyse og motionforhold

De følgende elementprosentene av karbon, hydrogen, nitrogen og svovel av en prøve av et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbaminsyre l-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-ylester fra eksempel 6 ble bestemt ved for-brenningsanalyse ved anvendelse av en Flash EA 1112 Elemental Analyzer (CE Elantech, Lakewood, NJ): karbon 52,95%, hydrogen 5,43%, nitrogen 6,83% og svovel 6,87%. Vektprosenten av 1,2-etandisulfonsyre i den krystallinske prøven, beregnet fra den målte vektprosenten av svovel, er 20,4%, hvilket er lik den teoretiske vektprosenten av 20,4%, hvilket tilveiebringer et motionforhold på 1:1.

Fremstilling A

Cellekultur og membranpreparering fra celler som uttrykker humane Pi, P2eller 03adrenerge reseptorer

Kinesisk hamsterovarie (CHO) cellelinjer som stabilt uttrykker henholdsvis klonede humane Pi, P2eller P3adrenergiske reseptorer, ble dyrket til nær konfluens i Hams F-12 medier med 10% FBS i nærvær av 500 ug/ml Geneticin. Cellemonolaget ble løftet med 2mM EDTA i PBS. Celler ble pelletisert ved sentrifugering ved 1.000 opm, og celle-pelletene ble deretter lagret frosset ved -80 °C eller membraner ble fremstilt umiddelbart for anvendelse. For fremstilling av Pi og P2reseptoruttrykkende membraner ble cellpelletene resuspendert i lyseringsbuffer (10 mM HEPES/HC1, lOmM EDTA, pH 7,4 ved 4°C) og homogenisert ved å anvende en tettpassende Dounce glasshomogenisator (30 slag) på is. For de mer proteasesensitive P3reseptoruttrykkende membranene ble celle pelletene homogenisert i lyseringsbuffer (lOmM Tris/HCl, pH 7,4) supplert med en tablett av "Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets with 2 mM EDTA" pr. 50 ml buffer (Roche katalog nr. 1697498, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). Homogenatet ble sentrifugert ved 20.000 x g, og den resulterende pelleten ble gradvis vasket en gang med lyseringsbuffer ved resuspensjon og sentrifugering som ovenfor. Den endelige pelleten ble deretter resuspendert i iskald bindingsanalysebuffer (75 mM Tris/HCl pH 7,4, 12,5mMMgCl2, 1 mMEDTA). Proteinkonsentrasjonen av membransuspensjonen ble bestemt ved fremgangsmåtene beskrevet i Lowry et al., 1951, Journal ofBiological Chemistry, 193, 265; og Bradford, Analytical Biochemistry, 1976, 72, 248-54. Alle membranene ble lagret frosset i porsjoner ved -80 °C eller anvendt umiddelbart.

Fremstilling B

Cellekultur og membranpreparering fra celler som uttrykker humane Mi, M2, M3og M4muskariniske reseptorer

CHO cellelinjer som stabilt uttrykker klonede humane hMi, hM2, hM3og I1M4muskariniske reseptorundertyper, ble dyrket til nær konfluens i HAMs F-12 medium supplert med 10% FBS og 250 ug/ml Geneticin. Cellene ble dyrket i en 5% C02, 37°C inkubator og løftet med 2 mM EDTA i dPBS. Celler ble samlet ved 5 minutter sentrifugering ved 650 x g, og cellepelleter ble enten lagret frosset ved -80°C eller membraner ble fremstilt umiddelbart for anvendelse. For membranfremstilling ble celle-pelletene resuspendert i lyseringsbuffer og homogenisert med en Polytron PT-2100 vevsoppbryter (Kinematica AG; 20 sekunder x 2 støt). Råmembraner ble sentrifugert ved 40.000 x g i 15 minutter ved 4°C. Membranpelleten ble deretter resuspendert med resuspensjonsbuffer og homogenisert igjen med Polytron vevsoppbryteren. Proteinkonsentrasjonen av membransuspensjonen ble bestemt ved fremgangsmåten beskrevet i Lowry et al., 1951, Journal ofBiochemistry, 193, 265. Alle membranene ble lagret frosset i porsjoner ved -80°C eller anvendt umiddelbart. Porsjoner av preparerte hM5reseptormembraner ble innkjøpt direkte fra Perkin Eimer og lagret ved -80 °C inntil anvendelse.

Analyseforsøksprosedyre A

Radioligand bindingsanalyse for humane Pi, P2og P3adrenergiske reseptorer Bindingsanalyser ble utført i 96-brønns mikrotiterplater i et totalt analysevolum på 100 ul med 10-15 ug membranprotein inneholdende de humane Pi, p2eller P3adrenergiske reseptorene i analysebuffer (75 mM Tris/HCl pH 7,4 ved 25°C, 12,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 0,2% BS A). Metningsbindingsundersøkelser for bestemmelse av K<*verdier av radioliganden ble utført ved anvendelse av [ H]-dihydroalprenolol (NET-720,

100 Ci/mmol, PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA) for Pi og p2reseptorene og [<125>I]-(-)-jodcyanopindolol (NEKS-189, 220 Ci/mmol, PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA) ved 10 eller 11 forskjellige konsentrasjoner varierende fra 0,01 nMtil 20 nM. Fortrengningsanalyser for bestemmelse av K, verdier av forsøksforbindelser ble utført med [ 3 H]-dihydroalprenolol ved 1 nM og [ 125I]-(-)-jodcyanopindolol ved 0,5 nM ilO eller 11 forskjellige konsentrasjoner for forsøksforbindelse varierende fra 10 pM til 10 uM. Ikke-spesifikk binding ble bestemt i nærvær av 10 uM propranolol. Analyser ble inkubert i 1 time ved 37°C, og deretter ble bindingsreaksjoner terminert ved rak

filtrering over GF/B for Pi og P2reseptorene eller GF/C glassfiberfilter plater for P3reseptorene (Packard BioScience Co., Meriden, CT), forbløtet i 0,3% polyetylenimin. Filterplater ble vasket tre ganger med filtreringsbuffer (75 mM Tris/HCl pH 7,4 ved 4°C, 12,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA) for å fjerne ubundet radioaktivitet. Platene ble deretter tørket og 50 ul of Microscint-20 cæakwscintillasjonsfluid (Packard BioScience Co., Meriden, CT) ble tilsatt og platene ble talt i en Packard Topcount væskescintillasjonsteller (Packard BioScience Co., Meriden, CT). Bindingsdata ble analysert ved ikke-lineær regresjonsanalyse med GraphPad Prism Software pakken (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) ved å anvende 3-parametermodellen for en-sete konkurranse. Kurveminimum ble fastsatt til verdien for ikke-spesifikk binding, som bestemt i nærvær av 10 uM propranolol. K, verdier for forsøksforbindelser ble beregnet fra observerte IC50verdier og K<*verdien for radioliganden ved anvendelse av Cheng-Prusoff ligningen (Cheng Y, og Prusoff WH., BiochemicalPharmacology, 1973, 22, 23, 3099-108).

I denne analysen indikerer en lavere K, verdi at en forsøksforbindelse har en høyere bindingsaffinitet for den testede reseptoren. Ved testing i denne analysen ble forbindelsen av formel I funnet å ha en K; verdi på mindre enn 10 nM for den humane P2adrenergiske reseptoren.

Analyseforsøksprosedyre B

Radioligand bindingsanalyse for muskariniske reseptorer

Radioligand bindingsanalyser for klonede humane muskariniske reseptorer ble utført i 96-brønns mikrotiterplater i et samlet analysevolum på 100 ul. CHO cellemembraner som stabilt uttrykker enten den hMi, hM2,11M3,11M4eller I1M5muskariniske undertypen ble fortynnet i analysebuffer til følgende spesifikke målproteinkonsentrasjoner (ug/brønn): 10 ug for hMi, 10-15 ug for hM2, 10-20 ug for hM3, 10-20 ug for I1M4, og 10-12 ug for hM5for å få tilsvarende signaler (cpm). Membranene ble kort homogenisert ved anvendelse av en Polytron vevsoppbryter (10 sekunder) før analyseplate-tilsetning. Metningsbindingsstudier for bestemmelse av KDverder av radioliganden ble utført ved anvendelse av L-[A^-metyl-<3>//]skopolaminmetylklorid ([<3>H]-NMS) (TRK666, 84,0 Ci/mmol, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, England) ved konsentrasjoner varierende fra 0,001 nM til 20 nM. Fortreningsanalyser for bestemmelse av K, verdier av forsøksforbindelser ble utført med [ H]-NMS ved 1 nM og elleve forskjellige forsøksforbindelseskonsentrasjoner. Forsøksforbindelsene ble innledningsvis oppløst til en konsentrasjon på 400 uM i bufferfortynning og deretter serievis fortynnet 5x med fortynningsbuffer til endelig konsentrasjoner varierende fra 10 pM til 100 uM. Tilsetningsrekkefølgen og volumene til analyseplatene var som følger: 25 ul radioligand, 25 ul fortynnet forsøksforbindelse og 50 ul membraner. Analyseplater ble inkubert i 60 minutter ved 37°C. Bindingsreaksjoner ble terminert ved rask filtrering over GF/B glassfiberfilterplater (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA) forbehandlet i 1% BSA. Filterplater ble renset tre ganger med vaskebuffer (10 mM HEPES) for å fjerne ubundet radioaktivitet. Platene ble deretter lufttørket og 50 ul Microscint-20 væske-scintillasjonsfluid (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA) ble tilsatt til hver brønn. Platene ble deretter telt i en PerkinElmer Topcount væskescintillasjonsteller (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA). Bindingsdata ble analysert ved ikke-lineær regresjonsanalyse med GraphPad Prism Software pakken (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) ved anvendelse av en-sete kompetisjonsmodellen. K, verdier for forsøksforbindelser ble beregnet fra observerte IC50verdier og Kdverdien for radioliganden ved anvendelse av Cheng-Prusoff ligningen (Cheng Y; Prusoff WH. (1973) Biochemical Pharmacology, 22(23):3099-108). K; verdier ble omdannet til pK; verdier for å bestemme den geometriske middelverdien og 95% konfidensintervaller. Denne sammenfatnings-statistikken ble deretter omdannet tilbake til K; verdier for datarapporerting.

I denne analysen indikerer en lavere K, verdie at forsøksforbindelsen har en høyere bindingsaffinitet for den testede reseptoren. Ved testing i denne analysen, ble forbindelsen av formel I funnet å ha en K; verdi på mindre enn 10 nM for de humane M2og M3muskariniske reseptorene.

Analyseforsøksprosedyre C

Helcelle cAMP Flashplate Analyse i CHO Cellelinjer som heterologt uttrykker humane Pi, P2eller P3adrenergiske reseptorer

cAMP analyser ble utført i et radioimmunoanalyseformat ved anvendelse av Flashplate Adenylyl Cyklaseaktiveringsanalysesystemet med [<125>I]-cAMP (NEN SMP004, PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA), i henhold til fabrikantens instruksjoner. For bestemmelse av p reseptoragonistpotensen (EC50) ble CHO-K1 cellelinjer som stabilt uttrykker klonede humane Pi, P2eller P3adrenergiske reseptorer dyrket til nær konfluens i HAMs F-12 medium supplert med 10% FBS og Geneticin (250 ug/ml). Celler ble renset med PBS og løsnet i dPBS (Dulbeccos fosfatbufret saltvannsoppløs ning, uten CaCb og MgCb) inneholdende 2 mM EDTA eller Trypsin-EDTA oppløsning (0,05% trypsin/0,53 mM EDTA). Etter telling av celler i Coulter celleteller, ble celler pelletisert ved sentrifugering ved 1.000 opm og resuspendert i stimuleringsbuffer inneholdende IBMX (PerkinElmer Kit) foroppvarmet til romtemperatur til en konsentrasjon på 1,6 x IO6 til 2,8 x IO6 celler/ml. Ca. 60.000 til 80.000 celler pr. brønn

ble anvendt i denne analysen, forsøksforbindelser (10 mM i DMSO) ble fortynnet i PBS inneholdende 0,1% BSA i Beckman Biomek-2000 og testet ved 11 forskjellige konsentrasjoner varierende fra 100 uM til 1 pM. Reaksjoner ble inkubert i 10 minutter ved 37°C og stoppet ved tilsetning av 100 ul kald deteksjonsbuffer inneholdende [<125>I]-cAMP (NEN SMP004, PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA). Mengden av cAMP produsert (pmol/brønn) ble beregnet basert på tellingene observert for prøvene og cAMP standardene som beskrevet i forbrukerens anvendelsesmanualen. Data ble analysert ved ikke-lineære regresjonsanalyse med GraphPad Prism Software pakken (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) med sigmoidalligningen. Cheng-Prusoff ligningen (Cheng Y, og Prusoff WH., BiochemicalPharmacology, 1973, 22, 23, 3099-108) ble anvendt for å beregne EC50 verdiene.

I denne analysen indikerer en lavere EC50verdi at forsøksforbindelsen har en høyere funksjonell aktivitet ved den testede reseptoren. Ved testing i denne analysen ble forbindelsen av formel I funnet å ha en EC50verdi på minder enn 10 nM for den humane P2adrenergiske reseptoren.

Analyseforsøksprosedyre D

Funksjonelle analyser for antagonisme for muskariniske reseptorundertyper A. Blokkade av agonistformidlet [<35>S]GTPyS Binding

Den funksjonelle potensen av en forsøksforbindelse ble bestemt ved å måle evnen av forbindelsen til å blokkere oksotremorinstimulert [<35>S]GTPyS binding i CHO-K1 celler som uttrykker hM2reseptoren.

Ved tidspunktet for anvendelse ble frosne membraner opptint og deretter fortynnet i analysebuffer med en endelig målsvevskonsentrasjon på 5-10 \ ig protein pr. brønn. Membranene ble kort homogenisert ved anvendelse av en Polytron PT-2100 vevsoppbryter og deretter tilsatt til analyseplatene.

EC90verdien (effektiv konsentrasjon for 90% maksimal respons) for stimulering av [ 35S]GTPyS binding ved agonisten oksotremorin ble bestemt i hvert forsøk.

For å bestemme evnen av en forsøksforbindelse til å inhibere oksotremorinstimulert [ 35S]GTPyS binding, ble følgende tilsatt til hver brønn av 96 brønnsplater: 25 ul av analysebuffer med [<35>S]GTPyS (0,4 nM), 25 ul oksotremorin (EC90) og GDP (3 uM), 25 ul av fortynnet forsøksforbindelse og 25 ul CHO cellemembraner som uttrykker I1M2 reseptoren. Analyseplatene ble deretter inkubert ved 37°C i 60 minutter. Analyse platene ble filtrert over 1% BSA-forbehandlede GF/B filtre ved anvendelse av en PerkinElmer 96-brønns høster. Platene ble renset med iskold vaskebuffer i 3 x 3 sekunder og deretter luft- eller vakuumtørket. Microscint-20 scintillasjonsvæske (50 ul) ble tilsatt til hver brønn, og hver plate ble forseglet og radioaktivitet telt på en Topcounter (PerkinElmer). Data ble analysert ved ikke-lineær regresjonsanalyse med GraphPad Prism Software pakken (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) ved anvendelse av ikke-linear regresjon, en-sete kompetisjonsligning. Cheng-Prusoff ligningen ble anvendt for å beregne K;, ved anvendelse av IC50verdier fra konsentrasjon-responskurven for forsøksforbindelse og oksotremorinkonsentrasjonen i analysen som henholdsvis Kdog [L], ligandkonsentrasjon.

I denne analysen indikerer en lavere K; verdi at forsøksforbindelsen har en høyere funksjonell aktivitet ved den testede reseptoren. Ved testing i denne analysen, ble forbindelse av formel I funnet å ha en K; verdi på mindre enn ca. 10 nM for blokkade av oksotremorinstimulert [<35>S]GTPyS binding i CHO-K1 celler som uttrykker hM2reseptoren.

B. Blokkade av agonistformidlet kalsiumfrigivelse via FLIPR analyser Muskariniske reseptorundertyper (Mi, M3og M5reseptorer), som kobler til Gq proteiner, aktiverer fosfolipase C (PLC) veien ved agonistbinding til reseptoren. Som et resultat, hydrolyserer aktivert PLC fosfatylinositoldifosfat (PIP2) til diacylglycerol (DAG) og fosfatidyl-l,4,5-trifosfat (IP3), som i sin tur genererer kalsiumfrigivelse fra intracellulare lagre, dvs. endoplasmisk og sarkoplasmisk reticulum. FLIPR (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) analysen kapitaliserer på denne økningen i intracellulært kalsium ved å anvende et kalsiumsensitivt fargestoff (Fluo-4AM, Molecular Probes, Eugene, OR) som fluorescerer når fritt kalsium bindes. Fluorescenshendelsen måles i reell tid ved hjelp av FLIPR, som detekterer endringen i fluorescens fra et monolag av celler klonet med humant Mi og M3, og chimpanse M5reseptorer. Antagonistpotens kan bestemmes ved evnen av antagonister til å inhibere agonistformidlet økning i intracellulært kalsium.

For FLIPR kalsiumstimuleringsanalyser ble CHO celler som stabilt uttrykker hMi, hM3ogCM5reseptorer podet i 96-brønns FLIPR plater natten før analysen ble utført. Podede celler ble vasket to ganger ved hjelp av Cellwash (MTX Labsystems, Inc.) med FLIPR buffer (10 mM HEPES, pH 7,4, 2 mM kalsiumklorid, 2,5 mM probenecid i Hanks bufrede saltoppløsning (HBSS) uten kalsium og magnesium) for å fjerne vekstmedium og etterlate 50 ul/brønn av FLIPR buffer. Cellene ble deretter inkubert med 50 ul/brønn av 4 uM FLU0-4AM (en 2X oppløsning ble fremstilt) i 40 minutter ved 37°C, 5% karbondioksid. Etter fargestoffinkuberingsperioden ble cellene vasket to ganger med FLIPR buffer, for å etterlate et endelig volum av 50 ul/brønn.

For å bestemme antagonistpotensen, ble den doseavhengige stimuleringen av intracellulær Ca 2_|_ frigivelse for oksotremorin først bestemt slik at antagonistpotensen senere kan måles mot oksotremorinstimulering ved en EC90konsentrasjon. Celler ble først inkubert med forbindelsefortynningsbuffer i 20 minutter, etterfulgt av agonist-tilsetning, hvilket ble utført ved hjelp av FLIPR. En EC90verdi for oksotremorin ble generert i henhold til den generelle fremgangsmåten som er detaljert beskrevet i FLIPR målings- og datareduksjonsdelen nedenfor, i forbindelse med formelen ECf= ((F/l 00-F)A1/H)<*>EC50 • En oksotremorinkonsentrasjon på 3 x ECfble fremstilt i stimulerings-plater slik at en EC90konsentrasjon av oksotremorin ble tilsatt til hver brønn i antago-nistinhiberinganalyseplatene.

Parametrene anvendt for FLIPR var: eksponeringslengde på 0,4 sekunder, laserstyrke på 0,5 watt, eksitasjonsbølgelengde på 488 nm, og emisjonsbølgelengde på 550 nm. Basislinje ble bestemt ved å måle endringen i fluorescens i 10 sekunder før tilsetning av agonist. Etter agoniststimulering målte FLIPR kontinuerlig endringen av fluorescens hvert 0,5 til 1 sekund i 1,5 minutter for å oppfange maksimal fluorescensendring.

Endringen av fluorescens ble uttrykt som maksimum fluorescens minus basislinje fluorescens for hver brønn. Rådata ble analysert mot logaritmen av legemiddelkonsen-trasjon ved ikke-lineær regresjon med GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) ved anvendelse av en innbygget modell for sigmoidal doserespons. Antagonist K; verdier ble bestemt ved Prism ved anvendelse av oksotremorin EC50verdien som KDog oksotremorin EC90for ligandkonsentrasjonen i henhold til Cheng-Prusoff ligningen (Cheng & Prusoff, 1973).

I denne analysen indikerer en lavere K; verdi at forsøksforbindelsen har en høyere funksjonell aktivitet ved den testede reseptoren. Ved testing i denne analysen ble forbindelsen av formel I funnet å ha en K; verdi på mindre enn ca. 10 nM for blokkade av agonistformidlet kalsiumfrigivelse i CHO celler som stabilt uttrykker hMi, I1M3ogCM5reseptorene.

Analyseforsøksprosedyre £

Helcelle cAMP Flashplate analyse med en lungeepitelcellelinje som endogent uttrykker human p2adrenergisk reseptor

For bestemmelsen av agonistpotenser og virkningsfullheter (intrinsikkaktiviteter) i en cellelinje som uttrykker endogene nivåer av den p2adrenergiske reseptoren, ble det anvendt en human lungeepitelcellelinje (BEAS-2B) (ATCC CRL-9609, American Type Culture Collection, Manassas, VA) (January B, et al., British Journal ofPharmacology, 1998, 123, 4, 701-11). Celler ble dyrket til 75-90% konfluens i fullstendig, serumfritt medium (LHC-9 MEDIUM inneholdende Epinefrin og Retinoinsyre, kat # 181-500, Biosource International, Camarillo, CA). Dagen før analysen ble mediet byttet til LHC-8 (intet epinefrin eller retinoinsyre, kat # 141-500, Biosource International, Camarillo,

CA).

cAMP analyser ble utført i et radioimmunoanalyseformat ved anvendelse av Flashplate Adenylylcyklaseaktiveringsanalysesystemet med [<125>I]-cAMP (NEN SMP004, PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA), i henhold til fabrikantens instruksjoner. På dagen for analysen ble celler renset med PBS, løftet ved skaping med 5mM EDTA i PBS og talt. Celler ble pelletisert ved sentrifugering ved 1.000 opm og resuspendert i stimuleringsbuffer foroppvarmet til 37°C ved en endelig konsentrasjon på 600.000 celler/ml. Celler ble anvendt ved en endelig konsentrasjon på 100.000 til 120.000 celler/brønn i denne analysen. Forsøksforbindelser ble serievis fortynnet i analysebuffer (75 mM Tris/HCl pH 7,4 ved 25°C, 12,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 0,2% BSA) i Beckman Biomek-2000. Forsøksforbindelser ble testet i analysen ved 11 forskjellige konsentrasjoner, varierende fra 10 uM til 10 pM. Reaksjoner ble inkubert i 10 minutter ved 37°C og stoppet ved tilsetning av 100 ul iskald deteksjonsbuffer. Plater ble forseglet, inkubert over natten ved 4°C og talt neste morgen i en Topcount scintilla-sjonsteller (Packard BioScience Co., Meriden, CT). Mengden av cAMP produsert pr. ml reaksjon ble beregnet basert på tellingene observert for prøver og cAMP standarder, som beskrevet i fabrikanten brukermanual. Data ble analysert ved ikke-lineær regresjonsanalyse med GraphPad Prism Software pakken (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) ved å anvende 4-parametermodellen for sigmoidal doserespons.

I denne analysen indikerer en lavere EC50verdi at forsøksforbindelsen har en høyere funksjonell aktivitet ved den testede reseptoren. Ved testing i denne analysen ble forbindelsen av formel I funnet å ha en EC50verdi mindre enn ca. 10 nM for den p2adrenergiske reseptoren.

Analyseforsøksprosedyre F

Varighet av bronkobeskyttelse i marsvinmodeller for acetylkolinindusert eller histaminindusert bronkokonstriksjon

Disse in vivo analysene ble utført for å bedømme de bronkobeskyttende effektene av forsøksforbindelser som viser både muskarinisk reseptorantagonist og P2adrenergisk reseptoragonistaktivitet. For å isolere muskarinantagonistaktivitet i den acetylkolin-induserte bronkokonstriksjonsmodellen, ble dyrene administrert propanolol, en forbindelse som blokkerer P reseptoraktivitet, før administrering av acetylkolin. Varighet av bronkobeskyttelse i den histamininduserte bronkokonstriksjonsmodellen gjenspeiler P2adrenergisk reseptoragonistaktivitet.

Grupper på 6 hannmarsvin (Duncan-Hartley (HsdPoc:DH) Harlan, Madison, WT) med vekt mellom 250 og 350 g ble individuelt identifisert ved hjelp av burkort. Gjennom undersøkelsen ble dyrene gitt fri tilgang til mat og vann ad libitum.

Forsøksforbindelser ble administrert via inhalering over 10 minutter i et hel-legeme eksponeringsdoseringskammer (R&S Molds, San Carlos, CA). Doseringskamrene ble anordnet slik at en aerosol simultant ble avlevert til 6 individuelle kamre fra et sentrall grenrør. Marsvinene ble eksponert mot en aerosol av en forsøksforbindelse eller bærer (WFI). Disse aerosolene ble generert fra vandige oppløsninger ved anvendelse av LC Star Nebulizer Set (Model 22F51, PARI respirasjon Equipment, Inc. Midlo-

thian, VA) drevet ved hjelp av en blanding av gasser (CO2= 5%, O2 = 21% og N2= 74%) ved et trykk på 22 psi. Gasstrømmen gjennom forstøvningsinnretningen ved dette driftstrykket var ca. 3 l/minutt. De genererte aerosolene ble drevet inn i kamrene ved hjelp av positivt trykk. Ingen fortynningsluft ble anvendt under avleveringen av aerosoliserte oppløsninger. Under den 10 minutters forstøvningen ble ca. 1,8 ml oppløs-ning forstøvet. Denne verdien ble målt gravimetrisk ved å sammenligne før- og etter-forstøvningsvekter av den fylte forstøveren. De bronkobeskyttende effektene av forsøksforbindelsene administrert via inhalering ble evaluert ved å anvende hel-legeme pletysmografi ved 1,5, 24, 48 og 72 timer etterdosering.

Førtifem minutter før starten av pulmonarevaluerigen ble hvert marsvin anestetisert med en intramuskulær injeksjon av ketamin (43,75 mg/kg), xylazin (3,50 mg/kg) og acepromazin (1,05 mg/kg). Etter at det kirurgiske området var barbert og renst med 70% alkohol, ble det gjort et 2-3 cm midtlinjeinnsnitt ved det ventrale aspektet av nakken. Deretter ble jugularvenen isolert og kannylert med et saltvannsfylt polyetylen kateter (PE-50, Becton Dickinson, Sparks, MD) for å tillate intravenøse infusjoner av acetylkolin (Ach) eller histamin i saltvann. Luftrøret ble deretter dissikert fritt og kannylert med et 14G teflonrør (#NE- 014, Small Parts, Miami Lakes, FL). Om nødvendig, ble anestesi opprettholdt ved ytterligere intramuskulære injeksjoner av den tidligere nevnte anestetiske blandingen. Dybden av anestesi ble overvåket og justert dersom dyrene viste respons på klyping i potene eller dersom respirasjonsraten var høyere enn 100 åndedrag/minutt.

Når kannyleringer var fullført, ble dyrene plassert i en pletysmograf (#PLY3114, Buxco Electronics, Inc., Sharon, CT) og en esofageal trykkannyle (PE-160, Becton Dickinson, Sparks, MD) ble innført for å måle pulmonart drivende trykk { trykk). Teflontrakealrøret ble festet til åpningen av pletysmografen for å tillate marsvinet å ånde værelsesluft fra utenfor kammeret. Kammeret ble deretter forseglet. En varmelampe ble anvendt for å opprettholde kroppstemperatur og marsvinets lunger ble oppblåst tre ganger med 4 ml luft ved anvendelse av en 10 ml kalibreringssprøyte (#5520 Series, Hans Rudolph, Kansas City, MO) for å sikre at de nedre luftveiene ikke falt sammen og at dyret ikke led av hyperventilering.

Når det var bestemt at basislinjeverdier var innenfor området på 0,3 - 0,9 ml/cm H2O for samsvar og innenfor området 0,1-0,199 cm H20/ml pr. sekund for resistens, ble pulmonar evaluering initiert. Et Buxco pulmonart målecomputerprogam muliggjorde samlingen og derivatiseringen av pulmonarwerdier.

Starting av dette programmet initierte forsøksprotokollen og datasamlingen. Endringene i volum over tid som fant sted innenfor pletysmografen med hvert åndedrett, ble målt via en Buxco trykktransduser. Ved å integrere dette signalet over tid, ble det beregnet en måling av strøm for hvert åndedrag. Dette signalet, sammen med endringene i pulmonart drivende trykk, som ble samlet ved å anvende en Sensym trykktransduser (#TRD4100), ble forbundet via en Buxco (MAX 2270) forforsterker til en datasam-lingsgrenseflate (#'s SFT3400 og SFT3813). Alle andre pulmonare parametre ble avledet fra disse to kildene.

Basislinjeverdier ble oppsamlet i 5 minutter, etter litt tid ble marsvinene stimulert med Ach eller histamin. Ved evaluering av muskariniske antagonisteffekter, ble propanolol (5 mg/Kg, iv) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) administrert 15 minutter før stimulering med Ach. Ach (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (0.1 mg/mL) ble infusert intravenøst i 1 minutt fra en sprøytepumpe (sp210iw, World Precision Instruments, Inc.,

Sarasota, FL) ved de følgende doser og foreskrevne tider fra start av eksperimentet:

1.9 ug/minutt i 5 minutter, 3.8 ug/minutt i 10 minutter, 7.5 ug/minutt i 15 minutter, 15.0 jig/minutt i 20 minutter, 30 jig/minutt i 25 minutter og 60 jig/minutt i 30 minutter. Alternativt ble bronkobeskyttelse av testforbindelser analyset i acetylcholin stimulert modell uten forbehandling med en betablokkerende forbindelse.

Ved evaluering av p2adrenergisk reseptor agonisteffekter av testforbindelsene ble histamin (25 ug/mL) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) infusert intravenøst i 1 minutt fra a sprøytepumpe i de følgende doser og foreskrevne tider fra starten av eksperimentet: 0.5 jig/minutt i 5 minutter, 0.9 ug/minutt i 10 minutter, 1.9 ug/minutt i 15 minutter,

3.8 jig/minutt i 20 minutter, 7.5 jig/minutt i 25 minutter og 15 jig/minutt i 30 minutter. Hvis resistans eller samsvar ikke hadde gått tilbake til basislinjeverdier etter 3 minutter følgende hver Ach eller histamin dose, ble marsvinets lunger fylt tre ganger med 4 mL luft fra en 10 mL kalibreringssprøyte. Målte pulmonare parametere inkluderer respirasjonsfrekvens (pust/minutt), samsvar (mL/cm H20) og pulmonar resistans (cm H20/ mL per sekund). Når de pulmonare funksjonsmålingene var fullført ved minutt 35 i denne protokollen, ble marsvinet fjernet fra pletysmografen og avlivet ved karbondioksidasfyksi.

Datene ble evaluert på én av to måter:

(a) Pulmonar resistans (Rl, cm H20/mL per sekund) ble beregnet fra forholdet "trykkendring" til "strømningsendring." Rl responsen til ACh (60 ug/min, IH) ble beregnet for vehikkelen og testforbindelsesgruppene. Den midlere ACh respons i vehikkel-behandlede dyr, ved hver førbehandlingstid, ble beregnet og anvendt til å beregne % inhibering av ACh respons, ved den korresponderende førbehandlingstiden ved hver testforbindelsesdose. Inhiberings dose-responskurver for 'Rl' ble tilpasset med en fire parameter logistisk ligning ved anvendelse av GraphPad Prism, versjon 3.00 for Windows (GraphPad Software, San Diego, California) for å estimere bronkobeskyttende ID50(dose påkrevd for å inhibere ACh (60 ug/min) bronkokonstriktor respons med 50%). Den anvendte ligningen var som følger:

Y = Min + (Maks-Min)/(1 + 10 (0°g idso-ks).Hiikiope) }

hvor KS er logaritmen av dose, Y er responsen (% Inhibering av ACh indusert økning i Rl). Y starter ved Min og går asymptotisk til Maks med en sigmoidal form. (b) Mengden PD2, som er definert som mengden av Ach eller histamin som behøves for å forårsake en dobling av basislinje pulmonar resistans, ble beregnet ved anvendelse av de pulmonare resistansverdiene avledet fra strømningen og trykket i løpet av et

område av Ach eller histamin stimuleringer ved anvendelse av den følgende ligningen (avledet fra ligningen anvendt for å beregne PC20verdier klinisk (se Am. Thoracic Soc, 2000):

hvor:

Ci= konsentrasjon av Ach eller histamin før C2

C2= konsentrasjon av Ach eller histamin resulterende i minst en 2-gang økning

i pulmonar resistans (R^

Ro = Basislinje RLverdi

Rj = RLverdi etter C1

R2<=>RLverdi etter C2

Statistisk analyse av dataene ble utført ved anvendelse av en to-halet - Students t-test. En P-verdi <0.05 ble ansett signifikant.

Når testet i denne analysen produserte forbindelsen med formel I en dose-avhengig bronkobeskyttende effekt mot MCh-indusert bronkokonstriksjon og His-indusert bronkokonstriksjon. I tillegg hadde forbindelsen med formel I en varighet (PD T1/2) av bronkobeskyttende aktivitet på minst ca. 24 timer i denne analysen.

Claims

1. Krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl -2-ylkarbamin syrel-[2-(2- klor -4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-yl ester eller et solvat derav.

2. Forbindelsen ifølge krav 1, hvori forbindelsen erkarakterisert veddifferensial sveipkalorimetriopptak som viser en maksimal endoterm varmestrøm i området 215 °C til 229 °C.

3. Forbindelsen ifølge krav 1, hvori forbindelsen erkarakterisert veddifferensial sveipkalorimetriopptak som viser en maksimal endoterm varmestrøm i området 230 °C til 240 °C.

4. Forbindelsen ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3,karakterisert vedat forbindelsen er i findelt form.

5. Farmasøytisk preparat,karakterisert vedat det omfatter en farmasøytisk akseptabelt bærer og en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4.

6. Farmasøytisk preparat ifølge krav 5,karakterisertv e d at preparatet ytterligere omfatter et steroidalt anti-inflammatorisk middel.

7. Farmasøytisk preparat ifølge krav 6,karakterisert vedat det steroidale anti-inflammatoriske middel er 6a,9a-difluor-17a -[(2-furanylkarbonyl)oksy] -11 P-hydroksy-16a-metyl-3 -oksoandrosta-1,4-dien- 17B-karbotionsyre Æ-fluormetyl ester eller et solvat derav .

8. Farmasøytisk preparat ifølge krav 5,karakterisert vedat preparatet ytterligere omfatter en fosfodiesterase-4 inhibitor.

9. Farmasøytisk preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 5 til 8,karakterisert vedat preparatet er formulert for administrasjon ved inhalering.

10. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter å kontakte bifenyl -2-ylkarbaminsyrel - [2-(2- klor -4- {[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-1,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]-piperidin-4-yl ester med 1,2-etandisulfonsyre eller et hydrat derav.

11. Bifenyl -2-ylkarbaminsyrel-[2-(2- klor -4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]-piperidin-4-yl ester 1,2-etandisulfonsyresalt.

12. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter: (a) å kontakte en forbindelse med formel II:

hvori R<la>,Rlbog R<lc>er uavhengig valgt fra C1.4alkyl, fenyl, -C1.4alkyl-( fenyl ), eller en av R<l>a,RlbogR<le>er -0-(Ci.4 alkyl); med fluoridion; og (b) å kontakte produktet fra trinn (a) med 1,2-etandisulfonsyre eller et hydrat derav; for å danne et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl -2-ylkarbaminsyrel-[2-(2-klor-4- {[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-1,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-yl ester eller et solvat derav, hvori trinn (a) og (b) utføres i den samme reaksjonsbeholderen uten isolering av produktet fra trinn (a).

13. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse ifølge krav 1 som har et smeltepunkt høyere enn 230 °C,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter tilsetning av en kimkrystall av et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl -2-ylkarbaminsyrel-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-1,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl} -5-metoksyfenyl karbamoyl)etyl]piperidin-4-yl ester eller et solvat derav til en oppløsning omfattende et 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbaminsyrel -[2-(2-klor-4- {[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l ,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl} -5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-yl ester eller et solvat derav oppløst i et inert fortynningsmiddel, hvori kimkrystallen har et smeltepunkt høyere enn 230 °C.

14. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse ifølge krav 1 som har et smeltepunkt høyere enn 230 °C,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter: (a) å oppløse et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbaminsyrel-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-yl ester i et inert fortynningsmiddel ved en første temperatur; (b) å avkjøle produktet fra trinn (a) til en andre temperatur; og (c) å tilsette en kimkrystall av 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbaminsyrel-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-yl ester; hvori kimkrystallen har et smeltepunkt høyere enn 230 °C, den første temperaturen er en temperatur tilstrekkelig til å oppløse 1,2-etandisulfonsyresaltet, og den andre temperaturen er under en temperatur ved hvilken kimkrystallen fullstendig oppløses når tilsatt til produktet fra trinn (b).

15. Krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbaminsyrel-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-1,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl} -5-metoksyfenylkarbamoyl)etyl]piperidin-4-yl ester eller et solvat derav for anvendelse i terapi eller som et medikament.

16. Anvendelse av et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbaminsyrel-[2-(2-klor-4-{[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl}-5-metoksyfenylkarbamoyl)ethyl]piperidin-4-yl ester eller et solvat derav for fremstilling av et medikament for behandling av en pulmonar sykdom.

17. Anvendelse ifølge krav 16, hvori den pulmonære sykdommen er kronisk obstruktiv pulmonar sykdom eller astma.

18. Anvendelse av: (a) et krystallinsk 1,2-etandisulfonsyresalt av bifenyl-2-ylkarbaminsyrel-[2-(2-klor -4- {[(i?)-2-hydroksy-2-(8-hydroksy-2-okso-l ,2-dihydroquinolin-5-yl)etylamino]metyl} - 5- metoksyfenylkarbamoyl )etyl]piperidin-4-yl ester eller et solvat derav ; og (b) et steroidalt anti-inflammatorisk middel; i fremstilling av et medikament for behandling av en pulmonar sykdom.

19. Anvendelse ifølge krav 18, hvori det steroidale anti-inflammatoriske middel er 6a,9a-difluor-17a -[(2-furanylkarbonyl)oksy]-l 1 P-hydroksy-16a-metyl-3-oksoandrosta-l,4-dien-17P-karbotionsyre Æ-fluormetyl ester eller et solvat derav.