CN100567502C

CN100567502C - 药学制剂

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Publication number: CN100567502C
Application number: CNB2004800155168A
Authority: CN
Inventors: 小林正伸; 陈健
Original assignee: ONCOREX Inc
Current assignee: Oncorex Inc.
Priority date: 2003-04-03
Filing date: 2004-04-05
Publication date: 2009-12-09
Anticipated expiration: 2024-04-05
Also published as: CN1798850A; CA2521169A1; JP4662269B2; US20070031899A1; EP1624073A4; US7824872B2; JPWO2004090158A1; WO2004090158A1; EP1624073A1

Abstract

本发明的目的是提供筛选显示抗癌活性的新化合物的方法。本发明的筛选方法包括使用丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1或其部分肽或其盐。

Description

药学制剂

技术领域

本发明涉及癌症治疗和预防性药剂的筛选方法，并且更加具体地，涉及癌症治疗和预防性药剂的筛选方法，其中这些药剂还对癌细胞和抗癌剂无效的实体癌有效。

背景技术

目前临床上使用许多种类型的抗癌剂。这些临床应用的抗癌剂遇到许多问题，如出现获得对于曾经有效的抗癌剂的抗性的癌细胞，从而降低它们对于实体癌的效力。据认为抗癌剂抗实体瘤的效力随着当实体瘤的里面部分达到一定大小或更大时变得缺氧而降低。

在进行性的癌症中，内部的癌细胞比周围细胞增殖得更快。因而对于这些内部细胞的新血管的供应变得不充分，血液供应变得不足，并产生缺氧的情况。例如，在Teicher，B.A.“Hypoxia and drug resistance.”Cancer MetastasisRev.，13：139-168，1994；Brown，J.M.&Giaccia，A.J.“The unique physiology ofsolid tumors：opportunities(and problem) for cancer therapy.”Cancer Res.，58：1408-1416，1998；Brown，J.M.“Exploiting the hypoxic cancer cell：mechanisms and therapeutic strategies.”Mol.Med.Today，6：157-162，2000；Luk，C.K.，Veinot-Drebot，L.，Tjan，E&Tannock，I.F.“Effect of transient Hypoxia onsensitivity to doxorubicin in human and murine cell lines.”J Natl.Cancer Inst.，82：684-692，1990；Sakata，K.，Kwok，T.T.，Murphy，B.J.，Laderoute，K.R.，Gordon，G.R.，Sutherland，R.M.“Hypoxia-induced drug resistance：comparison toP-glycoprotein-associated drug resistance.”Br.J Cancer，64：809-814，1991；Sanna，K.&Rofstad，E.K.“Hypoxia-induced resistance to doxorubicin and methotrexatein human melanoma celllines in vitro.”Int.J Cancer，58：258-262，1994中所述，它们公开了在低氧条件下的癌细胞比在高氧条件下更加耐受化疗和放疗，并且低氧条件诱导顽固癌细胞中的药物抗性。上述文献中所描述的结果显示低氧条件在顽固癌细胞中诱导抗凋亡因子。

Pim-1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，它起初在由小鼠白血病病毒(MuLV)引发的T细胞淋巴瘤中被鉴定为经常由白血病病毒插入激活的基因(Cuypers，H.T.，Selten，G.，Quint，W.，Zijlstra，M.，Maandag，E.R.，Boelens，W.，vanWezenbeek，P.，Melief，C.，Berns，A.“Murine leukemia virus-induced T-celllymphomagenesis：integration of proviruses in a distinct chromosomal region.”Cell，37：141-150，1984；and Selten，G.，Cuypers，H.T.&Berns，A.“Proviralactivation of the putative oncogene Pim-1in MuLV induced T-cell lymphomas.”EMBO J，4：1793-1798，1985)。另外，据报道细胞质中的Pim-1作为一种在各种生血细胞中抑制凋亡的因子而起作用(Pircher，T.J.，et al.“Pim-1 kinaseprotects hematopoietic PDC cells from genotoxin-induced death.”Oncogene，19：3684-3692，2000；and Lilly，M.&Kraft，A.“Enfored expression of the Mr33,000Pim-1kinase enhances factor-independent survival and inhibits apoptosisin murine myeloid cells.”Cancer Res.，57：5348-5355，1997)。所以，能够灭活Pim-1的物质将对于预防/治疗实体癌和各种Pim-1诱导的病症有效。

因此，本发明的一个目的是提供筛选显示抗癌活性的新化合物的方法。本发明的另一个目的是提供癌症治疗和预防性药剂的筛选方法，其中这些药剂通过灭活Pim-1来预防和治疗癌症。

发明内容

作为广泛研究以实现上述目的的结果，本发明人发现一种在癌细胞中大量存在的蛋白质，并基于这一发现完成了本发明。

本发明是基于上述发现而产生的，并且提供癌症治疗和预防性药剂的筛选方法，其中所述方法包括使用丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1或其部分肽或盐。

本发明还提供筛选癌症治疗和预防性药剂的试剂盒，其中所述试剂盒包含丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1，或其部分肽或盐。

本发明还提供癌症的治疗和预防性药剂，其中利用上述筛选方法或试剂盒获得所述药剂。

本发明还提供癌症的治疗和预防性药剂，其中所述药剂包含抑制丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1或其部分肽或盐的活性的化合物，或这些化合物的盐。

本发明还提供癌症的治疗和预防性药剂，其中所述药剂包含抑制编码丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1或其部分肽或盐的基因的表达的化合物，或这些化合物的盐。

本发明还提供癌症的治疗和预防性药剂，其中所述药剂包含这样的多肽，所述多肽含有与含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽相同或基本上相同的氨基酸序列。

本发明还提供癌症的治疗和预防性药剂，其中所述药剂包含抗丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1或其部分肽或盐的抗体。

并且提供筛选凋亡诱导剂的方法，其中所述方法包括使用丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1或其部分肽或盐。

本发明还提供筛选凋亡诱导剂的试剂盒，其中所述药剂包含丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1，或其部分肽或盐。

本发明还提供利用上述筛选方法或试剂盒获得的凋亡诱导剂。

本发明还提供凋亡诱导剂，其包含抑制丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1或其部分肽或盐的活性的化合物，或这些化合物的盐。

本发明还提供凋亡诱导剂，其包含抑制编码丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1或其部分肽或盐的基因的表达的化合物，或这些化合物的盐。

本发明还提供凋亡诱导剂，其包含这样的多肽，所述多肽含有与含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽相同或基本上相同的氨基酸序列。

本发明还提供凋亡诱导剂，其包含抗丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1或其部分肽或盐的抗体。

本发明还提供筛选抗癌剂的增效剂的方法，其中所述方法包括使用丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1或其部分肽或盐。

本发明还提供筛选抗癌剂的增效剂的试剂盒，其中所述试剂盒包含丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1，或其部分肽或盐。

本发明还提供抗癌剂的增效剂，其中利用上述筛选方法或试剂盒获得所述抗癌剂的增效剂。

本发明还提供抗癌剂的增效剂，其中所述的增效剂包含抑制丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1或其部分肽或盐的活性的化合物，或这些化合物的盐。

本发明还提供抗癌剂的增效剂，其中所述的增效剂包含抑制编码丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1或其部分肽或盐的基因的表达的化合物，或这些化合物的盐。

本发明还提供抗癌剂的增效剂，其中所述的增效剂包含这样的多肽，所述多肽含有与含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽相同或基本上相同的氨基酸序列。

本发明还提供抗癌剂的增效剂，其中所述的增效剂包含抗丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1或其部分肽或盐的抗体。

本发明还提供包含与下列多聚核苷酸具有95％或更大同源性的核苷酸序列的多聚核苷酸：

(b)一种包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列的多聚核苷酸，或一种能够与包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列的多聚核苷酸杂交的cDNA多聚核苷酸；和

(c)一种包含核苷酸序列的多聚核苷酸，所述核苷酸序列编码含有与SEQ ID NO：3的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列的多肽，或一种cDNA多聚核苷酸，它能够与包含一种核苷酸序列的多聚核苷酸杂交，所述核苷酸序列编码含有与含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列的多肽。

本发明还提供包含上述多聚核苷酸的载体。

本发明还提供携带上述表达载体的宿主细胞。

本发明还提供生产多肽或其盐的方法，所述多肽或其盐包含与含有SEQID NO：3的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列，其中所述方法包括在适于表达所述多肽的条件下培养上述宿主细胞，以便从获得的培养物中收集所述多肽。

本发明还提供癌症的预防和治疗性药剂，其中所述药剂包含上述多核苷酸或重组载体。

本发明还提供凋亡诱导性药剂，其包含上述多核苷酸或重组载体。

本发明还提供抗癌剂的增效剂，其中所述的增效剂包含上述多核苷酸或重组载体。

附图简述

图1显示FACS分析的结果。

图2显示FACS分析的结果。

图3显示FACS分析的结果。

图4显示Western印迹的结果，以检测在低和正常氧分压下培养的各种细胞中的Pim-1。

图5显示Northern印迹的结果，以检测在低和正常氧分压下培养的各种细胞中的Pim-1mRNA。

图6显示通过Western印迹在三种细胞系中检测Pim-1的结果。

图7显示用钙蛋白酶(calpain)抑制剂处理的细胞中通过Western印迹检测Pim-1的结果。

图8显示泛素化的Pim-1的蛋白质电泳结果。

图9显示在转化的细胞中显性失活的Pim-1的表达结果。

图10显示FACS分析的结果。

图11显示FACS分析的结果。

图12是显示当施用多种细胞时肿瘤大小变化的图表。

图13是一组显示免疫组织化学染色的结果的照片。

图14显示FACS分析的结果。

实施发明的最佳方式

下面对本发明进行描述。

在本发明中，“丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1”(下文中也称作“Pim-1”)意为一种包含SEQ ID NO：1氨基酸序列并且具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的多肽。Pim-1在由鼠白血病病毒(MuLV)引发的T细胞淋巴瘤中被鉴定为由MuLV插入激活的基因(Comerford，K.M.，Wallace，T.J.，Karhausen，J.，Louis N.A.，Montalto，M.C.，Colgan，S.P.“低氧-inducible factor-1-dependent regulation ofthe multidrug resistance(MDR1)gene.”Cancer Res.，62：3387-3394，2001；andNiizeki，H.，Kobayashi，M.，Horiuchi，I.，Akakura，N.，Chen，J.，Wang，J.，Hamada，J.，Seth，P.，Katoh，H.，Watanabe，H.，Raz，A.，Hosokawa，M.“低氧enhances the expression of autocrine motility factor and the mot1lity of humanpancreatic cancer cells.”Br.J Cancer，86：1914-1919，2002)。

在本发明中，Pim-1或其部分肽包括这样的蛋白质，所述蛋白质含有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列。这些蛋白质可以是源自人或温血动物(例如，豚鼠、大鼠、小鼠、鸡、兔、猪、羊、牛、猴等)细胞(例如，肝细胞、脾细胞、神经元、神经胶质细胞、胰β细胞、髓样细胞、肾小球系膜细胞、朗格汉斯细胞、表皮细胞、上皮细胞、杯状细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、纤维细胞、肌细胞、脂肪细胞、免疫细胞(如巨噬细胞、T细胞、B细胞、天然杀伤细胞、肥大细胞、嗜中性细胞、嗜碱性细胞、嗜酸性细胞、单核细胞等)、巨核细胞、滑膜细胞、软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、乳腺细胞、肝细胞，或间质细胞，或前体细胞、干细胞，或上述细胞的癌细胞)的蛋白质，或源自这些细胞存在的各种组织，如脑、脑的各个部分(例如，嗅球、杏仁核、基底神经节、海马回、丘脑、下丘脑、大脑皮层、延髓或小脑)、脊髓、垂体、胃、胰、肾、肝、生殖腺、甲状腺、胆囊、骨髓、肾上腺、皮肤、肌肉、肺、胃肠道(例如，大肠和小肠)、血管、心、胸腺、脾、下颌下腺、外周血、前列腺、睾丸、卵巢、胎盘、子宫、骨骼、关节和骨骼肌，或者它们可以是合成的蛋白质。

与SEQ ID NO：1的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列是，例如，与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有大约50％或更高序列同源性的氨基酸序列，优选大约60％或更高，更加优选大约70％或更高，甚至更加优选大约80％或更高，尤其优选大约90％或更高，最优选大约95％或更高。优选地，包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的蛋白质是，例如，包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列，并且具有与包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质基本上相同类型的活性的蛋白质。

“基本上相同类型的活性”指，例如，由Pim-1所具有的丝氨酸/苏氨酸激酶活性。优选与这种激酶活性等同的活性。这种激酶活性可以测量为，例如，使底物肽如p21蛋白或myb蛋白磷酸化的活性。另外，如下所述，由于Pim-1抑制凋亡诱导活性，可以通过测量抑制凋亡诱导活性的这种效应来测定活性是基本上相同或是不同。

用于本发明的Pim-1包括，例如，包含具有SEQ ID No：1的氨基酸序列中一个或两个或多个(例如，大约1到50个，或优选大约1到30个)氨基酸缺失的氨基酸序列的蛋白质；包含具有SEQ ID No：1的氨基酸序列中一个或两个或多个(例如，大约1到100个，或优选大约1到30个)氨基酸添加的氨基酸序列的蛋白质；包含具有SEQ ID No：1的氨基酸序列中一个或两个或多个(例如，大约1到100个，或优选大约1到30个)氨基酸插入的氨基酸序列的蛋白质；包含具有SEQ ID No：1的氨基酸序列中一个或两个或多个(例如，大约1到100个，或优选大约1到30个)氨基酸取代的氨基酸序列的肽；或包含具有上述改变组合的氨基酸序列的蛋白质。这些氨基酸插入、取代和缺失的位置并不受到特别限制。

包含SEQ ID No：1的氨基酸序列的蛋白质的C末端可以是羧基(-COOH)，羧酸盐基(-COO^-)，酰胺基(-CONH₂)，或酯基(-COOR)。在酯基中的R包括，例如，1-6个碳原子的烷基如甲基、乙基、n-丙基、异丙基或n-丁基；3-8个碳原子的环烷基如环戊基或环己基；6-12个碳原子的芳基如苯基，或α萘基；苯基-烷基如苯甲基或苯乙基；α-萘基-烷基如α-萘甲基；7-14个碳原子的芳烷基；以及新戊酰羟基甲基(pivaloyloxymethyl)。当由SEQ IDNo：1所代表的蛋白质除了C末端的羧基之外具有羧基(或羧酸盐基)时，那些羧基可以进行酰胺化或酯化。这些酯包括，例如以上对于C末端所述的酯。另外，由SEQ ID No：1所代表的蛋白质可以是下列：N末端氨基酸残基(例如，蛋氨酸残基)的氨基被保护基(如1-6个碳原子的酰基，如包括甲酰基或乙酰基的1-6个碳原子的链烷酰基(alkanoyl group)保护的蛋白质；N末端谷氨酰胺残基转变为焦谷氨酸的蛋白质，所述谷氨酰胺由体内剪切所产生；或者分子中氨基酸的侧链上的取代基(-OH，-SH，氨基，咪唑基，吲哚基，胍基等)被适当的保护基(如1-6个碳原子的酰基，如包括甲酰基或乙酰基的1-6个碳原子的链烷酰基)所保护的氨基酸；或者偶联蛋白质如糖链连接的所谓糖蛋白。

用于本发明的Pim-1的部分肽是上述蛋白质的部分肽，并且优选是具有与上述蛋白质相似特性的部分肽。

用于本发明的Pim-1及其部分肽包括用生理上可接受的酸(如无机酸和有机酸)和碱(例如，碱金属盐)形成的盐，并且特别优选生理上可接受的酸加成盐。这类盐的例子包括那些用无机酸(例如，盐酸、磷酸、氢溴酸和硫酸)和有机酸(例如，醋酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸和苯磺酸)形成的盐。用于本发明的Pim-1及其部分肽或盐可以通过已知的蛋白纯化方法由上述人或温血动物的细胞或组织制备。另外，它们能够通过培养包含编码所述蛋白的DNA(例如，包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列的DNAs)的转化体进行生产。另外，它们能够根据公知的肽合成方法进行生产。由人或哺乳动物进行生产包括对人或哺乳动物的组织或细胞进行匀浆，随后利用酸等提取匀浆，随后通过结合层析法如反相层析和离子交换层析从获得的提取物中纯化并分离所述蛋白的步骤。

用于本发明的Pim-1及其部分肽或盐可以进行合成，并且可以使用普通的可商购的蛋白合成用树脂进行合成。这类树脂的例子包括氯甲基树脂、羟甲基树脂、二苯甲胺树脂、氨甲基树脂、4-苄基氧苯甲醇树脂(4-benzyloxybenzyl alcohol resin)、4-甲基二苯甲基胺树脂(4-methylbenzhydrylamine resin)、PAM树脂、4-羟基甲基甲基苯基乙酰胺基甲基树脂、聚丙烯酰胺树脂、4-(2′，4′-二甲氧基苯基-羟甲基)苯氧树脂和4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc氨基乙基)苯氧树脂。利用这类树脂，使用各种公知的缩合方法，根据靶蛋白的序列，将α-氨基和侧链上的官能团受到适当保护的氨基酸缩合到树脂上。在反应结束时，将所述蛋白质或部分肽从树脂中切下，同时，去除各种保护基以获得需要的蛋白质，或其部分肽、或其盐。上述受到保护的氨基酸能够利用各种可用于蛋白质合成的活化试剂进行缩合，碳化二亚胺特别合适。所用的碳化二亚胺包括DCC，N，N’-二异丙基碳化二亚胺，和N-乙基-N’-(3-二甲基氨基脯氨酰)碳化二亚胺。对于由碳化二亚胺所进行的活化作用，可以将受保护的氨基酸直接与消旋抑制剂(如HOBt或HOOBt)一起加入到树脂中，也可以将受保护的氨基酸首先活化为对称酸酐，或HOBt酯，或HOOBt酯，并随后加入到树脂中。

用于活化受保护氨基酸并将它们与树脂一起进行缩合的溶剂可以根据需要从已知的用于蛋白质缩合反应的溶剂中选择。例如，可以使用酸酰胺如N，N-二甲基甲酰胺，N，N-二甲基乙酰胺，和N-甲基吡啶酮(N-methylpyrolidone)；卤代烃如二氯甲烷(methylene chloride)和氯仿；醇如三氟乙醇；硫氧化物如二甲基硫氧化物；吡啶；醚如二噁烷和四氢呋喃；腈如乙腈和丙腈；酯如甲基乙酯和乙基乙酯；或它们的适合的混合物。反应混度可以适当地从已知可用于蛋白键形成反应的范围中选择，并且通常选择介于约-20℃和50℃之间的温度。通常使用多出1.5到4倍的活化氨基酸衍生物。如果茚三酮反应测试结果显示缩合不充分，可以在不除去保护基团的情况下，反复进行缩合反应以获得充分的缩合。如果即使在重复反应之后还未获得足够的缩合物，可以将未反应的氨基酸用乙酸酐或乙酰咪唑进行乙酰化以避免对于随后反应的效应。

用作起始氨基基团的保护基团包括，例如，Z，Boc，t-戊氧羰基、异冰片基氧羰基(isobornyloxycarbonyl)、4-甲氧苄基氧羰基、Cl-Z、Br-Z、金刚烷氧羰基(adamantyloxycarbonyl)、三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、甲酰基、2-硝基苯基硫苯基(2-nitrophenylsulphenyl)、diphenylphosphinothioyl和Fmoc。羧基可以通过例如烷基酯化(例如，甲基、乙基、丙基、丁基、t-丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、2-金刚烷基等的直链、支或环烷基酯化)，芳烷基酯化(例如，酯化为苄基酯、4-硝基苄基酯、4-甲氧基苄基酯、4-氯苄基酯或二苯甲基酯)，苯甲酰甲酯化，苄氧羰基酰肼化反应(hydrazidification)，t-异丁氧羰基酰肼化反应或三苯甲基酰肼化反应进行保护。丝氨酸的羟基能够通过酯化或醚化作用进行保护。适于酯化作用的基团包括，例如，低级(1-6个碳原子)链烷酰基如乙酰基，芳酰基如苯甲酰基，和源自碳酸的取代基如苄氧羰基和乙氧羰基。适于醚化作用的取代基包括，例如，苄基、四氢吡喃基和异丁基。Bzl，Cl₂-Bzl，2-硝基苄基，Br-Z，t-丁基等能够用于保护酪氨酸的酚羟基。Tos，4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基，DNP，苄氧甲基，Bum，Boc，Trt，Fmoc基等能够用于保护组氨酸的咪唑部分。

在起始材料中的活化羧基的例子包括相应的酸酐、叠氮化物、活化的酯[具有醇的酯(如五氯苯酚，2，4，5-三氯苯酚，2，4-二硝基苯酚，氰基甲醇，对硝基苯酚，HONB，N-羟基琥珀酰亚胺，N-羟基邻苯二甲酰亚胺，或HOBt)]等。在起始材料中的活化氨基的例子包括相应的磷酸酰胺。可以用于去除(消除)保护基的方法包括，例如，在氢气流下于催化剂如Pd-黑或Pd-碳存在时的催化还原，用酸如无水氟化氢、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氟醋酸或其混合物进行处理，用碱如二异丙基乙胺、三乙胺、哌啶或哌嗪进行处理，或用液体氨水中的钠进行还原。如上所述利用酸处理的消除反应一般在大约-20℃到40℃的温度进行。加入阳离子消除剂如苯甲醚、苯酚、茴香硫醚、间甲酚、对位甲酚、二甲硫醚、1，4-二巯基丁烷和1，2-二巯基乙烷在酸处理中有效。而且，能够通过苯硫酚处理去除用于保护组氨酸咪唑基的2，4-二硝基苯基，而用于保护色氨酸吲哚基的甲酰基能够在1，2-二巯基乙烷，1，4-二巯基丁烷等存在时通过上述酸处理，以及通过用碱如稀释的氢氧化钠溶液或稀释的氨水处理来去除。

不参与起始材料保护性基团的反应、保护性基团的去除的官能团的保护，和参与反应的官能团的活化，可以适当地选自公知的取代基团和方法。在另一种获得蛋白质或部分肽的酰胺的方法中，例如，首先将羧基末端氨基酸的α羧基酰胺化以进行保护，将肽(蛋白质)链向氨基侧延伸到需要的链长，生产一种蛋白质或部分肽，其中只去除了肽链的N末端α氨基保护基团，以及一种蛋白质或部分肽，其中只去除了肽链的C末端羧基保护基团，并使这些蛋白质或肽在与上述相似的溶剂混合物中缩合。缩合反应的细节与上述相同。纯化通过缩合获得的受保护的蛋白质或肽，并且随后通过上述方法去除所有的保护基团以获得需要的粗制蛋白质或肽。随后可以通过各种公知的纯化方法对这种粗制蛋白质或肽进行纯化，并可以将主要级分冻干以获得所需蛋白质或肽的酰胺。为了获得所述蛋白质或肽的酯，首先用一种所需的醇将羧基末端氨基酸的α羧基缩合以产生一种氨基酸酯，随后以与所述蛋白质或肽的酰胺同样的方式可以获得所需的蛋白质或肽的酯。

用于本发明的Pim-1的部分肽或其盐通过根据已知的肽合成方法，或通过用适当的肽酶剪切用于本发明的Pim-1来进行生产。肽合成的方法可以包括，例如，固相合成或液相合成。具体地，使可以构成用于本发明的部分肽的部分肽或氨基酸与已有的部分进行缩合，并且如果产物携带保护性基团，则能够通过去除所述保护性基团来产生所需的肽。

用于本发明的编码Pim-1的多聚核苷酸可以是任何多聚核苷酸，只要它们包含编码Pim-1的核苷酸序列。DNAs是优选的，DNAs可以是基因组DNAs，基因组DNA文库，源自上述细胞或组织的cDNAs，源自上述细胞或组织的cDNA文库，或合成的DNAs等。用于文库的载体可以是噬菌体、质粒、粘粒、噬菌粒等。此外，所述DNAs可以通过反转录酶聚合酶链式反应(下文中简称为“RT-PCR”)利用由上述细胞或组织制备的总RNA或mRNA片段进行直接扩增。例如，编码用于本发明的Pim-1的DNAs可以是任何DNAs，只要所述DNAs包含SEQ ID No：2的核苷酸序列，或者包含在高严谨条件下与包含SEQ ID No：2的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，并且所述DNAs编码一种蛋白质，所述蛋白质具有与包含由核苷酸序列SEQ ID No：2编码的氨基酸序列所述蛋白质基本上相同的特性。

能够在高度严格条件下与SEQ ID No：2的核苷酸序列杂交的DNAs包括，例如，包含与SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有大约50％或更高，优选大约60％或更高，更加优选大约70％或更高，甚至更加优选大约80％或更高，尤其优选大约90％或更高，最优选大约95％或更高同源性的核苷酸序列的DNA。杂交可以利用或根据任何已知的方法进行，所述方法在“MolecularCloning”2nd edition(J.Sambrook 等，Cold Spring Harbor Lab.Press，1989)中进行了介绍。当利用一种可商购的文库时，可以根据所附说明书中所述方法实施操作。“高度严格条件”指诸如钠浓度为19到40mM，或者优选为19到20mM，以及温度为50到70℃，或者优选60到65℃的条件。具体地，钠浓度19mM和温度65℃是最优选的。

编码用于本发明的Pim-1的部分肽的DNAs可以是任何DNAs，只要它们包含编码用于本发明的部分肽的核苷酸序列。所用的DNAs可以是基因组DNAs，基因组DNA文库，源自上述细胞或组织的cDNAs，源自上述细胞或组织的cDNA文库，或合成的DNAs。编码用于本发明的部分肽的DNAs包括，例如，携带包含SEQ ID No：2的核苷酸序列的DNA的一部分的DNAs，或包含在高度严格条件下与SEQ ID No：2的核苷酸序列杂交的核苷酸序列的DNAs，并且还包含编码具有与本发明蛋白质基本上相同活性的蛋白质的DNAs的部分。短语“可以与SEQ ID No：2的核苷酸序列杂交的DNA”具有与上述相同的含义。利用上述杂交方法和高度严格的条件。

克隆编码用于本发明的完整Pim-1及其部分肽(下文这些可以简称为“Pim-1”)的DNAs的方法包括利用包含编码Pim-1的核苷酸序列的部分的合成DNA引物进行PCR扩增，或通过掺入到合适载体中的DNAs与编码Pim某些或全部区域的标记DNA片段，或标记的合成DNA杂交进行筛选。杂交可以通过，例如，在“Molecular Cloning”2nd edition(J.Sambrook 等，ColdSpring Harbor Lab.Press，1989)中介绍的方法来进行。当利用可商购的文库时，可以根据所附说明书中所述方法实施操作。可以利用或根据已知的方法，如ODA-LAPCR，Gapped duplex，或利用PCR或已知试剂盒的Kunkel，例如，Mutan^TM-superExpress Km(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，Mutan^TM-K(TakaraShuzo Co.，Ltd.)等来改变DNAs的核苷酸序列。可以利用编码所述蛋白质的克隆的DNAs，也可以根据目的，或根据需要，在用限制性酶消化之后，或在添加接头之后利用编码所述蛋白质的克隆的DNAs。所述DNAs可以在它们的5’端具有一个ATG作为翻译起始密码子，并且在它们的3’端具有TAA，TGA或TAG作为翻译终止密码子。这些翻译起始和终止密码子也可以利用适当的合成DNA衔接子加入到DNAs中。Pim-1的表达载体可以通过，例如，(1)从编码Pim-1的DNA中切出DNA目的片段，和随后(2)在适当表达载体的启动子下游连接DNA片段来产生。

筛选本发明的癌症预防和治疗剂的方法包括使用上述Pim-1或其部分肽、或其盐。更具体地，可以通过将Pim-1或其部分肽、或其盐与试验物质相接触，并测量Pim-1的磷酸化活性来实施筛选本发明的癌症预防剂和治疗剂的方法。或者，可以通过将Pim-1，其部分肽、或其盐与试验物质相接触，并测量Pim-1或其部分肽或盐对于调亡诱导的抑制效应来实施所述方法。

在另一种情况中，通过与缺失试验物质时观察到的活性相比来确认活性物质的存在进行筛选。这类方法还能够筛选调亡诱导剂。另外，抑制Pim-1或其部分肽或盐的活性能够抑制肿瘤形成；所以，这种方法可以允许筛选抗癌剂的增效剂。

用于本发明筛选方法中的试验样品的例子包括细胞提取物、植物提取物、纯化的或粗蛋白质、肽、非肽类化合物、合成的低分子量化合物、天然化合物和基因文库。本发明的筛选方法可以在细胞中实施，也可以在试管中实施。

当在细胞中实施所述方法时，可以使用生产Pim-1的细胞或用携带编码Pim-1的DNA的重组载体转化的细胞。当在试管中实施所述方法时，将Pim-1和Pim-1的底物肽混合于合适的反应缓冲液中，并且随后测量磷酸化的能力。对于底物肽没有特别的限制，只要它们能够被Pim-1磷酸化即可。反应条件是对于已知激酶传统使用的条件。

上述重组载体介绍如下。

携带编码Pim-1的DNA的重组载体可以通过在适当表达载体的启动子下游连接编码Pim-1的核苷酸片段(例如，包含SEQ ID No：2的核苷酸序列的多聚核苷酸)来产生。用于本发明的合适载体包括源自大肠杆菌(Escherichia coli)的质粒(例如，pBR322，pBR325，pUC18或pUC118)；源自枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)的质粒(例如，pUB110，pTP5或pC194)；源自酵母的质粒(例如，pSH19或pSH15)；噬菌体，如噬菌体；和动物病毒，如反转录病毒，痘苗病毒，或杆状病毒；以及pA1-11，pXT1，pRc/CMV，pRc/RSV，pcDNAI/Neo。在本发明的上下文中，可以使用任何启动子，只要它们适用于用来表达目的基因的宿主。例如，当宿主是大肠杆菌时，优选的启动子是trp启动子，lac启动子，recA启动子，PL启动子，lpp启动子，T7启动子，T3启动子和araBAD启动子。当宿主属于芽胞杆菌属(Bacillus)时，优选的启动子是SPO1启动子，penP启动子，XYL启动子，HWP启动子和CWP启动子。当宿主是枯草芽胞杆菌时，优选的启动子是SPO1启动子，SPO2启动子和penP启动子。当宿主是酵母是，优选的启动子是PHO5启动子，PGK启动子，GAP启动子和ADH启动子。当将动物细胞用作宿主时，优选使用SR 启动子，SV40启动子，LTR启动子，CMV启动子，HSV-TK启动子等。此外，当将昆虫细胞用作宿主时，使用多角体(polyhedron)启动子，OplE2启动子等。

除了上述启动子之外，根据需要重组载体可以包括已知的增强子，剪接信号，poly(A)添加信号，选择标记，SV40复制起始点(下文中有时缩写为“SV40orgdi”)等。另外，如果需要，由本发明的DNA编码的蛋白质还可以表达为与其它蛋白质(例如，谷胱甘肽-S-转移酶和蛋白A)的融合蛋白。可以通过利用位点特异性蛋白酶剪切这类融合蛋白以将它切分成各自的蛋白质。

上述选择标记的例子包括二氢叶酸还原酶(下文缩写为“dhfr”)基因[甲氨喋呤(MTX)抗性]、氨苄青霉素抗性基因(下文通常缩写为“Amp^r”)和新霉素抗性基因(下文通常缩写为“Neo^r”；G418抗性)等。尤其是，当利用dhfr基因缺陷的中华仓鼠卵巢细胞，并利用dhfr基因作为选择标记时，在无胸腺嘧啶脱氧核苷的培养基中筛选所需的基因。

合适宿主的例子包括埃希氏杆菌属细菌、枯草杆菌属细菌、酵母、昆虫细胞、昆虫以及动物细胞。合适的埃希氏杆菌属细菌的具体例子包括大肠杆菌K12·DH1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 60：160，1968)、JM103(NucleicAcids Research 9：309，1981)、JA221(Journal of Molecular Biology 120：517，1978))、HB101(Journal of Molecular Biology 41：459，1969)，C600(Genetics，39：440，1954)、DH5和JM109。合适的枯草杆菌属细菌的例子包括枯草杆菌MI114(Gene 24：255，1983)，207-21(Journal ofBiochemistry 95：87，1984)和短枯草杆菌(Bacillus brevis)。适合酵母的例子包括酿酒酵母(Saccaromycescerevisiae)AH22、AH22R-、NA87-11A、DKD-5D、20B-12，粟酒裂殖酵母(Schizosaccaromyces pombe)NCYC1913、NCYC2036，甲醇酵母(Pichiapastoris)M71，和汉森酵母(Hansenula polymorpha)。病毒为AcNPV时，所用昆虫细胞的例子包括源自草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)幼虫的细胞系(Sf细胞)，来自粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)中肠的MG1细胞、来自粉纹夜蛾卵(Trichoplusia ni)的High Five^TM细胞、来自甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)的细胞和来自Estigmena acrea的细胞。对于BmNPV病毒使用家蚕(Bombyxmori)的N细胞(BmN细胞)等。可用的上述Sf细胞的例子包括Sf9细胞(ATCCCRL1711)和Sf21细胞(这两种细胞均在Vaughn，J.L等，“In Vivo”，13，213-217(1977)中描述)。所用的昆虫包括，例如，家蚕的幼虫(Maeda 等，Nature，315：592，1985)。合适的哺乳动物细胞的例子包括猴COS-7细胞、Vero细胞、中华仓鼠卵巢细胞CHO(下文缩写为“CHO”)、dhfr基因缺陷的中华仓鼠卵巢细胞(下文缩写为“CHO(dhfr^-)”)、小鼠L细胞、小鼠AtT-20细胞、小鼠骨髓瘤细胞、大鼠GH3细胞和人FL细胞。

如果需要，可以将编码适合于宿主的信号序列的多聚核苷酸加到编码Pim-1的多聚核苷酸的5’末端一侧。当使用埃希氏菌属(Escherichia)的细菌作为宿主细胞时，使用PhoA信号序列、OmpA信号序列等；当使用芽胞杆菌属细菌作为宿主细胞时，使用-淀粉酶信号序列、枯草溶菌素信号序列等；当使用酵母作为宿主细胞时，使用MF信号序列、SUC2信号序列等；当使用动物细胞作为宿主细胞时，使用胰岛素信号序列、-干扰素信号序列、抗体分子信号序列等。利用以此方式构建以携带编码本发明的多肽的多聚核苷酸的表达载体能够产生转化体。

可以根据本领域已知的技术进行上述宿主细胞的转化。转化宿主细胞的示例性方法在下列参考文献中得到介绍：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69：2110，1972；Gene，17：107，1982；Molecular&General Genetics，168：111，1979；Methods in Enzymology，194：182-187，1991；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75：1929，1978；Cell Technology(Suppl.8)New Cell Technology ExperimentalProtocol，263-267，1995，(Shujunsha)；and Virology，52：456，1973。

将重组载体导入细菌如大肠杆菌的方法并不受到特别限制，只要它们成功地将DNA导入选定的细菌中。例如，可以使用钙离子法(Cohen，S.N.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69：2110，1972)和电穿孔法。

当使用酵母作为宿主时，将重组载体导入其中的方法并不受到特别限制，只要它们能够成功将DNA导入酵母。例如，可以使用电穿孔法、原生质球法和醋酸锂法。

当使用动物细胞作为宿主时，将重组载体导入其中的方法并不受到特别限制，只要它们能够成功将DNA导入动物细胞中。例如，可以使用电穿孔法、磷酸钙法和脂质转染法。

当使用昆虫细胞作为宿主时，将重组载体导入昆虫细胞中的方法并不受到特别限制，只要它们能够成功将DNA导入昆虫细胞。例如，可以使用磷酸钙法、脂质转染法和电穿孔法。

可以例如通过PCR、DNA杂交和Northern印迹杂交确认基因掺入宿主中。随后，将扩增产物进行，例如，琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳，并用溴化乙锭、SYBC Green溶液进行染色。一种检测为单一条带的扩增产物表示成功的转化。扩增产物还可以通过利用预标记了荧光染料等的引物进行PCR来检测。而且，在将它们固定于固相，如微量板上之后，可以通过荧光或酶学反应对扩增产物进行鉴定。

本发明的筛选方法可以利用上述转化细胞来实施。利用本发明的转化细胞的筛选方法可以如下所述进行。

本发明的筛选方法包括将上述转化细胞与Pim-1的底物肽与[³²P]-ATP一起培养，和通过测量³²P插入到底物肽中来测量Pim-1的磷酸化活性的步骤。进行这种测量并将结果进行比较以进行筛选。更加具体地，在存在或不存在试验物质时测量Pim-1的磷酸化活性，当存在试验化合物时的磷酸化活性低于其缺失时，确定所述试验物质具有对于Pim-1的抑制作用。

或者，可以通过测量凋亡诱导能力，而不是测量Pim-1的磷酸化活性来实施本发明的筛选方法。更加具体地，由于Pim-1抑制凋亡诱导能力，当在存在或缺失一种试验物质时测量抑制这种凋亡诱导能力的作用时，抑制作用的降低显示所述试验物质抑制Pim-1活性，具有凋亡诱导能力，并且在预防和治疗癌症中和增强抗癌剂效果方面有效。

由于Pim-1大量在于实体(solid)癌细胞中，具有针对Pim-1的抑制作用的化合物可以是具有抗癌，或特别抗实体癌的预防和治疗作用的化合物。这种抗癌的治疗作用包括抑制癌细胞的肿瘤形成能力，并且由凋亡诱导作用所显示。所以，上述筛选方法可以用作筛选凋亡诱导剂的方法。此外，所述筛选方法可以用作筛选抗癌剂的增效剂的方法。

另外，本发明的筛选方法是筛选促进或抑制丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1的活性的物质的方法，其中所述方法包括将丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1或其部分肽、或其盐与一种试验物质相接触，并且随后检测丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1的磷酸化活性的步骤。

可以利用一种报道基因表达水平的变化作为指征来检测磷酸化活性，所述报道基因响应于丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1磷酸化底物的结合而被激活。或者，磷酸化活性可以通过利用识别丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1磷酸化底物的磷酸化形式的抗体来进行检测。

下面描述利用一种报道基因表达水平的变化作为指征来检测磷酸化活性，所述基因响应于丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1磷酸化底物的结合而被激活。

将Pim-1的磷酸化底物肽的结合序列连接到表达载体的报告基因上，并将这种载体导入到宿主细胞中。进一步将表达Pim-1的载体导入相同宿主细胞中产生导入两种表达载体的细胞。上述载体能够被用作Pim-1表达载体。

可以与Pim-1表达载体类似地生产报告基因的表达载体，并且可以利用上述宿主细胞而无任何特别限制。

当磷酸化时用于本发明的Pim-1的磷酸化底物肽将结合到结合序列上。这类底物肽的例子包括c-Myb，活化T细胞的核因子(NFAT)和P21。例如，当c-Myb被磷酸化时，它结合到结合序列上，并且表达报告基因；因而，通过检测这种报告基因的表达，有可能检测c-Myb是否被磷酸化。

对于报告基因没有特别的限制，但是优选地，所述报告基因是稳定的并且它们的活性易于测定。这类报告基因的例子包括编码萤光素酶，-半乳糖苷酶，-葡糖醛酸糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶，过氧化物酶，HIS3基因，绿色荧光蛋白(GFP)等的基因，但所述报告基因并不限于此。报告基因可以具有它们的原始启动子，或者启动子部分可以被来自另一种基因的启动子所取代。所述报告基因应当可操作地连接到效应元件的下游。

更加具体地，在上述筛选方法中，当试验物质具有Pim-1抑制活性时，报告基因的表达受到压制或抑制。因而，通过检测报告基因的表达，有可能检测试验物质是否促进或抑制Pim-1活性。

接下来，将介绍利用抗体检测磷酸化活性，所述抗体识别丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1磷酸化底物的磷酸化形式。

当使用抗体时，例如，将识别Pim-1磷酸化底物的磷酸化形式的抗体(一抗)固定到板上。分离地，将Pim-1和Pim-1磷酸化底物肽在试验物质存在或缺失的缓冲溶液中进行混合，该过程通常通过温育二到四小时进行。这一过程引起底物肽被Pim-1磷酸化。接下来，将包含底物肽的缓冲液放置到板的孔中，并温育持续给定的时间。这一过程允许磷酸化的底物肽结合到一抗上。未磷酸化的底物肽不结合到一抗上。

由于磷酸化的底物肽结合到一抗上，随后检查与另一种抗底物肽的抗体(二抗)的结合能够检查所述底物肽是否被磷酸化。

当利用连接到放射性同位素上的抗体时，通过，例如，液体闪烁计数等检测二抗的结合。当利用在二抗和酶之间形成的复合物时，利用吸光度分光光度计检测底物的酶诱导变化，如着色的程度。当利用连接到荧光底物上的二抗时，利用荧光分光光度计进行检测。比较在存在和缺失试验物质的情况下获得的结果，能够检测试验物质是否促进或抑制Pim-1磷酸化活性。

一个所用底物的例子是P21蛋白。

所用的抗体既可以是多克隆也可以是单克隆抗体，只要它们能够识别磷酸化底物蛋白质，或未磷酸化的底物蛋白质。可以根据传统已知的用于生产抗体或抗血清的方法用，例如，P21蛋白(磷酸化的和未磷酸化的)作为抗原来生产抗体。

接下来，介绍进行本发明的筛选的试剂盒：

本发明的筛选试剂盒包含Pim-1或其部分肽、或其盐。使用本发明的筛选试剂盒筛选抑制Pim-1或其部分肽或盐的活性的化合物。

本发明的筛选试剂盒优选包含Pim-1或其部分肽或盐，Pim-1底物肽，和磷酸化底物肽的磷酸供体。

本发明的筛选试剂盒还包含上述表达载体或转化体。优选地，包含表达载体或转化体的筛选试剂盒还包含Pim-1底物肽，和底物肽磷酸化的磷酸供体。利用这些试剂盒可以实施上述筛选方法。

抑制Pim-1活性的化合物将成为凋亡诱导药剂的候选物，并且可以考虑它们治疗和预防癌症以及作为抗癌剂的增效剂的用途。

本发明的癌症预防和治疗剂、凋亡诱导剂和抗癌剂的增效剂包含抑制Pim-1或其部分肽或其盐的活性的化合物或其盐。上述筛选方法或试剂盒能够用于寻找抑制Pim-1或其部分肽或盐的活性的化合物或其盐。

抑制Pim-1活性的化合物的具体例子包括含有与含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽相同或基本上相同的氨基酸序列的多肽。含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽是一种丢失了Pim-1的激酶活性结构域的多肽，包含SEQ ID No：1的氨基酸序列，并且是丢失了SEQ ID No：1的1-80位的氨基酸残基的多肽。含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽是丢失了激酶活性结构域的多肽。如果此多肽存在，则Pim-1的活性受到抑制。所以，这种多肽可以用作癌症的预防和治疗剂、凋亡诱导剂和抗癌剂的增效剂。抑制Pim-1活性的化合物包括抗Pim-1抗体。另外，抑制Pim-1活性的化合物包括编码Pim-1的基因，或更加具体地，抗包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列的多聚核苷酸的双链RNAs(下文中，有时称为“SiRNA”)，以及反义寡核苷酸。所述双链RNAs优选是21到23个碱基对的短干扰RNAs。

含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽，和与含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽基本上相同的多肽可以是合成的多肽。

与SEQ ID NO：3的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列是，例如，与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有大约50％或更高序列同源性的氨基酸序列，优选大约60％或更高，更加优选大约70％或更高，甚至更加优选大约80％或更高，尤其优选大约90％或更高，最优选大约95％或更高。

含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽包括，例如，包含具有SEQ ID No：3的氨基酸序列中一个或两个或多个(例如，大约1到50个，或优选大约1到30个)氨基酸缺失的氨基酸序列的蛋白质；包含具有SEQ ID No：3的氨基酸序列中一个或两个或多个(例如，大约1到100个，或优选大约1到30个)氨基酸添加的氨基酸序列的蛋白质；包含具有SEQ ID No：3的氨基酸序列中一个或两个或多个(例如，大约1到100个，或优选大约1到30个)氨基酸插入的氨基酸序列的蛋白质；包含具有SEQ ID No：3的氨基酸序列中一个或两个或多个(例如，大约1到100个，或优选大约1到30个)氨基酸取代的氨基酸序列的肽；或包含具有上述改变组合的氨基酸序列的蛋白质。这些氨基酸插入、取代和缺失的位置并不受到特别限制。

包含SEQ ID No：3的氨基酸序列的蛋白质的C末端可以是羧基(-COOH)，羧酸盐基(-COO^-)，酰胺基(-CONH₂)，或酯基(-COOR)。在酯基中的R包括，例如，1-6个碳原子的烷基如甲基、乙基、n-丙基、异丙基或n-丁基；3-8个碳原子的环烷基如环戊基或环己基；6-12个碳原子的芳基如苯基，或α萘基；苯基-烷基如苯甲基或苯乙基；α-萘基-烷基如α-萘甲基；7-14个碳原子的芳烷基；以及新戊酰羟基甲基(pivaloyloxymethyl)。当由SEQ IDNo：3所代表的蛋白质除了C末端的羧基之外具有羧基(或羧酸盐基)时，那些羧基可以进行酰胺化或酯化。这些酯包括，例如以上对于C末端所述的酯。另外，由SEQ ID No：3所代表的蛋白质可以是下列：N末端氨基酸残基(例如，蛋氨酸残基)的氨基被保护基(如1-6个碳原子的酰基，如包括甲酰基或乙酰基的1-6个碳原子的链烷酰基(alkanoyl group)保护的蛋白质；N末端谷氨酰胺残基转变为焦谷氨酸的蛋白质，所述谷氨酰胺由体内剪切所产生；或者分子中氨基酸的侧链上的取代基(-OH，-SH，氨基，咪唑基，吲哚基，胍基等)被适当的保护基(如1-6个碳原子的酰基，如包括甲酰基或乙酰基的1-6个碳原子的链烷酰基)所保护的氨基酸；或者偶联蛋白质如糖链连接的所谓糖蛋白。

包含SEQ ID No：3的氨基酸序列的多肽可以盐的形式存在，这类盐的例子与对于Pim-1所述的盐相似。

包含SEQ ID No：3的氨基酸序列的多肽可以通过已知的肽合成方法进行合成。肽合成方法的例子包括与对于Pim-1所述相似的方法。

这些肽还可以通过用合适的肽酶剪切上述Pim-1进行生产。

包含SEQ ID No：3的氨基酸序列的多肽还可以通过培养已用表达载体转化过的转化体来生产，所述表达载体携带编码包含SEQ ID No：3氨基酸序列的多肽的DNA(例如，包含SEQ ID No：4的核苷酸序列的DNA)。

编码包含SEQ ID No：3氨基酸序列的多肽的多聚核苷酸可以是包含SEQ ID No：4的核苷酸序列的DNAs，或是任何包含在高度严格条件下与含有SEQ ID No：4的核苷酸序列的DNA杂交的核苷酸序列的DNAs。

能够在高度严格条件下与SEQ ID No：4的核苷酸序列杂交的DNAs包括，例如，包含一种核苷酸序列的DNAs，所述核苷酸序列具有与SEQ ID NO：4大约50％或更高，优选大约60％或更高，更加优选大约70％或更高，甚至更加优选大约80％或更高，尤其优选大约90％或更高，或者最优选大约95％或更高的序列同源性的核苷酸序列。可以通过上述的方法进行杂交。更加优选地，可以在高度严格条件下进行杂交。高度严格条件指上述的条件。

克隆完全编码含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽的DNAs的手段包括利用合成的DNA引物以进行PCR扩增，所述引物包含编码含有SEQ IDNO：3的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的部分，或者将整合入合适载体的DNAs与标记的DNA片段或与合成的DNA杂交进行筛选，所述标记的DNA片段编码含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽的某些或全部区域。上面介绍了所用的杂交方法。对DNA核苷酸序列的改变也如上所述进行。

编码包含SEQ ID No：3氨基酸序列的多肽的DNA，如携带包含SEQ IDNo：4的核苷酸序列的多聚核苷酸的重组载体，能够通过连接合适表达载体中启动子下游的多聚核苷酸片段进行生产。使用上述的载体和启动子。

除了上述的启动子之外，根据需要重组载体可以包括已知的增强子，剪接信号，poly(A)添加信号，选择标记，SV40复制起始点(下文中有时缩写为“SV40orgdi”)等。另外，如果需要，由本发明的DNA编码的蛋白质还可以表达为与其它蛋白质(例如，谷胱甘肽-S-转移酶和蛋白A)的融合蛋白。可以通过利用位点特异性蛋白酶剪切这类融合蛋白以将它切分成各自的蛋白质。

利用上述重组载体转化宿主细胞的方法与上述的方法相同。另外，可以使用上述的宿主细胞。

上述宿主细胞的转化可以根据本领域公知的方法进行。这些方法与上述的方法相同。

获得多肽或其盐的方法包括在适于表达所述多肽的条件下培养上述宿主细胞，以及从获得的培养物中收集所述多肽的步骤，所述多肽或其盐包含与SEQ ID NO：3的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列。

具体地，所述方法可以通过对上述宿主细胞进行匀浆，随后利用酸等抽提匀浆，并通过已知的纯化方法从抽提物中纯化所述蛋白质来进行，所述纯化方法结合层析方法如反相层析和离子交换层析。

当多肽以游离的形式获得时，可以通过已知的方法将它转变为一种适当的盐。另外，当它作为一种盐而被获得时，可以通过已知的方法将它转变为一种游离的形式或不同的盐。

本发明的多聚核苷酸，能够与这些多聚核苷酸杂交的cDNAs的多聚核苷酸，或包含这些多聚核苷酸的重组载体可以用作癌症的预防和治疗剂、凋亡诱导剂和抗癌剂的增效剂，所述多聚核苷酸包含编码含有与SEQ ID No：3的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。

例如，通过(A)向患者施用一种表达载体，和体内表达本发明的多肽，其中上述的多聚核苷酸受一种启动子的控制，所述启动子可以在靶细胞中起作用，或(B)以与上述相似的方式，将本发明的多聚核苷酸导入从患者体内移除的细胞中，在所述细胞中表达上述多肽，以及随后将这些细胞移植到患者中以获得上述对于癌症患者的效果。当将上述多聚核苷酸用作上述目的时，可以通过常规技术给药所述多聚核苷酸，或者单独给药，或者在插入合适载体后给药，所述载体如反转录病毒载体，腺病毒载体，或腺病毒相关病毒载体。

对抗包含SEQ ID No：2的核苷酸序列的多聚核苷酸的双链RNAs抑制含有相同序列的基因的表达。它们因此抑制含有SEQ ID No：2的核苷酸序列的多聚核苷酸的表达，并且作为结果，Pim-1表达受到抑制，并且能够抑制Pim-1活性。这种双链RNAs优选是21-23个碱基对的短干扰RNAs。作为制备双链RNAs的方法，可以利用传统已知的方法而无特别限制，例如，可以利用Silencer siRNA构建试剂盒(Ambion)进行制备。

相应于包含SEQ ID No：2的核苷酸序列的多聚核苷酸的双链RNAs包括，例如：

包含含有SEQ ID No：9(5′-aaugaugaagucgaagagaucccugucuc-3′)的序列的多聚核苷酸和含有SEQ ID No：10(5′-aagaucucuucgacuucaucaccugucuc-3′)的序列的多聚核苷酸的双链RNAs；

包含含有SEQ ID No：11(5′-aaaucuaaugagaugcugacaccugucuc-3′)的序列的多聚核苷酸和含有SEQ ID No：12(5′-aaugucagcaucucauuagauccugucuc-3′)的序列的多聚核苷酸的双链RNAs；

包含含有SEQ ID No：13(5′-aaauccauggaugguucuggaccugucuc-3′)的序列的多聚核苷酸和含有SEQ ID No：14(5′-aauccagaaccauccauggauccugucuc-3′)的序列的多聚核苷酸的双链RNAs。

上述抑制Pim-1的化合物，如包含SEQ ID No：3的氨基酸序列的多肽，可以直接，或者在与一种生理上可接近的载体一起配制后进行给药，所述载体如一种增强吸收的辅剂。当利用上述多肽作为癌症的预防和治疗剂、凋亡诱导剂和抗癌剂的增效剂时，优选使用纯化到90％，更加优选95％或更高，甚至更加优选98％或更高，最优选99％或更高的所述多肽。根据需要，可以将上述多肽以糖衣片、胶囊、丹药、微胶囊等口服给药，或以气雾剂形式的吸入剂肠胃外给药，或制备成溶于水或其它可药用溶液的无菌溶液，或可注射的溶液如悬浮剂。

例如，可以将本发明的多肽与生理学上可接受的已知载体、调味剂、赋形剂、着色剂、防腐剂、稳定剂、粘合剂等以符合制药规定的要求的常用单位剂型进行混合，以便生产药物制剂。调节这些制剂中活性成分的量从而在特定范围内获得合适剂量。可以混合入片剂、胶囊等的添加剂包括粘和剂如明胶、玉米淀粉、西黄耆胶和阿拉伯胶；赋形剂如结晶纤维素；膨胀剂如玉米淀粉、明胶和藻酸；润滑剂如硬脂酸镁；甜味剂如蔗糖、乳糖和糖精；加味剂如薄荷、akamono oil和樱桃。当单位剂型为胶囊形式时，可进一步将液体载体如油和脂肪同上述材料一起使用。可以通过将本发明的多肽溶解、悬浮或乳化于通常用来制备注射液的无菌水性介质或油脂介质中来制成注射液。用于注射的水性介质的例子包括，生理盐水、及包含葡萄糖和其它辅助制剂的等渗溶液，并可以将它们与合适的助溶剂如醇(例如，乙醇等)、聚醇(如丙二醇或聚乙二醇等)、或非离子表面活性剂[例如聚山梨酸酯80，HCO-50(聚氧乙烯(50mol)氢化蓖麻油的加合物)]结合使用。油脂介质包括芝麻油和大豆油，它们可与助溶剂如苯甲酸苄酯和苯甲醇结合使用。制剂还包括缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液或乙酸钠缓冲液等)、镇静剂(例如，苯扎氯胺或盐酸普鲁卡因)、稳定剂(例如，人血清白蛋白或聚乙二醇)、防腐剂(例如，苯甲醇或酚)或抗氧化剂结合使用。制备的注射液体一般装在合适的安瓿中。剂量根据患者的体重和年龄以及给药方法变化，但是本领域技术人员能够适当地选择合适的剂量。

插入上述多聚核苷酸的重组载体也如上所述进行制备，并正常地进行肠胃外给药。由于以此方式获得的药物制品是安全的并具低毒性，可以将它们给药于，例如，温血动物(例如，豚鼠、大鼠、小鼠、鸡、兔、猪、羊、牛、猴等)，并且能够用作癌症的预防和治疗剂、凋亡诱导剂和抗癌剂的增效剂。

上述癌症治疗和预防剂，以及抗癌剂的增效剂，靶向诸如胰腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、胆管癌、脾癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、脑肿瘤和血癌的癌症，这些药剂对于抗实体癌特别有效，所述实体癌的细胞中的氧浓度是降低的。

将本发明的癌症治疗剂和预防剂、凋亡诱导剂和抗癌剂的增效剂直接或在通过已知的药学方法配成制剂之后向患者给药。例如，它们可以在配成制剂之后通过适当地结合可药用的载体或介质，更加具体地，无菌水和生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂等进行给药。可以通过本领域技术人员公知的方法将所述药剂向患者给药，如动脉内注射、静脉内注射、皮下注射，以及鼻内、经支气管、肌肉内或口服给药。剂量根据患者的体重和年龄、给药方法而异，但本领域技术人员能够适当地选择合适的剂量。

实施例

下面，参考实施例具体说明本发明，但并不受限于此。

[实施例1]

研究实体癌细胞在低的和正常的氧分压下对于抗癌剂的敏感性。将三种类型的实体胰腺癌细胞系(PCI-35细胞，KMP-4细胞，和PCI-43细胞)用作细胞。对于每种类型的细胞，在存在50g/mL顺铂时在低氧分压(1％氧气，5％二氧化碳；下文中，实施例中为相同值)或正常氧分压(20％氧气，5％二氧化碳；下文中，实施例中为相同值)下将2×10³个细胞培养六小时。培养后，用生理盐水缓冲液(pH7.4)将细胞洗涤两次以制备样品。将Dulbecco’sModified Eagle’s Medium/F12用作培养的培养基(下文中，如果不特别指定，假定为使用相同培养基)。

将上述细胞用碘化丙啶(propidium iodide)(PI)和FITC-偶联的抗膜联蛋白V进行染色，并利用FACS calibur(Becton Dickinson)进行FACS分析。

FACS的结果显示于图1中。在图1中，“含氧量正常(Normoxia)”意为在正常的氧分压下，而“低氧(Hypoxia)”意为在低氧分压下(下文相同)。在实施例中的FACS分析可以描述为用PI和抗-膜联蛋白V对细胞染色，和基于染色强度分选细胞以显示分布，如图1中的分布。在附图中，右下方的象限代表早期凋亡细胞，而右上方的象限代表晚期凋亡细胞。左下方的象限代表活细胞。凋亡细胞的比例显示为百分比，所述凋亡细胞为右下方和右上方象限的总和。下文中，以相同的方式显示FACS分析。

如图1中所示，当在顺铂存在的情况下培养细胞时，对于三种类型的实体胰腺癌细胞系来说在含氧量正常下凋亡的诱导大约是在低氧下的两倍。更加具体地，在三种类型的实体胰腺癌细胞系中，发现调亡诱导在低氧下比在含氧量正常下更加强烈地受到抑制。

[实施例2]

在与实施例1相同的条件下培养PCI-43细胞多达24小时。如在实施例1中的对培养前和培养后12小时和24小时获得的样品进行分析。结果显示于图2中。如图2中所示，调亡随着时间进展而被顺铂诱导，但是当在低氧下进行培养时凋亡细胞的比例为在含氧量正常下时的大约一半。

上述结果显示每种类型的细胞都在低氧情况下比在含氧量正常下更加耐受顺铂诱导的凋亡。

[实施例3]

利用吉西他滨(gemcitabine)、阿霉素(adriamycin)和顺铂(cisplatin)，并且利用PCI-43细胞，如实施例1中一样进行测量。吉西他滨和阿霉素的浓度分别为0.1-1mol和0.1-5mol。由测量的结果计算IC50值，如下所示。

在用各浓度的抗癌剂处理48小时后，测定活细胞的数目，并当未加入各种抗癌剂时所存在的半数活细胞所需的抗癌剂浓度定义为IC50值。结果显示于表1中。

[表1]

如表1中所示，对于由抗癌剂吉他西滨和阿霉素进行的50％凋亡诱导，在低氧情况下比在含氧量正常情况下，吉他西滨和阿霉素都需要更高的浓度，正如顺铂一样。

[实施例4]

通过如在实验1中一样培养细胞对PCI-43细胞进行分析，除了使用2g/mL的抗-Fas抗体而代替顺铂。在培养前以及在培养24小时后进行分析。结果显示于图3中。

如图3中所示，发现PCI-43细胞在低氧情况下比在含氧量正常情况下对于抗Fas抗体诱导的凋亡更加敏感。

[实施例5]

在低氧和含氧量正常情况下培养各种癌细胞16小时，并分析每种细胞中的Pim-1蛋白质和Pim-1mRNA。

所用的细胞为HCT116(结肠癌细胞系)，HePG2(肝癌细胞系)，KMP-4(胰腺癌细胞系)，PCI-10(胰腺癌细胞系)，PCI-35(胰腺癌细胞系)，和PCI-43(胰腺癌细胞系)。在低氧(1％氧气，5％二氧化碳)，或含氧量正常(20％氧气，5％二氧化碳)中将每种类型的细胞培养16小时。利用Trizol试剂从培养的细胞中提取RNA，并利用1％NP-40裂解缓冲液(50M Tris pH7.5，150nM NaCl，2M EDTA，1M EGTA，50M NaF，1M Na₃VO₄，1mMPMSF)从培养的细胞中提取蛋白质。

通过Western印迹检测蛋白质。更加具体地，将上述样品通过12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，并随后印迹到硝化纤维膜上。将膜用封闭缓冲液(5％脱脂牛奶，溶于生理性的Tween-磷酸盐缓冲液中)进行封闭，与抗Pim-1抗体反应一小时，随后用过氧化物酶偶联的羊抗小鼠IgG二抗温育，并利用ECL检测试剂盒(Amersham)进行检测。

结果显示于图4中。图4显示利用Western印迹检测Pim-1的结果，所述Pim-1由在低氧和含氧量正常情况下培养各种细胞获得。在图4中，N和H分别指在含氧量正常和低氧情况下培养的结果。如图4中所示，在所有被检查的细胞系中，当在低氧情况下培养时比在含氧量正常情况下培养时Pim-1的量更大。

接下来，进行Northern印迹以检测各种细胞中的Pim-1mRNA。通过RT-PCR扩增进行Pim-1检测的cDNA片段并用作Northern印迹分析的探针。将下列用作PCR引物。

pim-1

正向：5’-GGTTGGATGCTCTTGTCCAA-3’(SEQ ID No：5)

反向：5’-CCTTCCAGAAGTCTTCTAT-3’(SEQ ID No：6)

结果显示于图5中。图5显示利用Northern印迹检测Pim-1mRNA的结果，所述Pim-1由在低氧和含氧量正常情况下培养各种细胞获得。显示于图5底部的图显示通过利用扫描仪读取上面所示Western印迹分析结果的强度比率。图5显示在所有被检查的细胞系中，当在低氧情况下培养时比在含氧量正常情况下培养时Pim-1mRNA的量更大。

上述结果显示在低氧情况下培养时比在含氧量正常情况下于癌细胞中产生更大量的Pim-1。

[实施例6]

当将各种癌细胞暴露于低氧时随着时间观察Pim-1蛋白质的表达。所用的细胞为HCT116、PCI-10和PCI-43。在培养细胞前，和在暴露于低氧两小时和四小时后对细胞取样。将细胞以与实施例5中相同的方式进行处理，并进行Western印迹。结果显示于图6中。在图6中，将β-肌动蛋白用作检测对照。如图6中所示，在全部三种所用细胞类型中，发现Pim-1的量在暴露于低氧后随着时间增加。

[实施例7]

研究Pim-1在含氧量正常情况下是否被蛋白酶所降解。将PCI-43细胞在低氧和含氧量正常下培养。在培养前，培养4、12和24小时后对在低氧下培养的细胞取样。将细胞以与实施例5中相同的方式进行处理，并进行Western印迹。在培养基中进行含氧量正常下的培养，所述培养基中加入了50M的蛋白酶体抑制剂N-乙酰基-L-亮氨酰基-L-亮氨酰基-L-正亮氨酸(N-acetyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L-norleucinal)(ALLN)。当在含氧量正常下培养时，在培养前，培养6和12小时后获得样品。。将细胞以与实施例5中相同的方式进行处理，并进行Western印迹。结果显示于图7中。如图7中所示，当低氧下培养时，自暴露于低氧之后Pim-1的量随着时间增加，并且在含氧量正常情况下Pim-1的量也随着时间增加。这显示在不存在蛋白酶体抑制剂的情况下Pim-1蛋白正在被降解。

[实施例8]

在存在蛋白酶体抑制剂ALLN的情况下在含氧量正常下培养PCI-43细胞。将细胞培养十六小时，取样，并在泛素的免疫沉淀之后通过Western印迹进行分析。实施与实施例5中相同的操作，除了使用抗泛素抗体和抗Pim-1抗体作为一抗。ALLN的浓度为0，50和100M。结果显示于图8中。在图8中，左侧显示利用抗Pim-1抗体作为一抗的结果，而右侧显示利用抗泛素抗体作为一抗的结果。如图8所示，由于样品与抗Pim-1抗体反应，Pim-1抗体结合到免疫沉淀的泛素上。更加具体地，Pim-1首先被泛素化(ubiquitinated)，蛋白酶体利用泛素(ubiquitin)作为标记，并降解Pim-1。

[实施例9]

实施例1-3显示由各种抗癌剂引发的凋亡诱导能力在低氧下于癌细胞中得以减弱。另外，由于实施例4显示大量的Pim-1存在于在低氧下培养的癌细胞中，建立一种显性失活的(dominant-negative)Pim-1转染子以便说明Pim-1的作用。该Pim-1转染子产生一种缺失激酶活性结构域的野生型Pim-1肽，或更加具体地，一种由SEQ ID No：3所代表的肽。

由纯化自PCI-10细胞的mRNA的RT产物扩增缺失激酶活性结构域的显性失活的Pim-1的cDNA，并克隆入pCR4-TOPO。利用ABI377自动测序仪(Applied Biosystems)和DyeDeoxy Terminator试剂盒(Perkin-Elmer)对所述cDNA进行测序。随后连接克隆的cDNA片段至质粒载体pcDNA3.1(Invitrogen)中。下面简单介绍RT-PCR方法。

通过在反应混合物中于37℃温育一小时进行每种RNA样品(5g)的cDNA扩增，所述反应混合物包含75mM KCl，50mM Tris-HCl(pH8.3)，3mM MgCl₂，10mM二硫苏糖醇，每种dNTP 0.5mM，2M随机引物，和1000U AMLV反转录酶(Gibco BRL)。在反应混合物中对cDNA进行PCR扩增，所述反应混合物包含50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH9.0)，2.5mMMgCl₂，0.1％Triton X-100，每种dNTP 200M，每种特异性引物10M，和1U的Taq聚合酶(Gibco BRL)。对于PCR，在DNA热循环仪(Barnstead/Thermolyne)中进行35个循环(94℃，一分钟；60℃，一分钟；和72℃，两分钟)。

将下列用作PCR引物：

dnpim-1

正向：5’-GTAGAATTCGCCACCATGCCTGCCTAATGGCACTCGAGTG-3’(SEQ ID No：7)

反向：5’-GTACTATTTGCTGGGCCCCGGCGAC-3’(SEQ ID No：8)

利用脂转染胺(Life Technologies)将获得的载体转导入PCI-43细胞。用1,200g/mL的G-418筛选转染子，并随后通过限制性稀释以获得显性失活的转染子(dominant-negative transfectant)dnp3、dnp4和dnp10进行克隆。接下来，在存在600g/mLG-418的情况下维持所述转染子。

对于获得的转染细胞进行蛋白质电泳。利用1％NP-40裂解缓冲液(50M Tris pH7.5，150nM NaCl，2M EDTA，1M，EGTA，50M NaF，1M Na₃VO₄和1M PMSF)进行样品制备。

作为对照，也对用载体转化的细胞进行蛋白质电泳。

结果显示于图9中。图9显示对转化细胞进行蛋白质电泳的结果。如图9所示，代表缺失激酶活性结构域的Pim-1的峰被发现于dnp3、dnp4和dnp10中(图9中的dnPim-1)。在只用载体进行转化的细胞中没有检测到这种峰(v3和v4)。

[实施例10]

如在实施例1中一样对实施例9中所获细胞dnp3、dnp4和dnp10细胞，以及对v3细胞测量凋亡诱导能力，所述v3细胞只导入了载体。结果显示于图10中。

如在图10中所示，当存在顺铂的情况下培养v3时，在含氧量正常下比在低氧下诱导了两倍的凋亡。相反，在显性失活的Pim-1dnp3、dnp4和dnp10中，没有观察到在含氧量正常下和在低氧下之间的差异。

[实施例11]

如在实施例1中一样培养细胞并进行分析，除了使用2g/mL的抗Fas抗体而非顺铂。在培养前，和在培养24小时后进行分析。结果显示于图11中。

如图11中所示，在低氧和含氧量正常下v3、dnp3、dnp4和dnp10对于由抗Fas抗体诱导的凋亡的敏感性相同。

根据实施例9和10，当Pim-1作用受到抑制时，对于由抗癌剂诱导的凋亡的敏感性恢复，但对于在低氧条件下由抗Fas抗体诱导的凋亡的敏感性并未恢复。这显示在胰腺癌细胞中Pim-1与抗癌剂抗性相关。

[实施例12]

将v3，dnp3，dnp4和dnp10每种5x10⁶细胞皮下注射到SCID小鼠的右侧腹中。皮下注射后，每三天观察肿瘤大小直到第21天。通过用测径器测量肿瘤的长和短径，并利用下列等式来测量肿瘤大小：

(短径)x(短径)x(长径)/2。

结果显示于图12中。图12是显示当施用多种细胞时肿瘤大小变化的曲线图。在图12的曲线图中，横轴显示皮下注射以来的天数，而纵轴显示肿瘤大小(mm³)。图12的曲线图显示来自实验的平均值和标准偏差，每一个所述实验都使用5只SCID小鼠进行。如图12中所示，随着天数增多，在施用了v3的组中肿瘤体积增加。相反地，在施用了dnp3，dnp4和dnp10的携带显性失活的Pim-1的组中，肿瘤大小从施用后第6天减小。因此，发现显性失活的Pim-1缺乏肿瘤形成能力。

[实施例13]

在皮下注射6天后将肿瘤组织从实施例12中所用的小鼠中移除，并且将所述组织进行免疫组化染色：凋亡细胞的PCNA和TUNEL染色。结果显示于图13中。

在图13中，(a)显示来自皮下注射v3细胞的小鼠的肿瘤细胞的PCNA染色；(b)显示来自皮下注射dnp4细胞的小鼠的肿瘤细胞的PCNA染色；(c)显示来自皮下注射v3细胞的小鼠的肿瘤细胞的TUNEL染色；而(d)显示来自皮下注射dnp4细胞的小鼠的肿瘤细胞的TUNEL染色。如图13中所示，在v3样品中比在dnp4样品中有显著更多的细胞被PCNA阳性染色，而相反地，TUNEL阳性染色的细胞只发现于dnp4样品中。

这些结果显示Pim-1功能是体内形成胰腺癌所必需的。

[实施例14]

利用Silencer siRNA构建试剂盒(Ambion)生产包含含有SEQ ID No：9的核苷酸序列的多聚核苷酸和含有SEQ ID No：10的核苷酸序列的多聚核苷酸的SiRNA；包含含有SEQ ID No：11的核苷酸序列的多聚核苷酸和含有SEQ ID No：12的核苷酸序列的多聚核苷酸的SiRNA；和包含含有SEQ IDNo：13的核苷酸序列的多聚核苷酸和含有SEQ ID No：14的核苷酸序列的多聚核苷酸的SiRNA(这些被称为Pim-1-RNASi-379，Pim-1-RNASi-784和Pim-1-RNASi-848)。将包含由SEQ ID NO：15所代表的核苷酸序列的SiRNA用作对照(这被称为GFP对照)。将PCI-43细胞(2x10⁵个细胞)铺到6孔板上，并温育12小时。接下来利用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将SiRNA导入这些细胞，将细胞温育24小时，在低氧下和在含氧量正常下用50M顺铂培养48小时，并如实施例1中一样进行FACS分析。

将FACS分析的结果显示于图14中。如图14中所示，当在含氧量正常下在顺铂存在的情况下培养对照细胞时，与在低氧相比诱导了大约二倍的凋亡。相反地，当在SiRNA存在的情况下进行培养时，在含氧量正常和低氧情况下的结果没有区别。

[实施例15]

将人胚肾293细胞系与pcDNA3.1-Pim-1表达载体和候选化合物混合，并随后进行孵育，所述细胞系携带一种将全长c-Myb连接到pcDNA3.1上的表达载体，以及一种通过将五种c-Myb结合序列(5’-TAACGGTT-3’，包含SEQ ID No：16的核苷酸序列)串联到pTAL-Luc载体上而制备的c-Myb荧光素酶表达载体。孵育后，使用双重荧光素酶测试试剂(Promega)测量荧光素酶活性。将实施例9中获得的显性失活的Pim-1转化体用作候选化合物。

尽管结果未作为附图显示，当混合显性失活的Pim-1转化体时荧光素酶活性受到抑制，而这确证了这种系统能够用于寻找抑制Pim-1活性的化合物。

如上面详述的，当暴露于低氧时各种癌细胞中Pim-1的量提高，而在含氧量正常情况下Pim-1被降解。利用显性失活的Pim-1抑制Pim-1基因的功能引起抗癌剂耐受性和肿瘤形成能力二者的降低。

因此，抑制Pim-1蛋白或Pim-1基因的功能能够显示出癌症治疗、凋亡诱导和抗癌剂效果增强的效应。所以，显性失活的Pim-1和抑制Pim-1的化合物对于癌症治疗等有效。

序列表

<110>株式会社康福来(ONCOREX，INC.)

<120>药物

<130>pctf178

<140>PCT/JP04/004917

<141>2004-04-05

<150>US 60/459,644

<151>2003-04-03

<160>16

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>313

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

Met Leu Leu Ser Lys Ile Asn Ser Leu Ala His Leu Arg Ala Ala Pro

1 5 10 15

Cys Asn Asp Leu His Ala Thr Lys Leu Ala Pro Gly Lys Glu Lys Glu

20 25 30

Pro Leu Glu Ser Gln Tyr Gln Val Gly Pro Leu Leu Gly Ser Gly Gly

35 40 45

Phe Gly Ser Val Tyr Ser Gly Ile Arg Val Ser Asp Asn Leu Pro Val

50 55 60

Ala Ile Lys His Val Glu Lys Asp Arg Ile Ser Asp Trp Gly Glu Leu

65 70 75 80

Pro Asn Gly Thr Arg Val Pro Met Glu Val Val Leu Leu Lys Lys Val

85 90 95

Ser Ser Gly Phe Ser Gly Val Ile Arg Leu Leu Asp Trp Phe Glu Arg

100 105 110

Pro Asp Ser Phe Val Leu Ile Leu Glu Arg Pro Glu Pro Val Gln Asp

115 120 125

Leu Phe Asp Phe Ile Thr Glu Arg Gly Ala Leu Gln Glu Glu Leu Ala

130 135 140

Arg Ser Phe Phe Trp Gln Val Leu Glu Ala Val Arg His Cys His Asn

145 150 155 160

Cys Gly Val Leu His Arg Asp Ile Lys Asp Glu Asn Ile Leu Ile Asp

165 170 175

Leu Asn Arg Gly Glu Leu Lys Leu Ile Asp Phe Gly Ser Gly Ala Leu

180 185 190

Leu Lys Asp Thr Val Tyr Thr Asp Phe Asp Gly Thr Arg Val Tyr Ser

195 200 205

Pro Pro Glu Trp Ile Arg Tyr His Arg Tyr His Gly Arg Ser Ala Ala

210 215 220

Val Trp Ser Leu Gly Ile Leu Leu Tyr Asp Met Val Cys Gly Asp Ile

225 230 235 240

Pro Phe Glu His Asp Glu Glu Ile Ile Arg Gly Gln Val Phe Phe Arg

245 250 255

Gln Arg Val Ser Ser Glu Cys Gln His Leu Ile Arg Trp Cys Leu Ala

260 265 270

Leu Arg Pro Ser Asp Arg Pro Thr Phe Glu Glu Ile Gln Asn His Pro

275 280 285

Trp Met Gln Asp Val Leu Leu Pro Gln Glu Thr Ala Glu Ile His Leu

290 295 300

His Ser Leu Ser Pro Gly Pro Ser Lys

305 310

<210>2

<211>942

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>2

atgctcttgt ccaaaatcaa ctcgcttgcc cacctgcgcg ccgcgccctg caacgacctg 60

cacgccacca agctggcgcc cggcaaggag aaggagcccc tggagtcgca gtaccaggtg 120

ggcccgctac tgggcagcgg cggcttcggc tcggtctact caggcatccg cgtctccgac 180

aacttgccgg tggccatcaa acacgtggag aaggaccgga tttccgactg gggagagctg 240

cctaatggca ctcgagtgcc catggaagtg gtcctgctga agaaggtgag ctcgggtttc 300

tccggcgtca ttaggctcct ggactggttc gagaggcccg acagtttcgt cctgatcctg 360

gagaggcccg agccggtgca agatctcttc gacttcatca cggaaagggg agccctgcaa 420

gaggagctgg cccgcagctt cttctggcag gtgctggagg ccgtgcggca ctgccacaac 480

tgcggggtgc tccaccgcga catcaaggac gaaaacatcc ttatcgacct caatcgcggc 540

gagctcaagc tcatcgactt cgggtcgggg gcgctgctca aggacaccgt ctacacggac 600

ttcgatggga cccgagtgta tagccctcca gagtggatcc gctaccatcg ctaccatggc 660

aggtcggcgg cagtctggtc cctggggatc ctgctgtatg atatggtgtg tggagatatt 720

cctttcgagc atgacgaaga gatcatcagg ggccaggttt tcttcaggca gagggtctct 780

tcagaatgtc agcatctcat tagatggtgc ttggccctga gaccatcaga taggccaacc 840

ttcgaagaaa tccagaacca tccatggatg caagatgttc tcctgcccca ggaaactgct 900

gagatccacc tccacagcct gtcgccgggg cccagcaaat ag 942

<210>3

<211>233

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>3

Pro Asn Gly Thr Arg Val Pro Met Glu Val Val Leu Leu Lys Lys Val

1 5 10 15

Ser Ser Gly Phe Ser Gly Val Ile Arg Leu Leu Asp Trp Phe Glu Arg

20 25 30

Pro Asp Ser Phe Val Leu Ile Leu Glu Arg Pro Glu Pro Val Gln Asp

35 40 45

Leu Phe Asp Phe Ile Thr Glu Arg Gly Ala Leu Gln Glu Glu Leu Ala

50 55 60

Arg Ser Phe Phe Trp Gln Val Leu Glu Ala Val Arg His Cys His Asn

65 70 75 80

Cys Gly Val Leu His Arg Asp Ile Lys Asp Glu Asn Ile Leu Ile Asp

85 90 95

Leu Asn Arg Gly Glu Leu Lys Leu Ile Asp Phe Gly Ser Gly Ala Leu

100 105 110

Leu Lys Asp Thr Val Tyr Thr Asp Phe Asp Gly Thr Arg Val Tyr Ser

115 120 125

Pro Pro Glu Trp Ile Arg Tyr His Arg Tyr His Gly Arg Ser Ala Ala

130 135 140

Val Trp Ser Leu Gly Ile Leu Leu Tyr Asp Met Val Cys Gly Asp Ile

145 150 155 160

Pro Phe Glu His Asp Glu Glu Ile Ile Arg Gly Gln Val Phe Phe Arg

165 170 175

Gln Arg Val Ser Ser Glu Cys Gln His Leu Ile Arg Trp Cys Leu Ala

180 185 190

Leu Arg Pro Ser Asp Arg Pro Thr Phe Glu Glu Ile Gln Asn His Pro

195 200 205

Trp Met Gln Asp Val Leu Leu Pro Gln Glu Thr Ala Glu Ile His Leu

210 215 220

His Ser Leu Ser Pro Gly Pro Ser Lys

225 230

<210>4

<211>702

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>4

cctaatggca ctcgagtgcc catggaagtg gtcctgctga agaaggtgag ctcgggtttc 60

tccggcgtca ttaggctcct ggactggttc gagaggcccg acagtttcgt cctgatcctg 120

gagaggcccg agccggtgca agatctcttc gacttcatca cggaaagggg agccctgcaa 180

gaggagctgg cccgcagctt cttctggcag gtgctggagg ccgtgcggca ctgccacaac 240

tgcggggtgc tccaccgcga catcaaggac gaaaacatcc ttatcgacct caatcgcggc 300

gagctcaagc tcatcgactt cgggtcgggg gcgctgctca aggacaccgt ctacacggac 360

ttcgatggga cccgagtgta tagccctcca gagtggatcc gctaccatcg ctaccatggc 420

aggtcggcgg cagtctggtc cctggggatc ctgctgtatg atatggtgtg tggagatatt 480

cctttcgagc atgacgaaga gatcatcagg ggccaggttt tcttcaggca gagggtctct 540

tcagaatgtc agcatctcat tagatggtgc ttggccctga gaccatcaga taggccaacc 600

ttcgaagaaa tccagaacca tccatggatg caagatgttc tcctgcccca ggaaactgct 660

gagatccacc tccacagcct gtcgccgggg cccagcaaat ag 702

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>5

ggttggatgc tcttgtccaa 20

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>6

ccttccagaa gtcttctat 19

<210>7

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>7

gtagaattcg ccaccatgcc tgcctaatgg cactcgagtg 40

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>8

gtactatttg ctgggccccg gcgac 25

<210>9

<211>29

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：短干扰RNA

<400>9

aaugaugaag ucgaagagau cccugucuc 29

<210>10

<211>29

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：短干扰RNA

<400>10

aagaucucuu cgacuucauc accugucuc 29

<210>11

<211>29

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：短干扰RNA

<400>11

aaaucuaaug agaugcugac accugucuc 29

<210>12

<211>29

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：短干扰RNA

<400>12

aaugucagca ucucauuaga uccugucuc 29

<210>13

<211>29

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：短干扰RNA

<400>13

aaauccaugg augguucugg accugucuc 29

<210>14

<211>29

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：短干扰RNA

<400>14

aauccagaac cauccaugga uccugucuc 29

<210>15

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：短干扰RNA

<400>15

ggcuacgucc aggagcgcac c 21

<210>16

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>16

taacggtt 8

Claims

1.一种筛选胰腺癌的预防或治疗性药剂的方法，其中所述方法包括，鉴定抑制丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1或其部分肽、或其盐的活性的化合物。

2.一种筛选胰腺癌凋亡诱导剂的方法，其中所述方法包括鉴定抑制丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1或其部分肽、或其盐的活性的化合物。

3.一种筛选胰腺癌抗癌剂的增效剂的方法，其中所述方法包括鉴定抑制丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1或其部分肽、或其盐的活性的化合物。

4.权利要求1的方法，其中所述方法包括下列步骤：

将试验物质与丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1或其部分肽、或其盐相接触；和

检测丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1的磷酸化活性，以鉴定抑制丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1活性的化合物。

5.权利要求2的方法，其中所述方法包括下列步骤：

6.权利要求3的方法，其中所述方法包括下列步骤：

7.权利要求4-6之一的方法，其中所述磷酸化活性通过利用一种报道基因表达水平的变化作为指征来检测，所述基因响应于丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1磷酸化底物的结合而被激活。

8.权利要求4-6之一的方法，其中所述磷酸化活性利用抗体进行检测，所述抗体识别丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1磷酸化底物的磷酸化形式。