CN100536918C

CN100536918C - 尘螨合剂

Info

Publication number: CN100536918C
Application number: CNB2006100231590A
Authority: CN
Inventors: 胡赓熙
Original assignee: ZHEJIANG WOLWO BIOTECH CO Ltd
Current assignee: Zhejiang Wolwo Bio-pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2006-01-09
Filing date: 2006-01-09
Publication date: 2009-09-09
Anticipated expiration: 2026-01-09
Also published as: CN1840189A

Abstract

本发明提供了一种治疗过敏性疾病的药物组合物，该组合物包含粉尘螨变应原、户尘螨变应原以及药学上可接受的载体。本发明还涉及所述药物组合物的制备方法。本发明的组合物可用于过敏性哮喘、变应性鼻炎、过敏性皮炎、慢性荨麻疹等症的治疗。

Description

尘螨合剂

技术领域

本发明属于生物技术药物领域，具体涉及一种用于通过特异性免疫治疗方法预防和治疗过敏性疾病的药物组合物及其制备方法。

背景技术

1.尘螨与过敏性哮喘和变应性鼻炎的关系

哮喘是当今世界上最常见的疾患之一，也是世界公认的医学难题，被世界卫生组织(WHO)列为疾病中四大顽症之一，WHO把哮喘定义为终身疾病。根据2003年世界哮喘日的最新数据估计，目前全球每20个人中就有1个患有哮喘。全球哮喘负担报告的初步调查结果显示，哮喘是目前全球最常见的慢性疾病之一，约累计影响3亿人。根据全球哮喘防治创议的资料，每年全世界有超过1亿新增哮喘病例。我国哮喘患病率明显上升(统计学有显著意义)，由1990年0.9％上升到2000年1.50％，增加了64.8％，这与全球范围哮喘患病率普遍升高的趋势是一致的。

哮喘是气道的慢性过敏性炎症反应，是致敏原诱发的迟发性变态反应，由多种细胞和炎症介质、细胞因子参与的慢性气道炎症。

尘螨是世界性分布最强烈的变应原之一。它主要引起尘螨过敏性哮喘(吸入性哮喘的一种)、过敏性皮炎(遗传过敏性皮炎atopic dermatitis)和变应性鼻炎(血管舒缩性鼻炎vasomotor rhinitis)等螨性遗传过敏(mitey atopy)。能引起人类变态反应的尘螨主要有3种，即尘螨亚科中的尘螨属(Dermatophagoides)的2种：户尘螨(D.pteronyssinus)和粉尘螨(D.farinae)，以及蚍螨亚科中一种欧尘螨属(Euroglyphus)的埋内欧尘螨(E.maynei)，三种尘螨从抗原性强度方面比较，粉尘螨和户尘螨比埋内欧尘螨强得多。

以螨为变应原引起的慢性气道炎症所致的哮喘称之为尘螨过敏性哮喘(Dust MiteSensitive Asthma，DMSA)。在婴儿哮喘中，尘螨过敏性哮喘占80％，成人哮喘中尘螨过敏性哮喘占40％～50％。

尘螨也是引起变应性鼻炎(过敏性鼻炎)最主要的变应原种类。变应性鼻炎同样是一个全球性健康问题，它在世界各地均常见，其全球发病率10％—25％，并且患者数仍在增加；它可以影响患者的日常生活、学习以及工作效率，并且造成经济上的严重负担。许多研究均表明，尘螨是变应性鼻炎最主要的变应原。

尘螨变应原是高度水溶的，并且是耐热的，水液提取后稀释至1/10万，90％左右的过敏体质者对它呈皮内试验阳性反应。尘螨变应原的分子量在20KD～30KD之间，可能是糖蛋白，但亦非单一物质，其抗原成分在2至5种以上，已经由琼脂双向扩散试验和圆盘电泳等血清免疫学技术所阐明。

肖文秀等研究者用皮肤试验法研究了室内尘螨变应原与哮喘患儿的关系，研究发现哮喘患儿对室内尘螨的皮肤试验阳性率高达87.5％，而正常儿童仅11.4％，这一结果提示，室内尘螨与儿童哮喘关系密切，可能是其重要的致敏原。

1969年，Voorhorst等提出当每克屋尘含有多于100个以上的尘螨就有诱发过敏症状和哮喘的危险。据报道，尘螨致敏的哮喘患者，通常居住在每克屋尘含有多于500个尘螨的居室中，而每克屋尘中可含有多达1350个尘螨。对于具有特应性体质的哮喘患儿来说，生活在一个充满螨的空间里，无疑对其疾病的发展起到了推波助澜的作用。

2.尘螨变应原

过敏性哮喘和变应性鼻炎患者普遍对尘螨过敏。室内尘螨中最常见的诱发过敏性疾病的变应原是属于Dermatophagoids类的户尘螨(DErmatophagoids Pteronyssinus，Der.p.)和粉尘螨(Dermatophagoids farine，Der.f.)，也有其它螨类，如Bloryia tropocalis，Chortoglyphus arcuatus，Lepidoglyphus destructor和Aleuroglyphus ovatus等。在全世界范围内，居室内最优势的螨类是粉尘螨和户尘螨。尘螨靠吃人体脱落的皮肤鳞屑生长繁殖，其最具变应原的部分是躯干和粪小球。

Arlian LG于1987年用异种交叉免疫电泳方法(Heterologous crossedimmunoelectrophoresis，CIE)分析证明Dp和Df螨体提取液中含有21中交叉抗原。将两个螨过敏患者血清与此免疫电泳凝胶相培养，然后进行凝胶电泳，发现9种以上的交叉抗原与螨sIgE在交叉放射免疫电泳上显示结合，为共同变应原。同样方法分析到在二螨粪便中有13种共同抗原，其中有8种以上为共同变应原。而Hong CS在1991年用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离Df提取液并用放射自显影术鉴定其成分，发现Df虫体提取物中共有30条蛋白条带，有13条分子量在93KD和12KD之间的条带可与尘螨过敏患者sIgE结合。Df虫体的主要变应原蛋白成分的分子量在14—15KD之间，可与95.7％的患者血清中sIgE出现反应。Heymann PW对Derf II与DerpII进行了比较性研究。他用SDS—PAGE证明了DerfII和Derp II均为单一多肽链，两者分子量25KD。

在尘螨的各组变应原中，以第I组(Der I)和第II组(Der II)变应原研究得最多。

Derp1和Derf1有80％序列是一致的，两种蛋白均为半胱氨酸蛋白酶，与木瓜蛋白酶和肌动蛋白(actinidin)属同一家族，有222或223个氨基酸残基，分子量为25kDa。Derp2和Derf2的cDNA序列均有129个氨基酸，分子量为14kDa，没有N-端糖基化作用位点。它们相互间有12％的氨基酸差异，此差异甚至分布于整个序列中。

3.过敏性哮喘和变应性鼻炎的治疗现状

3.1 过敏性哮喘

过敏性哮喘的治疗目标包括尽快控制哮喘症状至最轻，乃至无任何症状，包括夜间无症状；使哮喘发作次数减至最少，甚至不发作；β2激动剂用量减至最少，乃至不用；所用药物副作用最少，乃至没有；活动不受任何限制，与正常人一样生活、工作、学习。

目前，过敏性哮喘的治疗应该根据患者平素病情的轻重程度选择最合适的治疗方案。一般可分为长期治疗方案、急性发作期治疗方案和缓解期治疗，同时加以辅助机械通气治疗。目前，国内外用于治疗过敏性哮喘及变应性鼻炎的治疗手段有化学药物对症治疗、特异性免疫治疗(脱敏治疗)、中药治疗，此外国内还见中医穴位治疗以及两者相结合的穴位免疫疗法。其中的化学药物对症治疗是目前比较普遍的治疗方法。

针对哮喘发作时的临床症状进行的对症治疗，即通过抗炎、舒张支气管平滑肌，降低血管通透性、调节肥大细胞及嗜碱性粒细胞介质的释放来进行治疗。哮喘常用药物原则上可分为长期控制药物和快速缓解药物两大类：哮喘控制药物有糖皮质激素、长效的β2激动剂、白三烯调节剂、缓释茶碱及色甘酸钠等；而缓解药物常用的主要有：短效的β2激动剂、茶碱、抗胆碱药物。

各种化学药物治疗随着服用时间的延长，具有不同程度的不良反应并可能产生一定的耐药。糖皮质激素是哮喘治疗中最常用的抗炎药物，但是糖皮质激素的长期应用可能对肾上腺皮质功能产生轻度抑制，急性发作期的大剂量应用会对脑垂体—肾上腺轴产生抑制作用。茶碱是常用的平喘药物，用药后的不良反应主要有胃肠道症状(恶心、呕吐)、心血管系统症状(心动过速、心律紊乱、血压下降)、偶可兴奋呼吸中枢，严重者可引起抽搐甚至死亡。茶碱的有效血药浓度与中毒血药浓度十分接近，用药应该谨慎。β2激动剂可舒张气道平滑肌，增加粘液纤毛清除功能、降低血管通透性、调节肥大细胞及嗜碱性粒细胞介质的释放。长期应用β2激动剂可造成受体功能下调，药物疗效下降。

3.2 变应性鼻炎

治疗变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)的两类主要药物是口服H1抗组胺药和鼻腔局部应用糖皮质激素。这些药物可单独或联合用药，这取决于病人的主要症状以及对治疗的反应。第一代抗组胺药能缓解AR的喷嚏、流涕症状，但它们能透过血脑屏障，引起明显的中枢抑制作用，影响工作和学习，特别是驾车和高空作业时应慎用。第二代抗组胺药与第一代抗组胺药相比，第二代抗组胺药没有或只有极小的中枢抑制作用。减充血药如假麻黄碱、去甲麻黄碱等，有失眠、食欲不振等不良反应，且禁忌症较多，如心率不齐或心绞痛等。在有些情况下，还应加用鼻腔局部用药的糖皮质激素。鼻腔内吸入型糖皮质激素是重度AR的一线治疗药物，起效慢于口服抗组胺药，最佳效果一般在数天或数周内，糖皮质激素类药物可抑制儿童生长发育，因此，儿童应尽可能减小本类药物用量，并常规性的测量身高。在成人，鼻腔内吸入型糖皮质激素的全身不良反应较轻。此类药的使用时可引起鼻充血、鼻痛，但这些症状会逐渐消失。极少数情况下会引起膜穿孔，因此嘱咐病人使用喷雾器时不要碰到隔膜，并且定期检查鼻隔膜。抗胆碱药物缓解AR患者鼻溢效果尤佳，但对鼻塞、喷嚏症状无效，其不良反应主要有鼻干涩和鼻出血。

4.特异性免疫治疗(脱敏疗法)

变应原特异性免疫治疗(Allergen Specific Immunotherapy，SIT)最初是1903年由德国的Dunbar开始试用。几年后由Noon和Freeman加以发展并被广泛推广，自1911年开始出现大量的临床研究报告。标准化变应原特异性免疫治疗能够改变变态反应性疾病的基本病理生理机制，是世界卫生组织和全球各变态反应、哮喘与免疫学学会共同唯一推荐的对因治疗。

国外临床研究已证明脱敏治疗对变应性鼻炎和哮喘有效。这些研究中应用主观症状和一些客观的数据表明，影响脱敏治疗的疗效有下列因素：(1)有赖于各自变应原有适当的剂量；(2)必须进行适当的时间；(3)所用的变应原应是特异的；(4)如停止治疗可致症状复发。

“变应原免疫治疗WHO意见书”中指出，当患者存在多重变应原敏感时，医生会使用含有这些变应原的混合疫苗。混合疫苗存在两个问题：一是多个变应原过度稀释可能导致各个变应原剂量不足；二是由于某种变应原含有活性酶，稀释或与其它变应原混合时各个变应原效价会快速下降。但对于相关的变应原而言，它们具有相同的抗原决定簇，会引起交叉反应，如户尘螨和粉尘螨，这些具有相关性的变应原，临床应用单价疫苗还是混合疫苗，没有实质性区别。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种治疗过敏性疾病(过敏性哮喘、变应性鼻炎、过敏性皮炎、慢性荨麻疹等)的抗过敏药物---粉尘螨和户尘螨混合变应原制剂。该制剂利用特异性免疫治疗的原理，通过服用由小至大剂量的变应原，使病人逐步提高对外来变应原的耐受性，从而达到减轻发作或控制发作的目的。

为实现上述目的，本发明第一方面提供了一种治疗过敏性疾病的药物组合物，其特征在于，该组合物包含粉尘螨变应原、户尘螨变应原以及药学上可接受的载体。

本发明另一方面提供了一种制备上述药物组合物的方法，其特征在于，将粉尘螨变应原、户尘螨变应原以及药学上可接受的载体混合。

本发明还有一个方面涉及粉尘螨变应原和户尘螨变应原的组合在制备用于通过特异性免疫治疗方法治疗过敏性疾病的药物组合物中的用途。

在本发明上述几个方面的较佳实施方案中，所述粉尘螨变应原为从粉尘螨的培养基分离获得的粉尘螨变应原，所述户尘螨变应原为从户尘螨螨体分离获得的户尘螨变应原。

在更佳的实施方案中，所述从粉尘螨的培养基分离获得的粉尘螨变应原为用以下方法制得的粉尘螨变应原浸出液：以面粉或动物饲料为培养基培养粉尘螨标准种，用脱脂剂处理粉尘螨代谢培养基；将脱脂后的粉尘螨代谢培养基与生理盐水溶液混合，过滤，将得到的滤液作为粉尘螨变应原浸出液；

所述从户尘螨螨体分离获得的户尘螨变应原为用以下方法制得的户尘螨变应原浸出液：使户尘螨培养基中户尘螨密度达到300—500只/克，除去户尘螨代谢培养基，收集户尘螨螨体进行研磨，脱脂处理后将虫体与生理盐水溶液混合，过滤，将得到的滤液作为户尘螨变应原浸出液。

在另一较佳实施方案中，本发明所述的过敏性疾病选自过敏性哮喘、变应性鼻炎、过敏性皮炎和慢性荨麻疹。

由于在日常生活中接触多种变应原，过敏性疾病患者的病因与多种变应原有关。若仅用单一的抗原组分进行治疗，则不适用于因为多种变应原过敏引起疾病的患者。而本发明包含多种变应原，治疗时的适用范围更广。因此，本发明药物在过敏性疾病治疗领域有广阔的应用前景和临床价值。

具体实施方案

本发明的药物组合物所包含的原材料有两种，一种是纯种户尘螨(较佳的是纯种户尘螨螨体)，另一种是纯种粉尘螨(较佳的是饲养纯种粉尘螨所得到的粉尘螨代谢培养基)。

早在60、70年代，Voorhorst等人(1964)就已证明尘螨是屋尘中重要的变应原。现已证实，尘螨富含变应原的部分是其躯干和粪小球。制备用于治疗用途的尘螨变应原浸出液通常会使用培养基和虫体两种原料。尘螨的螨虫活体、尸体碎屑及排泄物均是具有攻击性的变应原。粉尘螨的培养基汇集了粉尘螨的代谢产物，包括其蜕皮、分泌物、排泄物和死亡虫体。研究者对其代谢培养基进行提取，去除了其他杂质，保留了所有蛋白成分，其中所含的变应原种类和相对含量与使病人致敏的物质非常相近，制备而成的药物应该对绝大多数尘螨性过敏病人均有效。同时，粉尘螨的培养周期较户尘螨要短，培养基中除粉尘螨相关蛋白外，含有的其他致敏蛋白少。所以，用粉尘螨培养基为原料相比直接以虫体作为原料，产量更大，成本更低，且提取物中有更多的变应原活性蛋白。但对于户尘螨而言，由于户尘螨饲养的培养基成分非常复杂，包括动物配合饲料、干酵母粉、干鱼粉，蛋白成份种类繁多，难以提取、分离及纯化，难以对其进行质量控制，因此直接选择纯户尘螨螨体作为户尘螨变应原蛋白原料，是为了更好的确保批与批之间产品的一致性。

综上所述，本发明者采用了纯种户尘螨螨体和饲养纯种粉尘螨所得到的粉尘螨代谢培养基作为生产用的原材料，以此来获得户尘螨和粉尘螨变应原活性蛋白。

具体而言，为实现本发明的发明目的，本发明第一方面提供了一种治疗过敏性疾病的药物组合物，其特征在于，该组合物包含粉尘螨变应原、户尘螨变应原以及药学上可接受的载体。

在一个较佳的实施方案中，本发明提供了一种治疗过敏性疾病的药物组合物，该组合物包含从粉尘螨的培养基分离获得的粉尘螨变应原、从户尘螨螨体分离获得的户尘螨变应原以及药学上可接受的载体。

本领域技术人员能够理解，所述“从粉尘螨的培养基分离获得的粉尘螨变应原”包含了一种或多种变应原，较佳的是多种粉尘螨变应原的混合物。同样，所述“从户尘螨螨体分离获得的户尘螨变应原”也包含了一种或多种变应原，较佳的是多种户尘螨变应原的混合物。本发明药物组合物中的两类变应原或其混合物可以呈液体形式或干粉形式，较佳的是液体形式，例如可采用含有多种变应原的混合物的浸出液形式。

本发明的药物组合物包含从粉尘螨的培养基分离获得的粉尘螨变应原和从户尘螨螨体分离获得的户尘螨变应原。在更佳的实施方案中，本发明的药物组合物基本上由从粉尘螨的培养基分离获得的粉尘螨变应原、从户尘螨螨体分离获得的户尘螨变应原以及药学上可接受的载体组成。此处的术语“基本上由……组成”指的是该组合物中还可以含有任何其它组分，这些组分可以以任何含量存在，只要以该含量存在的该组分对于本发明的药物组合物在治疗过敏性疾病方面的效果没有实质性的影响即可。

在另一较佳的实施方案中，本发明的药物组合物中还可包括佐剂如氢氧化铝凝胶等。

所述粉尘螨变应原的含量为药物组合物的重量的0.001～50％(重量)，更佳的为0.01-30％(重量)，还要佳的为0.05-20％(重量)；所述户尘螨变应原的含量为药物组合物的重量的0.001～50％(重量)，更佳的为0.01-30％(重量)，还要佳的为0.05-20％(重量)。

当采用上述制备的粉尘螨浸出液和户尘螨浸出液时，所述粉尘螨浸出液为药物组合物的体积的0.01～99.99％(体积)，更佳的为20-80％(体积)，还要佳的为30-60％(体积)；所述户尘螨浸出液为药物组合物的体积的0.01～99.99％(体积)，更佳的为0.01-50％(体积)，还要佳的为0.01-20％(体积)。

在较佳的实施方案中，所述从粉尘螨的培养基分离获得的粉尘螨变应原为用以下方法制得的粉尘螨变应原浸出液：以面粉或动物饲料为培养基培养粉尘螨标准种，用脱脂剂处理粉尘螨代谢培养基；将脱脂后的粉尘螨代谢培养基与生理盐水溶液混合，过滤，将得到的滤液作为粉尘螨变应原浸出液。

在更佳的实施方案中，所述粉尘螨变应原是用以下方法制得的粉尘螨变应原浸出液：

1)脱脂、干燥：以面粉或动物饲料为培养基培养粉尘螨标准种，将筛取的粉尘螨代谢培养基连续用丙酮浸泡脱脂3次，每次4小时，至脱脂后的丙酮为无色后，将脱脂后的固体物自然干燥至无丙酮味后称重。实验室操作应在通风橱内完成，中试采用真空浓缩提取罐。

2)提取：将粉尘螨代谢培养基和生理盐水二者以1：2-1：50(较佳的为1:5-1:10，更佳的为1：10)(W/V)比例提取(即每1克脱脂后的粉尘螨代谢培养基用2-50毫升生理盐水溶液提取)，4℃间歇磁力搅拌72小时(每次搅拌时间为8小时，静置过夜后再次磁力搅拌8小时，如此反复)。

3)去渣：结束搅拌后将生理盐水溶液浸出液用普通滤纸过滤，得到粗滤液。

4)精滤：将得到的粗滤液用孔径不大于1μm的微孔滤膜进行精滤，得到的滤液为粉尘螨变应原提取液，对其进行总蛋白浓度测定(BCA法)。若蛋白浓度不小于3.2mg/ml时，可作为原料用于制备尘螨合剂的原液，将检测合格的粉尘螨变应原提取液于4℃低温保存。

本发明药物组合物中的从户尘螨螨体分离获得的户尘螨变应原为用以下方法制得的户尘螨变应原浸出液：使户尘螨培养基中户尘螨密度达到300—500只/克，除去户尘螨代谢培养基，收集户尘螨螨体进行研磨，脱脂处理后将虫体与生理盐水溶液混合，过滤，将得到的滤液作为户尘螨变应原浸出液。

在更佳的实施方案中，所述户尘螨变应原是用以下方法制得的户尘螨变应原浸出液：

1)清洗、研磨、脱脂、干燥：使户尘螨培养基中户尘螨密度达到300—500只/克，除去户尘螨代谢培养基，将获得的户尘螨螨体以生理盐水悬浮清洗，晾干后，置于-20℃保存备用。称取一定质量的虫体，对虫体进行液氮研磨，连续用丙酮浸泡脱脂3次，每次4小时，至脱脂后的丙酮为无色后，将脱脂后的固体物自然干燥至无丙酮味后称重。

2)提取：将户尘螨虫体和生理盐水二者以1：5-1：50(较佳的为1:20-1:30，更佳的为1：25)(W/V)浸泡提取(即每1克脱脂后的户尘螨虫体用5-50毫升生理盐水溶液提取)，4℃间歇磁力搅拌72小时(每次搅拌时间为8小时，静置过夜后再次磁力搅拌8小时，如此反复)。

4)精滤：将得到的粗滤液用孔径不大于1μm的微孔滤膜进行除菌过滤，得到的滤液为户尘螨变应原提取液，对其进行总蛋白浓度测定(BCA法)，若蛋白浓度不小于1.5mg/ml时，可作为原料用于制备尘螨合剂的原液，将检测合格的户尘螨变应原提取液于4℃低温保存。

将按照上述步骤获得的户尘螨变应原提取液和粉尘螨变应原提取液按比例混和后除菌过滤，即为尘螨合剂的原液。原液如果在一周之内使用可于4℃低温保存，若长期保存备用，应置于—20℃环境下。

对于粉尘螨和户尘螨的培养基，其可由本领域技术人员根据常规技术来选择确定，较佳的培养基是以面粉或动物饲料为培养基，其中还可任选地掺入酵母粉、干鱼粉等。

在上述方案中，所用的脱脂剂是常规的，脱脂剂包括但不限制于乙醚、丙酮等。

本发明药物组合物中所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明药物组合物中的变应原相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物在治疗过敏性疾病方面的效果。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等，其中较佳的载体选自生理盐水、甘油和磷酸盐缓冲盐水。

本发明的药物组合物可以制成各种医学上可接受的剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。本发明所述制剂是指口服液、注射剂、舌下含服剂等多种液体剂型，或通过加以适当的赋形剂制备成片剂、胶囊剂等多种其他剂型。较佳的是，所述药物组合物的剂型选自注射剂、胶囊、舌下含服剂、口服液、气雾剂或贴剂。

本发明另一方面还提供了一种制备上述药物组合物的方法，该方法包括将粉尘螨变应原(如粉尘螨的培养基分离获得的粉尘螨变应原)、户尘螨变应原(如从户尘螨螨体分离获得的户尘螨变应原)以及药学上可接受的载体相混合，从而获得所述药物组合物。粉尘螨变应原、户尘螨变应原以及药学上可接受的载体之间的混合次序没有特别的限制，例如可以先将粉尘螨变应原与户尘螨变应原混合起来制成混合制剂，随后再将其与药学上可接受的载体相混合，也可将粉尘螨变应原与户尘螨变应原同时加入药学上可接受的载体内。

在一个较佳的实施方案，本发明的药物组合物是通过将上述的粉尘螨变应原浸出液与户尘螨变应原浸出液按照一定比例混合而获得的。当采用上述制备的粉尘螨浸出液和户尘螨浸出液时，所述粉尘螨浸出液为药物组合物的体积的0.01～99.99％(体积)，更佳的为20-80％(体积)，还要佳的为30-60％(体积)；所述户尘螨浸出液为药物组合物的体积的0.01～99.99％(体积)，更佳的为0.01-50％(体积)，还要佳的为0.01-20％(体积)。

本发明另一方面还涉及粉尘螨变应原和户尘螨变应原的组合在制备用于通过特异性免疫治疗方法治疗过敏性疾病的药物组合物中的用途。在较佳的实施方案中，所述过敏性疾病选自过敏性哮喘、变应性鼻炎、过敏性皮炎、慢性荨麻疹等。

本发明可用于过敏性哮喘、变应性鼻炎、过敏性皮炎、慢性荨麻疹等症的治疗。治疗时将多个浓度制剂配合使用。对患者先使用较低的浓度进行治疗，然后逐步增加制剂浓度，最后用较高浓度的制剂维持治疗。由于不同浓度的药物被人体吸收的途径不一样，所以治疗时使用的初始浓度和维持浓度也不同。

下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明的范围。

实施例1 粉尘螨变应原浸出液的制备

1)脱脂、干燥

以面粉或动物饲料为培养基(面粉：酵母粉＝10：1)培养粉尘螨标准种，将筛取(用120目网筛进行筛取，除去粉尘螨螨体)的粉尘螨代谢培养基连续用丙酮浸泡脱脂3次，每次4小时，至脱脂后的丙酮为无色后，将脱脂后的固体物自然干燥至无丙酮味后称重。实验室操作应在通风橱内完成，中试采用真空浓缩提取罐。

2)提取

为保证有效成分不失活，提取应在4℃完成。详细步骤为：将步骤1)获得的脱脂后的粉尘螨代谢培养基和生理盐水二者以1：10(W/V)比例提取(即每1克脱脂后的粉尘螨代谢培养基用10毫升生理盐水溶液提取)，4℃间歇磁力搅拌72小时(每次搅拌时间为8小时，静置过夜后再次磁力搅拌8小时，如此反复)。

3)去渣

结束搅拌后将生理盐水溶液浸出液用普通滤纸过滤，得到粗滤液。

4)精滤

将步骤3)得到的粗滤液用孔径不大于1μm的微孔滤膜进行精滤，得到的滤液为粉尘螨变应原提取液，对其进行总蛋白浓度测定(BCA法)，若蛋白浓度不小于3.2mg/ml时，可作为原料用于制备尘螨合剂的原液，将检测合格的粉尘螨变应原提取液于4℃低温保存。

实施例2 户尘螨变应原浸出液的制备

1)清洗、研磨、脱脂、干燥

在培养基(2份实验室动物饲料，2份干酵母，1份干鱼粉，培养基湿度为16％)中培养户尘螨使其密度达到300—500只/克。用饱和NaCl溶液悬浮分离，收集户尘螨螨体。

将获得的户尘螨螨体以生理盐水悬浮清洗，晾干后，置于-20℃保存备用。称取虫体，对虫体进行液氮研磨，连续用丙酮浸泡脱脂3次，每次4小时，至脱脂后的丙酮为无色后，将脱脂后的固体物自然干燥至无丙酮味后称重。

2)提取

将户尘螨虫体和生理盐水二者以1：25(W/V)浸泡提取(即每1克脱脂后的户尘螨虫体用25毫升生理盐水溶液提取)，4℃间歇磁力搅拌72小时(每次搅拌时间为8小时，静置过夜后再次磁力搅拌8小时，如此反复)。

3)去渣

4)精滤

将得到的粗滤液用孔径不大于1μm的微孔滤膜进行除菌过滤，得到的滤液为户尘螨变应原提取液，对其进行总蛋白浓度测定(BCA法)，若蛋白浓度不小于1.5mg/ml时，可作为原料用于制备尘螨合剂的原液，将检测合格的户尘螨变应原提取液于4℃低温保存。

实施例3 剂型的制备

1)将实施例1和2获得的浸出液用生理盐水稀释，并按50：1比例(体积比)混合，然后加入等体积甘油制成混合变应原制剂。按照治疗所需浓度，稀释成1：100(V/V)至1：100000000(V/V)范围内的多个浓度的制剂；分装、灌封；56℃灭活1小时左右除菌，即得舌下含服剂；

2)取上述原液按常规制剂方法制得注射剂、片剂或胶囊剂。

实施例4 变应原制剂的药效学实验

(1).对螨蛋白致敏豚鼠抗原攻击后肺功能的影响

1.1 动物和药品

动物：Hartley品系豚鼠，体重300～400g，

各半，购于浙江大学医学院实验动物中心，合格证书：医动字第220010014。动物饲养环境条件：购来后的动物饲养于浙江大学动物实验中心动物房内，室温20～23℃，相对湿度74-82％环境。光照12h暗、12h明。动物自由饮水进食。

试剂和受试物：

1)尘螨冻干品(抗原)，由浙江我武生物科技有限公司提供，批号：2004100601；质检报告：单位蛋白重量(mg)：19.5mg/瓶，总变应原活性(kUA/l)：4.91kUA/l，活性蛋白Derf1 4345.33ng/ml，Der p1 294.98ng/ml，Derp(f)2 1117.74ng/ml。

2)本发明的尘螨合剂(实施例3制得的舌下含服剂型，下同)1号(蛋白浓度0.75μg/mL)，2号(蛋白浓度7.5μg/mL)，3号(蛋白浓度75μg/mL)，4号(蛋白浓度250μg/mL)，5号(蛋白浓度750μg/mL)由浙江我武生物科技有限公司，批号：20041001。

3)乌拉坦(Urethane)，中国医药公司上海化学试剂公司。

1.2 仪器动物肺机械功能测定系统：体积描记器、差压换能器(Motorola)、计算机(PentiumIII，128M/60G)、MedLab生物信号采集处理系统(MedLab(V5.0.0，南京美易公司)，动物肺机械功能测定仪。

1.3 方法

1.3.1 致敏：参考Hsiue TR等人Int Arch Allergy Immunol.1997；112(3)：295-302.的方法改良，将25mg尘螨蛋白溶于1％氢氧化铝凝胶0.5ml中，给豚鼠皮下注射，另将25mg尘螨蛋白溶于0.1％氢氧化铝凝胶0.5ml中给同一豚鼠腹腔注射。每间隔10d重复致敏1次，共3次。

1.3.2 分组：分3组，即正常组(n＝10)，模型组(n＝14)和脱敏组(n＝14)。

1.3.3 给药剂量和疗程：参考尘螨合剂临床给药设计剂量和疗程，脱敏组于豚鼠第1次致敏同时开始逐步增量舌下给药，第1周每只豚鼠第1天给尘螨合剂1号1滴，第2天2滴，第3天3滴，第4天4滴，第5天6滴，第6天8滴，第7天10滴；第2周开始给尘螨合剂2号1周，每天的剂量与尘螨合剂1号相同；第3周开始给尘螨合剂3号1周，第4周开始给尘螨合剂4号1周，第5周开始给尘螨合剂5号1周，如此从1号～5号共给药35天。模型组于豚鼠第1次致敏同时开始给生理盐水，每天的容量与尘螨合剂相同。正常组不作处理。

1.3.4 肺功能测定步骤：测定肺阻力(lung resistance，R_L)和动态肺顺应性(dynamic lung compliance，C_dyn)。致敏豚鼠经乌拉坦1g/kg i.p麻醉，切开颈部皮肤，分离气管，行气管插管。R_L和C_dyn测定步骤：1、将手术后的豚鼠置于1.5L豚鼠体描记器(body plethysmograph)内，接通气管插管，引伸于体积描记器外。同时于体积描记器的侧孔接上压力换能器和PCLAB生物信号采集处理系统。将所有待测的导管接通完毕，盖上体描记器的盖子，并使其完全密闭，即可描记随动物呼吸而引起密闭的体描记器内容积的变化，即为潮气量(tidal volume，V_T)，以定容器定标。2、取Fisher管与气管插管接通，联上压力换能器—PCLAB生物信号采集处理系统，通过并联的压力换能器记录系统描记其压力差，即可测气流速率(airway flow，

)，用流量计定标。3、用一钝头、并带有2～3小孔的金属管(#16针头)直接插入胸膜腔内，连着导管与差压换能器—PCLAB生物信号采集处理系统联接，差压换能器的另一头与口腔插管连接(测口腔压)，即可测得跨肺压(transpulmonary pressure，Ptp)，用水检压计定标。计算公式：

R_{L} (cm H_{2} O / ml / s) = Ptp / \dot{V},

C_dyn(ml/cmH₂O)＝V_T/Ptp。

1.3.5 抗原攻击：第3次致敏后第10天，一次性静脉注射0.1％尘螨蛋白0.5ml。描记吸入后1、2、3、4、5、10、15、20、25、30min的V_T、

和Ptp以变化。

1.3.6 统计方法：x±s，Mann-Whitney Rank Sum Test或T-test法检验。

(2).尘螨合剂对哮喘豚鼠气道高反应性的影响

试剂和受试物：

2)尘螨合剂1号，2号，3号，4号，5号由浙江我武生物科技有限公司，批号：20041001。

3)氯化乙酰甲胆碱(Methacholine，Mch)，美国Sigma公司。

4)乌拉坦(Urethane)，中国医药公司上海化学试剂公司。

5)其他试剂均为国产分析纯产品.试剂于临用前配制成所需浓度。

1.2 仪器动物肺机械功能测定系统：体积描记器、差压换能器(Motorola)、计算机(PentiumIII，128M/60G)、MedLab生物信号采集处理系统(MedLab(V5.0.0，南京美易公司)，动物肺机械功能测定仪，PARI MASTER压缩雾化器(BARI，MASTER；Germany)。

1.3 方法

1.3.1 致敏：参考Hsiue的方法改良，将25mg尘螨蛋白溶于1％氢氧化铝凝胶0.5ml中，给豚鼠皮下注射，另将25mg尘螨蛋白溶于0.1％氢氧化铝凝胶0.5ml中给同一豚鼠腹腔注射。每间隔10d重复致敏1次，共3次。

1.3.2 分组：分3组，每组8～9只，即正常组，模型组和脱敏组。

1.3.3 给药剂量和疗程：同“尘螨合剂对螨蛋白致敏豚鼠抗原攻击后肺功能的影响”实验。

1.3.4 抗原攻击：第3次致敏后第8天开始，每天抗原攻击1次。将模型组和脱敏组豚鼠放入45×45×30cm密闭盒内，用压缩雾化器向密闭盒内喷雾0.5％尘螨蛋白(w/v)30min。每天1次，共喷雾攻击抗原7d。

1.3.5 肺功能测定步骤：同“尘螨合剂对螨蛋白致敏豚鼠抗原攻击后肺功能的影响”实验

1.3.6 Methacholine激发：用压缩雾化器气雾不同浓度Mch(0.016、0.032、0.0625、0.125、0.500mg/ml)15sec，激发豚鼠产生BHR，每次激发前，须待上一浓度的反应回到基线后再开始。激发后描记1-2min的V_T、

和Ptp的曲线。

1.3.7 统计方法：x±s，Mann-Whitney Rank Sum Test或T-test法检验。PC₁₀₀或PC₅₀(95％可信限)用上海科学技术出版社POMS 2.0版软件计算。

(3).尘螨合剂对哮喘大鼠气道高反应性的影响

1.1 动物和药品

动物：Wistar品系幼年大鼠，体重80～100g，雄性，购于中国科学院上海实验动物中心，许可证：SCXK(沪)2003—0003。动物饲养环境条件：购来后的动物饲养于浙江大学动物实验中心的II级动物房内，室温20～23℃，相对湿度74-82％环境。光照12h暗、12h明。动物自由饮水进食。

试剂、受试物和仪器：尘螨冻干品(抗原)，尘螨合剂1号、2号、3号、4号、5号，Methacholine、乌拉坦等试剂、受试物和仪器同“尘螨合剂对哮喘豚鼠气道高反应性的影响”实验。

1.2 方法

1.2.1 致敏：参考Dong W等人Toxicol Sci.2003；72(1)：113-21的方法，将20mg尘螨蛋白溶于10％氢氧化铝凝胶0.5ml中，在大鼠四足掌，每足掌0.05ml、两侧腹股沟各0.05ml、背部和腹部皮下注射各2点(s.c)，每点0.05ml。每间隔10d重复致敏1次，共3次。

1.2.2 分组：分3组，每组8～10只，即正常组，模型组和脱敏组。

1.2.3 给药剂量和疗程：同“尘螨合剂对螨蛋白致敏豚鼠抗原攻击后肺功能的影响”实验

1.2.4 抗原攻击：第3次致敏后第8天开始，每天抗原攻击1次。将模型组和脱敏组大鼠放入45×45×30cm密闭盒内，用压缩雾化器向密闭盒内喷雾0.5％尘螨蛋白(w/v)30min。每天1次，共喷雾攻击抗原7d。

1.2.5 肺功能测定步骤：同“尘螨合剂对螨蛋白致敏豚鼠抗原攻击后肺功能的影响”实验

1.2.6 Methacholine激发：用压缩雾化器气雾不同浓度Mch(0.016、0.032、0.0625、0.125、0.500、1.000、2.000mg/ml)15sec，激发大鼠产生BHR，每次激发前，须待上一浓度的反应回到基线后再开始。激发后描记1-2min的V_T、

和Ptp的曲线。

1.2.7 统计方法：x±s，Mann-Whitney Rank Sum Test或T-test法检验。PC₁₀₀或PC₂₅(95％可信限)用上海科学技术出版社POMS 2.0版软件计算。

(4).尘螨合剂对哮喘豚鼠气道炎症细胞聚集和浸润的影响

1.1 动物和药品同“尘螨合剂对螨蛋白致敏豚鼠抗原攻击后肺功能的影响”实验

1.2 仪器系统显微镜(Type：Olympus BX51，日本)；冷冻离心机(Type：Eppendorf 5804R，Germany)，PARI MASTER压缩雾化器(BARI，MASTER；Germany)。

1.3 方法

1.3.2 分组：分3组，每组12～15只，即正常组，模型组和脱敏组。

1.3.3 给药剂量和疗程：同“尘螨合剂对螨蛋白致敏豚鼠抗原攻击后肺功能的影响”实验

1.3.5 支气管肺泡灌流：豚鼠股动脉放血处死。切开颈部皮肤，分离出气管，切开气管，插入气管插管，用含肝素和1％小牛血清的生理盐水5ml，分3次从气管插管注入左侧肺内(右侧肺结扎后留作病理切片检查)，来回冲洗3回，冲洗液收集于试管内，回收率约70-80％(3-4ml)。

1.3.6 白细胞计数和分类计数：1％冰醋酸1:3稀释灌流液，用计数板在显微镜下计总数。其余灌流液2000rpm离心，离心沉淀物涂于玻片上，干后用瑞士染色液染色，然后在高倍镜下分类计数。

(5).尘螨合剂对哮喘大鼠气道炎症细胞聚集和浸润的影响

1.1 动物和药品

动物：同“尘螨合剂对哮喘大鼠气道高反应性的影响”实验

试剂和受试物：尘螨冻干品(抗原)，尘螨合剂1号、2号、3号、4号、5号，乌拉坦等试剂和受试物同“尘螨合剂对哮喘豚鼠气道高反应性的影响”实验。

1.2 仪器系统显微镜(Type：Olympus BX51，日本)；冷冻离心机(Type：Eppendorf 5804R，Germany)，PARI MASTER压缩雾化器(BARI，MASTER；Germany)

1.3 方法

1.3.1 致敏：同“尘螨合剂对哮喘大鼠气道高反应性的影响”实验。

1.3.4 抗原攻击：同“尘螨合剂对哮喘大鼠气道高反应性的影响”实验。

1.3.5 支气管肺泡灌流：末次抗原攻击后24h，大鼠股动脉放血处死，分离血清测定IgE和IgG。切开颈部皮肤，分离出气管，切开气管，插入气管插管，用含肝素和1％小牛血清的生理盐水5ml，分3次从气管插管注入左侧肺内(右侧肺结扎后留作病理切片检查和作肺匀浆测定细胞因子)，来回冲洗3回，冲洗液收集于试管内，回收率约70-80％(3-4ml)。

1.3.6 白细胞计数和分类计数：1％冰醋酸1:3稀释灌流液，用计数板在显微镜下计总数。其余灌流液2000rpm离心，上清用于测定细胞因子。离心沉淀涂于玻片上，干后用瑞士染色液染色，然后在高倍镜下分类计数。

1.3.7 统计方法：x±s，T-test。

(6).尘螨合剂对哮喘小鼠气道炎症细胞聚集和浸润的影响

动物：ICR品系小鼠，体重18～20g，雌性，购于浙江省实验动物中心，许可证：SCXK(浙)2003—0001。动物饲养环境条件：购来后的动物饲养于浙江大学动物实验中心的II级动物房内，室温20～23℃，相对湿度74~82％环境。光照12h暗、12h明。动物自由饮水进食。

1.3 方法

1.3.1 致敏小鼠：参考Clarke AH的方法改进^[14]，将20mg尘螨蛋白溶于10％氢氧化铝凝胶0.5ml中，在小鼠两后足掌，每足掌0.025ml、两侧腹股沟各0.05ml、背部和腹部皮下注射各2点(s.c)，每点0.05ml。每间隔10d重复致敏1次，共3次。

1.3.2 给药剂量和疗程：同“尘螨合剂对螨蛋白致敏豚鼠抗原攻击后肺功能的影响”实验。

1.3.3 抗原攻击：第3次致敏后第8天开始，每天抗原攻击1次。将模型组和脱敏组小鼠放入45×45×30cm密闭盒内，用压缩雾化器向密闭盒内喷雾0.5％尘螨蛋白(w/v)30min。每天1次，共喷雾攻击抗原7d。

1.3.4 支气管肺泡灌流：小鼠放血处死，分离血清测定IgE和IgG。切开颈部皮肤，分离出气管，切开气管，插入气管插管，用含肝素和1％小牛血清的生理盐水1.5ml，分3次从气管插管注入左侧肺内(右侧肺结扎后留作病理切片检查和作肺匀浆测定细胞因子)，来回冲洗3回，冲洗液收集于试管内，回收率约70-80％(1~1.2ml)。将获得的BALF在4℃，500g离心10min。收集无细胞的BALF上清液冷藏于-80℃，用于测定IFN-γ、IL-4。

1.3.5 白细胞计数和分类计数：1％冰醋酸稀释灌流液，用计数板在显微镜下计总数。其余灌流液2000rpm离心，离心沉淀物涂于玻片上，干后用瑞士染色液染色，然后在高倍镜下分类计数。

(7).尘螨合剂对尘螨蛋白致敏小鼠血清IgE和IgG的影响

1.1 药品与试剂：尘螨冻干品(抗原)，尘螨合剂1号、2号、3号、4号、5号、乌拉坦等试剂和受试物同“尘螨合剂对哮喘豚鼠气道高反应性的影响”实验。小鼠IgE ELISA Quantition Kit，购于BETHYL Laboratories.INC；小鼠IgG ELISAQuantition Kit，购于BETHYL Laboratories.INC

1.2 仪器

PARI MASTER压缩吸入机(BARI，MASTER；Germany)；匀浆机(宁波新科)；冷冻离心机(Type：Eppendorf 5804R，Germany)；酶标仪(BIO-TEK，ELX800，USA)。

1.3 动物

ICR品系小鼠，体重18～20g，雌性，购于浙江省实验动物中心。动物饲养环境条件：购来后的动物饲养于浙江大学动物实验中心的II级动物房内，室温20～23℃，相对湿度74~82％环境。光照12h暗、12h明。动物自由饮水进食。

2 方法：

2.1 致敏小鼠：参考Clarke AH等Int Arch Allergy Immunol 1999；120：126-134.的方法改进，将20mg尘螨蛋白溶于10％氢氧化铝凝胶0.5ml中，在小鼠两后足掌，每足掌0.025ml、两侧腹股沟各0.05ml、背部和腹部皮下注射各2点(s.c)，每点0.05ml。每间隔10d重复致敏1次，共3次。

2.2 给药剂量和疗程：同“尘螨合剂对螨蛋白致敏豚鼠抗原攻击后肺功能的影响”实验。

2.3 抗原攻击：第3次致敏后第8天开始，每天抗原攻击1次。将模型组和脱敏组小鼠放入45×45×30cm密闭盒内，用压缩雾化器向密闭盒内喷雾0.5％尘螨蛋白(w/v)30min。每天1次，共喷雾攻击抗原7d。

2.4 取血与血清分离：小鼠眼眶放血置1.5ml试管内，置室温待血清出现分离，用4℃低温离心机2000rpm离心10min，取出血清，置—80℃冰箱备测。

2.5 IgE和IgG测定：实验操作过程完全按照小鼠IgE ELISA试剂盒和小鼠IgGELISA试剂盒使用说明书。

(8).尘螨合剂对大鼠血清和肺组织匀浆IgE和IgG水平的影响

1.1 药品与试剂：尘螨冻干品(抗原)，尘螨合剂1号、2号、3号、4号、5号、乌拉坦等试剂和受试物同“尘螨合剂对哮喘豚鼠气道高反应性的影响”实验。大鼠IgEELISA Quantition Kit，购于BETHYL Laboratories.INC；大鼠IgG ELISA QuantitionKit，购于BETHYL Laboratories.INC

1.2 仪器：PARI MASTER压缩吸入机(BARI，MASTER；Germany)；匀浆机(宁波新科)；冷冻离心机(Type：Eppendorf 5804R，Germany)；酶标仪(BIO-TEK，ELX800，USA)。

1.3 动物：同“尘螨合剂对哮喘大鼠气道高反应性的影响”实验。

2.方法

2.1 分组：分3组，每组6～8只，即正常组，模型组和脱敏组。

2.2 致敏大鼠：同“尘螨合剂对哮喘大鼠气道高反应性的影响”实验。

2.3 给药剂量和疗程：同“尘螨合剂对螨蛋白致敏豚鼠抗原攻击后肺功能的影响”实验。

2.4 抗原攻击：同“尘螨合剂对哮喘大鼠气道高反应性的影响”实验。

2.5 取血与血清分离：大鼠股动脉放血置5ml试管内，置室温待血清出现分离，用4℃低温离心机2000rpm离心10min，取出血清，置—80℃冰箱备测。

2.6 肺组织匀浆制备：将保存于液氮中的肺组织解冻后，用滤纸吸干水分，精密称重后，加缓冲液至10mg/100μL。在冰浴中用匀浆机充分匀浆，然后置冷冻离心机10000rpm离心10min，取上清液测定IgE和IgG。

2.7 IgE和IgG测定：实验操作过程完全按照大鼠IgE ELISA试剂盒和大鼠IgGELISA试剂盒使用说明书。

(9)、尘螨合剂对尘螨蛋白致敏小鼠肺组织INF-γ和IL-4的调节作用

1.1 药品与试剂：尘螨冻干品(抗原)，尘螨合剂1号、2号、3号、4号、5号、乌拉坦等试剂和受试物同“尘螨合剂对哮喘豚鼠气道高反应性的影响”实验。小鼠IFN-γELISA试剂盒，购于eBioscience Co.USA；

小鼠IL-4ELISA试剂盒，购于eBioscience Co.USA。

1.2 仪器：PARI MASTER压缩吸入机(BARI，MASTER；Germany)；匀浆机(宁波新科)；冷冻离心机(Eppendorf 5804R，Germany)；酶标仪(BIO-TEK，ELX800，USA)。

1.3 动物：同“尘螨合剂对哮喘小鼠气道炎症细胞聚集和浸润的影响”实验。

2 方法：

2.1 致敏小鼠：同“尘螨合剂对哮喘小鼠气道炎症细胞聚集和浸润的影响”实验。

2.3 抗原攻击：同“尘螨合剂对哮喘小鼠气道炎症细胞聚集和浸润的影响”实验。

2.4 肺组织匀浆制备：小鼠股动脉放血处死，开胸后取出肺组织，保存于液氮中1h，然后转移至-80℃冰箱保存。实验时将肺组织解冻后，用滤纸吸干水分，精密称重后，加缓冲液至10mg/100μL。在冰浴中用匀浆机充分匀浆，然后置冷冻离心机10000rpm离心10min，取上清液测定细胞因子。

2.5 IFN-γ、IL-4测定：实验操作过程完全按照小鼠IFN-γELISA试剂盒和小鼠IL-4 ELISA试剂盒使用说明书。

(10).尘螨合剂对大鼠肺组织和支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞因子的影响

1.1 药品与试剂：尘螨冻干品(抗原)，尘螨合剂1号、2号、3号、4号、5号、乌拉坦等试剂和受试物同“尘螨合剂对哮喘豚鼠气道高反应性的影响”实验。大鼠IFN-γ ELISA试剂盒，购于eBioscience Co.USA；大鼠IL-4ELISA试剂盒，购于U-CyTech bioscience Co.USA。

2.方法

2.1 分组：分3组，每组7只，即正常组，模型组和脱敏组。

2.5 支气管肺泡灌流：大鼠放血处死，分离血清测定IgE和IgG。切开颈部皮肤，分离出气管，切开气管，插入气管插管，用含肝素和1％小牛血清的生理盐水5ml，分3次从气管插管注入左侧肺内(右侧肺结扎后留作病理切片检查和作肺匀浆测定细胞因子)，来回冲洗3回，冲洗液收集于试管内，回收率约70-80％(3-4ml)。将获得的BALF在4℃，500g离心10min。收集无细胞的BALF上清液冷藏于-80℃，用于测定IFN-γ、IL-4。

2.1.6 肺组织匀浆制备：将保存于液氮中的肺组织解冻后，用滤纸吸干水分，精密称重后，加缓冲液至10mg/100μL。在冰浴中用匀浆机充分匀浆，然后置冷冻离心机10000rpm离心10min，取上清液测定细胞因子。

2.6 IFN-γ、IL-4测定：实验操作过程完全按照大鼠IFN-γ ELISA试剂盒和大鼠IL-4 ELISA试剂盒使用说明书。

结果：

1.对豚鼠模型的作用：尘螨合剂脱敏治疗后能明显抑制肺阻力(lung resistance，R_L)增高和动态肺顺应性(dynamic lung compliance，C_dyn)下降，在注射尘螨蛋白攻击后，与模型组比较R_L平均值和C_dyn平均值有非常显著的差异(P<0.001)。气道高反应性实验中，尘螨合剂脱敏组与模型组比较，气道对Methacholine敏感性被明显降低。此外，尘螨合剂对白细胞总数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞增多均有明显的抑制作用，也能明显抑制支气管周围嗜酸性粒细胞和中性粒细胞浸润等病理性改变。

2.对大鼠模型的作用：尘螨合剂脱敏治疗后能明显降低血清总IgE水平(P<0.05)，抑制大鼠的气道高反应性，减少灌洗液中的炎症细胞总数以及嗜酸性粒细胞和中性粒细胞数目，减轻支气管周围嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的浸润，抑制血管腔内和气管腔内有较多的嗜酸性粒细胞和中性粒细胞聚集，升高肺组织匀浆中IFN-γ水平(P<0.05)。

3.对小鼠模型的作用：尘螨合剂脱敏治疗后能明显降低血清总IgE水平(P<0.01)和总IgG水平(P<0.05)，减少灌洗液中的炎症细胞总数以及嗜酸性粒细胞和中性粒细胞数目，减轻支气管和微血管周围嗜酸性粒细胞的浸润，升高肺组织匀浆中IFN-γ水平(P<0.05)和降低IL-4水平(P<0.01)。

尘螨蛋白+佐剂(氢氧化铝凝胶)反复致敏的豚鼠在抗原攻击后(一次性静脉注射0.1％尘螨蛋白0.5ml)，通过肺功能检测可观察到肺阻力(R_L)明显增高，肺动态顺应性(C_dyn)明显下降，攻击后1min达到最高峰，R_L值与攻击前基线值比较增加124％，C_dyn值下降37％，表现为哮喘的速发相(early phase)，其结果与Yasue M等，CellImmunol.1999；192(2)：185-93报道基本一致，但本发明的致敏周期为9周，共反复致敏了5次。反复致敏的豚鼠在抗原反复攻击时(雾化吸入，每天1次，共喷雾攻击7d)，在每天的抗原攻击过程中可观察到豚鼠会产生明显的喘息和咳嗽反应，但不像卵白蛋白致敏豚鼠在抗原(卵白蛋白)攻击后豚鼠会产生喘息和窒息，死亡率高达50％以上的现象。反复攻击后的豚鼠通过肺功能检测可观察到气道对Methacholine激发敏感性显著增高，产生了明显的气道高反应性；通过支气管肺泡灌洗可见灌洗液中的炎症细胞数目明显增加，其中嗜酸性粒细胞增多最为明显。通过肺组织病理切片检查发现支气管周围有大量的嗜酸性粒细胞和中性粒细胞浸润，淋巴细胞和巨噬细胞也有增加，表现典型的哮喘的迟发相(late phase)。尘螨合剂脱敏治疗后能明显抑制R1增高和C_dyn下降，在注射尘螨蛋白攻击后，R_L最高峰值与攻击前基线值比较仅增加58％，C_dyn值下降31％，与模型组比较R_L平均值和C_dyn平均值也有非常显著的差异(P<0.001)。气道高反应性实验中，尘螨合剂脱敏组与模型组比较，气道对Methacholine敏感性被明显降低。此外，尘螨合剂对白细胞总数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞增多均有明显的抑制作用，也能明显抑制支气管周围嗜酸性粒细胞和中性粒细胞浸润等病理性改变。

尘螨蛋白+佐剂(氢氧化铝凝胶)反复致敏的大鼠血清总IgE水平与正常大鼠比较有非常明显的升高(P<0.01)，血清总IgG水平正常大鼠比较虽然也有所升高，但没有明显差异(P>0.05)；肺组织匀浆的IgE和IgG水平也有升高趋势，但组间统计比较没有显著性差异(P>0.05)。致敏大鼠在抗原反复攻击时(雾化吸入，每天1次，共喷雾攻击7d)不像豚鼠的表现，在每天的抗原攻击过程中没有观察到明显的喘息和咳嗽反应。但经多次反复抗原攻击处死后作支气管肺泡灌洗，可见灌洗液中的炎症细胞总数明显增加，嗜酸性粒细胞和中性粒细胞显著增多(P<0.01)，肺组织病理切片检查发现支气管周围有较多的嗜酸性粒细胞和中性粒细胞浸润，血管腔内和气管腔内有较多的嗜酸性粒细胞和中性粒细胞聚集；支气管肺泡灌洗液和肺组织匀浆中的Th2细胞因子IL-4水平与正常大鼠比较有所升高，Th1细胞因子IFN-γ水平变化不大。上述结果与Singh P研究的结果有许多相似处，但不同品系的大鼠对尘螨蛋白致敏的敏感性有所不同。尘螨合剂脱敏治疗后能明显降低血清总IgE水平(P<0.05)，抑制大鼠的气道高反应性，减少灌洗液中的炎症细胞总数以及嗜酸性粒细胞和中性粒细胞数目，减轻支气管周围嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的浸润，抑制血管腔内和气管腔内有较多的嗜酸性粒细胞和中性粒细胞聚集，升高肺组织匀浆中IFN-γ水平(P<0.05)。

尘螨蛋白+佐剂(氢氧化铝凝胶)反复致敏的小鼠血清总IgE和IgG水平与正常小鼠比较有非常明显的升高(P<0.001)，但肺组织匀浆的IgE和IgG水平组间统计比较没有显著性差异(P>0.05，未显示结果)。致敏小鼠在抗原反复攻击时(雾化吸入，每天1次，共喷雾攻击7d)不像豚鼠的表现，类似于大鼠的表现，在每天的抗原攻击过程中也没有观察到明显的喘息和咳嗽反应。但经多次反复抗原攻击处死后，支气管肺泡灌洗中的炎症细胞总数以及嗜酸性粒细胞和中性粒细胞数目，和肺组织病理切片检查的支气管周围嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的浸润表现基本类似于大鼠模型的结果。模型组小鼠的肺组织匀浆中的Th1细胞因子IFN-γ水平明显下降，Th2细胞因子IL-4水平上升。尘螨合剂脱敏治疗后能明显降低血清总IgE水平(P<0.01)和总IgG水平(P<0.05)，减少灌洗液中的炎症细胞总数以及嗜酸性粒细胞和中性粒细胞数目，减轻支气管和微血管周围嗜酸性粒细胞的浸润，升高肺组织匀浆中IFN-γ水平(P<0.05)和降低IL-4水平(P<0.01)。

支气管哮喘是一种变态反应性疾病。抗原与肺部致敏肥大细胞上抗体结合，引起肥大细胞脱颗粒，释放组胺和慢反应物质等过敏介质，导致支气管平滑肌收缩，粘膜充血水肿，腺体分泌增多，造成肺阻力增大和肺顺应性下降而发生通气功能障碍，即所谓的哮喘速发相。R_L和C_dyn是动物肺功能评价指标，前者反应了大气道的功能状态，如平滑肌痉挛，粘膜充血水肿，腺体分泌增多等，后者表示胸廓或肺的弹性是否正常的标志，凡影响肺的弹性纤维或肺泡表面活性物质的，均可影响肺顺应性。肺，小气道等阻塞时，也会使肺顺应性下降。本实验采用尘螨蛋白致敏豚鼠静脉一次性注射抗原诱导IAR，结果显示用尘螨合剂脱敏治疗后抑制了肺阻力增大和肺顺应性下降反应，其作用机制可能与反复抗原脱敏后，中和了体内的尘螨蛋白特异性的IgG和IgE水平，使特异性的IgG和IgE水平下降，结合在炎症细胞上的抗体明显减少，当进行抗原攻击时炎症细胞释放过敏性介质的量也随之明显较少。

气道高反应性(BHR)系指气管、支气管的一种异常敏感状态，对于各种刺激(物理、化学、生物)因子表现出一种过强、过早的反应，一般认为BHR是支气管哮喘的基本特征，能否降低BHR是平喘药疗效评价的重要指标。目前认为气道的炎症反应是形成BHR最主要的原因之一。哮喘患者的气管、支气管粘膜表现为慢性的非特异性炎症过程，当抗原到达支气管上皮后，通过树突状细胞(Dentritic cell)作用于T淋巴细胞，特别是辅助性T淋巴细胞(Th)，Th2细胞被激活，释放IL-4，作用于B淋巴细胞产生IgE；释放IL-13作用于肥大细胞，释放IL-5及GM-CSF，作用于嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞等使它们在气管内聚集、激活、释放出各种活性介质(白三烯、中性蛋白酶、嗜酸性阳性蛋白、主碱基蛋白、5-HT、PAF等)，致使毛细血管通透性增强，腺体细胞分泌增强及支气管平滑肌收缩。从支气管肺泡灌洗液及支气管粘膜活检分析证实，即使在无明显症状的BHR患者，其支气管壁已有嗜酸性粒细胞的浸润。在本实验中，本发明者建立了methacholine诱导尘螨蛋白性哮喘豚鼠和大鼠的BHR模型。在评价BHR的实验中，通过测定肺阻力(R_L)和动态肺顺应性(C_dyn)来评价受试药物的作用。实验可见，哮喘模型动物对methacholine刺激的敏感性明显高于正常动物，如豚鼠，模型组R_L PC₁₀₀与正常组R_L PC₁₀₀值比较高近4倍，模型组C_dyn PC₅₀与正常组C_dyn PC₅₀值比较高近3倍。大鼠则更为明显，模型组R_L PC₁₀₀与正常组R_L PC₁₀₀值比较高9倍，模型组C_dyn PC₂₅与正常组比较高近21倍。尘螨合剂由低剂量到高剂量长期给药能明显抑制豚鼠和大鼠的气道BHR。如豚鼠，尘螨合剂脱敏组R_L PC₁₀₀值与模型组比较降低了3.5倍，尘螨合剂脱敏组C_dyn PC₅₀值与模型组比较降低了2倍。而在大鼠，尘螨合剂脱敏组R_L PC₁₀₀值与模型组比较降低了3.3倍，尘螨合剂脱敏组C_dyn PC₂₅值与模型组比较降低了6.8倍。这些结果显示，尘螨合剂由低剂量到高剂量长期给药能明显抑制豚鼠和大鼠的气道BHR。

过敏反应过程中揭示了Th1和Th2细胞之间平衡关系，使人们注意到Th1细胞因子γ-干扰素。由于γ-干扰素能抑制IgE的合成和Th2前期细胞的分化，所以γ-干扰素的缺乏会诱导Th2细胞因子途径促进过敏性炎症。而Th2细胞细胞因子IL-4在过敏反应中发挥重要的前炎(pro-inflammatory)功能，包括分化Th2细胞，诱导IgE产生，上调IgE受体，增强IgG1和IgG4，抑制IgM、IgG2，生成IgM，上调血管黏附分子-1(VCAM-1)表达，促进嗜酸性粒细胞跨膜浸入肺组织，抑制Th1细胞分化和生成干扰素-γ，抑制T-淋巴细胞凋亡等。降低IL-4水平或阻断IL-4的信号传导以及拮抗IL-4的作用可能是抗过敏作用的一个重要靶点。在本实验中，本发明者观察了小鼠肺组织匀浆和大鼠支气管肺泡灌洗液和肺组织匀浆中的Th2细胞因子IL-4水平和Th1细胞因子IFN-γ水平变化。结果显示模型组小鼠的肺组织匀浆中的Th1细胞因子IFN-γ水平明显下降，Th2细胞因子IL-4水平上升。尘螨合剂脱敏治疗后能明显升高肺组织匀浆中IFN-γ水平(P<0.05)和降低IL-4水平(P<0.01)。大鼠模型组支气管肺泡灌洗液和肺组织匀浆中的Th2细胞因子IL-4水平与正常大鼠比较有所升高，Th1细胞因子IFN-γ水平变化不大。尘螨合剂脱敏治疗后能升高肺组织匀浆中IFN-γ水平(P<0.05)，对肺组织匀浆中IL-4水平有所降低，但不明显(P>0.05)。这些结果提示尘螨合剂脱敏治疗对Th1和Th2细胞之间平衡关系可能有调节作用，但作用机制尚需进一步研究。

尘螨合剂脱敏治疗能明显减轻尘螨蛋白致敏豚鼠抗原攻击后引起急性支气管收缩反应(哮喘速发相)；降低由乙酰甲胆碱(methacholine)诱导的豚鼠和大鼠气道高反应性，抑制豚鼠和大鼠以及小鼠抗原攻击后引起支气管炎症细胞聚集和肺组织炎症细胞浸润(哮喘迟发相)；其作用机制可能与降低血清和肺组织IgE和IgG含量，降低肺组织Th2细胞因子升高Th1细胞因子有关。

尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。

Claims

1.一种治疗过敏性疾病的药物组合物，其特征在于，该组合物包含粉尘螨变应原、户尘螨变应原以及药学上可接受的载体，

其中所述粉尘螨变应原是用以下方法制得的粉尘螨变应原浸出液：

1)以面粉：酵母粉为10：1的培养基培养粉尘螨标准种，用120目网筛进行筛取，除去粉尘螨螨体，将筛取的粉尘螨代谢培养基连续用丙酮浸泡脱脂3次，每次4小时，至脱脂后的丙酮为无色后，将脱脂后的固体物自然干燥至无丙酮味后称重；

2)将步骤1)获得的脱脂后的粉尘螨代谢培养基和生理盐水二者以1：10(W/V)比例提取，4℃间歇磁力搅拌72小时，每次搅拌时间为8小时，静置过夜后再次磁力搅拌8小时，如此反复；

3)结束搅拌后将生理盐水溶液浸出液用普通滤纸过滤，得到粗滤液；

4)将步骤3)得到的粗滤液用孔径不大于1μm的微孔滤膜进行精滤，得到的滤液为粉尘螨变应原提取液，用BCA法对其进行总蛋白浓度测定，若蛋白浓度不小于3.2mg/ml时，作为原料用于制备尘螨合剂的原液；

所述户尘螨变应原是用以下方法制得的户尘螨变应原浸出液：

a)在培养基中培养户尘螨使其密度达到300—500只/克，用饱和NaCl溶液悬浮分离，收集户尘螨螨体；将获得的户尘螨螨体以生理盐水悬浮清洗，晾干后，置于-20℃保存备用；称取虫体，对虫体进行液氮研磨，连续用丙酮浸泡脱脂3次，每次4小时，至脱脂后的丙酮为无色后，将脱脂后的固体物自然干燥至无丙酮味后称重；

b)将户尘螨虫体和生理盐水二者以1：25(W/V)浸泡提取，4℃间歇磁力搅拌72小时，每次搅拌时间为8小时，静置过夜后再次磁力搅拌8小时，如此反复；

c)结束搅拌后将生理盐水溶液浸出液用普通滤纸过滤，得到粗滤液；

d)将得到的粗滤液用孔径不大于1μm的微孔滤膜进行除菌过滤，得到的滤液为户尘螨变应原提取液，用BCA法对其进行总蛋白浓度测定，若蛋白浓度不小于1.5mg/ml时，作为原料用于制备尘螨合剂的原液；

其中所述粉尘螨变应原浸出液和所述户尘螨变应原浸出液按50：1的体积比混合。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型选自注射剂、胶囊、舌下含服剂、口服液、气雾剂、鼻腔剂或贴剂。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述步骤a)中的培养基由2份实验室动物饲料、2份干酵母、1份干鱼粉组成，培养基湿度为16％。

4.一种制备权利要求1所述的药物组合物的方法，其特征在于，将粉尘螨变应原、户尘螨变应原以及药学上可接受的载体混合，

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤a)中的培养基由2份实验室动物饲料、2份干酵母、1份干鱼粉组成，培养基湿度为16％。

6.粉尘螨变应原和户尘螨变应原的组合在制备用于通过特异性免疫治疗方法治疗过敏性疾病的药物组合物中的用途，

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述过敏性疾病选自过敏性哮喘、变应性鼻炎、过敏性皮炎和慢性荨麻疹。

8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述步骤a)中的培养基由2份实验室动物饲料、2份干酵母、1份干鱼粉组成，培养基湿度为16％。