CN1008145B - 冻干的b型肝炎疫苗 - Google Patents

Abstract

B型肝炎疫苗的冻干制品、包括由能产生HBs抗原的重组生物体产生的纯化的B型肝炎病毒表面抗原，在稳定剂存在下此制品以冻干状态吸附于铝凝胶上；所说的冻干制剂制备的步骤包括向纯化的重组体源HBs抗原中加入铝凝胶和稳定剂，并冻干该混合物。所说的冻干制剂能长期稳定地保存而不丢失其抗原效价；并能用于B型肝炎病毒感染的预防。

Description

本发明是有关B型肝炎疫苗的冻干制剂。特别是有关B型肝炎疫苗的冻干制剂，是通过HBs抗原得到纯化的产品，在铝凝胶和一种稳定剂存在下经冻干而制备的B型肝炎疫苗的冻干制剂，上述HBs抗原是由能够产生HBs抗原的转化生物体来表达，该抗原是用常规DNA重组技术制备的。

B型肝炎是一种由B型肝炎病毒引起的疫病（下文用“HBV”表示），并包含有免疫学上和临床上非常重要的问题。但从未找到任何有效的治疗方法。为此，主要研究的是预防方法。合适的预防方法是提供一种以HBs抗原为有效成份的疫苗给恐怕要感染HBV的人。一种疫苗已在实践中使用，这种疫苗的制备方法是从一组仅称为“带菌者”的潜伏病毒携带者的血浆里得到的高纯HBs抗原制备的。

然而，血源疫苗是以HBs抗原阳性者的血浆里得到的，因此其制备方法存在有各种各样的问题，比如得到足够的原始血浆就很困难;为必须在黑猩猩体内作安全试验，以便证明在制剂中不留有感染因子，如B型肝炎病毒或任何其它血源病毒;此外，要得到足够的试验用黑猩猩也很困难。

为了解决这些问题，许多研究者正在从事研究获得大量起始HBs抗原的技术，采用的办法是用DNA重组技术，通过将一个编码HBs抗原蛋白质的HBV    DNA到大肠杆菌或酵母里，并用这样获得的转化了的微生物来表达HBs抗原。最近，用这些重组微生物表达HBs抗原已获成功。特别是在用重组体酵母生产HBs抗原已在工业规模内完成，其后，已经进行试验纯化这样获得的HBS抗原，并制备B型肝炎疫苗的制剂。

B型肝炎疫苗对预防医务工作者的病毒感染很有效，对于偶尔和B型肝炎病人和潜在的病毒带毒者以及病人、带菌者及婴儿的家属接触的研究者预防也有效，此时病毒是通过血液感染的。据说在日本，通常发现的带菌者为总人口的2-3%，而在东南亚和非洲达10-15%。因此，提取B型肝炎疫苗在世界范围内都是需要的。根据这个论点，需要在世界范围内包括日本在内，制造广泛可得到的B型肝炎疫苗，而且重要的是要提供一种稳定的且能长期保存的制剂。

商用B型肝炎疫苗是从血源HBs抗原产品中获得的一种液态制剂，而且在储藏期间能逐渐失去其抗原效价。

在此情况下，本发明人研究了在工业规模上制备长时期内，有更大储存稳定性的B型肝炎疫苗的方法，而且还发现了能用重组体源HBs抗原代替血源HBs抗原，以及在特定条件下冻干HBs抗原得到所要的疫苗。

已知一种未活化的疫苗是通过掺入佐剂，如铝凝胶而制备的，为的是在用疫苗时提高人体内的抗体产率。B型肝炎疫苗制剂一般也掺和了铝凝胶。对于冻干B型肝炎疫苗来说，假若B型肝炎疫苗只是由冻干的HBs抗原制得的，那么它必须是通过预先把HBs抗原（下文偶尔称为“HBsAg”）溶解于注射用盐水和注射用蒸馏水内，且使用前再将此溶液和铝凝胶混合而制备的。这样的方法中，在每一最小使用单位的容器里，HBsAg在铝凝胶上的吸附是有不同的，这取决于制备步骤的顺序、温度、摇动混合的条件等因素，因此抗体的产生率就可能依每一批疫苗有所变化。此外，当一种重组体源HBs抗原采用与普通液体制剂相同的条件冻干时，冻干过程中，疫苗的抗原效价会不合需要地降低。

本发明人深入细致地研究了吸附于铝凝胶上的重组体源HBsAg的冻干条件。研究的结果还不能说明这样的一些问题，如抗原效价的降低 或性质的劣化，但能给出所要的具有比普通液体制剂有更大储存稳定性的冻干制剂。还进一步研究了适当的稳定制剂的成份。结果发现，所要的冻干制剂的制备可通过在悬浮态铝凝胶上吸附纯化重组体源HBsAg，溶解稳定剂和任选的悬浮液保护剂，以及冻干通过上述步骤所制备的混合物。

本发明的一个目的是使用能产生HBs抗原的重组体微生物，提供一种改良制B型肝炎疫苗的冻干制剂。本发明的另一个目的是为了得到一种有极好储藏稳定性的冻干B型肝炎疫苗的，而提供一个重组体源HBs抗原的冻干方法。这些和另外一些目的以及本发明的优点，将使熟练技术人员根据下列叙述得以明了。

本发明的冻干B型肝炎疫苗可通过将铝凝胶加到一种重组体源HBs抗原几乎是中性的缓冲溶液的水溶液中，使HBs抗原吸附到铝凝胶上，再往其中加入一种选自氨基酸和/或糖类的稳定剂以及任选的胶体物质，另一任选的普通防腐剂、等渗剂等，以制备一种疫苗溶液，将其冻干，最好是在按最小使用单位分装成瓶之后再冻干。用这种方法获得的B型肝炎疫苗冻干制剂能在长时间内保持很高的抗原效价，而且每批制剂每一含最小使用单位的瓶装制剂，都具有相同的抗原效价，困此使用起来是很便利的。

起始的纯化重组体源HBs抗原的制备程序是：将一个编码从B型肝炎病毒DNA分离的HBs抗原的基因引入大肠杆菌、酵母、培养的动物细胞等生物体，从而由基因转化微生物，并通过HBs抗原基因的活动表达HBs抗原。制备重组体源HBs抗原的方法早已为人所知。例如，Valenzuela报导过制备重组体酵母源HBs抗原的方法（参见Valenzuela，Nature，298，347（1982）和日本专利（申请）第一次公开77823/1983），方法包括制备一种穿梭载体（PHB 516），在其中有一个HBS基因，它被结合到一个具有PBR322质粒的复制起始区域的穿梭载体（PMA56）中的酵母乙醇脱氧酶启动于中，一个2μ质粒Trp1复制起始区域，Trp1及酵母乙醇脱氧酶启动子区域;将此穿梭载体引入酵母，以制备转化的酵母并培养转化酵母，以产生所要的HBs抗原。

另外一种已知的制备酵母源HBs抗原的方法已由Miyanohara等人（参见proc.Natl.Acad.Sci.，USA.80，1（1983）和日专利（申请）第一次公开31799/1984）报导。这个方法包括制备一个穿梭载体（PAH203），在其中有一个HBs基因被连接到一个具有2μ质粒复制起始区域的穿梭载体中的可转录酸性磷酸酶启动子内，一个pBR322质粒的复制起始区域，一个酵母染色体的复制起始区域，参与亮氨酸合成的酵母leu2基因，一个大肠杆菌抗氨苄青霉素基因和一个酵母的可抑制酸性磷酸酶启动子区域;将穿梭载体引入酵母〔AH22（a，leu2，his4，Canl，Cir⁺）〕以制备转化酵母;并培养转化酵母以产生所要的HBs抗原。

另据Hitzeman报导，曾制备了一个其中的HBs基因被连接到酵母3-磷酸甘油酸激酶（PGK）启动子上的穿梭载体，之后被用于制备能产生HBs抗原的转化酵母（参见Hitzeman，Nucleic    Acids    Research，11（9），2745（1983）和日本专利（申请）第一次公开109427/1983）。

此外又据Nozaki等人报导，通过将HBs基因与具有插入到起源于Coll    E1，pMB1或p15A的大肠杆菌质粒中的SV40    DNA的复制起始区域的，并且不能在哺乳动物细胞内复制抑制的区域的载体重组，而制得一个重组DNA。而通过用这些重组DNA转化这个哺乳动物细胞，即小鼠LTK细胞，之后再培养这个转化了的细胞，从而获得所要的HBs 抗原（参见30th    Plenary    Session    of    The    Society    of    Virology，Japan，Abstracts，P-1069（1982）和日本专利（申请）第一次公开36698/1984）。还有一些利用DNA重组技术，通过动物细胞产生HBs抗原的报告，如日本专利（申请）第一次公开56685/1983，995/1983和39784/1982。

将如此得到的HBs抗原用常规纯化方法加以高纯度提纯。这些方法通常都是用于分离和纯化生物活性物质的，如破碎细胞、抽提细胞碎片、用硫酸铵盐析、凝胶过滤、离子交换层析、用聚乙二醇分级分离、亲合层析、用蔗糖和氯化铝的超速离心等，而高度纯化了的HBs抗原被用作本发明的冻干B型肝炎疫苗制剂。

从上述重组微生物获得的纯化HBs抗原，按下述方法冻干。将HBs抗原溶解于水中或接近中性的合适浓度的缓冲液中，如0.01M磷酸盐缓冲液、0.01M柠檬酸盐缓冲液，或0.005M    McIlvaine氏缓冲液，以使HBs抗原和其它添加物具有下述浓度：即含在蛋白质提浓物中HBs抗原不多于0.1W/V%，最好小于0.02W/V%。作为佐剂加进去的铝凝胶，其含量按重量计，为HBs抗原重量的3至10倍。

HBsAg吸附在铝凝胶上，是通过将含HBs抗原的溶液与铝凝胶混合而进行的，或者通过把适当含量的氯化铝溶液加入含HBs抗原的溶液1并向其中加入适当浓度的氢氧化钠水溶液，借以产生了氢氧化铝凝胶，同时HBs抗原被吸附于其上。如使用磷酸钠水溶液代替氢氧化钠水溶液时，则产生磷酸铝凝胶，而HBs抗原便吸附在此凝胶上。因此本发明所用的铝凝胶包括氢氧化铝凝胶和磷酸铝凝胶。

如此获得的吸附HBs抗原的铝凝胶悬浮液与稳定剂、一种任选的防腐剂以及等渗剂相混合，之后将混合物冻干。

稳定剂包括氨基酸和多糖类。氨基酸和多糖可以单独使用，但最好 是两者一起使用。胶体物质作为一种稳定剂，可任选一种加进去。

适用的氨基酸有甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸等或其盐（如谷氨酸单钠），它们可单独使用或两个或两个以上合并使用，通常的使用量为0.1-2.0W/V%。适用的糖类有单糖，如葡萄糖、木糖、半乳糖、果糖等，二糖如乳糖、麦芽糖、蔗糖等，以及糖醇如甘露醇、山梨醇、木糖醇等，它们可被单独使用，也可两个或两个以上合并使用。其用量一般为0.1-15W/V%。适用的胶体物质如明胶，人白蛋白、dextrane等，其用量通常为0.01-0.1W/V%。任选的防腐剂如乙基汞硫代水阳酸钠，其使用量为0.05-0.1W/V%。

当使用冻干疫苗时，为了使其能在生理上是等渗的，制剂最好和一种中性盐混合。中性盐包括氯化钠、氯化钾、氯化镁，最好的中性盐是氯化钠，它可以被用于上面提到过的其它中性盐的混合物中。通常所含中性盐的浓度为0.1-3W/V%，最好是0.5-2W/V%。

如此制备的疫苗溶液分装到一个剂量单位包装的容器内，以使每个容器含有的HBs抗原量为20到1000μg。分装到每一个容器的溶液通过常规快速冻干法或慢速冻干法冻干，而得到所要的冻干制剂。冻干通常是在下列条件下进行的：即将该溶液于低温下（如-40℃或更低，最好是-50℃或更低），在大气压下，予冻干几个小时（如3-10小时），然后在固定的较高温度（如0°-8℃），于减压条件下（如0.01毫米汞柱）一期冻干至几十小时，这阶段产品温度将低于-35℃（如大约-38℃），之后，产品要在固定的升高的温度（为25°-30℃）更为降低的压力下（如0.001-0.005毫米汞柱）二期冻干几小时到几十个小时（如6-10小时，最好是7-9小时）。

冻干制剂至少含有重组体源HBs抗原，铝凝胶，一种稳定剂和一种中性盐。

用上述方法制备的B型肝炎疫苗的冻干制剂具有良好的储藏稳定性，而不降低抗原效价，另外当使用时，能迅速溶解于注射溶液中。

当使用本发明的冻干制剂时，将制剂溶于注射用蒸馏水或注射用生理盐水，以便将HBs抗原蛋白质的浓度调整到5μg/ml到50μg/ml，并将盐的浓度调到接近等渗。生理上的等渗溶液是为皮下用药时使用的。疫苗的剂量对成人一次用药量通常按HBs抗原蛋白质计为5μg到50μg。

本发明的制剂，按《生物制品最低要求》（Minimum    Requirement    of    Biological    Products）（日本卫生和福利部（厚生省）1981年发布的第287号通告）中规定的，依普通实验方法用豚鼠作试验，未显现异常毒性。

本发明可用下述参考例加以说明，但这些例子不应看作是对上述方法的限制。

参考例1

来源于重组体酵母的纯化HBs抗原的制备

按照Miyanohara等人的方法（参见日本专利（申请）第一次公开31799/1984），制备并培养在组体酵母，以产生HBs抗原，依如下方法分离并纯化HBs抗原：

（1）、HBV    DNA的制备

（ⅰ）、病毒DNA的制备

将由10名HBsAg和HBeAg阳性者的（Subtype    adr）采集的正常血浆（700ml），以5，000r.p.m离心20分钟，以除去不溶物。将所得到的溶液于4℃，18.000r.p.m离心8小时，并将所得到的沉淀物重新溶解于10ml含10mM    Tris-Hcl，0.1M    Nacl和1mM    EDTA的缓冲液（PH7.5）中。将该溶液加到含30%蔗糖的离心管的顶 部，于4℃，39.000r.p.m离心4小时。所得到的沉淀再次溶解于如上述的同样的缓冲液中。

此缓冲液需在一反应混合物中，于37℃，旧HBV聚合酶处理30分钟。该混合物（500μl）含有67mM Tris-Hcl（PH7.5），80mM NH₄cl，25mM Mgcl₂，0.5%（W/V%，下同）NP40（ter-gitol，Sigma公司制造），0.1%2-巯基乙醇，330μM dcTP（三磷酸脱氧胺苷酯），dGTP（三磷酸脱氧鸟苷）和dATP（三磷酸脱氧腺苷），0.5μM α-〔³²P〕dTTP（三磷酸脱氧胸苷）。向反应混合物中加入终浓度为330μM的dTTP，并将该混合物置于37℃进一步反应3小时。然后再向反应混合物中加同样体积的100mM EDTA溶液。通过上述的DNA聚合反应，DNA单股区域都被修复为完好的双股，以得到〔³²P〕标记的材料。将该物加到离心管的顶部，管内予先顺次放入30%，20%和10%的蔗糖水溶液，于4℃，39，000r.p.m离心4.5小时。

为了水解与DNA结合得很紧的蛋白质，将上述获得的沉淀于1mg/ml的链霉蛋白酶E（Kaken化学公司制造）和0.2%十二烷基磺酸钠水溶液的混合物中（200μl）中，于37℃处理2小时。将所得到的混合物用苯酚（200μl）抽提两次，之后再用乙醚洗所得到的含DNA抽提物，以除去苯酚溶剂而得到HBV DNA溶液。由此得到的DNA具有的2.5×10⁶CPm/μg比放射活性，并能用于被限制性内切酶消化。

（ⅱ）、HBV    DNA的克隆化

通过使用入一噬菌体Sharon    16A    DNA作为载体，将上述方法获得的双股环状HBV    DNA克隆化，然后通过用已知的质粒pACYC177作为载体再次克隆化。具体方法如下：

（A）、在入-噬菌体Sharon    16A寄主-载体系统中先隆化：

在10mM Tris-Hcl（PH7.4），7mM Mgcl₂，100mM Nacl和7mM 2-巯基乙醇的混合物（20μl）中，于37℃用核酸内切酶XhoI处理HBV DNA（20ng）2小时。得到的混合物用苯酚（20μl）抽提，并再用乙醚抽提，再往水层加两倍体积的冷乙醇以沉淀DNA。将混合物于-70℃放置1小时，之后以10，000r.p.m离心5分钟，回收沉淀的DNA。将如此分离的沉淀物溶解于10mM Tris-Hcl（PH7.4）和1mM EDTA的混合物（5μl）中。按上述的同样方法经核酸内切酶XhoI裂解而得到HBV DNA和等摩尔量的λ-噬菌体Sharon 16A DNA（有一个Xho I的识别位点），与T₄DNA连接酶〔由50mM Tris-Hcl（PH7.4），10mM Mgcl₂，10mM二硫苏糖醇，100μg/ml牛血清白蛋白，0.5mM ATP和0.5μl酶制剂（T₄连接酶，Takara生物药品公司制造，1-5×10³单位/ml）〕组成的混合物（10μl）。T₄连接酶于4℃反应18小时。将反应混合物用苯酚之后用乙醚抽取，之后再用乙醇依上述方法进行沉淀。将该沉淀物溶解于10mM Tris-Hcl（PH7.4）和1mM DETA的混合物（10μl）中。

将退火的DNA按“Method in Engymolgy”，68，299-309所述的方法经体外包装操作而生成λ-噬菌体，并且用大肠杆菌DP50 SupF（参见Blattner，F.R.et al.，Scieucl，196，161，1977）作指示物在L-琼脂板（23Cm×23Cm）上进一步产生噬菌斑（10⁴）。这些噬菌斑用上述方法制备的³²P标记的HBV DNA作探针（参见SCience，196，180，1977）将这些噬菌斑作噬菌斑杂交，以便筛选由具有HBV DNA的噬菌体形成的噬菌斑。通过这一方法，得以分离出所要的噬菌体的集合物。

（B）、用质粒PACYC177作载体再克隆

从上述（A）中获得的具有HBV    DNA噬菌体，通过使用大肠杆菌DP50-SuPF作为感染的细菌，按上述“Methods    in    Enzymology”，68，245-378，1979的方法制备噬菌体DNA。这样获得的DNA用Xho    I在与上述相同条件下消化2小时，并将得到的反应混合物经使用0.75%琼脂糖凝胶的电泳分离，得到HBV    DNA（3.2Kb）。将此HBV    DNA吸附于DEAE（二乙氨乙基纤维素）纸上（日本Toyo    Roshi公司制造），以便与载体DNA分离，然后用1M    Nacl水溶液淋洗，而得到在两端上具有Xho    I末端的HBV    DNA。

另外，在卡那霉素-抗性基因内有一单个的Xho    I裂解位点的质粒PACYC177（参见Chang，A.C.Y.，Cohen，S.N.;J.Bacteriol.，134，1141-1156，1978）可用Xho    I对产物依上述同样方法用苯酚抽提，乙醚处理及乙醇沉淀。

这样得到的用Xho I裂解的PACYC177与在上述方法中得到的Xho I-末端HBV DNA以1∶5摩尔比例进行混合，并通过上述的T₄DNA连接酶催化的反应，反应18小时使之共价结合。

将反应混合物（10μl）加到由M.V.Norgard，Gene，3，279（1978）中所描述方法制备的0.1ml大肠杆菌X1776（参见R.III.Curtiss，et    al.，“Molecular    Cloning    of    recombinant    DNA”esd.W.A.Scott    and    R.Werner，page99，Academic    press（1877）〕中，将混合物混匀，并在0℃使其静置25分钟。将混合物移到含氨苄青霉素（20μg/ml），α-生物素（1μg/ml），二氨基庚二酸（100μg/ml）和胸腺嘧啶（20μg/ml）的L-琼脂板上，并于37℃培养过夜。生成的菌落移到含卡那霉素（20μg/ml）的琼脂板和含氨苄青霉素（20μg/ml）的琼脂板上， 筛选出只在含氨苄青霉素的琼脂板上生长的菌落。用Matsubara（J.Virol.，16，479，1975）所述的方法由筛选出来的菌落制备质粒。所获得的质粒，即pACYC177-HBV    DNA（定名为“pHBV”）的重组体DNA，用Xho    I在上述相同的条件下处理，而得到完整的HBV    DNA片段（3.2Kb）。

（2）、穿梭载体pAM82的制备

含有组构可抑制的酸性磷酸酶（RAP）的60，000道尔顿多肽（P60）基因的大约8.000核苷酸对EcoRI片段（RAP可从酵母S2882C基因库得到，参见Clarke，L.and    Carbon，J.Cell，9，91-99，1976）被插入已知的大肠杆菌质粒pBR322的EcoRI位点，从而得到一种用作起始材料的质粒。

为了除去RAP编码顺序，起始质粒被限制性内切酶Sal I消化并再次与T₄DNA连接酶共价结合。所得到的质粒pAT25，缺失Sal I位点到酸性磷酸酶基因片段5.2Kb〔所说的质粒pAT25是由一个有从EcoRI位点到pBR322的Sal I位点的片段的质粒。pBR322含有抗氨苄青霉素基因和一个从EcoRI位点到酵母酸性磷酸酶基因的Sal I位点的片段，在其中这两个片段各以其相对应的末端相联接〕。

在上述pAT25的EcoRI位点插入一个含arsl和Trpl基因的EcoRI片段（1.4Kb），Trpl基因是用EcoRI处理质粒YRP    7（参见Struhl，K.et    al.，proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，76，1035-1039，1979）而得到的。经上述插入后得到质粒pAT26。所说的arsl-Trpl片段在Trpl基因内，有一个限制酶Hind    III的单一识别位点。

在上述pAT26的Hind    III位点上插入一个含有Leu2和2μori的Hind    III片段，得到穿梭载体pAT77。2μ    ori是通过用 Hind    III处理质粒pSLE1（参见Tohe，A.et    al.，J.Bacteriol.，141，413-416，1980）而制得的。载于啤酒酵母（即Saccharomyces    Cerevisiae    AH    22/pAT77）已根据布达佩斯条约寄存于日本工业科学与技术厅所属发酵研究所，登记号为“FERMBP-324”。

如此用Sal I裂解获得的pAT77（1μg），在20mM Tris-Hcl（PH8.2），12mM Cacl₂，12mM Mgcl₂，0.2M Nacl和1mM EDTA的溶液（50μl）中，用核酸外切酶BAL 31（0.1单位）处理30秒至1分钟。该反应混合物按上述方法用苯酚抽提，乙醇沉淀。将所得到的沉淀与Xho I联结物（linker，1 Pmol）混合，并按上述条件与T4 DNA连接酶连接，反应进行12小时。采用R.III.Curtiss等人所述的方法“Molecular Cloning of recombinaut DNA”eds.W.A.Scott and R.Werner，Page99，Academic Press（1977）用上述反应混合物转化大肠杆菌。按K.Matsubara（J.Virol.，16，479，1975）所述的方法，所得到的转化菌中制备质粒DNAs。根据Maxam-Gilbert法（参见Maxam，A.&Gilbert，W.，Pro.Natl.Acad.Sci.，74，560-564），测定了所得DNA的核苷酸的顺序，进一步用BAL31切掉酸性磷酸酶基因区域。由这些DNA中，筛选并分离所要的质粒pAM82。

将载体pAM82中编码磷酸酶结构基因的产品P60的第一个氨基酸（蛋白酸）密码子ATG中的“A”定为“+1”，切掉直到till-33的区域。载于啤酒酵母（即Saccharomyces    Cerevisiae    AH    22/PAM82）的PAM82已根据布达佩斯条约寄存于日本工业科学与技术厅所属发酵研究所，登记号为“FERM    BP-313”。

（3）、HBsAg基因表达质粒的制备

用Xho I处理质粒pHBV获得的HBV DNA与Xho I裂解穿梭载体pAM82，在上述相同的条件下，以5∶1摩尔比例，通过T₄DNA连接酶进行重组。

用反应混合物转化大肠杆菌α1776，并从所得到的抗氨苄青霉素的转化菌里制备质粒DNA。用各种限制酶如Xho    I，Xba    I和Hind    III分析所制备的质粒DNA。借以测定插入到载体中的HBV    DNA及其插入方向。

如此获得的HBsAg基因表达质粒（定名为PAH203），在向磷酸酶启动子下游方向的顺序上，有HBs基因和HBc基因。

（4）、转化酵母的制备

起始酵母是啤酒酵母AH22〔a，Leu2，his4，Can1（Cir⁺）〕，已根据布达佩斯条约寄存于日本工业科学与技术厅所属发酵研究所，登记号为“FERM BP-312”。起始酵母接种于含2%多胨（Polypeptone），1%酵母提取物和2%葡萄糖的YPD培养基（100ml）上，并于30℃下培养过夜，之后，用离心法收集细胞。用灭菌水（20ml）洗收集的细胞，悬浮于1.2M山梨醇和100μg/ml酶解酶（Zymolyase）-60.000（日本Seikagaku Kogyo公司制造）的溶液（5ml）中，将悬浮液于30℃下静置30分钟而得到球状体。用1.2M山梨醇溶液洗涤球状体三次，然后悬浮于2M山梨醇、10mM Cacl₂和10mM Tris-Hcl（PH7.5）的溶液（0.6ml）中。将所制备的悬浮液以每份为60μl的体积分装小试管中。上述（3）制备的重组体质粒pAH203（30μl）溶液加到悬浮液中。混合均匀后，按10mM终浓度加进0.1M Cacl₂（3μl），再将混合物置于室温下静置5-10分钟。往所得到的混合物里加1ml的20%聚乙二醇4.000溶液，10 mM Cacl₂和10mM Tris-Hcl（PH7.5）各1ml，并将混合物置于室温静置20分钟。将得到的混合物（每份0.2ml）加到含22%山梨醇、2%葡萄糖、0.7%酵母氮基氨基酸、2%YPD、20μg/ml组氨酸和3%琼脂的培养基（10ml）中，将其置于45℃的恒温上。轻轻混合以后，在含有预先制备的1.2M山梨醇，并且还含有0.7%酵母氮碱氨基酸、2%葡萄糖、20μg/ml组氨酸和2%琼脂的最低限度培养板上加一层该混合物，并将其静置。培养板置于30℃下培养得到不需亮氨酸的酵母的菌落。菌落再置于添加亮氨酸（20μg/ml）BurkHolder最低限度培养基（minimal medium）上培养〔参见Tohe，A，et al.，J.Bachterol.，113，727-738，1973〕从而得到所要的转化酵母：啤酒酵母（Saccharomyces Cerevisiae）PAH 203。

（5）、用转化酵母生产HBsAg

上述（4）中所获得的转化酵母接种于添了组氨酸（20μg/ml）的BurkHolder最低限度培养基（10ml），并于30℃培养。所得培养物进一步接种到添加组氨酸（20μg/ml）BurkHolder最低限度培养基（10l）于30℃培育并加搅拌48小时。用离心法收集处于对数生长期的细胞，悬浮于不含磷酸盐（在BurkHolder最低限度培养基中，用Kcl替代KH₂Po4制得，继之补加20μg/ml组氨酸）的最低限度培养基中（10l），细胞浓度大约为4×10⁶细胞/ml。于30℃培养24小时后，培养基以4，000r.p.m离心10分钟，收集细胞（大约120g）。

（6）、HBs抗原纯化产品的制备

在重复使用上述（5）的方法制备的细胞中（约1Kg），加进0.1M磷酸盐缓冲液（PH7.2）（5l），并在600到700Kg/Cm²压力下 用Manton-Gaulin破碎机处理上述混合物以捣碎细胞。捣碎的细胞经离心除去粗大的碎细胞片，得到HBs抗原的粗提物。通过滴加10%的醋酸水溶液将粗提物的PH值调到5.2。混合物于4℃下搅拌30分钟后，用离心法除去沉淀物。

往所获得的上清液中加氨水以调节PH约为6.5，并缓慢向上清液加硫酸铵其终浓度为2.5M，但要保持上述PH值。使其静置30分钟后，混合物经离心取出含HBs抗原的沉淀物。将这样获得的沉淀物悬浮于0.1M磷酸盐缓冲液（PH7.2）约300ml中，混合物对上述所用的同样缓冲液渗析。

渗析后，混合物用0.1M磷酸盐缓冲液稀释3倍左右，然后使其通过氢氧磷灰石填充柱（凝胶含量：约1l），该柱预先已用上述同种缓冲液平衡，通过以上步骤HBs抗原就吸附在凝胶上。该柱用平衡时所用的缓冲液仔细洗涤，然后再用0.2M磷酸钾缓冲液（PH7.2，约3l）通过柱，以除去沾污物。此后，用0.5M磷酸钾缓冲液（PH7.2，约3l）通过柱，以洗脱HBs抗原。对0.1M磷酸钾缓冲液渗析后，含HBs抗原的部份再次通过事先已用上述同种缓冲液平衡过的氢氧磷灰石柱（凝胶含量：约500ml），通过上述步骤HBs抗原就被吸附在凝胶上。再用有一浓度梯度为0.2→0.5M的磷酸钾缓冲液（约2l）通过柱以收集含HBs抗原的部份。

这样获得的含HBs抗原的部份（约1000ml），对0.01M磷酸盐缓冲液渗析，然后用中空纤维超滤器（Minimodule，日本Asahi化学工业公司制造）浓缩至100ml。

一种50%蔗糖溶液，一种20%蔗糖溶液和所获得的含HBs抗原部份以三层加入Hitachi    Rp-42超速离心机的离心管中，于4℃，以27，000r.p.m离心16小时，通过这一步骤HBs抗原被浓缩在 蔗糖溶液介面周围。

这样纯化的含HBs抗原的部份，对加入了0.14M    Nacl的0.01M磷酸盐缓冲液渗析，并向其中加浓度为1.2g/ml的氯化铯。用Hitachi    RP-42超速离心机以25.000r.p.m，于10℃将混合物离心60小时，得到纯化的HBs抗原。这样经纯化的含HBs抗原的部份对加入了0.14M    Nacl的0.01M磷酸盐缓冲液渗析，之后用Minimodule（日本Asahi公司制造）中空纤维超滤器浓缩。所得物对加入了0.14M    Nacl的0.01M磷酸盐缓冲液渗析，然后经过滤除菌以得到HBs抗原的纯品（HBs抗原蛋白质含量：106μg/ml;12ml）。

根据SDS-聚丙烯晴凝胶电泳，上述获得的HBs抗原的纯品显现亚基蛋白质（分子量：约25，000）单一带。此外，使用抗重组源HBs抗原-豚鼠抗体和一种抗人源HBs抗原豚鼠抗体的免疫扩散法，与人源HBs抗原的标准品比较，两种HBs抗原纯品表现了同样的抗原性。

参考例2

来源于重组的哺乳动物细胞的纯化HBs抗原的制备

根据Nozaki等人的方法（参见日本专利（申请）第一次公开36689/1984），制备并培养重组哺乳动物细胞，以产生HBs抗原，HBs抗原的分离和纯化如下：

（1）HBV    DNA    BamRI片段的制备

上述参考例1中制备的质粒PHBV，（1）采用一般方法用BamHI处理，所得到的反应混合物再用0.75%琼脂糖凝胶进行电泳，以得到HBV    DNA的BamHI片段。

（2）载体（PXRIIG    BamHI片段）的制备

将穿梭载体pXRIIG（得自美国Harvard大学）（1μg）加入含有10mM Tris-Hcl（PH8.0），7mM Mgcl₂，100mM Nacl和2mM α-巯基乙醇的混合物（20μl），并往里加1个单位的BamHI（一个单位：每1小时能完全消化1μg λ DNA的酶活性），将该混合物置于30℃下反应1小时。反应混合物用苯酚抽提，水层用乙醚抽提，然后用乙醇沉淀。将沉淀物溶解于水中，该溶液用于制备重组体DNA。

（3）、HBV    DNA    pXRIIG重组体DNA的制备

含有HBV    DNA    BamHI片段（150ng）和pXRIIG    BamHI片段（50ng）的溶液（50μl）于16℃与T4    DNA连接酶反应4小时。

用上述同种方法获得的反应混合物转化大肠杆菌α1776。再按上述（1）（B）所述的方法将所得到的转化菌在L-琼脂培养基上培养12小时后，筛选出在琼脂培养基上生长的菌落。再把筛选出来的菌落分别加到含四环素（TC）（10μg/ml）琼脂培养基和含氯苄青霉素（Ap）（40μg/ml）的琼脂培养基上，将在含TC的琼脂培养基中不能生长而在含AP的琼脂培养基上能生长的菌落筛选出来。每一种菌落都在上面已提及过的大肠杆菌α1776的培养液中培养，并用上述同种方法提取质粒。借助使用各种限制酶（如BamHI、XhoI、HindIII、SalI）的裂解图分析，筛选出含HBV    DNA的三个BamHI片段和pXR-IIG（所述重组体DNA定名为pSHB3）的一个片段的重组DNA。

（4）、小鼠LTK^-细胞的转化

制备下列液体A和液体B：

液体A：含有50mM Hepes（即N-2-羟乙基

嗪-N-2-乙基磺酸），280mM Nacl，和15mM Na₂HPO4·12H₂O的溶液（1.25ml，PH7.1）。

液体B：含有pSHB3（50μg），PTK（2.5μg）（参见Colbere-Garapin，F.，Proc.Natl.Acad.Scic.USA，76，3755，1979），鲑鱼精子DNA（带基因DNA，Carrier DNA）（50μg）和2M Cacl₂（0.15ml）的DNA溶液（1.1ml）混合物。

搅伴下将液体B滴加到液体A中，混合物于室温下放置30分钟。用滴管吸取足够量后，将混合液（0.5ml）逐滴加入盛有单层小鼠LTK^-细胞的烧瓶内（约10⁵细胞/烧瓶）。为了使混合物吸附在细胞上，室温下将烧瓶放置30分钟，并往其中加入Dulbecco改良的Eagle培养基（下文称“DMEM”，5ml），该培养基含有10%小牛血清（参见Dulbecco，R & Freeman，G.;Virology.8，396，1959），并将该混合物置在5%Co₂环境下，于37℃，培养约5小时。换新的DMEM后，将混合物进一步培养24小时。然后，培养基换成含次黄嘌呤（15μg/ml）、氨基蝶呤（1μg/ml）和胸腺嘧啶核苷（5μg/ml）的培养基（下文称“HAT”培养基）〔参见Littlefield;J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，72，3961-3965，（1963）〕。培养持续期间，每2天到3天换一次新的HAT培养基。4个星期以后，收集TK⁺细胞菌落，从而获得所要的转化细胞。

（5）、用转化的哺乳动物细胞生产HBs抗原

将上述（4）中所制备的转化小鼠L细胞接种到含10%小牛血清，青霉素（250单位/ml）和链霉素（0.2μg/ml）的DMEM培养基，将该混合物在37℃下培养1周。培养肉汤的上清液中含有浓度大约为400ng/ml的HBs抗原。

（6）、纯化用转化的哺乳动物细胞生产的HBs抗原

按上述（5）重复培养，获得培养物上清液（10l），用中空纤维超滤器（Minimodule，日本ASahi化学工业公司制造）将其浓缩至1000ml。在通过加入氨水保持溶液PH值为6.5时，缓慢加入硫酸铵，使终浓度为2.5M。静置30分钟后，用离心法把HBs抗原的沉淀物分离出来。将所得到的沉淀物溶于加入了0.14M    Nacl的0.01M磷酸盐缓冲溶液（PH7.2）（100ml）中，此混合物对上述所用的相同的缓冲液渗析。

渗析后，将该混合物通过琼脂糖（Sepharose    CL    6    B）（由瑞典pharmacia公司制造）（凝胶含量：2l）柱作凝胶过滤层析。收集并储集含HBs抗原的部份（通过紫外吸收监测仪分析测定，从洗脱开始相当于外水体积的第一个峰部分）。将集中的部分对0.1M磷酸钾缓冲液（PH7.2）渗析，然后通过预先已用上述相同的缓冲液平衡的氢氧磷灰石（凝胶含量大约为250ml）柱，HBs抗原就吸附在凝胶上。用平衡所用同样缓冲液冲洗柱以除去沾污物，之后用0.5M磷酸钾缓冲液以洗脱HBs抗原。含HBs抗原部份（约250ml）对0.01M磷酸盐缓冲液（PH6.2）渗析，再用中空纤维超滤器浓缩至50ml。

将50%蔗糖溶液，20%蔗糖溶液和上述制备的含HBs抗原的部份分别加入Hitachi    RP-42型超速离心机的离心管，形成三个层，于4℃，以27，000r.p.m超速离心16小时，借此HBs抗原就被集中于两蔗糖溶液层的界面。

经纯化的含HBs抗原的部份，在以加入了0.14M    Nacl的0.01M磷酸盐缓冲液中渗析，然后用Minimodule（日本Asahi化学工业公司制造）浓缩。用过滤法除菌，而得到一种纯化的HBs抗原产物（HBs抗原蛋白质含量：98μg/ml;14ml）。

例1

将氢氧化铝凝胶加入按参考例1方法生产的重组体源HBs抗原纯化产物的溶液中，凝胶加入量按重量（按氢氧化铝重量计算）为HBs抗原蛋白质的8倍。混合物经离心除去上清液，从而得到吸附了HBs抗原的氢氧化铝凝胶。

然而，当重复使用上述方法时，用磷酸铝代替氢氧化铝，可得到吸附了HBs抗原的磷酸铝凝胶。

向每份由上述获得的吸附HBs抗原铝凝胶中，如表1所列的溶于加入了0.14M    Nacl的0.01M磷酸盐缓冲液（PH6.0）的各种稳定剂，即得到疫苗溶液（HBs抗原蛋白质浓度：40μg/ml）。

每份1ml的这种溶液装入2ml的小瓶里，并于-50℃，常压下予冻干6小时。继之在减压到0.04毫米汞柱的压力后，于5℃一期冻干15小时，之后在0.04毫米汞柱、30℃下经二期冻干8小时。从而就得到所要的冻干制剂。

向冻干的产物流水号1-11中分别加入生理盐溶液（各2ml），并加入柠檬酸钠以完全溶解铝凝胶。通过使用AUSRIA    II（日本Dainabbott放射性同位素实验室制造）的放射免疫分析法，测定溶液中的HBs抗原，然后将得到的数据与参考值（冻干前的产物）比较。相对抗原性如表2所示。

表2

流水号 相对抗原性^＊

1    0.16

2    0.66

3    0.82

4    1.05

5    0.98

6    0.96

7    1.04

8    0.96

9    1.02

10    0.94

11    0.99

^＊）冻干产品的抗原性对未冻干产品抗原性的相对值（后者值以1计）。

例2

在按参考例1所述方法制备的重组体源HBs抗原的纯品溶液中（HBs抗原蛋白质浓度：96μg/ml），加入氯化铝（60mg）水溶液（5ml）。用1N的NaoH调节溶液的PH到6.1。混合物经离心除去上清液，而得到吸附了HBs抗原的铝凝胶。将所得到的凝胶与含乳糖（10W/V%），l-谷氨酸单钠（0.4W/V%）、精氨酸（0.4W/V%）、明胶（0.08W/V%）和乙基汞硫代水阳酸钠（0.005W/V%），加入了0.14M    Nacl的0.01M磷酸盐缓冲液（PH6.2， 72ml）混合。

将所得的疫苗溶液以每份0.5ml分装到2ml小瓶中，然后按例1所述的方法进行冻干处理。

上述例2中所获得的冻干疫苗制剂与起始储备品比较，检定其在小鼠体内表现的免疫源性。也就是将冻干疫苗制剂溶于蒸馏水，豚鼠背部皮下注射，接种量分别是0.5μg，1μg和2μg    HBsAg。5周后，从动物体内采血，用放射免疫测定法（使用检测抗HBs抗体的药盒AUSAB，日本Dainabbott公司制造）测其抗HBs抗体。作为参照，同样测定了用起始储备品接种的抗体效价。结果列于表3。

表3

相对效价^＊95%置信限

参照    1.00

冻干疫苗    3.78    2.15-14.21

^＊对应每种冻干疫苗注射量的平均抗体值与起始储备品平均

抗体值相比的平均相对值（后者值以1计）。

冻干疫苗也进行了如下储藏稳定性实验。

将冻干疫苗在恒定温度下保持一固定时间后，向疫苗样品中加入柠檬酸钠，以溶解铝凝胶，然后用放射免疫测定法测其抗原性。冻干产物的相对值计算是以与HBs抗原的标准样品相比计算的（即通过把人蛋白加到人源HBs抗原的纯制品内，分装到各小瓶里，将其保持在-80℃冻干状态，当测定时，液化样品作为参考）（参考抗体值以1计）。每一种样品的相对值列于表4（此处所列冻干样品值以1计）。

本发明的冻干产品甚至于37℃保存25周仍是稳定的，而且该产品 和液体疫苗有很大的差别（参见下文对比例1中所公开部分）。

此外，对37℃保存25周的样品进行了异常毒性检验，结果未观察到任何异常毒性。

表4

保存的温度    抗原性的变化

保存周数

1    4    10    15    25

37℃    1.06    0.92    0.98    1.12    1.06

室温M    0.96    0.96    1.04    1.01    1.04

4℃    1.00    0.98    1.10    1.02    0.96

对比例1

将含氢氧化铝凝胶的悬浮液（2.9ml）加到例2所用的重组体源HBs抗原纯品的溶液（HBs抗原蛋白质浓度：96μg/ml）（50ml）中。该混合物经离心除去上清液，而得到一种吸附了HBs抗原的铝凝胶。铝凝胶和含乙基汞硫代水杨酸钠（50μg/ml）的加入了0.14M    Nacl的0.01M磷酸盐缓冲液（PH6.0）（60ml）混合，而得出疫苗溶液。该疫苗溶液（每份1ml）被分装到2ml小瓶，得到液体疫苗制剂。

该疫苗制剂按例2的方法进行储藏稳定性试验。结果列于表5。

此外，将例2中制备的疫苗制剂，未经冻干（即静置）作储藏稳定性试验。结果列于表6。

表5

保存温度 抗原性的变化^1）

保存周数

1    5    10    15    25

37℃    0.71    0.20    0.18    0.03    0.00

4℃    1.02    1.09    0.98    1.02    1/02

1）用例2的方法测定。

表6

保存温度 抗原性的变化^1）

保存周数

1    5    10    15    25

37℃    0.67    0.23    0.19    0.13    0.00

1）用例2的方法测定。

例3

按参考例2中所述同样方法制备的重组体源HBs抗原（HBs抗原蛋白质浓度：105μg/ml）纯化产物的溶液（80ml）内，加入氢氧化铝（50mg）水溶液（5ml）。该混合物经离心除去上清液而得到吸附了HBs抗原的铝凝胶。如此得到的铝凝胶和含乳糖（10W/V%）、甘氨酸（1W/V%）、明酸（0.05W/V%）、乙基汞硫代水杨杨酸钠（0.005W/V%）以及加入了0.14M    Nacl的0.01M磷酸盐缓冲液液（PH6.0，105ml）混合。

把所获得疫苗溶液以每份1ml分装入2ml小瓶，按例1的方法进行冻干处理。

冻干产品按例2的方法进行储藏稳定性试验。结果列于表7。

表7

保存温度 抗原性的变化^1）

保存周数

1    5    10    15    25

37℃    1.01    0.97    1.06    0.99    0.98

室温    1.04    0.95    1.05    1.00    0.98

4℃    1.04    0.92    1.11    0.97    1.01

1）用例2的方法测定

于37℃保存25周的样品，按上述方法进行异常毒性试验，但未观察到任何异常毒性。

Claims (2)

1、一种制备冻干的B型肝炎疫苗的方法，这种方法的特征包括将铝凝胶和稳定剂加到纯化了的、由可以产生HBs抗原的重组微生物体产生的B型肝炎病毒表面抗原的水溶液中，使其中的B型肝炎病毒表面抗原吸附于铝凝胶上，将这种混合物分成最小使用单位，并冻干每一使用单位的混合物，其中铝凝胶是由包括氢氧化铝凝胶和磷酸铝凝胶的一组铝凝胶中选出的一种铝凝胶，其中稳定剂是由至少一种氨基酸或它的盐，至少一种糖化合物和至少一种胶体物质组合而成的。

2、根据权利要求1的方法，其中的氨基酸或它的盐是由包括甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸一钠、精氨酸和赖氨酸的一组氨基酸中选出的一种氨基酸;糖化合物是由包括葡萄糖、木糖、半乳糖、果糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇和木糖醇的一组糖化合物中选出的一种糖;而胶体物质是由包括白明胶、人体白蛋白和葡聚糖的一组胶体物质中选出的胶体物质。