CN100586482C - 二氧化硅微粒为载体的淋巴染料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了二氧化硅微粒为载体的淋巴染料的制备方法，属于微纳米技术与临床医学基础的交叉领域。本发明将标记淋巴结的染料通过吸附、包埋等方法连接到二氧化硅微粒表面、孔隙或内部空腔中，形成可用于标记识别前哨淋巴结二氧化硅微粒。本发明具有实质性特点和显著进步，本发明可通过二氧化硅的空间体积的位阻效应将染料截留在前哨淋巴结或减慢流过前哨淋巴结的速度，此外，还可借助纳米二氧化硅所具有的淋巴靶向性的特点使染料定向释放或定向缓释到淋巴结。本发明所提供的二氧化硅微粒为载体的淋巴染料，可提高定位前哨淋巴结的方便性和准确性，在肿瘤普外科领域具有重要的科学研究价值和广阔的应用前景。

Description

二氧化硅微粒为载体的淋巴染料及其制备方法

技术领域

本发明涉及的是一种以二氧化硅微粒为载体的染料及其制备方法，尤其涉及的是一种将能标记淋巴结的蓝染料包埋到二氧化硅微粒中或者连接到二氧化硅微粒表面或者连接到二氧化硅微粒孔隙中的方法，属于微纳米技术与临床医学基础的交叉领域。

背景技术

淋巴结转移是恶性肿瘤患者死亡的主要原因。尽早发现淋巴结是否有转移，对肿瘤的临床分期以及据此对肿瘤进行相应的治疗具有重要的临床意义。

注射活性染料是术中示踪淋巴结的常用方法，所采用的活性染料主要是异硫蓝(isosulfan blue)、美蓝(methythionium)、专利蓝(patent blue)、伊文思蓝(evans blue)，靛卡红(indigocarmine)等，这些染料可显示淋巴的大致轮廓。一般在注射染料后几分钟内就可发现淋巴管和淋巴结被染蓝，术者须在较短的时间内准确分辨出原发肿瘤局部淋巴结循环的输入淋巴管，作一皮肤切口，沿蓝染的淋巴管寻找最先到达的淋巴结，即前哨淋巴结。这种方法对前哨淋巴结识别的成功率为66～98％。注射蓝染料的方法标记淋巴的速度很快，是一种目前较好的方法。此外，还有采用放射性核素对前哨淋巴结进行活检，以及将蓝染料与放射性核素联合使用来示踪前哨淋巴结。如Jose M等人[Jose M，et al.Intraoperative sentinel node identification in early stage cervicalcancer using a combination of radiolabeled albumin injection andisosulfan blue dye injection.Gynecologic Oncology，2004，92：845-850]采用放射性物质标记的人血清白蛋白与异硫蓝(isosulfan)联合使用来辨认早期宫颈癌的前哨淋巴结，结果在23位病人中，总共有51枚前哨淋巴结被检测到。众多研究表明，将蓝染料与放射性核素联合使用可明显提高定位前哨淋巴结的准确性。

然而，这种方法存在较大缺陷，如染料分子因为分子太小而使其在几分钟内便从前哨淋巴结流入下一组淋巴结，术者一般要在术中每隔15～20分钟要重新注射一次染料，否则染料将被淋巴通道快速转运而使前哨淋巴结颜色变淡，给寻找前哨淋巴结带来困难。对于乳腺癌来说，染料很难显示胸廓内、锁骨上及锁骨下的淋巴结，除非扩展手术切口。此外，de Decicco等人对250例乳腺癌患者进行前哨淋巴结活检时发现，太小的染色剂因过多地进入淋巴结而出现假阳性，认为较大的颗粒对前哨淋巴结进行活检的准确性增大。使用放射性核素，无论对患者还是医生都是有一定程度的危害的。

二氧化硅微粒尤其是纳米级二氧化硅具有分散性好、比表面积大、吸附能力强等优点，可用来作为药物的载体。如Natsugoe等将药物BLM吸附到硅微粒子上，对食道癌患者瘤周黏膜下注射，结果表明，吸附药物的硅微粒具有淋巴靶向给药和缓释的功能。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的之一在于提供一种提高定位前哨淋巴结的方便性和准确性的以二氧化硅微粒为载体的淋巴染料；

本发明的另一目的在于提供这种染料的制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种二氧化硅微粒为载体的淋巴染料，在淋巴染料分子与二氧化硅微粒的连接体系中，染料分子质量浓度为0.01～5wt％，二氧化硅微粒质量浓度为92～95wt％，余量为微球的胶联剂和修饰剂。

所述的标记淋巴结的染料是指可在临床上使用的染料，包括异硫蓝(isosulfan blue)，美蓝(methythionium)，专利蓝(patent blue)，伊文思蓝(evans blue)，靛卡红(indigocarmine)等中的任意一种及任意几种的组合。

所述的二氧化硅微粒是指二氧化硅的纳米粒子和微米粒子，二氧化硅纳米粒子是指粒度在3～1000nm粒子，二氧化硅微米粒子是指粒度在1～10μm的粒子，为球形，椭球形，或其他不规则形状，二氧化硅粒子中含有孔隙或不含有孔隙。

所述胶联剂为表面活性剂、高分子、及小分子中的一种或一种以上的混合物。

所述修饰剂为分子中含有羧基、氨基、羟基、磺酸基、腈基中的一种或一种以上极性基团的高分子或小分子或者硅烷偶连剂中的一种，二氧化硅表面修饰度为0～99％。

将临床上可用来标记淋巴结的染料连接到二氧化硅微粒上。所述的染料分子与二氧化硅微粒的连接，是通过物理包埋、吸附任意一种方法或两种方法同时并用。所述的物理包埋和吸附，是将染料分子溶解到二氧化硅微粒的水相溶液或有机溶液或水相与有机溶剂的混合液中，染料分子扩散进入二氧化硅微粒的空腔、孔隙以及表面。

所述的二氧化硅纳米粒子，是通过化学气相沉积法、离子交换法、化学沉淀法、溶胶-凝胶法、微乳液法、胶束法中的任意一种或几种的组合方法获得的。染料分子是在二氧化硅纳米粒子合成前加入的，或者在合成结束后加入的，通过洗涤分离除去未结合的染料。

本发明可将染料分子水溶液包埋到油包水型(W/O)的微乳中，然后在该微乳中通过正硅酸乙酯的水解或硅酸钠与酸反应合成二氧化硅，从而将染料分子包埋到二氧化硅粒子中。

本发明中，可先按常规方法获得纳米级二氧化硅，用有机溶剂和/或水洗涤后，分散于含胶联剂的水溶液中，通过喷雾干燥方法获得二氧化硅微球，然后在水相或有机相中将染料分子连接到二氧化硅微球上。或者在获得纳米级二氧化硅后，用有机溶剂和/或水洗涤后，分散于含染料分子和胶联剂的水溶液中，然后一起喷雾干燥的。所述的喷雾干燥，液滴的喷雾是通过气流式雾化器、压力式雾化器、旋转式雾化器、超声波雾化器中的任意一种进行的。喷雾干燥的进风温度为30～250℃，载气为惰性气体或空气。通过控制喷雾干燥条件，获得小于10μm的粒子。所述的胶联剂是指表面活性剂、高分子、及小分子中的任意一类中的任意一种或任意几种的任意组合。所获得的二氧化硅微球可进行常压干燥、真空干燥、冷冻干燥中的任意一种方式进一步干燥，干燥的时间为0～3天。干燥产物放置于硅胶干燥器或空气中保存。

此外，本发明还将在静电力和高分子辅助下自组装而成空心球形二氧化硅。即以纳米级胶体粒子为模板，将纳米二氧化硅和聚电解质通过静电作用逐层交替吸附到模板表面。然后通过高温煅烧或溶剂溶解的方法将模板溶解除去，形成微米级或纳米级的二氧化硅空心粒子，通过控制吸附的纳米二氧化硅和聚电解质的层数以获得不同壳层厚度的二氧化硅空心粒子。所述的纳米级胶体粒子模板，是指高分子纳米粒子或无机纳米粒子模板，模板材料为人血清白蛋白，牛血清白蛋白，小牛酪蛋白，鸡蛋白，玉米蛋白，淀粉，明胶，阿拉伯胶，海藻酸盐，壳聚糖，甲基纤维素，乙基纤维素，羧甲基纤维素，羧丙甲纤维素，邻苯二甲酸醋酸纤维素，丁醋酸纤维素，琥珀酸醋酸纤维素，聚氨基酸，聚碳酯，聚甲基丙烯酸甲酯，聚甲基丙烯酸乙酯，聚丙烯酸树脂，聚乳酸，聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物，聚合酸酐，乙交酯丙交酯共聚物，ε-己内酯丙交酯嵌段共聚物，羧甲基葡聚糖，聚苯乙烯中的任意一种以及半导体化合物中的任意一种。

所述的模板，其尺度为20～1000nm。

染料分子是在二氧化硅空心粒子形成之前加入的，或者在二氧化硅空心粒子形成之后加入的，或者在二氧化硅空心粒子形成过程中加入的。染料存在于二氧化硅空心粒子的空腔中、二氧化硅壳层之中和组成二氧化硅空心粒子的每一个二氧化硅纳米粒子表面或孔隙之中的任何一个地方。

本发明中，二氧化硅微粒表面含有修饰剂，这些修饰剂是指分子中含有羧基、氨基、羟基、磺酸基、腈基中的一种或几种极性基团的高分子或小分子，或者是指硅烷偶连剂，二氧化硅表面修饰度为0～99％。

本发明所述的二氧化硅微粒为载体的淋巴染料，是以水溶液状态存在的，或是以粉末状态存在的。染料分子连接到二氧化硅微粒上之后，进行灭菌，灭菌方式为加热灭菌或热压灭菌或滤过除菌或紫外灯辐照或其他无菌操作中的一种。

本发明将标记淋巴结的染料通过包埋、吸附等方法连接到3nm～10μm的二氧化硅微粒表面、孔隙或内部空腔中，形成连接蓝染料的二氧化硅微粒。这种微粒可通过其空间体积的位阻将染料截留在前哨淋巴结或减慢流过前哨淋巴结的速度，此外，还可借助纳米二氧化硅所具有的淋巴靶向性的特点使染料定向释放或定向缓释到淋巴结。二氧化硅微粒的空间体积的位阻、多孔的缓释效应以及淋巴靶向性的特点，使连接在二氧化硅微粒上的染料比单纯的染料在标记识别前哨淋巴结时具有更大的优越性，在肿瘤普外科领域具有广泛的应用。

具体实施方式

下面结合具体的实施例进一步说明本发明是如何实现的：

实施例1

将6mL环己烷、1.5mL Triton X-100、1.5mL正己醇和2.5mL的水溶液混合，得到透明澄清的微乳。向该微乳中滴加正硅酸乙酯的乙醇溶液，并用氨水调节pH至9左右，室温下搅拌反应。通过离心分离产物，用乙醇和去离子水反复交替洗涤离子所得的沉淀，然后将沉淀分散于去离子水中。

TEM观察表明，所得产物主要为规则的接近单分散的球形二氧化硅粒子，粒度为70nm左右。但也有部分颗粒发生了团聚。

将洗涤后的沉淀再分散于水相中，向其中加入异硫蓝溶液，超声波分散10min，再静置30min左右后，离心，弃去上清，结果得到蓝色沉淀。通过控制混合体系中二氧化硅和异硫蓝的量，可得异硫蓝约占5wt％、二氧化硅约占95wt％的产物。

实施例2

将6mL环己烷、1.5mL Triton X-100、1.5mL正己醇和2.5mL的异硫蓝水溶液混合，得到透明澄清的异硫蓝微乳。向异硫蓝微乳中滴加正硅酸乙酯的乙醇溶液，并用氨水调节pH至9左右，室温下搅拌过夜。通过离心分离产物，用乙醇和去离子水反复交替洗涤离子所得的沉淀，然后将沉淀分散于去离子水中，并于100℃蒸汽灭菌30min。

结果得到包埋异硫蓝的蓝色溶胶，TEM观察表明，所得产物主要为规则的接近单分散的球形粒子，粒度为70nm左右，少部分团聚体粒度达到了亚微米。

实施例3

在实施例2的异硫蓝微乳体系中，水相中含有聚乙二醇，然后按实施例2相同的方法合成二氧化硅，获得的二氧化硅分散于生理盐水中，并于100℃蒸汽灭菌30min。

结果亦得到包埋异硫蓝的蓝色溶胶。TEM观察下，大部分粒子为50～70nm的球形粒子，具有很好的分散性。

实施例4

按实施例2制备不含蓝染料的二氧化硅纳米粒子溶胶，通过下面5种方法进行喷雾干燥：

(1)将获得的二氧化硅纳米粒子分散于含异硫蓝去离子水中，然后在进风温度为110℃，出风温度为75±2℃，雾化盘转速度为20000r·min^-1，进料速度为1ml·min^-1的条件下喷雾干燥。喷雾干燥过程中，对喷雾的前驱体混合液进行搅拌。

将粉末粒子分散于含1mg·ml^-1的聚二甲基二烯丙基氯化胺(PDADMAC)和0.5mol·l^-1的NaCl的混合溶液中，振荡，使PDADMAC吸附在二氧化硅微球表面。

结果获得蓝色的产物，显微镜下观察发现，粒子为1～3μm，具有较好的分散性。

(2)将获得的二氧化硅纳米粒子分散于含异硫蓝和0.2wt％牛血清白蛋白(BSA)的去离子水中，然后在进风温度为110℃，出风温度为75±2℃，雾化盘转速度为20000r·min^-1，进料速度为1ml·min^-1的条件下喷雾干燥。喷雾干燥过程中，对喷雾的前驱体混合液进行搅拌。将获得的干燥粉末置于120℃烘箱中加热2h，使BSA变性。产物置于硅胶干燥器中保存。

结果得到不溶于水的蓝色粉末粒子，粒子粒度亦为1～3μm。对微球的水溶液进行超声波处理，微球仍能较好地保持原有的形貌。

(3)将获得的二氧化硅纳米粒子分散于含0.2wt％BSA的去离子水中，然后在进风温度为110℃，出风温度为75±2℃，雾化盘转速度为20000r·min^-1，进料速度为1ml·min^-1的条件下喷雾干燥。喷雾干燥过程中，对喷雾的前驱体混合液进行搅拌。将获得的干燥粉末置于120℃烘箱中加热2h，使BSA变性。

将粉末粒子分散于含异硫蓝的溶液中，60℃水浴中处理30min，然后冷却至室温。通过离心和洗涤，除去游离的蓝染料。

结果获得蓝色的沉淀，粒子为2～5μm。

(4)将获得的二氧化硅纳米粒子分散于含0.2wt％BSA的去离子水中，然后在进风温度为70℃，出风温度为50±2℃，雾化盘转速度为20000r·min^-1，进料速度为1ml·min^-1的条件下喷雾干燥。喷雾干燥过程中，对喷雾的前驱体混合液进行搅拌。将获得的干燥粉末置于120℃烘箱中加热2h，使BSA变性。

将粉末粒子分散于含异硫蓝的溶液中，60℃水浴中处理30min，然后冷却至室温。通过离心和洗涤，除去游离的蓝染料。结果获得蓝色的沉淀，所有粒子均为规则的球形，粒子为2～5μm。

(5)将获得的二氧化硅纳米粒子分散于含0.5wt％BSA的去离子水中，然后在进风温度为250℃，雾化盘转速度为20000r·min^-1，通过控制进料速度使出风温度稳定在220±2℃，喷雾干燥过程中，对喷雾的前驱体混合液进行搅拌。将获得的干燥粉末置于120℃烘箱中加热2h，使BSA进一步变性。

将粉末粒子分散于含异硫蓝的溶液中，60℃水浴中处理30min，然后冷却至室温。通过离心和洗涤，除去游离的蓝染料。

结果得到的粒度为2～10μm蓝色粒子

本实施例的5种方法中，通过加入的异硫蓝、二氧化硅、PDADMAC、BSA的比例，可方便地获得异硫蓝质量浓度为0.01～5wt％，二氧化硅微粒质量浓度为92～95wt％的二氧化硅微球。异硫蓝主要是通过吸附的方法结合到二氧化硅的表面及其孔隙中的。

实施例5

按实施例2制备不含蓝染料的50nm左右的纳米二氧化硅粒子。并用乙醇和去离子水反复洗涤沉淀，将沉淀配制适当浓度的去离子水溶液。

将经过蒸馏的30mL苯乙烯单体、适量K₂S₂O₃和0.8g聚乙烯醇加入到500mL去离子水中，在氮气保护和75℃下高速搅拌回流反应3h.用甲醇分离产物，并用去离子水和甲醇反复洗涤分离出的沉淀，结果得到粒度主要分布在200～500nm的球形聚苯乙烯粒子。

将聚苯乙烯加入到50mL浓度为1mg·mL^-1的PDADMAC和0.5mol·l^-1的NaCl的混合溶液中，超声波分散，使聚苯乙烯与PDADMAC吸附约30min。用去离子水洗涤产物2次，然后加入到二氧化硅溶液中，搅拌吸附30min，用去离子水洗涤产物2次，再将沉淀分散到50mL浓度为1mg·mL^-1的PDADMAC水溶液中吸附30min，用去离子水洗涤后，然后将沉淀分散到二氧化硅溶液中吸附30min。如此依次交替吸附PDADMAC和二氧化硅，得到吸附4层PDADMAC和二氧化硅的聚苯乙烯微球。将这种聚苯乙烯微球于500℃煅烧1h，将聚苯乙烯除去，即得到空心的二氧化硅微球。

TEM观察表明，获得的二氧化硅空心粒子为400～2μm。

取获得的空心球形二氧化硅适量，浸泡在含美蓝的溶液中，磁力搅拌2h，离心后弃去上清，沉淀进行冷冻干燥24h，结果得到蓝色的二氧化硅粉末，蓝染料主要存在于二氧化硅空心粒子的空腔中。

Claims (6)

1、一种二氧化硅微粒为载体的淋巴染料，其特征在于：淋巴染料分子与二氧化硅微粒的连接体系中，染料分子质量浓度为0.01～5wt％，二氧化硅微粒质量浓度为92～95wt％，余量为微球的胶联剂和修饰剂，所述的二氧化硅微粒为载体的淋巴染料为水溶液状或粉末状中的一种，其中，所述的淋巴染料为异硫蓝、美蓝、专利蓝、伊文思蓝或靛卡红中的一种或一种以上的混合物。

2、根据权利要求1所述的一种二氧化硅微粒为载体的淋巴染料，其特征在于：所述二氧化硅微粒为粒度在1～10μm的微米粒子和粒度在3～1000nm的纳米粒子，形状为球形，椭球形，或不规则形状。

3、根据权利要求1所述的一种二氧化硅微粒为载体的淋巴染料，其特征在于：所述交联剂为表面活性剂。

4、根据权利要求1所述的一种二氧化硅微粒为载体的淋巴染料，其特征在于：所述修饰剂为分子中含有羧基、氨基、羟基、磺酸基、腈基中的一种或一种以上极性基团或者硅烷偶联剂中的一种，二氧化硅表面修饰度为0～99％。

5、针对权利要求1、2、3或4所述的一种二氧化硅微粒为载体的淋巴染料的制备方法，其特征在于：选用物理包埋或吸附中的一种方法或两种方法同时并用：将染料分子溶解到二氧化硅微粒的水相溶液或有机溶液或水相与有机溶剂的混合液中，染料分子扩散进入二氧化硅微粒的空腔、孔隙以及表面，染料分子在二氧化硅微粒合成前加入或者在合成结束后加入的，通过洗涤分离除去未结合的染料，最后进行灭菌。

6、针对权利要求1、2、3或4所述的一种二氧化硅微粒为载体的淋巴染料的制备方法，其特征在于：将染料分子水溶液包埋到油包水型微乳中，然后在该微乳中通过正硅酸乙酯的水解或硅酸钠与酸反应合成二氧化硅，从而将染料分子包埋到二氧化硅粒子中，最后进行灭菌。