CN100534535C - 用于药物化合物的改进的接头 - Google Patents

Abstract

一种延长用于诊断成像或治疗的药物化合物半衰期的新和改进的方法，使用新的接头使诊断或治疗部分与导向肽或另一个诊断或治疗部分连接。得到的化合物具有通式M-N-O-P-Q，其中M是诊断或治疗部分，N-O-P本发明的接头，以及Q是导向肽。在另一个实施方案中，化合物可具有式M-N-O-P-M，其中M独立地是诊断或治疗部分并且N-O-P本发明的接头还提供了使用本发明的化合物成像或治疗患者的方法。进一步提供了由所述化合物制备诊断成像剂的方法和试剂盒。还提供了所述化合物放射治疗患者的方法，以及由所述化合物制备放射治疗剂的方法。

Description

用于药物化合物的改进的接头

本申请要求享有2003年1月13日申请的、系列号为60/439,722的美国临时专利申请的申请目的益处，由此通过参考将其并入本申请。

发明领域

本发明涉及新的和改进的改进药物化合物半衰期的方法，所述药物化合物通过使用新的接头以使诊断或治疗部分与导向部分连接，或者使两个诊断或治疗部分彼此相互连接，或使一个诊断部分与一个治疗部分连接而适用作诊断或治疗剂。

发明背景

药物(例如，作为诊断成像剂、治疗剂等)用来检测和治疗癌症的用途是人们熟知的。在更近一些年，用于癌症检测和/或治疗的定向位点的放射性药物的发现获得了广泛应用并继续发展为更好地鉴别这类化合物的特异性、功效和实用性的医学专业。

这些更新的放射性药物物质典型地由一种与金属螯合剂连接的导向剂组成，所述金属螯合剂可与诊断性金属放射性核素例如，锝或铟，或治疗性金属放射性核素例如，镥、钇或铼螯合(例如，络合)。金属螯合剂的作用是结合(也就是，螯合)作为放射性药物试剂的金属放射性核素，使其被递送至期望的部位。不能与金属放射性核素强结合的金属螯合剂将使放射性药物物质失去其期望的作用，因为金属放射性核素将因此不能到达其期望的部位。因此，进一步的研究与开发导致了金属螯合剂的发现，例如在授予Pollak等的美国专利No.5,662,885中所报道的，由此通过参考将其并入，它表现出强的对金属放射性核素的亲和力和与导向剂结合的能力。随后，使用“间隔区”以产生金属螯合剂与导向剂之间的物理分离的概念被进一步引入，例如在授予Pollak等的美国专利No.5,976,495中，由此通过参考将其并入。

导向剂的作用是通过它对某一结合位点有亲和力的优点将诊断或治疗剂，例如，一种含有金属放射性核素的放射性药物物质，导向到期望的检测或治疗的位点。典型地，导向剂可能包括一种蛋白质，一种多肽，或者其他对特定的受体表现出特异亲和力的大分子。其他已知的导向剂包括单克隆抗体(MAbs)，抗体片段(F_ab和(F_ab)₂)，和受体亲和肽。Donald J.Buchsbaum，“放射标记抗体的癌症治疗；抗体和它的放射标记的药物动力学；实验放射免疫治疗和增强治疗效果的方法”，CRC Press，Boca Raton，第10章，第115-140页，(1995)；Fischman，等。“一张乘车票：抗体的放射性药物学(A Ticket toRide：Peptide Radiopharmaceuticals)，”核医学杂志(The Journalof Nuclear Medicine)，第14卷，第12期，(1993年12月)。

在设计一种用于癌症的诊断或治疗剂的有效化合物时，药物有合适的体内导向和药物动力学特性是很重要的。例如，对于一种放射性药物来说，放射标记的多肽能被靶细胞高度特异地摄取是优选的。此外，一旦放射性核素定位在靶部位，它能够在那儿保留一段期望的时间以便运送高度定位的放射剂量到靶部位也是优选的。

而且，改进的放射标记的多肽能被有效地从正常组织中清除，对于放射性药物物质来说，这也是一个重要的因素。当被金属放射性核素标记(通过一种螯合的接合作用)的生物大分子(例如，MAb，F_ab或多肽)，被应用于一种动物例如人时，大部分的金属放射性核素(以某些化学形式)能在肾脏或肝脏实质内被俘获(也就是，不排泄入尿和胆汁)。Duncan等；对于更小的放射标记的生物大分子(也就是，F_ab或多肽)，清除活动的主要途径是通过肾脏，肾脏也能够保留高水平的放射性金属(也就是，通常多于10-15％的注入剂量)。金属放射性核素在肾脏或肝脏内的潴留是不被期望的。

相反地，如果需要更长时间的诊断成像或者对放射治疗来说需要更大的肿瘤摄取量，一种诊断或治疗剂被肾脏从血流中清除太快也不是合乎需要的。放射性药物化合物在患者体内的潴留经常是按照半衰期(也就是，用药剂剂量的一半被从患者体内清除所需要的时间)来计算的。一种半衰期更短的放射性药物化合物与半衰期更长的放射性药物化合物相比显示它以更快的速度被从患者体内清除。

一种用于改进药物化合物半衰期的新的和改进的方法现在已经被发现，这导致改进的诊断或治疗剂。

发明概述

在本发明一个示范性的实施方案中，提供了一种新的和改进的用于改进供诊断或治疗使用的药物化合物半衰期的方法，以及表现出这样一种改进的半衰期的化合物。在一个实施方案中，诊断或治疗剂(例如，能够络合医学有用的金属离子或放射性核素(金属螯合剂)或光学标记的化学部分)通过本发明的接头或间隔区与导向肽连接。可选择地，放射性卤素通过本发明的接头或间隔区与导向肽连接。

作为结果，本发明的化合物通常可具有下式：

M-N-O-P-Q

其中M是诊断或治疗剂，N-O-P是接头，以及Q是导向部分。在一个实施方案中，M可以是一种呈与金属放射性核素络合或未络合形式的金属螯合剂。可选择地，M可以是一种放射性卤素而不是一种金属螯合剂。

金属螯合剂M可以是本领域中已知的与医学有用的金属离子或放射性核素络合的金属螯合剂中的任何一种。优选的螯合剂包括DTPA，DOTA，DO3A，HP-DO3A，EDTA，TETA，EHPG，HBED，NOTA，DOTMA，TETMA，PDTA，TTHA，LICAM，MECAM，或者多肽螯合剂，例如，在这里讨论的那些。金属螯合剂可能与金属放射性核素络合也可能不络合，并且也可能包括一个选择性的间隔区例如单个氨基酸。优选的用于闪烁照相术或放射治疗的金属放射性核素包括^99mTc，⁵¹Cr，⁶⁷Ga，⁶⁸Ga，⁴⁷Sc，⁵¹Cr，¹⁶⁷Tm，¹⁴¹Ce，¹¹¹In，¹⁶⁸Yb，¹⁷⁵Yb，¹⁴⁰La，⁹⁰Y，⁸⁸Y，¹⁵³Sm，¹⁶⁶Ho，¹⁶⁵Dy，¹⁶⁶Dy，⁶²Cu，⁶⁴Cu，⁶⁷Cu，⁹⁷Ru，¹⁰³Ru，¹⁸⁶Re，¹⁸⁸Re，²⁰³Pb，²¹¹Bi，²¹²Bi，²¹³Bi，²¹⁴Bi，¹⁰⁵Rh，¹⁰⁹Pd，^117mSn，¹⁴⁹Pm，¹⁶¹Tb，¹⁷⁷Lu，¹⁹⁸Au和¹⁹⁹Au。金属的选择将基于所期望的诊断或治疗应用来决定。例如，为了诊断的目的，优选的放射性核素包括⁶⁴Cu，⁶⁷Ga，⁶⁸Ga，^99mTc和¹¹¹In，特别优选^99mTc和¹¹¹In。为了治疗的目的，优选的放射性核素包括⁶⁴Cu，⁹⁰Y，¹⁰⁵Rh和⁹⁰Y，¹¹¹In，^117mSn，¹⁴⁹Pm，¹⁵³Sm，¹⁶¹Tb，¹⁶⁶Dy，¹⁶⁶Ho，¹⁷⁵Yb，¹⁷⁷Lu，^186/188Re，和¹⁹⁹Au，特别优选¹⁷⁷Lu，⁹⁰Y，¹⁸⁶Re和¹⁸⁸Re。用于本发明化合物中的最优选的螯合剂是1-取代的4，7，10-三羧甲基-1，4，7，10四氮杂环十二烷三乙酸(DO3A)。

M是一种放射性卤素时，优选的放射性核素例如¹⁸F，¹²⁴I，¹²⁵I，¹³¹I，¹²³I，⁷⁷Br，和⁷⁶Br也可以被使用。

M是一种诊断部分时，优选的诊断部分包括，例如，使能够通过如x-射线，磁共振成像，超声，荧光和其它光学成像方法技术来检测化合物的物质。特别优选的诊断部分是一种光标记。

M是一种治疗部分时，优选的本发明化合物可结合，例如，治疗部分比如抗生素，激素，酶，抗体，生长因子，等。

接头N-O-P包括至少一种取代的胆汁酸。

导向肽Q是对特殊位点有结合亲和力的任何肽，或其等同物，衍生物或者类似物。导向肽可以是与目的受体或酶结合的肽。例如，导向肽Q可以是LHRH(促黄体生成激素释放激素)、胰岛素、催产素，促生长素抑制素，NK-1(神经激肽-1)，VIP(血管活性肠多肽)，GRP(胃泌激素释放多肽)，铃蟾肽或者本领域中已知的其它任意激素肽，以及它们的类似物和衍生物。

在一个可选择的实施方案中，一种诊断或治疗剂通过本发明的接头或间隔区与诊断或治疗剂连接。这个实施方案的化合物通常可具有下式：

M-N-O-P-M

其中M是如上面所定义的诊断或治疗剂，并且N-O-P是如上所定义的接头。

还提供一种新的使用本发明的化合物成像的方法。

进一步提供一种新的制备诊断成像剂的方法，包括在一种可注射的成像剂中加入一种包含本发明的化合物的物质的步骤。

包含制备本发明的诊断或治疗剂所需的所有组分的单或多瓶试剂盒是本发明的组成部分。

还提供一种新的用本发明的化合物治疗(包括放射治疗和光线治疗)的方法，以及一种新的制备放射治疗剂的方法，包括在一种可注射的治疗介质中加入一种包含本发明的化合物的物质的步骤。

附图的简单说明

图1是如在实施例I中描述的4-[[(3β，5β，12α)-23-[1，1-二甲基乙烷]-1-(氧羰基)]-12-羟基-24-降胆烷-3-基]氨基]-4-氧代丁酸N-羟基琥珀酰亚胺基酯(化合物A-OSu)合成的图示；

图2是如在实施例II中描述的化合物B的化学结构；

图3是如在实施例III中描述的(3β，5β，12α)-3-[[3，5-双[[4-[(2，5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-1，4-二氧代丁基]氨基]苯甲酰基]氨基-12-羟基胆烷-24-酸1，1-二甲基乙基酯(化合物C-(OSu)₂)合成的一系列化学反应的图示；

图4是如在实施例III中描述的牛1-[[(3β，5β，12α)-23-[(1，1-二甲基)乙氧基羰基]-12-羟基-24-降胆烷-3-基]氨基]羰基-3，5-双[[4-(胰岛素-NB^ε29-基)-1，4-二氧代丁基]氨基]苯(化合物D)的化学结构；

图5A是如在实施例VII中描述的N¹，N⁴，N⁷-三醋酸根-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N¹⁰-(2-乙酰氨基乙胺)(化合物E)的化学结构；

图5B是如在实施例VII中描述的化合物F的化学结构；

图6A是如在实施例VIII中描述的中间体C((3β，5β)-3-(9H-芴-9-基甲氧基)氨基胆烷-24-酸)，由A((3β，5β)-3-氨基胆烷-24-酸甲基酯)和B((3β，5β)-3-氨基胆烷-24-酸)合成的一系列化学反应的图示；

图6B是如在实施例VIII中描述的N-[(3β，5β)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-胆烷-24-基]-L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-缬氨酰-L-甘氨酰-L-组氨酰-L-亮氨酰-L-甲硫氨酰胺(L62)合成的连续反应的图示；

图7A是如在实施例IX中描述的中间体(3β，5β)-3-[[(9H-芴-9基甲氧基)氨基]乙酰基]氨基-12-氧代胆烷-24-酸(C)合成的一系列化学反应的图示；

图7B是如在实施例IX中描述的N-[(3β，5β)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-12，24-二氧代胆烷-24-基]-L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-缬氨酰-甘氨酰-L-组氨酰-L-亮氨酰-L-甲硫氨酰胺(L67)合成的连续反应的图示；

图7C是如在实施例IX中描述的(3β，5β)-3-氨基-12-氧代胆烷-24-酸(B)的化学结构；

图7D是如在实施例IX中描述的(3β，5β)-3-[[(9H-芴-9基甲氧基)氨基]乙酰基]氨基-12-氧代胆烷-24-酸(C)的化学结构；

图7E是如在实施例IX中描述的N-[(3β，5β)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-12，24-二氧代胆烷-24-基]-L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-缬氨酰-甘氨酰-L-组氨酰-L-亮氨酰-L-甲硫氨酰胺(L67)的化学结构；

图8A是如在实施例X中描述的获得中间体(3β，5β，7α，12α)-3-[[(9H-芴-9基甲氧基)氨基]乙酰基]氨基-7，12-二羟基胆烷-24-酸(3b)的反应顺序的图示；

图8B是如在实施例X中描述的N-[(3β，5β，12α)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-12-羟基-24-氧代胆烷-24-基]L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-缬氨酰-甘氨酰-L-组氨酰-L-亮氨酰-甲硫氨酰胺(L63)；N-[(3β，5β，12α)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-7，12-二羟基-24-氧代胆烷-24-基]L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-缬氨酰-甘氨酰-L-组氨酰-L-亮氨酰-甲硫氨酰胺(L64)；以及N-[(3β，5β)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-12，24-二氧代胆烷-24-基]-L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-缬氨酰-甘氨酰-L-组氨酰-L-亮氨酰-L-甲硫氨酰胺(L67)合成的连续反应的的图示；

图8C是如在实施例X中描述的N-[(3β，5β，12α)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-7，12-二羟基-24-氧代胆烷-24-基]L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-缬氨酰-甘氨酰-L-组氨酰-L-亮氨酰-甲硫氨酰胺(64)合成的连续反应的的图示；

图8D是如在实施例X中描述的(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羟基胆烷-24-酸(2b)的化学结构；

图8E是如在实施例X中描述的(3β，5β，12α)-3-[[(9H-芴-9基甲氧基)氨基]乙酰基]氨基-12-羟基胆烷-24-酸(3a)的化学结构；

图8F是如在实施例X中描述的(3β，5β，7α，12α)-3-[[(9H-芴-9基甲氧基)氨基]乙酰基]氨基-7，12-二羟基胆烷-24-酸(3b)的化学结构；

图8G是如在实施例X中描述的N-[(3β，5β，12α)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-12-羟基-24-氧代胆烷-24-基]L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-缬氨酰-甘氨酰-L-组氨酰-L-亮氨酰-甲硫氨酰胺(L63)的化学结构；

图8H是如在实施例X中描述的N-[(3β，5β，12α)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-7，12-二羟基-24-氧代胆烷-24-基]L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-缬氨酰-甘氨酰-L-组氨酰-L-亮氨酰-甲硫氨酰胺(L64)的化学结构；

图9是DO3A-单酰胺-Gly-Lys-(3，6，9-三氧杂十一烷1，11-二羧酸-3，7-二脱氧-3-氨基胆酸)-L-精氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-缬氨酰-甘氨酰-L-组氨酰-L-亮氨酰-甲硫氨酰胺(L65)的化学结构；

图10A是N-[2-S-[[[[[12α-羟基-17β-(1-甲基-3-羧丙基)本胆烷-3β-氨基甲酰基甲氧基乙氧基乙氧基乙酰基]-氨基-6[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-己酰-L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-缬氨酰-甘氨酰-L-组氨酰-L-亮氨酰-L-甲硫氨酰胺(L66)的化学结构；

图10B是N-[(3β，5β，7α，12α)-3-[[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1基]乙酰基]氨基]乙氧乙氧基]乙酰基]氨基]-7，12-二羟基胆烷-24-基]-L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-缬氨酰-甘氨酰-L-组氨酰-L-亮氨酰-L-甲硫氨酰胺(L69)的化学结构；

图11A是如在实施例XV中描述的用Gd-L64的HAS的结合实验的结果的图示；

图11B是如在实施例XV中描述的用Gd-L64的HAS的结合实验结果的图示；

图12A是如在实施例XVII中描述的放射治疗结果的图示；

图12B是如在实施例XVII中描述的其它放射治疗结果的图示；

图13A是如在实施例XX中描述的(3β，5β，7α，12α)-3-(9H-芴-9基甲氧基)氨基-7，12-二羟基胆烷-24-酸(B)合成的反应图示；

图13B是如在实施例XX中描述的N-[(3β，5β，7α，12α)-3-[[[2-[2-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-7，12-二羟基-24-氧代胆烷-24基]-L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-缬氨酰-甘氨酰-L-组氨酰-L-亮氨酰-L-甲硫氨酰胺)合成的反应图示。

发明的详细说明

在下列说明中，本发明的各个方面将被进一步详细阐述。为了解释的目的，特定的结构和细节将被阐明以便提供本发明的一个全面的了解。然而，没有具体的细节可以实施本发明，这对本领域中的技术人员来说也是明显的。而且，很熟知的特性可能被省略或被简化以便不把本发明搞混。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种改进用于诊断或治疗的药物化合物的半衰期的新的和改进的方法，以及表现出这样一种改进的半衰期的化合物。在这些实施方案中，一种诊断或治疗剂(例如一种金属螯合剂，一种放射性卤素，或一种光学标记)通过本发明的接头或间隔区与导向肽连接。

一般地，本发明的化合物包括下式的化合物：

M-N-O-P-Q

其中M是诊断或治疗剂，N-O-P是接头，以及Q是导向部分。正如下面更详细的解释，M和Q可能被连接在接头的任一端(例如在本发明的胆酸衍生物的氨基或羧酸基)或者M和Q可能都与接头的同一端连接(例如都与本发明的胆酸衍生物接头的氨基或都与其羧酸基)。

在一个可选择的实施方案中，一种诊断或治疗剂通过本发明的接头或间隔区与第二种诊断或治疗剂连接。这个实施方案的化合物通常可具有下式：

M-N-O-P-M

其中M是如上面定义的诊断或治疗剂，N-O-P是如上面定义的接头。正如下面更详细的解释，每一个M可能被连接在接头的任一端(例如在本发明的胆酸衍生物接头的氨基或羧酸基)或者两个M可能都与接头的同一端连接(例如都与本发明的胆酸衍生物接头的氨基或羧酸基)。

在下面的讨论中将描述每个诊断或治疗剂、接头和导向部分。当M是金属螯合剂时，它可以是呈络与金属放射性核素合或者不络合的形式。可选择地，M可以是一种放射性卤素而不是一种金属螯合剂。在另一个优选的实施方案中，M是一种光学标记(例如一种能被光成像，视声学成像或者光致发光可检测的或者在光线治疗中有用的光标记或其他标记)。

在本发明的另一个实施方案中，提供了一种新的和改进的接头或间隔区，该接头或间隔区当用来使诊断或治疗剂与导向部分连接或者使一个诊断或治疗剂与第二个诊断或治疗剂相连接时，能够改进药物化合物的半衰期。一般地，本发明的接头可具有下式：

N-O-P

在这里，N，O和P的每一个被定义在整个说明书中。

符合这些标准的化合物与本领域中已知的其它放射标记的复合多肽相比有改进的药物动力学特性。例如，用本发明的接头制备的化合物显示能够在血流中更长时间地保留(与结合人血清白蛋白(HSA)一致))，因此将比以前已知的化合物有更长的半衰期。更长的半哀期在医学上是有益处的，因为它允许更长的诊断成像时间，或者对于治疗的用处来说，它允许更长时间地暴露于导向细胞以便进行放射治疗。

1A.金属螯合剂

术语“金属螯合剂”表示与金属原子形成络合物的分子，其中所说的络合物在生理状态下是稳定的。也就是，金属在体内将保持与螯合剂骨架络合。更特别地，金属螯合剂是一种与放射性核素金属络合从而形成一种金属络合物的分子，这种金属络合物在生理状态下是稳定的，而且也有至少一个与接头N-O-P结合的反应官能团。金属螯合剂M可以是本领域中已知的络合医学上有用的金属离子或放射性核素的任何一种金属螯合剂。金属螯合剂可能与，也可能不与金属放射性核素络合。而且，金属螯合剂能包括一个可选择的间隔区，例如，不与金属络合，但是能够在金属螯合剂和接头之间产生物理性隔开的单个氨基酸(例如，Gly)。

本发明的金属螯合剂可以包括，例如，线性的，大环的，三联吡啶和N₃S，N₂S₂，或N₄螯合剂(也见，U.S.5,367,080，U.S.5,364,613，U.S.5,021,556，U.S.5,075099，U.S.5,886,142，通过参考将它们的公开内容以其整体并入本申请)，以及本领域中已知的其他螯合剂，它包括，但不限于，HYNIC，DTPA，EDTA，DOTA，TETA，和双氨基双硫羟(BAT)螯合剂(也见U.S.5,720,934)。例如，N₄螯合剂被描述在美国专利号6,143,274；6,093,382；5,608,110；5,656,329；5,656,254；和5,688,487中，通过参考将它们的公开内容以其整体并入本申请。某些N₃S螯合剂被描述在PCT/CA94/00395，PCT/CA94/00497，PCT/CA95/00249和美国专利号5,662,885；5,976,495；以及5,780,006中，通过参考将它们的公开内容以其整体并入本申请。螯合剂也可以包括螯合配体巯基-乙酰基-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酸(MAG3)的衍生物，它包括一个N₃S和N₂S₂系统例如MAMA(单酰胺单胺二硫酚)，DADS(N₂S二胺二硫酚)，CODADS等。在Liu和Edwards，Chem Rev.1999，99，2235-2268及其中的参考文献中描述了这些配体系统和一系列其它的配体系统，通过参考将它们的公开内容以其全部并入本申请。

金属螯合剂也可以包括含有配体原子的络合物，这些配体原子在四配位基数组中不被供给金属。这些包括锝和铼二肟的烃基代硼酸加合物，例如那些在美国专利号5,183,653；5,387,409；和5,118,797中被描述的，通过参考将它们的公开内容以其全部并入本申请。

优选的螯合剂的例子包括，但不限于，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、1，4，7，10-四氮杂环十四烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)、1-取代的1，4，7，-三羧甲基1，4，7，10四氮杂环十二烷三乙酸(D03A)、乙二胺四乙酸(EDTA和1，4，8，11-四氮杂环十四烷-1，4，8，11-四乙酸(TETA)。另外的螯合配体是亚乙基双-(2-羟基-苯基甘氨酸)(EHPG)及其衍生物，包括5-Cl-EHPG、5-Br-EHPG、5-Me-EHPG、5-t-Bu-EHPG和5-sec-Bu-EHPG；苯并二亚乙基三胺五乙酸(苯并-DTPA)及其衍生物，包括二苯并-DTPA、苯基-DTPA、二苯基-DTPA、苄基-DTPA和二苄基DTPA；双-2(羟基苄基)-亚乙基-二胺二乙酸(HBED)及其衍生物；大环化合物类含有至少3个碳原子，更优选至少6个和至少两个杂原子(O和/或N)，该大环化合物可由一个环或在杂环元素处连接在一起的两个或三个环组成，例如苯并-DOTA、二苯并-DOTA和苯并-NOTA，其中NOTA是1，4，7-三氮杂环壬烷N，N’，N”-三乙酸、苯并-TETA、苯并-DOTMA，其中DOTMA是1，4，7，10-四氮杂环十四烷-1，4，7，10-四(甲基四乙酸)，以及苯并-TETMA，其中TETMA是1，4，8，11-四氮杂环十四烷-1，4，8，11-(甲基四乙酸)；1，3-亚丙基二胺四乙酸(PDTA)和三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)的衍生物；1，5，10-N，N′，N″-三(2，3-二羟基苯甲酰基)-三儿茶酚酸酯(tricatecholate，LICAM)和1，3，5-N，N′，N″-三(2，3-二羟基苯甲酰基)氨甲基苯(MECAM)的衍生物。本发明考虑到的代表性螯合剂和螯合基团的例子被描述在WO 98/18496，WO86/06605，WO 91/03200，WO 95/28179，WO 96/23526，WO 97/36619，PCT/US98/01473，PCT/US98/20182，以及U.S.4,899,755，U.S.5,474,756，U.S.5,846,519，U.S.6,143,274，共未决的申请U.S.S.N[律师立档号057637/01021，名称为“适用作金属螯合剂的新化合物”，在或接近本申请的同一天提交，]，通过参考将它们的每一篇以其整体并入本申请。

特别优选的金属螯合剂包括式1、2和3的那些(例如¹¹¹铟和放射性镧系元素，例如，¹⁷⁷Lu，⁹⁰Y，¹⁵²Sm和¹⁶⁶Ho)和下述式4、5和6的那些(例如放射性^99mTc，¹⁸⁶Re和¹⁸⁸Re)。这些和其它螯合基团被描述在美国专利号6,093,382和5,608110中，通过参考将它们以其整体并入本申请。另外，例如美国专利号6,143,274中描述了式3的螯合基团；例如美国专利号5,627,286和6,093,382中描述了式5的螯合基团；以及例如美国专利号5,662,885、5,780,006；和5,976,495中描述了式6的螯合基团。式6的特异性金属螯剂包括N，N-二甲基-Gly-Ser-Cys；N，N-二甲基-Gly-Thr-Cys；N，N-二乙基-Gly-Ser-Cys；N，N-二苄基-Gly-Ser-Cys；以及它们的其它变体。例如，不实际上与金属放射性核素络合的间隔区例如额外的单个氨基酸Gly，可与这些金属螯剂(例如N，N-二甲基-Gly-Ser-Cys-Gly；N，N-二甲基-Gly-Thr-Cys-Gly；N，N-二乙基-Gly-Ser-Cys-Gly；N，N-二苄基-Gly-Ser-Cys-Gly)连接。其它有用的金属螯剂例如在美国专利号6,334,996中公开的那些的全部，通过参考也将其并入本申请(例如二甲基-Gly-L-叔丁基-Gly-L-Cys-Gly；二甲基-Gly-D-叔丁基-Gly-L-Cys-Gly；二甲基-Gly-L-叔丁基-Gly-L-Cys等)。

此外，硫保护基团例如Acm(乙酰氨基甲基)、三甲苯基或其它已知的烷基、芳基、酰基、烷酰基、芳酰基、巯酰基、以及有机硫羟基可以与这些金属螯合剂的半胱氨酸氨基酸连接。

此外，其它有用的金属螯合剂包括：

在上述式1和2中，R是烷基，优选甲基。在上述式5a和5b中，X是CH₂或O；Y是C₁-C₁₀支链或无支链的烷基；芳基、芳氧基、芳氨基、芳氨酰基；芳烷基-其中与芳基连接的烷基是C₁-C₁₀支链或无支链的烷基、C₁-C₁₀支链或无支链的羟基或多羟基烷基或多烷氧基烷基或多羟基多烷氧基烷基，J是任选的，但如果存在它是C(＝O)-、OC(＝O)-、SO₂-、NC(＝O)-、NC(＝S)-、N(Y)、NC(＝NCH₃)-、NC(＝NH)-、N＝N-、由合成或天然存在的氨基酸衍生的均聚酰胺或杂多胺；全部情况下n为1-100。例如在美国专利号6,093,382中描述了这些结构的其它变体。在式6中，基团S-NHCOCH₃可以被SH或S-Z取代，其中Z是任何已知的硫保护基团，例如上面描述的那些。式7说明了适用作金属螯合剂的叔丁基化合物的一个实施方案。通过参考将前述专利、申请和参考文献的每一篇以它们的整体并入本申请。

在一个优选的实施方案中，金属螯合剂包括环状或无环多氨基羧酸例如DOTA(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸)、DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、DTPA-双甲基酰胺、DTPA-双吗啉酰胺、D03AN-[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10四氮杂环十二烷-1基]乙酰基、HP-D03A、D03A-单酰胺和它们的衍生物。

优选的用于闪烁照相术或放射治疗的金属放射性核素包括^99mTc，⁵¹Cr，⁶⁷Ga，⁶⁸Ga，⁴⁷Sc，⁵¹Cr，¹⁶⁷Tm，¹⁴¹Ce，¹¹¹In，¹⁶⁸Yb，¹⁷⁵Yb，¹⁴⁰La，⁹⁰Y，⁸⁸Y，¹⁵³Sm，¹⁶⁶Ho，¹⁶⁵Dy，¹⁶⁶Dy，⁶²Cu，⁶⁴Cu，⁶⁷Cu，⁹⁷Ru，¹⁰³Ru，¹⁸⁶Re，¹⁸⁸Re，²⁰³Pb，²¹¹Bi，²¹²Bi，²¹³Bi，²¹⁴Bi，¹⁰⁵Rh，¹⁰⁹Pd，^117mSn，¹⁴⁹Pm，¹⁶¹Tb，¹⁴⁰La，¹⁷⁷Lu，¹⁹⁸Au，和¹⁹⁹Au和它的氧化物或氮化物。金属的选择将根据希望的诊断或治疗应用来决定。例如，为了诊断的目的(例如，在原发肿瘤和转移瘤中诊断和监测治疗的进展)，优选的放射性核素包括⁶⁴Cu，⁶⁷Ga，⁶⁸Ga，^99mTc和¹¹¹In，其中^99mTc和¹¹¹In是特别优选的。为了治疗的目的(例如，为原发肿瘤和前列腺癌，乳腺癌，肺癌等相关的转移瘤提供放射治疗)，优选的放射性核素包括⁶⁴Cu，⁹⁰Y，¹⁰⁵Rh，¹¹¹In，^117mSn，¹⁴⁹Pm，¹⁵³Sm，¹⁶¹Tb，¹⁶⁶Dy，¹⁶⁶Ho，¹⁷⁵Yb，¹⁷⁷Lu，¹⁸⁶Re，¹⁸⁸Re，和¹⁹⁹Au，其中¹⁷⁷Lu，⁹⁰Y，¹⁸⁶Re，和¹⁸⁸Re是特别优选的。^99mTc是特别有用和优选的诊断放射性核素，因为它的低费用，易得到，成像特性，和高特异活性。^99mTc的核和放射性特性使这种同位素成为一种理想的闪烁照相成像的试剂。这种同位素有一种140keV的单光子能量和大约6小时的放射性半衰期，它从⁹⁹Mo-^99mTc的发生器中容易得到。例如，^99mTc标记的多肽能被用来在原发肿瘤和转移瘤中诊断和监测治疗的进展。¹⁷⁷Lu，⁹⁰Y或其它治疗的放射性核素标记的多肽能被用来为原发肿瘤和前列腺癌，乳腺癌，肺癌等相关的转移瘤提供放射治疗。

1B.放射性卤素

在一个可选择的实施方案中，本发明的化合物能通过使用放射性核素的卤化进行标记，例如¹⁸F，¹²⁴I，¹²⁵I，¹³¹I，¹²³I，⁷⁷Br，和⁷⁶Br而不是使用一种金属螯合剂来连接金属放射性核素。金属或卤素放射性核素的选择将根据希望的治疗或诊断应用来决定。

2A.其它诊断部分

在可选择的实施方案中，本发明的化合物可以结合其它的诊断部分，例如能够通过象x-射线，磁共振成像，超声，荧光和其它光学成像方法之类技术来检测化合物的物质，如下面更详细描述的那样。诊断部分的选择将根据希望的应用来决定。在一个实施方案中，本发明的化合物可以结合光标记，例如光学染料，其包括有机发色团或荧光团，有广泛的不局限的环系统以及在400-1500nm的范围内有最大的吸收和发射。本发明的化合物可以选择地用生物发光分子被衍生化。光标记的优选最大吸收范围是在600和1000nm之间以使来自血红蛋白的信号的干扰最小化。优选地，光吸收标记有大的摩尔吸附性，例如，＞10⁵cm^-1M^-1，而荧光光学染料将有高的量子产量。光学染料的例子包括，但不限于被描述在WO 98/18497，WO 98/18496，WO 98/18495，WO98/18498，WO 98/53857，WO 96/17628，WO 97/18841，WO 96/23524，WO 98/47538中的那些，在这里引为参考。例如，光标记可以共价地直接连接至本发明的化合物，例如，包括本发明的导向肽或诊断或治疗部分和接头的化合物。由于它们的生物相容性，高摩尔吸附性，和/或高荧光量子产量，几种在电磁光谱的可见和近红外线区内吸收和发射光的染料正在被用于多种生物医学应用。与作为造影剂的染料结合的光学形态的高灵敏度可以与核医学的高灵敏度相平行，并允许器官和组织可见化，没有电离辐射的不希望的影响。在近红外线区(NIR)有强烈吸收和发射的花菁染料是特别有用的，因为生物组织在这个区是光学透明的。例如，在NIR区有吸收和发射的靛花菁(indocyanine)绿已经被用来监测心脏的输出量，肝功能，和肝血流，它的功能化衍生物已经被用来结合生物分子用于诊断目的(R.B.Mujumdar，L.A.Ernst，S.R.Mujumdar，等，Cyanine dye labeling reagents：Sulfoindocyanine succinimidyl esters.Bioconjugate Chemistry，1993，4(2)，105-111；Linda G.Lee和Sam L.Woo.“N-Heteroaromatic ion and iminium ion substituted cyanine dyesfor use as fluorescent labels”，美国专利号5,453,505；EricHohenschuh，等。“Light imaging contrast agents“，WO98/48846；Jonathan Turner，等。“Optical diagnostic agents for thediagnosis of neurodegenerative diseases by means of nearinfer-red radiation”，WO 98/22146；Kai Licha，等。“In-vivodiagnostic process by near infrared radia tion”，WO 96/17628；Robert A.Snow，等，Compounds，WO 98/48838。多种成像技术和试剂被描述在美国专利6,663,847、6,656,451、6,641,798、6,485,704、6,423,547、6,395,257、6,280,703、6,277,841、6,264,920、6,246,919、6,228,344、6,217,848、6,190,641、6,183,726、6,180,087、6,180,086、6,180,085、6,013,023和公开的美国专利申请2003185756、20031656432、2003158127、2003152577、2003143159、2003105300、2003105299、2003072763、2003036538、20030316237、2003017164、2002169107、2002164287和2002156117中。

2B.其它治疗部分

在可选择的实施方案中，本发明的化合物可结合其它治疗部分比如抗生素，激素，酶，抗体，生长因子，如下面更详细描述的那样。可选择地，本发明的化合物可与一个治疗部分结合应用。治疗部分的选择将根据希望的应用来决定。合适的治疗部分包括，但不限于：抗肿瘤剂，比如铂化合物(例如螺铂、顺铂和卡铂)，甲氨蝶呤，阿霉素，丝裂霉素，美坦西醇，博来霉素，胞嘧啶，阿糖胞苷，阿糖腺苷，巯基多聚赖氨酸，长春新碱，白消胺，苯丁酸氮芥，抗瘤氨酸(例如，苯丙氨酸氮芥、a、美法伦或苯丙氨酸氮芥)，巯基嘌呤，米托坦，盐酸丙卡巴肼，放线菌素D，盐酸柔红霉素，盐酸多柔比星，紫杉醇，丝裂霉素，普卡霉素(光辉霉素)，氨鲁米特，雌莫司汀磷酸酯钠，氟他氨，醋酸亮丙瑞林，醋酸甲地孕酮，枸橼酸他莫昔芬，睾内酯，曲洛司坦，安吖啶(m-AMSA)，天冬酰胺酶(L-天冬酰胺酶)欧文菌属天冬酰胺酶(Erwina aparaginase)，依托泊甙(VP-16)，干扰素a-2a，干扰素a-2b，替尼泊甙(VM-26)，硫酸长春碱(VLB)，和阿拉伯糖基(arabinosyl)；血产品例如肠胃外的铁，氯高铁血红素，血卟啉和它们的衍生物；生物反应调节剂例如胞壁酰二肽，胞壁酰三肽；微生物细胞壁成分；淋巴因子(例如细菌内毒素例如脂多糖，巨噬细胞激活因子)；细菌的亚单位(例如分枝杆菌，棒状菌)；合成的二肽N-乙酰-胞壁酰-1-丙氨酰-I)-异谷酰胺；抗真菌剂例如酮康唑，制霉菌素，灰黄霉素，5-氟胞嘧啶(5-fc)，咪康唑，两性霉素B，蓖麻毒蛋白，和β-内酰胺抗生素(例如，磺胺泽辛)；激素例如生长激素，促黑素细胞激素，雌二醇，丙酸倍氯米松，二丙酸倍氯松，倍他米松，醋酸倍他米松和倍他米松磷酸酯钠，vetamethsone disodiumphosphate，vetemthsone sodium phosphate，醋酸可的松，地塞米松，醋酸地塞米松，地塞米松磷酸钠，氟尼缩松，皮质醇(氢化可的松)，醋酸氢化可的松，环戊丙酸氢化可的松，氢可松磷酯钠，氢化可的松琥珀酸钠，甲泼尼龙，醋酸甲强龙，甲基强的松龙琥珀酸钠，醋酸帕拉米松(对氟米松)，泼尼松龙，醋酸泼尼松龙，泼尼松龙磷酸钠，强的松龙叔丁乙酯，泼尼松，曲安西龙，曲安奈德，双乙酸曲安西龙，己曲安奈德和醋酸氟氢可的松；维生素例如维生素B12neinoic acid，视黄醛和衍生物例如维生素A棕榈酸酯，和α-生育酚；酶例如锰超氧化物歧化酶或碱性磷酸酶；抗过敏剂例如amelexanox；抗凝剂例如苯丙香豆素和肝素；循环药物例如普萘洛尔；代谢强化因子例如谷胱甘肽；抗结核药例如对-氨基水杨酸，异烟肼，硫酸卷曲霉素cycloscrine，盐酸乙胺丁醇乙硫异烟胺，吡嗪酰胺，利福平，和硫酸链霉素；抗病毒药例如阿昔洛韦(无环鸟苷)，金刚烷胺叠氮胸苷(AZT或齐多夫定)，利巴韦林和阿糖腺苷一水化物(阿糖腺苷，ara-A)；抗心绞痛例如硫氮卓酮，硝苯地平，维拉帕米，丁四硝酯，硝酸异山梨酯，硝酸甘油(甘油三硝酸酯)和季戊四醇四硝酸酯；抗生素，抗炎药物例如二氟苯水杨酸，布洛芬，吲哚美辛，甲氯芬那酸，甲芬那酸，甲氧奈普酸，羟基保泰松，保泰松，吡罗昔康(康吡氧噻嗪)，舒林酸，托美丁，阿司匹林和水杨酸酯；抗寄生虫药物例如氯喹，羟氯喹，甲硝唑，奎宁和锑酸葡胺；抗风湿剂例如青霉胺；麻醉剂例如阿片樟脑酊；阿片制剂例如可待因，海洛因，美沙酮(非那酮)，吗啡和阿片；强心甙例如去乙酰毛花甙，洋地黄毒苷，地高辛，洋地黄甙和洋地黄；神经肌肉的阻滞剂例如阿曲库铵甲磺酸盐，加拉碘铵，溴化己芴铵，碘甲箭毒，泮库溴铵，氯琥珀胆碱，氯化简箭毒碱和维库溴铵；镇静剂(催眠药)例如异戊巴比妥，异戊巴比妥钠，阿普比妥，仲丁巴比妥钠，水合氯醛，乙氯叔醇，炔己蚁胺，盐酸氟安定，格鲁米特，盐酸甲氧异丁嗪，甲乙哌酮，咪达唑仑盐酸盐，三聚乙醛，戊巴比妥，戊巴比妥钠，苯巴比妥钠，司可巴比妥钠，他布比妥，替马西泮和三唑仑；局部麻醉剂例如布比卡因盐酸盐，氯普鲁卡因盐酸盐，盐酸依替卡因，盐酸利多卡因，甲哌卡因盐酸盐，盐酸普鲁卡因和丁卡因盐酸盐；以及全身麻醉剂例如氟哌利多，依托咪酯，含有氟哌利多的枸橼酸芬太尼，盐酸氯胺酮，甲己炔巴比妥钠和硫喷妥钠.在一个实施方案中，这个治疗部分可以是单克隆抗体，例如能够结合黑色素瘤抗原的单克隆抗体。

3.含有至少一种取代的胆汁酸的接头

在本发明的一个示范性的实施方案中，接头N-O-P含有至少一种取代的胆汁酸。因此，在接头N-O-P的这种实施方案中，

N是0(其中0意思是指它不存在)、α氨基酸、取代的胆汁酸或其它连接基团；

O是α氨基酸或取代的胆汁酸；以及

P是0、α氨基酸、取代的胆汁酸或其它连接基团，

其中N、O或P中的至少一个是取代的胆汁酸。

在本领域中α氨基酸是熟知的并且包括天然存在的和合成的氨基酸。

胆汁酸存在于胆汁中(肝脏的一种分泌物)并且是具有羟基和终止于羧基的5个碳原子侧链的类固醇。在取代的胆汁酸中，至少一个原子例如胆汁酸的氢原子被另一个原子、分子或化学基团取代。例如，取代的胆汁酸包括具有3-氨基、24-羧基官能的那些，所述官能在7和12位任选被氢、羟基或酮基官能度取代。

在本发明中其它适用的取代的胆汁酸包括取代的胆酸及其衍生物。具体的取代胆酸衍生物包括：

(3β，5β)-3-氨基胆烷-24-酸；

(3β，5β，12α)-3-氨基-12-羟基胆烷-24-酸；

(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羟基胆烷-24-酸；

赖氨酸-(3，6，9)-三氧杂十一烷-1，11-二羰基-3，7-二脱氧-3-氨基胆酸)；

(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羟基-12-氧代胆烷-24-酸；以及

(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羟基胆烷-24-酸。

3A.其它连接基团

可在接头N-O-P中使用的其它连接基团包括这样的化学基团，该化学基团起使诊断部分或治疗部分偶联至导向肽或其它诊断部分或治疗部分的作用，但对导向肽的导向功能或诊断或治疗部分的诊断或治疗功能无不利影响。适合的其它连接基团包括单独的肽(即连接在一起的氨基酸)、非肽基团(例如烃链)或氨基酸序列与非肽间隔区的组合。

在一个实施方案中，用于接头N-O-P中的其它连接基团包括L-谷氨酰胺和烃链，或它们的组合。

在另一个实施方案中，用于接头N-O-P中的其它连接基团包括由一系列氨基酸(例如，双甘氨酸、三甘氨酸、gly-gly-glu、gly-ser-gly等)组成的纯肽连接基团。

在还另一个实施方案中，用于接头N-O-P中的其它连接基团还可包括烃链[即，R₁-(CH₂)_n-R₂]，其中n是0-10，优选n＝3至9，R₁是可被用作共价连接配体骨架或预先形成的金属螯合剂或金属络合骨架或诊断部分或治疗部分的位点的基团(例如，H₂N-，HS-，-COOH)；以及R₂是被用于共价偶联至给定的导向肽的N-末端NH₂基的基团(例如，R₂是激活的COOH基)或其它诊断部分或治疗部分。用于使配体(即，螯合剂)或螯合物(与放射性核素络合的螯合剂/配体)与生物分子(例如导向肽)共轭的多种化学方法已被很好地描述在文献[Wilbur，1992；Parker，1990；Hermanson，1996；Frizberg等，1995]中。这些方法的一种或多种可被用于使未络合的配体(螯合剂)或放射性金属螯合物或其它诊断部分或治疗部分连接至接头或使接头连接至导向肽或其它诊断部分或治疗部分。这些方法包括酸酐、醛、异硫氰酸芳基酯、激活的酯或N-羟基琥珀亚酰胺的形成[Wilbur，1992；Parker，1990；Hermanson，1996；Frizberg等，1995]。

在优选的实施方案中，用于接头N-O-P中的其它连接基团可由具有如下描述的亲电体或亲核体的接头前体形成。

LP1：在接头的至少两个部位上具有相同的亲电体E1或亲核体Nu1的接头前体；

LP2：具有亲电体E1和在接头的另一个部位上具有不同的亲电体E2的接头前体；

LP3：具有亲核体Nu1和在接头的另一个部位上具有不同的亲核体Nu2的接头前体；或者

LP4：具有用亲电体E1功能化的一端和有亲核体Nu1的另一端的接头前体。

优选的亲核体Nu1/Nu2包括-OH、-NH、-NR、-SH、-HN-NH₂、-RN-NH₂和-RN-NHR’，其中R’和R独立地选自上面给出的R的定义，但R’不是H。

优选的亲电体E1/E2包括-COOH、-CH＝O(醛)、-CR＝OR’(酮)、-RN-C＝S、-RN-C＝O、-S-S-2-吡啶基、-SO₂-Y、-CH₂C(＝0)Y、和

其中Y可被选自下列基团：

Cl，Br，F

4.导向部分

导向部分(即式M-N-O-P-Q中的Q)是对特定位点或特定代谢官能具有结合亲和性的任何分子。导向部分将本发明的化合物引向至合适的位点，或使化合物参与到反应中，其中所需要的诊断或治疗活性将发挥。在一个示范性的实施方案中，导向部分可以是肽、其等同物、衍生物或类似物，其起与特定位点结合的配体的作用。在另一个示范性的实施方案中，导向部分可以是酶、或与酶结合的分子。在另一个示范性的实施方案中，导向部分可以是抗生素。

在优选的实施方案中，导向部分是肽，该肽与目的受体或酶结合。例如，导向肽Q可以是肽激素例如，黄体生成素激素释放激素(LHRH)例如在文献[例如，Radiometal-Binding Analogus of LeutenizingHormone Releasing Hormone PCT/US96/08695；PCT/US97/12084(WO98/02192)]中描述的；胰岛素；催产素(oxytosin)；促生长素抑制素；神经激肽-1(NK-1)；血管活性肠肽(VIP)，包括如在文献，[例如，Comparison of Cyclic and Linear Analogs of VasoactiveIntestinal Peptide.D.R.Bolin，J.M.Cottrel，R.Garippa，N.Rinaldi，R.Senda，B.Simkio，M.O’Donnell.Peptides：Chemistry，Structure and Biology Pravin T.P.kaumaya，和Roberts S.Hodges(编辑).Mayflower Scientific LTD.，1996，pgs174-175]中描写的线性和环状的；胃泌素释放肽；铃蟾肽和其它已知的激素肽，以及它们的类似物和衍生物。

其它适用的导向肽包括促生长素抑制素的类似物，其例如是兰瑞肽(Nal-Cys-Thr-DTrp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂)、奥曲肽(Nal-Cys-Thr-DTrp-Lys-Val-Cys-Thr-ol)、和Maltose(Phe-Cys-Thf-DTrp-Lys-Val-Cys-Thr-ol)。这些类似物被描述在文献[例如，PotentSomatostatin Analogs Containing N-terminal Modifications，S.H.Kim，J.Z.Dong，T.D.Gordon，H.l.Kimball，S.C.Moreau，J.-P.Moreau，B.A.Morgan，W.A.Murphy和J.E.Taylor；Peptides：Chemistry，Structure and Biology，Pravin T.P.kaumaya，和RobertsS.Hodges(编辑).Mayflower Scientific LTD.，1996，pgs241-243]中。

其它还适用的导向肽包括P物质激动剂[例如，G.Bitan，G.Byk，Y.Mahriki，M.Hanani，D.Halle，Z.Selinger，C.Gilon，Peptides：Chemistry，Structure and Biology Pravin T.P.kaumaya，和RobertsS.Hodges(编辑).Mayflower Scientific LTD.，1996，pgs697-698；G Protein Antagonists A novel hydrophobic peptide competes withreceptor for G protein binding，Hidehito Mukai，Eisuke Munekata，Tsutomu Higashijima，J.Bio.Chem.1992，267，16237-16243]；NPY(Y1)[例如，Novel Analogues of Neuropeptide Y with aPreference for the YI-receptor，Richard M.Soll，Michaela，C.Dinger，Ingrid Lundell，Dan Larhammer，Annette G.Beck-Sickinger，Eur.J.Biochem.2001，268，2828-2837；99mTc-Labeled Neuropeptide Y Analogues as Potential Tumor ImagingAgents，Michael Langer，Roberto La Bella，Elisa Garcia-Garayoa，Annette G.Beck-Sickinger，Bioconjugate Chem.2001，12，1028-1034；Novel Peptide Conjugates for Tumor-SpecificChemotherapy，Michael Langer，Felix Kratz，BarbaraRothen-Rutishauser，Heidi Wnderli-Allenspach，Annette G.Beck-Scikinger，J.Med.Chem.2001，44，1341-1348]；催产素；内皮缩血管肽A和内皮缩血管肽B；缓激肽；表皮生长因子(EGF)；白细胞介素-1[Anti-IL-1 Activity of Peptide Fragments of IL-1Family Proteins，I.Z.Siemion，A.Kluczyk，Zbigtniew Wieczorek，Peptides 1998，19，373-382]；和缩胆囊肽(CCK-B)[CholecystokininReceptor Imaging Using an Octapeptide DTPA-CCK Analgue inPatients with Medullary Thryoid Carcinoma，Eur.J.Nucl Med.200，27，1312-1317]。

例如可在下面的文献中找到给出导向肽的一般综述的文献：TheRole of Peptides and Their Receptors as Tumor Markers，Jean-Claude Reubi，Gastrointestinal Hormones in Medicine，Pg899-939；Peptide Radiopharmaceutical in Nuclear Medicine，D.Blok，R.I.J.Feitsma，P.Vermeij，E.J.K.Pauwels，Eur.J.Nul Med.1999，26，1511-1519；和Radiolabeled Peptides and Other Ligands forReceptors Overexpressed in Tumor Cells for Imaging Neoplasms，JohnG.McAfee，Ronald D.Neumann，Nuclear Medicine and Biology，1996，23，673-676(促生长素抑制素、VIP、CCK、GRP、P物质、甘丙素(Galanan)、促黑素(MSH)、LHRH、精氨酸升压素、内皮缩血管肽)。通过参考将在前面段落中所有前面提到的文献以其整体并入本申请。

其它导向肽参考文献包括如下：Coexpressed peptide receptorsin breast cancer as a molecular basis of in vivo multireceptortumor targeting.Jean Claude Reubi，Mathias Gugger，BeatriceWaser.Eur.J.Nul Med.2002，29，855-862，(包括NPY、GRP)；Radiometal-Binding Analogues of Leutenizing Hormone ReleasingHormones PCT/US96/08695(LHRH)；PCT/US97/12084(WO 98/02192)(LHRH)；PCT/EP90/01169(肽的放射治疗)；WO/91/01144(肽的放射治疗)；以及PCT/EP00/01553(用于肿瘤治疗和诊断的分子)，通过参考将它们全部以其整体并入本申请。

另外，可以使用导向肽的类似物。这些类似物包括导向所希望的位点受体的分子(具有大于或等于导向肽本身的亲和力)，以及导向肽的突变蛋白、反肽(retropeptides)和反-翻转肽(retro-inversopeptides)。普通技术人员将认为，这些类似物还可含有修饰，该修饰包括一个或多个氨基酸的取代、和/或缺失和/或添加，只要这些修饰不负面地改变其中所述肽的生物活性。可以通过用它们的同义氨基酸置换一个或多个氨基酸实施这些取代。一组内的同义氨基酸被定义为这样的氨基酸，它具有充分相似的生理化学性质以允许组的成员之间的取代以保持所述分子的生物学功能。本申请使用的同义氨基酸包括这些氨基酸的合成衍生物(例如D-型氨基酸和其它合成的衍生物)。

氨基酸的缺失或插入可被引入所定义的序列，只要它们不改变所说序列的生物学功能。优先地，这样的插入或缺失应被限制于1、2、3、4或5个氨基酸并且不应该移动或物理扰乱或替代对功能构象是关键的氨基酸。本申请所述肽或多肽的突变蛋白可具有与本说明书中公开的序列同源的序列，其中在一个或多个氨基酸位置存在氨基酸取代、缺失或插入。突变蛋白可具有为本申请所述肽的至少40％，优选至少50％，更优选60-70％，最优选80-90％的生物学活性。但是，它们还可以具有大于具体举例的肽的生物学活性，因此不必要一定与所举例的肽的生物学功能相等。导向肽的类似物还包括掺入引起肽骨架的酰胺键，包括硫酰胺、亚甲基胺、和E-烯烃变化的肽模拟物(peptidomimetics)或假肽(pseudopeptides)。基于导向肽或其具有被N-取代的肼羰基化合物取代的氨基酸(也被称为氮杂氨基酸)的肽类似物的结构的肽也被包括在本申请所使用的术语类似物中。

导向肽还可以通过N或C末端或通过与赖氨酸的ε氮、鸟氨酸的γ氮或天冬氨酸或谷氨酸的第二个羧基的连接与接头连接。

在一个示范性的实施方案中，导向肽Q是LHRH或其类似物或衍生物。例如，本领域中熟知，LHRH激动剂的位置6可被不同的功能基团，例如D赖氨酸取代。在一个优选的实施方案中，导向肽Q是式PGlu-His-Trp-W-Tyr-DLys-X-Y-Pro-Z的LHRH类似物，其中

W＝Ser、NMeSer或Thr。

X＝Leu、NMeLeu、叔丁基Gly。

Y＝Arg、ArgEt₂、Cit、Lys异丙基。

Z＝Gly-NH₂、NH乙基、氮杂gly-NH₂。

与甘氨酸和D赖氨酸偶联的本发明的接头可在位置6与LHRH连接。这种实施方案包括下式化合物：

PGlu-His-Trp-W-Tyr-DLys(M-M-O-P)-X-Y-Pro-Z，其中

W＝Ser、NMeSer或Thr。

X＝Leu、NMeLeu、叔丁基Gly。

Y＝Arg、ArgEt₂、Cit、Lys异丙基。

Z＝Gly-NH₂、NH乙基、氮杂gly-NH₂。

M是如本申请所定义的金属螯合剂，以及

N-O-P是本发明的接头。

在特别优选的实施方案中，本发明包括下式化合物：

PGlu-His-Trp-W-Tyr-DLys(DOTA-Gly-胆酸衍生物)-X-Y-Pro-Z，其中

W＝Ser、NMeSer或Thr。

X＝Leu、NMeLeu、叔丁基Gly。

Y＝Arg、ArgEt₂、Cit、Lys异丙基。

Z＝Gly-NH₂、NH乙基、氮杂gly-NH₂。

这里，DOTA-Gly是M(金属螯合剂和Gly间隔区)，N-O-P是本发明的接头(例如胆酸衍生物)，以及Q是结合Dlys6和上面所列举的其它取代的LHRH。

在一个优选的实施方案中，上式中的W、X、Y或Z组分是W＝Ser，X＝Leu，Y＝Arg和Z＝Gly-NH₂。

在另一个优选的实施方案中，Q是导向GRP受体家族中受体的肽，例如GRP或铃蟾肽的类似物或衍生物。在2003年1月13日提交的共未决(co-pending)的美国系列号10/341,577、以及美国专利6,200,546、US2002/0054855、US2003/0224998和WO02/87637中讨论了这样的导向肽，通过参考将它们以其全部并入本申请。

具有式M-N-O-P-Q的化合物的例子列在表1中，该式含有具有至少一种取代的胆汁酸的接头，所述胆汁酸与导向肽例如BBN(7-14)连接。使用本申请，特别是在实施例中所公开的方法，以及通过本领域技术人员已知的相似方法可制备这些化合物。

表1

*BBN(7-14)是[SEQ ID NO：1]

¹HPLC方法表示HPLC梯度10分钟时间。

²HPLC RT表示HPLC中化合物的保留时间。

³MS表示质谱，由质量/单位电荷(m/e)计算分子量。

⁴IC₅₀表示抑制碘化的铃蟾肽与细胞上的GRP受体的50％结合的化合物的浓度。

如下文更详细解释的，含有本发明的接头和GRP-R导向肽的化合物在动物模型中证实了意料之外优异的药物动力学和肿瘤摄取。

根据所选择的螯合剂，可通过不同的方法制备所述导向肽。一般通过在肽合成领域中广泛建立和已知的技术可最方便地制备所述肽，例如固相肽合成(SPPS)方法。固相肽合成(SPPS)涉及向形成的肽链分步添加氨基酸残基，所述肽链与不可溶的支持体或基质，例如聚苯乙烯连接。首先将所述肽的C-末端残基与商业上可获得的支持体锚定，其氨基用N-保护试剂例如叔丁氧羰基(Boc)或芴甲氧基羰基(Fmoc)基团保护。用适合的脱保护试剂例如在Boc的情况下用TFA或对Fmoc来说用哌啶去除氨基保护基团并与适合的偶联试剂例如N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)或N，N’-二异丙基碳二亚胺或2-(1H苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)一起添加下一个氨基酸残基(以N-保护的形式)。形成肽键后，从支持体洗下所述试剂。添加最后的残基后，用适合的试剂例如三氟乙酸(TFA)或氟化氢(HF)从支持体裂解所述肽。

然后可通过使导向肽的所选的残基的游离氨基与接头的适合的官能基团反应，将接头偶联以形成缀合物。还可以在树脂上组装上面讨论的螯合剂、接头和导向部分的整个构建体，然后通过适合试剂例如三氟乙酸或HF的作用裂解。

5.放射性药物化合物的标记和施用

通过配位化学领域中通常已知的各种方法可以实现金属在本发明的放射性药物缀合物内的掺入。当金属是^99mTc(一种优选的用于诊断成像的放射性核素)时，可使用下面的一般方法以形成锝络合物。通过最初将缀合物溶于水、稀释的酸或于醇例如乙醇的水溶液中形成肽-螯合剂缀合物溶液。然后选择性地将溶液脱气以去除溶解的氧。当肽中存在-SH基团时，可选择性地使用硫羟基保护基团例如Acm(乙酰氨基甲基)、三甲苯基或其它硫羟基保护基团以保护硫羟基免被氧化。用适合的试剂例如用氢氧化钠去除硫羟基保护基团，然后用有机酸例如乙酸(pH6.0-6.5)中和。或者，在锝螯合过程中原位去除硫羟基保护基团。在标记步骤中，将从钼发生器中获得高锝酸钠与足够量的还原剂例如氯化亚锡一起添加到缀合物的溶液中，以还原锝，并允许在室温下静置或加热。用色谱法例如用C-18 Sep Pak筒[MilliporeCorpation，Waters Chromatography Division，34 Maple Street，Milford，Massachusetts 01757]或通过HPLC使用本领域技术人员已知的方法可以将标记的缀合物与污染物^99mTcO₄和胶态^99mTcO₂分开。

在一种替代的方法中，可以通过反式螯合(transchelation)反应完成标记。在这种方法中，锝来源是在与所选择的螯合剂反应前与不稳定的配体络合的锝溶液，因此促进配体与所选择的螯合剂交换。用于反式螯合的适合的配体的例子包括酒石酸盐、柠檬酸盐、葡糖酸盐和葡庚糖酸盐(heptagluconate)。将要理解的是，使用上面描述的技术可以标记缀合物，或者，螯合剂本身可被标记并且随后被偶联至肽以形成缀合物；被称为“预标记的螯合物”方法的方法。Re和Tc都在周期表的VIIB列中并且它们是化学同族元素。因此，在极大程度上，这两种金属与表现出体内和体外高稳定性的配体框架(frameworks)的络合化学是相同的[Eckelman，1995]并且可使用相似的螯合剂和方法用Re标记。被用于与肽和蛋白质形成稳定的放射性金属络合物的许多^99mTc或^186/188Re络合物，在它们的+5氧化状态螯合这些金属[Lister-James等，1997]。该氧化状态使得选择性地将^99mTc-或^186/188Re置入配体框架中成为可能，所述配体框架已经与生物分子缀合、由一系列^99mTc(V)和/或^186/188Re(V)弱螯合物(例如，^99mTc-葡庚糖酸盐、柠檬酸盐、葡糖酸盐等)构建[Eckelman，1995；Lister-James等，1997；Pollak等，1996]。

可以使用本领域中已知的方法完成用放射性卤素标记本发明的导向肽或其它肽-接头缀合物。实施例描述了多种可被使用的方法。

可将标记有放射性核素金属，例如^99mTc的缀合物，以药物上可接受的载体和/或溶液例如盐溶液如等渗盐水形式，通过静脉内、皮下或腹膜内注射给予哺乳动物，包括人患者或受试者。本发明提供的放射标记的闪烁照相成像物质被提供具有适合量的放射性。在形成^99mTc放射性络合物时，优选在含有浓度为约0.01毫居里(mCi)至100mCi每毫升的放射性的溶液中形成放射性络合物。通常，给予的单位剂量具有约0.01毫居里(mCi)至100mCi，优选1mCi至30mCi的放射性。以单位剂量注射的溶液为0.01mL至约10mL。适合于施用的标记的缀合物的量依赖于所选缀合物的分布特征，在某种意义上说快速清除的缀合物比较慢清除的缀合物可能需要给予更高的剂量。在施用后适合的时间，通过标准的闪烁照相技术可以追踪体内分布和定位；典型地在30分钟和180分钟之间，取决于在靶位点的累积速率和在非靶组织的清除速率。例如，在将本发明的诊断放射性核素标记的化合物注射到患者中后，可使用根据被掺入成像物质中的核素的γ射线能量进行标定的γ照相机使所述物质的摄取部位成像并定量存在于所述位点的放射性的量。体内位点的成像可发生在几分钟内。但是，如果希望，在将放射标记的肽注入患者后，成像可发生几个小时或甚至更长时间。在大多数情况下，被给予剂量的足够量将在约0.1小时内累积被成像的部位以允许闪烁照片的拍摄。

可将本发明的化合物单独或作为含有其它组分例如赋形剂、稀释剂、自由基清除剂、稳定剂和载体(它们全部是本领域中已知的)的组合物的部分给予患者。也可以静脉内或腹膜内将所述化合物给予患者。

有许多与本发明有关的优点。按照本发明制备的化合物形成稳定、良好定义的^99mTc或^186/188Re标记的化合物。通过使用各放射性金属的适合的螯合剂框架也可以制备本发明类似的化合物，以形成稳定、良好定义的用¹⁵³Sm、⁹⁰Y、¹⁶⁶Ho、¹⁰⁵Rh、¹⁹⁹Au、¹⁴⁹Pm、¹⁷⁷Lu、¹¹¹I或其它放射性金属标记的产物。不到达(即不结合)癌细胞的放射性物质优先有效地被排泄到尿中，在肾中具有最小的放射性金属的保留。

6.可选择的实施方案

如在实施例中更详细解释的，含有本发明新接头的化合物表现出增加的血清白蛋白亲和性，其降低了所述化合物的排泄速率。因此这些化合物比没有本发明接头的化合物表现出更长的半衰期。令人惊奇地，导向肽与本发明胆酸衍生物接头的氨基连接的化合物，以及导向肽与胆酸衍生物接头的羧酸基连接的化合物，都表现出这种性质。

在本发明的一个示范性实施方案中，导向肽可通过3位的氨基与本发明的胆酸衍生物接头连接。诊断或治疗部分通过24位的羧酸基团被连接。

在另一个示范性实施方案中，导向肽可与本发明胆酸衍生物接头的24位的羧酸基团连接。诊断或治疗部分可通过所述接头的3位氨基被连接。例如，在L62(图6B)和L69(图10B)中，诊断部分(金属螯合剂)在3位被连接并且导向肽(BBN[7-14]在胆酸衍生物接头的24位被连接。

在另一个示范性实施方案中，诊断或治疗部分可与胆酸衍生物接头的氨基和羧基的任一个连接。在优选的示范性实施方案中，化合物具有与3-氨基连接的治疗部分(胰岛素分子)和与胆酸衍生物接头的24位羧基连接的另一个治疗部分(胰岛素分子)。参见例如化合物D(图4)。在另一个优选的示范性实施方案中，化合物具有与3-氨基连接的治疗部分(胰岛素分子)和与胆酸衍生物接头的24位羧基连接的诊断部分(金属螯合剂)(或相反)。参见例如化合物F(图5B)。

本发明还包括一种实施方案，其中导向肽和诊断或治疗部分(或两个诊断和/或治疗部分)都可通过胆酸衍生物接头的3-氨基被连接。例如，在L65(图9)和L66(图10A)中，诊断部分(金属螯合剂)和导向肽(13BN[7-14])都在本发明胆酸衍生物接头的3-位被连接。

7A.诊断和治疗用途

当用诊断和/或治疗部分(例如，诊断或治疗有用的金属)标记时，通过在诊断成像、放射诊断学和放射治疗学领域中已建立的方法，可将本发明的化合物用于治疗和/或检测疾病例如癌，包括肿瘤，[Bushbaum，1995；Fischman et al.，1993；Schubiger et al.，1996；Lowbertz et al.，1994；Krenning et al.，1994]。

本发明的化合物，如在实施例中更详细解释的，比没有在此公开的新接头的化合物显示在体内更高的肿瘤中摄取，表现出提高的导向期望的受体表达性组织(例如受体表达性肿瘤)的能力。因此，本发明的化合物更好地能够成像或输送放射治疗至这些期望的组织。事实上，如在实施例中所显示的，使用本发明的化合物放射治疗更有效(并且存活时间增加)。

这些化合物的诊断应用，使用诊断成像(例如闪烁照相术、磁共振、超声、光学、光声术或声致发光成像)时，可被作为靶细胞存在的第一线诊断筛选，使用手持放射检测仪器时作为放射免疫导向的外科手术(PIGS)中导向所选组织的物质，作为在施用相配的一对放射治疗化合物前获得计量学数据的工具，以及作为评估作为治疗随时间的函数的靶受体群的工具。

这些化合物的治疗应用可被定义为在治疗疾病例如癌中将被用作第一线治疗的物质，在本发明的治疗剂可与辅助化疗结合(例如与在此公开的其它治疗剂的一种)被应用时作为组合治疗，或作为相配的一对治疗剂的治疗部分。相配的一对的概念表示单个未金属化的化合物，该化合物可起诊断和治疗物质的作用，取决于被选择用于与适合的螯合物结合的放射性金属。如果螯合剂不能容纳期望的金属，可进行适合的取代以容纳不同的金属，同时保持药理学，以致诊断化合物在体内的行为可被用于预测放射治疗化合物的行为。

7B.光学成像、声致发光、光声成像和光线疗法

按照本发明，在用光学标记的本发明化合物注射受试者后，用体内光成像可以使用许多光学参数来测定靶的定位。在制备图象中，被检测的光学参数可包括传导的辐射性、吸收、荧光或磷光的发射、光反射、吸收幅度或最大值的变化，以及弹性散射的辐射。例如，在接近650--1000nm近红外(NIR)波长，生物组织对光相对半透明的。NIR辐射可渗透组织直到几分米，允许使用本发明的化合物来在体内成像含靶组织。可见和近红外(NIR)光在临床实践中的应用快速增长。在电磁谱的可见、NIR或长波长(UV-A，＞350nm)区域的化合物吸收或发射潜在地适用于X-线断层成像、内窥镜检查目视和光线疗法。

生物医学光学的主要优点在于它的治疗潜能。光线疗法已被证实为安全和有效的用于治疗各种表面伤口(外部的和内部的)的方法。在光学成像和光线疗法中，增强信号检测和/或组织的光敏感的染料是重要的。先前的研究显示，某些染料可定位于肿瘤中并且起检测和治疗小癌的强力探针作用(D.A.Bellnier等.，Murinepharmacokinetics and antitumor efficacy of the photodynamicsensitizer2-[1-hexyloxyethyl]-2-devinyl pyropheophorbide-a，J.Photochem.Photobiol.，1993，20，pp.55-61；G.A.Wagnieres等，In vivo fluorescence spectroscopy and imaging foroncological applications，Photochem.Photobiol.，1998，68，pp.603-632；J.S.Reynolds等.，Imaging of spontaneous caninemammary tumors using fluorescent contrast agents，Photochem.Photobiol.，1999，70，pp.87-94)。但是，这些染料不优先定位在恶性组织中。

在一个示范性的实施方案中，本发明的化合物可与光标记(photolabels)，例如光学染料结合，其包括有机发色团或荧光团，具有广泛的非定域环系统并且具有400-1500nm范围内的吸收或发射最大值。本发明的化合物可选择地被用于生物发光分子衍生化。光标记的吸收最大值的优选范围在600和1000nm之间以最小化来自血红蛋白的信号干扰。优选地，光吸收标记具有大的摩尔吸收性，例如＞10⁵cm^-1M^-1，而荧光光学染料将有高的量子产量。光学染料的例子包括，但不限于，那些描述在WO 98/18497，WO 98/18496，WO 98/18495，WO98/18498，WO 98/53857，WO 96/17628，WO 97/18841，WO 96/23524，WO 98/47538，在这里引为参考。例如，光标记可以共价地直接连接本发明的化合物，例如，包括本发明的导向肽和接头的化合物或包括本发明的诊断或治疗部分和接头的化合物。

由于它们的生物相容性，高摩尔吸附性，和/或高荧光量子产量，几种在可见光和近红外线区的电磁光谱内吸收和发射光的染料正在被用于多种生物医学应用。与作为造影剂的染料结合的光学形态连同染料的高可以与核医学的高灵敏度相平行，并允许器官和组织可见化，没有电离辐射的不希望影响。在近红外线区(NIR)有强烈吸收和发射的花菁染料是特别有用的，因为生物组织在这个区是光学透明的(B.C.Wilson，Optical properties of tissues.Encyclopedia of HumanBiology，1991，5，587-597)。例如，在NIR区有吸收和发射的靛花菁绿已经被用来监测心脏的输出量，肝功能，和肝血流，(Y-L.He，H.Tanigami，H.Ueyama，T.Mashimo和I.Yoshiya，Measurement ofblood volume using indocyanine green measured withpulse-spectrometry：Its reproducibility and reliability.Critical Care Medicine，1998，26(8)，1446-1451；J.Caesar，S.Shaldon，L.Chiandussi等The use of Indocyanine green in themeasurement of hepatic blood flow and as a test of hepaticfunction Clin.Sci.1961，21，43-57)以及它的功能化衍生物已经被用来结合生物分子用于诊断目的(R.B.Mujumdar，L.A.Ernst，S.R.Mujumdar，等，Cyanine dye labeling reagents：Sulfoindocyanine succinimidyl esters.Bioconjugate Chemistry，1993，4(2)，105-111；Linda G.Lee和Sam L.Woo.“N-Heteroaromatic ion and iminium ion substituted cyanine dyesfor use as fluorescent labels”，美国专利号5,453,505；EricHohenschuh，等。“Light imaging contrast agents“，WO98/48846；Jonathan Turner，等。“Optical diagnostic agents for thediagnosis of neurodegenerative diseases by means of nearinfer-red radiation”，WO 98/22146；Kai Licha，等。“In-vivodiagnostic process by near infrared radia tion”，WO 96/17628；Robert A.Snow，等。Compounds，WO 98/48838.

注射光学标记的化合物后，用一种或多种光源(例如激光)以适合物质中所使用的光标记的波长范围扫描患者。使用的光可以是单色的或多色的和连续的或脉冲的。通过调谐至一或多波长的光测器检测传播的、散射的或反射的光以测定受试者中含靶组织的位置。可以随时间监测光学参数的变化以检测光学标记的试剂在靶位点的累积。可与本发明的光学成像试剂结合使用标准的成像方法和检测装置。

上面描述的光学成像试剂可被用于用光学标记的成像试剂进行的声光或声致发光成像。(见，U.S.5,171,298，WO 98/57666，以及其中的参考文献)。在声光成像中，超声辐射被应用到受试者并且影响传播的、发射的或反射的光的光学参数。在声致发光成像中，所应用的超声实际上产生检测的光。适合的使用这类技术的成像方法被描述在WO 98/57666中。

在美国专利6,663,847，6,656,451，6,641,798，6,485,704，6,423,547，6,395,257，6,280,703，6,277,841，6,264,920，6,264,919，6,228,344，6,217,848，6,190,641，6,183,726，6,180,087，6,180,086，6,180,085，6,013,243和公开的美国专利申请2003185756，20031656432，2003158127，2003152577，2003143159，2003105300，2003105299，2003072763，2003036538，2003031627，2003017164，2002169107，2002164287，和2002156117中描述了各种成像技术和试剂。

7C.磁共振成像

本发明的化合物可有利地与一种或多种顺磁性金属螯合物结合以形成用于MRI的造影剂。优选的顺磁性金属离子具有原子数21-29、42、44、或57-83。这包括过度金属或镧系的离子，其具有一个或多个，优选五个或更多个未配对的电子和至少约1.7玻尔磁子的磁矩。优选的顺磁性金属包括，但不限于，络(III)、锰(II)、锰(III)、铁(II)、铁(III)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、镨(III)、钕(III)、钐(III)、钆(III)、铽(III)、镝(III)、钬(III)、铒(III)、铕(III)和镱(III)。此外，本发明的化合物还可以与一种或多种超顺磁颗粒结合。

特别优选Gd(III)用于MRI，由于它的高松弛性和低毒性，以及只有一种生物学上可达到的氧化状态的可利用性。自从1988以来，Gd(III)螯合物已被用于临床和放射学MR应用，并且大约30％的MR检查目前使用基于钆(III)的造影剂。

本领域的技术人员将按照检测含靶组织所需的剂量并考虑其它因素例如金属对受试者的毒性选择金属。见，Tweedle等，Magnetic Resonance Imaging(2nd ed.)，vol.1，Partain等，eds.(W.B.Saunders Co.1988)，pp.796-7。通常，个体金属所需要的剂量将与它的松弛性成比例，通过生物分布、药物动力学和金属的代谢进行修饰。特别优选三价阳离子Gd3+用于MRI造影剂，由于它的高松弛性和低毒性，具有进一步的优点：它存在于唯一的生物学上可达到的氧化状态，使患者的不期望的金属代谢作用最小化。另一种有用的金属是Cr³⁺，它相对地不昂贵。

顺磁金属螯合剂是具有一个或多个极性基团的分子，所述极性基团起顺磁金属的配体的作用或与顺磁金属络合。适合的螯合剂是本领域中已知的并包括具有亚甲基膦酸基团、亚甲基甲羟胺酸基团、羧基亚乙基基团或羧基亚甲基基团。螯合剂的例子包括，但不限于，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、1，4，7，10-四氮杂环十四烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)、1-取代的1，4，7，-三羧甲基1，4，7，10四氮杂环十二烷三乙酸(D03A)、乙二胺四乙酸(EDTA和1，4，8，11-四氮杂环十四烷-1，4，8，11-四乙酸(TETA)。另外的螯合配体是亚乙基双-(2-羟基-苯基甘氨酸)(EHPG)及其衍生物，包括5-Cl-EHPG、5-Br-EHPG、5-Me-EHPG、5-t-Bu-EHPG和5-sec-Bu-EHPG；苯并二亚乙基三胺五乙酸(苯并-DTPA)及其衍生物，包括二苯并-DTPA、苯基-DTPA、二苯基-DTPA、苄基-DTPA和二苄基DTPA；双-2(羟基苄基)-亚乙基-二胺二乙酸(HBED)及其衍生物；大环化合物类含有至少3个碳原子，更优选至少6个和至少两个杂原子(O和/或N)，该大环化合物可由一个环或在杂环元素处连接在一起的两个或三个环组成，例如苯并-DOTA、二苯并-DOTA和苯并-NOTA，其中NOTA是1，4，7-三氮杂环壬烷N，N’，N”-三乙酸、苯并-TETA、苯并-DOTMA，其中DOTMA是1，4，7，10-四氮杂环十四烷-1，4，7，10-四(甲基四乙酸)，以及苯并-TETMA，其中TETMA是1，4，8，11-四氮杂环十四烷-1，4，8，11-(甲基四乙酸)；1，3-亚丙基二胺四乙酸(PDTA)和三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)的衍生物；1，5，10-N，N′，N″-三(2，3-二羟基苯甲酰基)-三儿茶酚酸酯(tricatecholate，LICAM)和1，3，5-N，N′，N″-三(2，3-二羟基苯甲酰基)氨甲基苯(MECAM)的衍生物。优选的用于本发明的螯合剂是DTPA。本发明考虑到的代表性螯合剂和螯合基团的例子被描述在WO98/18496，WO 86/06605，WO 91/03200，WO 95/28179，WO 96/23526，WO 97/36619，PCT/US98/01473，PCT/US98/20182，以及U.S.4,899,755，U.S.5,474,756，U.S.5,846,519和U.S.6,143,274，通过参考以其整体并入本申请。特别优选使用螯合物D03A。

放射性核素的螯合剂、顺磁金属的螯合剂可包括如上文所述定义的间隔基团。

通常，本申请公开的方法以及其它已知的方法可被用于偶联金属螯合物和包含本发明接头的化合物。参见例如，WO 95/28967，WO98/18496，WO 98/18497和其中的讨论。本发明考虑到了螯合物在任何位置上的连接，条件是为了使毒性最小化金属螯合物保留紧密结合金属的能力。相似地，为了产生与金属螯合物连接的位置，可以修饰或延长本发明化合物的组分，条件是这类修饰或延长不消除它结合靶的能力。

按照本申请公开内容制备的MRI造影剂可以相同的方式被用作常规MRI造影剂。当将含靶组织例如血管发生的位点成像时，可优选某些MR技术和脉冲序列以增强所述位点与背景血液和组织的对比。这些技术包括(但单不限于)，例如，寻求使血变黑暗的黑血血管造影术序列，例如快速自旋回波序列(参见例如，Alexander等.，MagneticResonance in Medicine，40(2)：298-310(1998))和流动损害的梯度回波序列(参见例如，Edelman等，Radiology，177(1)：45-50(1990))。这些方法还包括增强对比差异的流动独立技术，例如反转-恢复制备序列或饱和恢复制备序列，其将增加含靶组织例如血管发生性肿瘤和背景组织之间的对比。最后，磁化转移制备物还可以用这些物质改进对比(参见例如，Goodrich等，Investigative Radiology，31(6)：323-32(1996))。

将标记的试剂以可注射组合物的形式给予患者。给予MR造影剂的方法优选胃肠外施用，意思是指静脉内、动脉内、膜内、间隙、或腔施用。就成像活性血管发生而言，优选静脉内或动脉内施用。

就MRI来说，考虑到受试者将接受造影剂足以增强靶位点MR信号至少10％的剂量。注射包含MRI试剂的化合物构建体后，将患者在MRI机器中扫描以测定含靶的任何位点的位置。在治疗设置中，靶定位后，可以立即给予细胞毒性或治疗剂，如果需要，可以随后将患者扫描以使治疗效果可视化。

在优选的实施方案中，包含本发明接头和导向肽或治疗部分的化合物可与一种或多种顺磁金属螯合物或一种或多种超顺磁颗粒结合。这类化合物构建体与一种或多种顺磁金属络合并以足以增强靶位点MR信号至少10％的剂量被施用。注射后，将患者在MRI机器中扫描以测定含靶的任何位点的位置。

7D.超声成像

当通过物质传播超声时，物质的声性质将取决于传播的速度和物质的密度。在不同物质(固体、液体、气体)的界面处声性质的改变将是最明显的。因为在造影剂和周围组织之间的声差别，超声造影剂是强声波反射剂。因为在液体(例如血液)和含气或产气的超声造影剂之间的声差别，含气或产气的超声造影剂特别有用。因为它们的大小，包含微泡、微气囊等的超声造影剂在注射后可在血流中保持比其它可检测部分更长的时间；因此靶向超声试剂可证实表达或含有靶的组织的优异成像。

在本发明的这一方面，本发明的化合物构建体可包括作为诊断部分的物质，该物质适用于超声成像。例如，包含本发明接头和导向部分、另一个诊断部分或治疗部分的化合物，可与用于形成含有液体或气体的小泡(例如微泡、微气囊、微球体等)或乳剂的物质连接，它们起可检测标记(例如回波发生气体或能够产生回波气体的物质)的作用。用于这类小泡制备的物质包括表面活性剂、脂质、鞘脂、寡脂、磷脂、蛋白质、多肽、碳水化合物和合成或天然的聚合物质。参见例如，WO 98/53857，WO 98/18498，WO 98/18495，WO 98/18497，WO98/18496和WO 98/18501，通过参考以其整体将它们并入本申请。

优选包含稳定的微泡(优选的实施方案)、磷脂、以及特别是饱和的磷脂的悬浮液的造影剂。可通过本领域中已知的方法制备优选的充气微泡，例如通过在以下专利中的任一项中描述的方法：EP 554213，US 5,413,774，US 5,578,92，EP 744962，EP 682530，US5,556,610，US 5,846,518，US 6,183,725，EP 474833，US 5,271,928，US5,380,519，US 5,531,980，US 5,567,414，US 5,658,551，US5,643,553，US 5,911,972，US 6,110,443，US 6,136,293，EP 619743，US 5,445,813，US 5,597,549，US 5,686,060，US 6,187,288和US5,908,610，通过参考以其整体将它们中的每一项并入本申请。在优选的实施方案中，至少一种磷脂部分具有在美国专利5,686,060中描述的结构，通过参考以其整体将它并入本申请。

适合的磷脂的例子包括甘油与一个或两个脂肪酸(相同或不同)和磷酸分子的酯，其中磷酸残基依次与亲水性基团，例如胆碱、丝氨酸、肌醇、甘油、乙醇胺等基团结合。存在于磷脂中的脂肪酸通常是脂族酸，典型地含有12至24个碳原子，优选14至22，它们可被饱和或可含有一个或多个不饱和现象。适合的脂肪酸的例子是月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸、油酸、亚油酸和亚麻酸。在本领域中磷脂的单酯被称为磷脂的“lyso”形式。

磷脂的进一步的例子是磷脂酸，即甘油-磷酸与脂肪酸的二酯，鞘磷脂，即那些其中具有脂肪酸的甘油二酯的残基被神经酰胺置换的磷脂酰胆碱类似物，心磷脂，即1，3-二磷脂酰甘油与脂肪酸的酯，神经节苷脂、脑苷脂等。

如本申请所使用的，术语磷脂包括天然存在的、半合成的或合成制备的产品，其可被单个地使用或作为混合物使用。天然存在的磷脂的例子是天然卵磷脂(磷脂酰胆碱(PC)衍生物)例如，典型地，大豆或卵黄卵磷脂。半合成的磷脂的例子是部分或全部氢化的天然存在的磷脂的衍生物。合成的磷脂的例子是例如，二月桂酰磷脂酰胆碱(“DLPC”)，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(“DPPC”)，二花生酰磷脂酰胆碱(“DAPC”)，二硬脂酰磷脂酰胆碱(“DSPC”)，1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(“MPPC”)，1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“PMPC”)，1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱(“PSPC”)，1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(“SPPC”)，二油酰磷脂酰胆碱(“DOPC”)，1，2二硬脂酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(乙基-DSPC)，二月桂酰磷脂酰甘油(“DLPG”)及其碱金属盐，二花生酰磷脂酰甘油(“DAPG”)及其碱金属盐，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)及其碱金属盐，二棕榈酰磷脂酰甘油(“DPPG”)及其碱金属盐，二硬脂酰磷脂酰甘油(“DSPG”)及其碱金属盐，二油酰磷脂酰甘油(“DOPG”)及其碱金属盐，二肉豆蔻酰磷脂酸(“DMPA”)及其碱金属盐，二棕榈酰磷脂酸(“DPPA”)及其碱金属盐，二硬脂酰磷脂酸(“DSPA”)，二花生酰磷脂酸(“DAPA”)及其碱金属盐，二肉豆蔻酰磷脂酰-乙醇胺(“DMPE”)，二棕榈酰磷脂酰-乙醇胺(“DPPE”)，二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺(“DSPE”)，二肉豆蔻酰磷脂酰-丝氨酸(“DMPS”)，二花生酰磷脂酰-丝氨酸(“DAPS”)，二棕榈酰磷脂酰-丝氨酸(“DPPS”)，二硬脂酰磷脂酰-丝氨酸(“DSPS”)，二油酰磷脂酰-丝氨酸(“DOPS”)，二棕榈酰鞘磷脂(“DPSP”)和二硬脂酰鞘磷脂(“DSSP”)。

其它优选的磷脂包括二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酸和二棕榈酰磷脂酰丝氨酸。组合物还可含有PEG-4000和/或棕榈酸。可以使用本申请公开的或本领域技术人员已知的任何气体；然而，优选惰性气体，例如SF₆或碳氟化合物，例如CF₄、C₃F₈和C₄F₁₀。

使用已知的方法例如冷冻干燥或喷雾干燥粗磷脂在适合溶剂中的溶液或使用在EP 554213，US 5,413,774，US 5,578,292，EP 744962，EP 682530，US 5,556,610，US 5,846,518，US 6,183,725，EP 474833，US 5,271,928，US 5,380,519，US 5,531,980，US 5,567,414，US5,658,551，US 5,643,553，US 5,911,972，US 6,110,443，US6,136,293，EP 619743，US 5,445,813，US 5,597,549，US 5,686,060，US 6,187,288和US 5,908,610中描述的方法，由磷脂可制备优选的微泡悬浮液，通过参考以其整体将它们并入本申请。最优选地，将磷脂溶解在有机溶剂中并且不通过脂质体形成阶段干燥溶液。这可以通过将磷脂溶解在适合的有机溶剂，连同亲水性稳定剂物质或既溶于有机溶剂又溶于水的化合物并且冷冻干燥或喷雾干燥所述溶液而被完成。在这种事实方案中，选择亲水性稳定剂的标准是它在选择的有机溶剂中的溶解度。可溶于水和有机溶剂中的亲水性稳定剂化合物的例子是例如聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)等，苹果酸、乙醇酸(glycolic acid)、麦牙酚等。这类亲水性化合物还有助于使微泡大小分布均匀化并且增加贮藏下的稳定性。可使用任何适合的有机溶剂，只要它的沸点足够低并且它的熔点足够高以促进后续干燥。典型的有机溶剂包括，例如二噁烷、环己醇、叔丁醇、四氯二氟亚乙基(C₂Cl₄F₂)或2-甲基-2-丁醇，但是优选2-甲基-2-丁醇和C₂Cl₄F₂。

在通过分散在水性载体中形成微泡的悬浮液之前，将冷冻干燥或喷雾干燥的磷脂粉末与空气或另一种气体接触。当与水性载体接触时，其结构已经被破裂的粉末状磷脂将形成层状化部分，它将稳定分散在其中的气体微泡。这种方法允许产生微泡的悬浮液，该悬浮液是稳定的，即使当被贮藏长时期并且通过简单溶解所需的层状化磷脂(已在所需要的气体下贮藏)，不用振动或剧烈搅拌。

或者，可通过在高搅拌速度下将气体悬浮在水溶液中制备微泡，如在WO 97/29783中公开的。制备微泡的进一步方法被公开在共未决欧洲专利申请号03002373，通过参考将其并入本申请，其包括在磷脂的存在下制备有机溶剂在适合水性介质中的乳剂，随后在任选的洗涤和/或过滤步骤后冷冻干燥所说的乳剂。

可将本领域技术人员已知的添加剂包括在稳定的微泡悬浮液中。例如，非成膜表面活性剂、包括聚氧化丙二醇和聚氧化二醇乙及相似的化合物，以及其各种共聚物；脂肪酸例如肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、或它们的衍生物，麦角甾醇，植物甾醇，谷甾醇，羊毛甾醇，生育酚，没食子酸丙酯，棕榈酸抗坏血酸酯和丁基化羟基甲苯可被添加。这些非成膜表面活性剂的量通常是以表面活性剂的总量计直到50％，但优选以重量计在0和30％之间。

其它含气体的悬浮液包括在例如，US 5,798,091和WO 97/29783中公开的那些，通过参考以其整体将它们并入本申请。可以按照在US5,798,091或W097/29783中所描述的制备这些物质，通过参考以其整体将它们并入本申请。

另一种优选的超声造影剂包括微气囊。术语“微气囊”表示具有物质边界或外壳的充气的物体。关于微气囊制剂和制备方法的更多信息可在EP-A-0 324 938 US 4,844,882；US 5,711,933；US 5,840,275；US 5,863,520；US 6,123,922；US 6,200,548；US 4,900,540；US5,123,414；US 5,230,882；5,469,854；5,585,112；US 4,718,433；US 4774,958；WO9501187；US 5,529,766；US 5,536,490和US5,990,263中找到，通过参考以其整体将它们的每一篇并入本申请。

优选的微气囊具有包括生物可降解的生理学上相容的聚合物或生物可降解的固体脂质的外壳。适用于本发明微气囊制备的聚合物可以从生物可降解的生理学上相容的聚合物中选择，例如在下面专利的任一篇中描述的那些的任一种：EP 458745，US 5,711,933，US 5,840,275，EP 554213，US 5,413,774和US 5,578,292，通过参考以其整体将它们并入本申请。特别地，聚合物可以从生物可降解的生理学上相容的聚合物中选择，例如低水溶解度的多糖类，聚丙交酯和聚乙交酯以及它们的共聚物，丙交酯和内酯，例如ε-己内酯、γ-戊内酯和多肽的共聚物。其它适合的聚合物包括聚(原酸)酯(参见例如，US 4,093,709；US 4,131,648；US 4,138,344；US 4,180,646)；聚乳酸和聚乙醇酸以及它们的共聚物，例如DEXON(参见J.Heller，Biomaterials 1(1980)，51；聚(DL-丙交酯-共-ε-己内酯)，聚(DL-丙交酯-共-γ-戊内酯)，聚(DL-丙交酯-共-γ-丁内酯)，聚烷基氰丙烯酸酯；聚酰胺，聚羟基丁酸酯；聚dioxanone；聚-β氨基酮(A.S.Angeloni，P.Ferruti，M.Tramontini和M.Casolaro，The Mannich bases inpolymer synthesis：3.Reduction of poly(beta-aminoketone)sto poly(gamma-aminoalcohol)s and their N-alkylation to poly(gamma-hydroxyquatemary ammonium salt)s，Polymer 23，pp1693-1697，1982.)；聚磷腈(Allcock，Harry R.Polyphosphazenes：new polymers with inorganic backbone atoms(Science 193(4259)，1214-19(1976))和聚酐。还可以按照WO-A-96/15815的方法制备本发明的微气囊，通过参考将它并入本申请，其中微气囊由包含生物可降解的脂质的生物可降解膜制备，所述脂质被选自一、二、三甘油酯、脂肪酸、甾醇、蜡和它们的混合物。优选的脂质是二或三甘油酯，例如二或三甘油肉豆蔻酸酯、二或三甘油棕榈酸酯或者二或三甘油硬脂酸酯，特别是甘油三棕榈酸酯或甘油三硬脂酸酯。

微气囊可使用本申请公开的或本领域技术人员已知的任何气体；但是，优选惰性气体如氟化的气体。可将微气囊与任选的本领域技术人员已知的添加剂和稳定剂一起悬浮在药物上可接受的液体载体中。

其它的含气体的造影剂制剂包括其中充气的微粒(尤其微粒的聚集体)或与之有关的其它制剂(例如被吸收在其表面上和/或在空隙、腔或孔中含有的)。制备这些试剂的方法被描述在EP 0122624，EP0123235，EP 0365467，US 5,558,857，US 5,607,661，US 5,637,289，US 5,558,856，US 5,137,928，WO 9521631和WO 9313809中，通过参考以其整体将它们的每一篇并入本申请。

这些超声组合物的任一种还应该是，尽可能，与血液等渗。因此，在注射前，可将小量的等渗剂添加到上述超声造影剂悬浮液的任一种中。所述等渗剂是在医药中通常使用的生理溶液并且它们包含盐水溶液(0.9％NaC1)、2.6％甘油溶液、5％右旋糖溶液等。另外，超声组合物可包括标准的药物上可接受的添加剂，包括，例如，乳化剂、粘性调节剂、冷冻保护剂、lyoprotectants、填充剂等。

在适用于本发明的超声造影剂中可使用任何生物相容的气体。本申请使用的术语“气体”包括在正常人体温度下实质上呈气体形式的任何物质(包括混合物)。气体因此可以包括，例如空气；氮气；氧气；CO₂；氩；氙或氪，氟化的气体(包括例如，全氟化碳、SF₆、SeF₆)低分子量烃(例如，含有1至7个碳原子)，例如，烷例如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷或戊烷，环烷例如环丙烷、环丁烷或环戊烷，烯例如乙烯、丙烯、丙二烯或丁烯、或炔例如乙炔或丙炔和/或它们的混合物。但是，优选氟化的气体。氟化的气体包括含有至少一个氟原子的物质，例如SF₆、氟利昂(含有一个或多个碳原子和氟的有机化合物，即CF₄、C₂F₆、C₃F₈、C₄F₈、C₄F₁₀、CBrF₃、CCI₂F₂、C₂CIF₅和CBrClF₂)和全氟化碳。术语全氟化碳表示仅含有碳和氟原子的化合物并包括，特别是，饱和的、未饱和的和环状全氟化碳。饱和的全氟化碳，其通常是优选的，具有式C_nF_n+2，其中n是1至12，优选2至10，最优选3至8并且甚至更优选3至6。适合的全氟化碳包括，例如CF₄、C₂F₆、C₃F₈、C₄F₈、C₄F₁₀、C₅F₁₂、C₆F₁₂、C₇F₁₄、C₈F₁₈和C₉F₂₀。最优选地，气体或气体混合物包含SF₆或选自由C₃F₈C₄F₈、C₅F₁₂、C₆F₁₂、C₇F₁₄、C₈F₁₈组成的组的全氟化碳，特别优选C₄F₁₀。还参见WO 97/29783，WO 98/53857，WO 98/18498，WO 98/18495，WO 98/18496，WO 98/18497，WO 98/18501，WO 98/05364，和WO 98/17324。

在某些情况下，包括气体物质的前体(例如能够在体内被转化成气体的物质，经常被称为“气体前体”)可能是理想的。优选地气体前体和其产生的气体是生理上可接受的。气体前体可以是pH-激活的、光-激活的、温度激活的等。例如，某些全氟化碳可被用作温度激活的气体前体。这些全氟化碳，例如全氟五烷，具有高于室温(或该物质被生产和/或贮藏的温度)但低于体温的液/气相转变温度；因此，它们经历相转变并且在身体内被转化成气体。

如所讨论的，气体可包括气体的混合物。下面的组合是优选的气体混合物：气体(A)和(B)的混合物，其中，气体(B)中的至少一种，以0.5-41％体积的量存在，具有大于80道尔顿的分子量并且是氟化的气体，(A)选自由空气、氧气、氮气、二氧化碳和它们的混合物组成的组，混合物的平衡为气体A。

因为超声小泡可大于本申请所描述的其它可检测的标记，为了增加所述物质的导向效率，可将它们与许多化合物构建体结合。与上述(或本领域的技术人员已知)的超声造影剂的连接可通过本发明的接头和制备小泡所使用的物质之间的共价键，或通过接头，如前面所述的。

许多方法可被用于制备与化合物结合的微泡的悬浮液。例如，人们通过将5％(w/w)的N-MPB-PE(1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-4-(对-马来酰亚胺-苯基丁酰胺)，(Avanti Polar-Lipids，Inc)掺入磷脂制剂中，可制备马来酰亚胺衍生的微泡。然后，将本发明的巯基乙酰化的化合物的溶液(10mg/mL在DMF中)添加到马来酰亚胺衍生的微泡悬浮液中，所述巯基乙酰化的化合物的溶液已在去乙酰化溶液(50mM磷酸钠、25mM EDTA、0.5M羟胺HCl，pH 7.5)中被培育。在黑暗中培育后，在温和的搅拌下，通过离心可纯化与微泡结合的化合物。

可被用于微泡衍生化的化合物典型地包括下面的组分：(a)疏水部分，与形成微泡或微气囊的外壳的物质相容，以允许化合物有效掺入小泡的外壳中；所说的部分典型地以脂质部分(甘油二棕榈酸酯、甘油二硬脂酸酯)为代表；以及(b)间隔区(典型地为不同分子量的PEG)，在一些情况中它可能是任选的(如果间隔区太长例如，微泡例如可存在被冷冻干燥的困难)或在一些其它情况下它是优选的(例如当用短间隔区与微泡结合时，肽可能更少活性)；以及(c)能够与结合的肽上的相应反应部分反应的反应性基团(例如具有半胱氨酸的-SH基团的马来酰亚胺)。

或者，可使用生物素/抗生物素蛋白制备与微泡缀合的化合物。例如，可使用如上制备的马来酰亚胺激活的磷脂微泡悬浮液制备与抗生物素蛋白缀合的微泡，将其加入巯基乙酰化的抗生物素蛋白(它已被用去乙酰化溶液培育)。然后将本发明生物素化的化合物加入抗生物素蛋白缀合的微泡的悬浮液，得到与化合物缀合的微泡的悬浮液。

除非它含有超极性化的气体，否则已知需要特殊的贮藏条件，本发明的冷冻干燥的残余物可被贮藏和运输，不需要它环境的温度控制并且特别是它可被供应至医院和医生，用于现场形成立即可使用的可施用的悬浮液，不需要这类使用者有特殊的贮藏设施。优选地在这样的情况下，它可呈两组分的试剂盒被供应，所述试剂盒可包括两个分开的容器或一种两室容器。在前一种情况下，优选地容器是常规的隔膜密封瓶，其中含有冷冻干燥的步骤b)残余物的瓶被用隔膜密封，可使用任选预过滤的注射器通过隔膜注射载体液体。在这样一种情况下，然后还将被用作第二组分的容器的注射器用于注射造影剂。在后一种情况下，优选地所述双室容器是两室注射器，一旦冷冻干燥物被重构然后适当地混合或温和地振动，可直接将容器用于注射造影剂。在两种情况下，提供了指引或允许将足够的泡形成性能量应用至容器的内容物的方法。但是，如上所注意到的，在按照本发明的稳定的造影剂中，气体微泡的大小实质上独立于被应用至重构干燥产品的振动能量的量。因此，通常需要仅仅温和的手振动以得到可重复的具有一致微泡大小的产品。

本领域的技术人员可以理解，能够以灭菌的方式用水溶液组合干燥粉末的其它两室重构系统也在本发明的范围内。在这样的系统中，如果将水相插入水不溶的气体和环境之间，那将是特别有利的。当形成造影剂必需的物质不已经存在于容器中时(例如在重构过程中与磷脂连接的导向配体)，它可被用试剂盒的其它组分包装，优选以适合于促进与试剂盒其它组分立即可用的组合的形式或容器。

不需要特殊的容器、瓶或连接系统；本发明可使用常规的容器、瓶或接管。唯一的要求是在塞子和容器之间好的密封。因此密封的质量成为主要关注的事情；密封完整性的任何剥蚀将允许不希望的物质进入瓶中。除了确保灭菌性以外，真空保留是产品在环境或减少的压力下塞好所必需的，以确保安全和适当的重构。至于塞子，它可以是基于高弹体的化合物或多组分制剂，例如聚(异丁烯)或丁基橡胶。

可按照本发明的使用的超声成像技术包括已知的技术，例如彩色多普勒，动力多普勒，多普勒幅度、刺激的声成像，以及二或三维成像技术。成像可以谐振(共振频率)或基本模式完成，优选第二谐振。

在超声应用中，由磷脂稳定的微泡形成的造影剂可以，例如，以这样的剂量被给予，以致注射的磷脂的量在0.1至200μg/kg体重，优选约0.1至30μg/kg的范围内。含微气囊的造影剂典型地以这样的剂量给予，以致成壁聚合物或脂质的量为约10μg/kg至约20mg/kg体重。

在优选的实施方案中，本申请描述的超声造影剂与与一种或多种由本发明的化合物(例如，本发明的接头)构成的化合物和导向肽，或其它诊断或治疗部分缀合。导向超声造影剂将定位在表达靶的组织的部位并且可被用于成像和/或治疗这样的组织。

7E.放射治疗

放射性同位素疗法涉及以损伤或破坏靶组织的足够的量给予放射标记的化合物。给予化合物后(例如通过静脉内、皮下、或腹膜内注射)，放射标记的药物优先定位在疾病部位(在这种情况下，表达靶的肿瘤或组织)。一旦定位，放射标记的化合物就用能量损伤或破坏发病的组织，所述能量是在被给予的同位素放射性衰变的过程中被释放的。

成功的放射治疗的设计涉及多种关键的因素：

1.输送放射性至疾病部位的适合的导向基团的选择；

2.释放损伤所述疾病部位，不实质性损伤邻近正常组织的足够能量的适合放射性核素的选择；

3.适合的导向基团和放射性核素的组合的选择，所述组合不会不利地影响这种缀合物定位在疾病部位的能力。关于放射性金属，这经常涉及螯合基团，该螯合基团与放射性核素紧密配位，与接头结合，该接头偶联所说的螯合物至导向基团，并且影响化合物的总体生物分布以使靶组织中的摄取最大化和使正常、非靶器官中的摄取最小化。

本发明提供了放射治疗剂，通过导向基团、放射性核素、金属螯合物和接头的适当选择，该放射治疗剂满足上述三个标准。

放射治疗剂可含有螯合的3⁺金属离子，该3⁺金属离子来自被称为镧系元素的元素类(原子序数57-71)和它们的类似物(即M³⁺金属例如钇和铟)。在这类中典型的放射性金属包括同位素90-钇、111-铟、149-钷、153-钐、166-镝、166-钬、175-镱和177-镥。所有这些金属(以及在镧系中的其它元素)具有非常相似的化学，因为它们保留在+3氧化态，并且优选与配体螯合，该配体带有硬(氧/氮)供体原子，以熟知的螯合物DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)和聚氮杂-聚羧酸酯大环类例如DOTA(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N’，N”，N’”-四乙酸)及其接近的类似物为代表。这些螯合配体的结构，以其完全脱质子化的形式显示如下。

这些螯合配体使放射金属胶囊化，通过多个氮和氧原子与它结合，因此防止了游离(未结合)的放射金属释放到体内。这是重要的，因为在体内3+放射金属从它们的螯合物的离解可能导致放射金属在肝脏、骨和脾中的摄取[Brechbiel MW，Gansow OA，″Backbone-substituted DTPA ligands for ⁹⁰Y radioimmunotherapy″，Bioconj.Chem.1991；2：187-194；Li，WP，Ma DS，HigginbothamC，Hoffman T，Ketring AR，Cutler CS，Jurisson，SS，″Developmentof an in vitro model for assessing the in vivo stability oflanthanide chelates.″Nucl.Med.Biol.2001；28(2)：145-154；Kasokat T，Urich K.Arzneim.-Forsch，″Quantification ofdechelation of gadopentetate dimeglumine in rats″.1992；42(6)：869-76]。除非它特异地导向这些器官，这样的非特异性摄取是非常不希望的，因为它导致非靶组织的非特异性照射，这可能导致这样的问题如由于骨髓照射的造血抑制。

关于放射治疗应用，可以使用本申请公开的治疗放射性核素的任意螯合剂。但是，特别优选DOTA螯合物的形式[Tweedle MF，GaughanGT，Hagan JT，″1-Substituted-1，4，7-triscarboxymethyl-1，4，7，10-tetraazacyclododecane and analogs.″US Patent 4,885,363，Dec.5，1989]，因为预料DOTA螯合物在体内比DTPA或其它线性螯合物更少去螯合。

使DOTA型大环类通过接头偶联至导向基团的一般方法(例如通过激活DOTA的羧酸酯的一种以形成活性酯，然后将它与接头上的氨基反应以形成稳定的酰胺键)，是本领域的技术人员已知的(参见例如，Tweedle等美国专利4,885,363)。还可以在多氮杂环的骨架上被修饰的DOTA型大环上进行偶联。

用于特定放射治疗应用的适当核素的选择取决于许多因素，包括：

a.物理半衰期-这应该足够长以允许放射治疗构建体从放射性金属和缀合物的合成和纯化，以及所述构建体向注射部位的输送，在注射前没有显著的放射性衰变。优选地，放射性核素应具有约0.5和8天之间的物理半衰期。

b.来自放射性核素的发射能量-是粒子发射体(例如α发射体、β发射体和俄歇电子发射体)的放射性核素特别有用，因为它们发射高能量粒子，该粒子在短距离内沉积它们的能量，由此高度地局部损伤。特别优选β发射的放射性核素，因为来自这些同位素的β粒子发射的能量在5至约150细胞直径内沉积。由这些核素制备的放射治疗剂能够杀灭发病的细胞(该发病的细胞相对接近它们的定位点)，但不能前进长距离损伤邻近正常组织例如骨髓。

c.比活性(即每质量放射性核素的放射性)-特别优选具有高比活性的放射性核素(例如产生90-Y、111-In、177-Lu的发生器)。通过其产生的方法、被用于产生它的特定的靶和所讨论的同位素的性质测定放射性核素的比活性。

许多镧系元素(lanthanides和lanthanoids)包括具有核性质的放射性同位素，所述性质使得它们适合于用作放射治疗剂，因为它们发射β粒子。这些中的一些列于下表中。

同位素	半衰期(天)	最大b-能量(Mev)	γ能量(Kev)	b-粒子的大约范围(细胞直径)
					149-Pm	2.21	1.1	286	60
153-Sm	1.93	0.69	103	30
					166-Dy	3.40	0.40	82.5	15
166-Ho	1.12	1.8	80.6	117
					175-Yb	4.19	0.47	396	17
177-Lu	6.71	0.50	208	20
					90-Y	2.67	2.28	-	150
111-In	2.810	俄歇电子发射体	173，247	＜5μm

Pm：钷，Sm：钐，Dy：镝，Ho：钬，Yb：镱，Lu：镥，Y：钇，In：铟

制备放射性金属例如β发射镧系元素同位素对本领域的技术人员来说是已知的，并且在其它地方被描述[例如，Ccutler CS，Smith CJ，Ehrhardt GJ.；Tyler TT，Jurisson SS，Deutsh E.“Current andpotential therapeutic uses of lanthanide radioisotopes.”Cancer Biother.Radiopharm.2000；15(6)：531-545]。这些同位素中的许多可以相对低成本的高收率被生产，并且许多(例如，⁹⁰-Y、¹⁴⁹-Pm、¹⁷⁷-Lu)可以接近无载体的比活性(即大量的原子是放射性的)被生产。因为非放射性原子可与它们的放射性类似物竞争与靶组织上的受体结合，高比活性放射性同位素的使用是重要的，以允许输送尽可能高剂量的放射性至靶组织。还特别优选含有铼(¹⁸⁶-Re和¹⁸⁸-Re)的β发射同位素的本发明放射治疗剂衍生物。

8.剂量和添加剂

关于本发明化合物的合适剂量方案对本领域的技术人员来是已知的。可使用许多方法给予所述化合物，所述方法包括，但不限于，单次或多次IV或IP注射。就本发明的放射性药物来说，人们给予一定量的放射性，该放射性足够允许成像，或者在放射治疗的情况下，引起靶GRP-R携带组织损伤或脱离，但不至于引起对非靶(正常组织)的实质性损伤。上文讨论了闪烁照相成像所需要的量和剂量。对于不同的构建体，放射治疗所需要的量和剂量也不同，取决于所使用的同位素的能量和半衰期、从身体的药物的摄取和清除的程度以及肿瘤的质量。通常，剂量可以从30-50mCi变化至直到约3居里的累积剂量。

可以将本发明的光学成像化合物单独或作为组合物的部分给予患者，所述组合物含有其它组分例如赋形剂、稀释剂、自由基清除剂、稳定剂和载体，它们全部都是本领域中已知的。可以静脉内或腹膜内将光学成像化合物给予患者。给予的化合物的量典型地将在大约0.01mg/kg至10.0mg/kg患者的体重的范围内。

在超声应用中，由磷脂稳定的微泡形成的造影剂可以，例如，以这样的剂量被给予，以致注射的磷脂的量在0.1至200μg/kg体重，优选约0.1至30μg/kg的范围内。含微气囊的造影剂典型地以这样的剂量给予，以致成壁聚合物或脂质的量为约10μg/kg至约20mg/kg体重。

就MRI来说，考虑到受试者将接受足以增强靶处的MR信号至少10％的造影剂剂量。注射包含MRI试剂的化合物后，将患者在MRI机器中扫描以测定含靶的任何位点的位置。在治疗设置中，靶定位后，可以立即给予细胞毒性或治疗剂，如果需要，可以随后将患者扫描以使治疗效果可视化。

本发明的药物组合物可包括生理学上可接受的缓冲剂，以及典型的添加剂、赋形剂等。在放射性药物的情况下，本发明的组合物可能需要辐射稳定剂以防止在注射前对化合物的辐射分解损伤。辐射稳定剂对本领域的技术人员来说是已知的，并且可以包括，例如，对-氨基苯甲酸、抗坏血酸、龙胆酸(gentistic acid)等。在共未决的临时申请美国系列号60/489,850中讨论了特别优选的稳定剂和制剂。

含有制备本发明诊断或治疗剂需要的全部组分的单或多瓶试剂盒是本发明的组成部分。在本发明放射性药物的情况下，这样的试剂盒通常将包括制备放射性药物需要的全部组分(放射性核素除外)。

例如，用于制备本发明放射性药物的单瓶试剂盒优选含有式M-N-O-P-Q的螯合物/接头/导向肽缀合物、亚锡盐的来源(如果需要还原，例如，当使用锝时)，或其它药物上可接受的还原剂，并且被用药物上可接受的酸或碱适当地缓冲以调节pH至约3至约9的值。使用的还原剂的量和类型将高度取决于要形成的交换络合物的性质。对本领域的技术人员来说适当的条件是熟知的。优选的是，试剂盒内容呈冻干的形式。这样的单瓶试剂盒可选择地含有不稳定的或交换的配体例如葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、甘露糖醇、苹果酸盐、柠檬酸或酒石酸并且还可含有反应改进剂例如二亚乙基三胺-五乙酸(DPTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)，或α、β或γ环糊精，它们起改进终产物的放射化学纯度和稳定性。所述试剂盒还可以含有稳定剂、膨胀剂例如甘露糖醇，它们被设计以有助于冷冻干燥过程，以及本领域技术人员已知的其它添加剂。

多瓶试剂盒优选含有相同的一般组分，但在重构所述放射性药物中使用多于一个的瓶。例如。一个瓶可以含有在添加高锝酸盐(例如亚锡来源或其它还原剂)时形成不稳定的Tc(V)络合物所需要的全部成分。向该瓶中添加高锝酸盐，在等待一段适当的时间后，将该瓶的内容物添加到第二瓶中，该第二瓶含有螯合物和导向肽以及适合调节pH至其最适值的缓冲剂。在约5至60分钟的反应时间后，形成了本发明的络合物。将这种多瓶试剂盒的两瓶的内容物冻干是有利的。如上所述，反应改进剂、交换配体、稳定剂、膨胀剂等可以存在于其中一瓶或两瓶中。

化合物的一般制备

可通过不同的方法制备本发明的化合物，这取决于所选择的诊断或治疗部分。可通过在肽合成领域中通常建立和已知的技术，例如固相肽合成(SPPS)方法，最方便地制备所述化合物的肽部分。因为可按照固相合成处理，使用交替的FMOC保护和脱保护是优选的制备短肽的方法。优选重组DNA技术用于生产蛋白质及其长的片段。

固相肽合成涉及向生成的肽链分步添加氨基酸残基，所述肽链与不可溶性的支持物或基质，例如聚苯乙烯连接。首先将所述肽的C-末端残基与商业上可获得的支持物锚定，其氨基用N-保护剂例如叔丁氧羰基(Boc)或芴甲氧基羰基(Fmoc)保护。在Boc或Fmoc的哌啶的情况下用适合的脱保护剂例如TFA去除所述氨基保护基团并与偶联剂例如二环碳二亚胺(DCC)一起添加下一个氨基酸残基(呈N-保护的形式)。形成肽键后，从支持物上洗涤试剂。添加最后的残基后，用适合的试剂例如三氟乙酸(TFA)或氟化氢(HF)从支持物上裂解所述肽。

实施例

下面的实施例提供了不同方法的例子，所述方法可被用来制备本发明的各种化合物。在每个实施例中，有以单一粗体大写字母(例如，A、B、C)鉴别的化合物，该化合物与所鉴别的附图中相同标记的对应化合物相关联。实施例I至VII是预言性的。

一般实验描述

A.使用的缩写的定义

整个说明书中使用下面通用的缩写：

1，1-二甲基乙氧羰基(Boc或Boc)；

9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)；

1-羟基苯并三唑(HOBT)；

N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)；

N-甲基吡咯烷酮(NMP)；

乙酸酐(Ac₂O)；

(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己-1-基)-3-甲基丁基(iv-Dde)；

三氟乙酸(TFA)；

试剂B(TFA∶HO∶苯酚∶三异丙基硅烷，88∶5∶5∶2)；

二异丙基乙胺(DIEA)；

O-(1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸)(HBTU)；

O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3四甲基脲六氟磷酸)(HATU)；

N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；

固相肽合成(SPPS)；

二甲亚砜(DMSO)；

二氯甲烷(DMF)；

二甲基甲酰胺(DMF)；

二甲基乙酰胺(DMA)；

异丁基氯甲酸酯(IBCF)；

1，4，7，10-四氮杂环十四烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)；

三异丙基硅烷(TIPS)；

1，4，7，10-四氮杂环十四烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)(1R)-1-[1，4，7，10-四氮杂-4，7，10-三(羧甲基)环十二烷基]乙烷-1，2-二羧酸)(CMDOTA)；

胎牛血清(FBS)；

人血清白蛋白(HSA)；

人前列腺细胞系(PC3)；

放射化学纯度(RCP)；

高效液相色谱法(HPLC)，以及

磁共振成像(MRI)。

B.材料

使用的Fmoc保护的氨基酸购自NovaBiochem(San Diego，CA，USA)、Advanced Chem Tech(Louisville，KY，USA、ChemImpexInternational(Wood Dale I11.，USA)和Multiple Peptide Systems(San Diego，CA，USA)。合成所需要的其它化学物、试剂和吸附剂从Aldrich Chemical Co.(Milwaukee，WI，USA)和VWR ScientificProducts(Bridgeport，NJ.，USA)获得。用于肽合成的溶剂从PhmarcoCo.(Brookfield CT.，USA)。用于HPLC分析和纯化的柱从WatersCo.(Milford，MA.，USA)。关于不可商业获得的那些的实验细节给出如下。

C.用于肽合成的仪器

使用Advanced Chem Tech 496 Ω MOS合成仪、Advanced Chem TechFBS合成仪和/或通过手动肽合成制备了肽。然而使用的重复的脱保护和链延伸的方案对所有都是相同的。

D.分析和纯化使用的仪器

使用Sh imzdzu-LC-10A双泵梯度分析LC系统进行分析性HPLC，所述系统利用Shimadzu-Class软件4.1版本进行系统控制、数据获取和后运行处理。在Hewlett-Packard Series 1100 MSD质谱仪上获取质谱，该质谱仪耦合有Hewlett-Packard Series 1100双泵梯度HPLC分析系统，该HPLC分析系统配置有Agilent Technologies 1100自动进样器，该自动进样器适合于直接流量注射或注射到WatersAssociates Xterra MS C18柱(4.6mm×50mm，5μm颗粒，120埃孔)。通过使用用于样品提交的‘MSD Anyone’软件的HP Kayak工作站和用于仪器控制和数据获取的HP化学工作站软件驱动仪器。在大多数情况下，通过使用浓度为1mg/ml样品溶液的5μl注射的直接注射引入样品并使用正离子电喷雾分析以获得m/e和m/z(多电荷)离子，用于结构的证实。以500MHz在Varian Innova分光计上获得了¹H-NMR谱。以125.73MHz在相同的仪器上获得了¹³C-NMR谱。一般地残留¹H吸收，或在¹³C-NMR谱的情况下，使用溶剂的¹³C吸收被用作内参考；在其他的情况下使用四甲基硅烷(δ＝0.00ppm)。以δ单位给出共振值。从Quantitative Technologies Inc.Whitehouse NJ.获得微分析数据。在Shimadzu-LC-8A双泵梯度制备性HPLC分析系统进行制备性HPLC，该HPLC分析系统使用Shimadzu-ClassVP软件4.3版本用于系统控制、数据获取、级分收集和后运行处理。

E.肽合成的固体支持物：

使用Rink Amide-Novagel HL树脂(0.6mmol/g作为固体支持物。)

F.偶联方法：

在典型的实验中，将第一个氨基酸装载在0.1g的树脂(0.06mmol)上。将合适的在NMP(0.25M溶液；0.960mL中的Fmoc保护的氨基酸添加到所述树脂中接着添加N-羟基苯并三唑(NMP中的0.5M；0.48mL)，将反应部件(在自动肽合成的情况下)和单个反应瓶(在手动肽合成的情况下)振摇约2分钟。向上述混合物中，添加二异丙基碳二亚胺(NMP中的0.5M；0.48mL)并在环境温度下振摇反应混合物4小时。然后将反应部件或单个反应瓶通过应用正压的干氮气清洗反应物。

G.洗涤方法：

将反应部件的每孔填充1.2mL的NMP并振摇部件5分钟。在正压的氮气下排除溶液。重复该方法三次。在使用单个瓶的手动合成的情况下，用合适体积的NMP，使用相同的方法。

H.Fmoc基团的去除：

用1.5mL 20％的DMF中的哌啶(v/v)处理含有Fmoc保护的氨基酸的树脂并振摇反应部件或单个手动反应瓶15分钟。从树脂中排除溶液。重复该方法一次并使用上述洗涤方法洗涤所述树脂。

I.配体(DOTA和CMDOTA)的最后偶联：

将树脂结合肽接头构建体的N-末端氨基去封闭并洗涤树脂。制备0.25M期望的配体和HBTU在NMP中的溶液，并且用两倍等价的DIEA处理。将得到的激活的配体的溶液添加到树脂(1.972mL；0.48mmol)中并在环境温度下振摇反应混合物24-30小时。排出溶液并洗涤树脂。用1.5mL二氯甲烷(3X)进行树脂的最后洗涤。

J.最终肽的脱保护和纯化：

将试剂B(2mL；88∶5∶5∶2-TFA∶苯酚∶水∶TIPS)的溶液添加到树脂中并在环境温度下哲摇反应部件或单个瓶4.5小时。将得到的含有脱保护肽的溶液排入瓶中。用1mL的试剂B再重复该方法两次。使用Genevac HT-12系列离心浓缩仪在减压下浓缩合并的滤液。然后用2mL的Et₂O研制每瓶中的残余物并滗析上清夜。重复该方法两次以提供无色固体形式的肽。将粗肽溶解在水/乙腈中并使用Waters Xterra MSC18 ODS柱(50mm X 19mm，5微米颗粒大小，120埃孔大小)或Waters-YMC C18 ODS柱250mm×30mm i.d.，10微米粒子大小。120埃孔大小)纯化。收集具有产品的级分并通过HPLC分析。集合具有＞95％纯度的级分并通过冻干分离所述肽。

制备性HPLC(Waters Xterra柱)的条件：

洗脱速度：50mL/min

检测：UV，λ＝220nm

洗脱剂A：0.1％aq.TFA；溶剂B：乙腈(0.1％TFA)。

条HPLC分析的条件：

柱：Waters Xterra(Waters Co.；4.6×50mm；MS C18；5微米粒子，120埃)。

洗脱速度：3mL/min；检测：UV，λ＝220nm

洗脱剂A：0.1％aq.TFA；溶剂B：乙腈(0.1％TFA)。

实施例1-图1

4-[[(3β，5β，12α)-23-[1，1-二甲基乙烷-1-(氧羰基)]-12-羟基-24-降胆烷-3-基]氨基]-4-氧代丁酸N-羟基琥珀酰亚胺基酯(化合物A-OSu)的合成

按照由R.P.bONAR-Law等(J.Chem.Soc.Perkin Trans.1，2245，1990)报道的胆酸酯化的方法，将脱氧胆酸转化成相应的叔丁基酯1。应用由P.L.Anelli等(Sybth.Commun.1998，28，109-117)开发的一点Mitsunobu-Staudinger方法，将化合物1转变成3β-氨基衍生物2。

在三乙胺的存在下，将氨基酯2与THF中的等克分子量的琥珀酸酐反应。在酸(适量HCl)混合(work up)后，用EtOAc提取混合物。将有机相蒸发至干并通过急骤色谱法纯化残余物得到衍生物3。收率55％。

在室温下将酸3与在THF和乙腈混合物中的N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺反应。二环己基脲沉淀后，将混合物过滤并蒸发以提供粗化合物A-OSu，该化合物没有进一步纯化被用于下面的步骤中。

实施例II-图2

牛N^εB29-[4-[[(3β，5β，12α)-23羧基-12-羟基-24-降胆烷-3-基]氨基]-4-氧代丁酰基]-胰岛素(化合物B)的合成

按照Naithani V.K.& Gattner H.-G.：Hoppe-Seyler’s Z.Physiol.Chem.349，373-384，1968，制备N^αA1，N^αA2-二柠康酰(dicitraconyl)-胰岛素(牛)。向N^αA1，N^αA2-二柠康酰-胰岛素(14μmol)在24mL二甲基甲酰胺中的溶液中添加在1.2mL二甲基甲酰胺中的三乙胺(92.7μmol)。添加在1mL二甲基甲酰胺中的化合物A-OSu(79μmol)并允许反应混合物在室温下进行30分钟。用1M乙酸酸化反应混合物并在1M乙酸中在Sephadex G-25(2×70cm)上色谱分离。采集蛋白质峰级分并冻干。在甲酸pH 3.5中72小时获得去柠康酰化，接着重新冻干。按照Radola：Biochem.Biophys.Acta295，412-428，1973(但如洗涤凝胶介质，使用Ultradex^TM(AmershamBiosciences Inc.))，通过在平板凝胶稳定层中的制备性等电聚焦分级分离所述物质。将凝胶悬浮在5M脲(用混合的层(bed)树脂纯化的)中并添加载体两性物(2％)，pH 4至6。将於浆置于平板(Desaga/Brinkmann)(20×20cm)，从阴极应用样品2cm，并且在1-4℃冷却板(Hormuth/Brinkmann)上在25至30V/cm下18至24小时获得聚焦。形成了可视(折射性)带，以及在凝胶样品在水中稀释后测定带中的pH。主要的带对应于pH 5.1，，即具有用化合物A选择性修饰Lys^εB29的胰岛素的期望的pH。通过用三层体积的1M乙酸稀释，从凝胶中回收主要的带中的物质。通过在1M乙酸中的SephadexG-25(2×70cm)上的色谱法去除脲并冻干蛋白质级分。在室温下将蛋白质溶解在并装载在7M脲，0.001MTris/HCl，pH 8.3中的DEAE-纤维素DE52(0.9×25cm)色谱柱上。用形成线性NaCl梯度(0至0.15M)的相同缓冲液洗脱柱。收集6.1mL的级分。收集主要的峰，在1M乙酸中在Sephadex G-25(2.5×70cm)柱上脱盐并冻干蛋白质级分。通过溶解在三氟乙酸中裂解叔丁基酯。蒸发三氟乙酸后，将蛋白质(化合物B)溶解在1M乙酸中并冻干。按照Davis B.J.：Am.N.Y.Acad.Sci.121，404-427，1964的分析性聚丙烯酰胺圆盘凝胶电泳，证实物质的同质性。离子喷雾质谱法显示出期望的化合物B的正确分子量。化合物B包含与本发明胆酸衍生物接头连接的治疗部分(胰岛素分子)。

实施例III-图3和4

A.(3β，5β，12α)-3-[[3，5-双[[4-[(2，5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-1，4-二氧代丁基]氨基]苯甲酰基]氨基-12-羟基胆烷-24-酸1，1-二甲基乙基酯(化合物C-(OSu)₂)的合成

将3，5-二硝基苯甲酰基氯化物1(商业产品)在无氯仿的乙醇中的溶液滴加至(3β，5β，12α)-3-氨基-12羟基胆烷酸叔丁基酯2在无氯仿的乙醇和三乙胺的溶液中。反应完全后，混合物用水洗涤、干燥(Na₂SO₄)、过滤并蒸发。通过用硅胶的急骤色谱法纯化粗的滤液得到纯化合物3，用乙醇中的钯(10％在活性炭上)氢化化合物3得到化合物4。将化合物4溶解在二氯甲烷中并与两摩尔当量的湖琥珀酸酐反应。然后在1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)的存在下，将中间体二酸在无氯仿的乙醇中与N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)反应。反应完全后，混合物用水洗涤、用Na₂SO₄干燥、过滤并蒸发得到化合物5＝C-(OSu)₂。

B.牛1-[[(3β，5β，12α)-23-[(1，1-二甲基)乙氧基羰基]-12-羟基-24-降胆烷-3-基]氨基]羰基-3，5-双[[4-(胰岛素-NB^ε29-基)-1，4-二氧代丁基]氨基]苯(化合物D)(图4)

按照Naithani V.K.& Gattner H.-G.：Hoppe-Seyler’s Z.Physiol.Chem.349，373-384，1968制备N^αA1，N^αA2-二柠康酰-胰岛素(牛)。向N^αA1，N^αA2-二柠康酰-胰岛素(28μmol)在48mL二甲基甲酰胺中的溶液中添加在2.4mL二甲基甲酰胺中的三乙胺(185μmol)。添加在2mL二甲基甲酰胺中的化合物A-(Osu)₂(14μmol)并允许反应混合物在室温下进行30分钟。反应混合物用1M乙酸酸化并在1M乙酸中在Sephadex G-25(2×70cm)上色谱分离。采集蛋白质峰级分并冻干。在甲酸pH 3.5中72小时获得去柠康酰化，接着重新冻干。通过溶解在三氟乙酸中裂解叔丁基酯。蒸发三氟乙酸后，将蛋白质溶解在1M乙酸中并通过在1M乙酸中在Sephadex G-50(2×70cm)上的色谱法分级分离。收集并冻干具有最大尺寸的分子的蛋白质峰。在相同的柱上再分级分离一次。冻干分级分离的蛋白质。离子喷雾质谱法显示了期望的化合物D的正确分子量。化合物D包含与本发明的接头连接的治疗部分(胰岛素分子)，它与另一个治疗部分(胰岛素分子)连接。

实施例IV

用¹²⁵I标记化合物B和D

通过在Lipkin E.W.，Teller D.C.& Haen C.：J.Biol.Chem.261，1694-1701，1986中描述的或在本申请中描述的方法，实现了用¹²⁵I标记化合物B和D。

实施例V

化合物B和D与人血清白蛋白的结合

按照Whitlam J.B.& Brown K.F.：J.Pharm.Sci.70，146-150，1981，应用在0.6mM人血清白蛋白中的1nM牛胰岛素溶液，掺有¹²⁵I标记的胰岛素，通过超滤测定与人血清白蛋白的结合。明显的是，相对于天然胰岛素的肾排除，这样的对白蛋白的结合将减少经修饰的胰岛素(化合物B和D)的肾排除。

实施例VI

化合物B和D的生物活性

已知与抗生物素蛋白与铁蛋白的的1∶1缀合物结合的N^εB29-生物素胰岛素，四个生物素结合位点中的三个被生物素占据，对于大鼠附睾脂肪细胞中的葡萄糖氧化的激活具有相同的剂量反应曲线(May J.M.，Williams R.H.& de Haen C.：J.Biol.Chem.253，686-690，1978)。使用其中描述的脂肪细胞试验，它涉及在含有血清白蛋白的缓冲液中的培育，显示化合物B和D具有与天然胰岛素相同的活性。结合减少的肾排除，这种性质使得胰岛素的化合物B和D形式具有延长的血浆半衰期，与不合有本发明接头的化合物相比，提供了改进的药物动力学特性。

实施例VII-图5A-B

¹¹¹ In-标记的胰岛素脱氧胆酸缀合物(化合物 ¹¹¹ In-F)的合成

A.牛1-[[(3β，5β，12α)-23-[(1，1-二甲基)乙氧基羰基]-12- 羟基-24-降胆烷-3-基]氨基]羰基-3-[[4-(胰岛素-N ^εB29 -基)-1，4-二 氧代丁基]氨基]-5-[[[[2-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮杂 环十二烷基]乙酰基]氨基]乙基]氨基]-1，4-二氧代丁基]氨基]苯的合 成。(化合物F)

按照Margerum，L.；Campion，B.；Fellmann，J.D.；Garrithy，M.；Varadarjan，J.PCT国际申请WO9528967，合成了N¹，N⁴，N⁷-三醋酸根-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N¹⁰-(2-乙酰氨基乙胺)(化合物E)(图5A)。按照Naithani V.K.& Gattner H.G.：Hoppe-Seyler’s Z.Physiol.Chem.349，373-384，1968制备了N^aA1，N^aA2-二柠康酰-胰岛素(牛)。向N^aA1，N^aA2-二柠康酰-胰岛素(28μmol)在48mL中二甲基甲酰胺的溶液中添加在2.4mL二甲基甲酰胺中的三乙胺(185μmol)。添加在2mL二甲基甲酰胺中的化合物C-(OSu)₂(见实施例III)(140μmol)并在室温下让反应继续进行30分钟。然后添加在2mL二甲基甲酰胺中的化合物E(280μmol)并在室温下让反应继续进行30分钟。反应混合物用1M乙酸酸化，使用具有1000标称切割分子量的透析膜用1M乙酸彻底透析。冻干存留液。在甲酸pH 3.5中72小时实现去柠康酰化，接着重新冻干。通过溶解在三氟乙酸中裂解叔丁基酯。蒸发三氟乙酸后，将蛋白质溶解在1M乙酸中并通过在1M乙酸中在Sephadex G-50上的色谱法分级分离。收集主要的蛋白质峰并冻干。然后在相同的柱上再分级分离一次所述物质。冻干分级分离的蛋白质。离子喷雾质谱法显示了期望的化合物F的正确分子量。(图5B)。化合物F包含与胆酸衍生物接头连接的治疗部分(胰岛素分子)，所述接头与诊断部分(金属螯合剂)连接。

B. ¹¹¹ In标记的化合物F(化合物 ¹¹¹ In-F)的合成

向适合用400μL自动进样器插头的5mL玻璃瓶中添加100μL溶解在0.2M NaOAc缓冲液(pH 4.8)与DMF的9∶1混合物中的化合物F的1mg/mL溶液。添加在0.05N HCl中的¹¹¹InCl₃[1.5mCi]，卷曲密封反应瓶并在45℃下将溶液加热30分钟。冷却至室温后，通过反相HPLC，在V ydac C-18肽和蛋白质柱[4.6×250mm；孔径：5微米；流速：1.5mL/min，在30℃下]上，使用0.1％三氟乙酸在H₂O中/0.085％三氟乙酸在乙腈中的水性/有机梯度，纯化标记混合物的等份样。将对应于¹¹¹In标记的化合物F的峰收集到含有0.2％人血清白蛋白的0.5mL的50mM柠檬酸盐缓冲液，pH 5.7中，接着在减压下使用Savant Speed Vacuum装置去除乙腈。

实施例VIII-图6A-B

L62的合成

概要：如图6A-B中所示，使用下面的步骤制备了L62：用NaOH水解(3β，5β)-3-氨基胆烷-24-酸甲基酯A得到相应的酸B，然后将B与Fmoc-C1反应得到中间体C。随后将用八肽Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂(BBN[7-14][SEQ ID NO：1])功能化的Rink酰胺树脂与C、Fmoc-甘氨酸和DOTA三-叔丁基酯反应。用试剂B裂解和脱保护后，通过HPLC纯化粗产物得到L62。总收率：2.5％。更详细的内容提供如下：

A.用铃蟾肽[7-14]，(A)功能化的Rink酰胺树脂

在固相肽合成容器(见附件No.1)中，向Rink酰胺NovaGel^TM树脂(10g；6.0mmol)A在DMF(45mL)中的悬浮液中连续地添加Fmoc-氨基酸(24mmol)、N-羟基苯并三唑(HOBt)(3.67g；24mmol)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)(3.75mL；24mmol)。使用长操作台面振动器在室温下振动混合物3小时，然后倒空溶液并用DMF(5×45mL)洗涤树脂。用在DMF(45mL)中的25％哌啶振动树脂4分钟，倒空溶液并添加新鲜的在DMF(45mL)中的25％哌啶。振动悬浮液10分钟，然后倒空溶液并用DMF(5×45mL)洗涤树脂。

连续地将这种方法应用于下面的氨基酸：N-α-Fmoc-L-甲硫氨酸、N-α-Fmoc-L-亮氨酸、N-α-Fmoc-N-im-三苯甲基-L-组氨酸、N-α-Fmoc-甘氨酸、N-α-Fmoc-L-缬氨酸、N-α-Fmoc-N-in-Boc-L-色氨酸。

在最后的偶联反应中，向在DMF(45mL)中的树脂中添加N-α-Fmoc-N-γ-三苯甲基-L-谷氨酸(14.6g；24mmol)、HOBt(3.67g；24mmol)和DIC(3.75mL；24mmol)。在室温下振动混合物3小时，然后倒空溶液，用DMF(5×45mL)洗涤树脂并真空干燥。

B.中间体B和C的制备：

1.(3β，5β)-3-氨基胆烷-24-酸(B)的合成

在45℃下，向(3β，5β)-3-氨基胆烷-24-酸甲基酯(5.0g；12.8mmol)的MeOH(65mL)溶液中滴加1M的NaOH溶液(16.6mL；16.6mmol)。在45℃下搅拌3小时后，将混合物浓缩至25mL并添加H₂O(40mL)和1M HCl(22mL)。过滤、用H₂O(2×50mL)洗涤并真空干燥沉淀的固体，得到白色的固体的B(5.0g；13.3mmol)。收率80％。

2.(3β，5β)-3-(9H-芴-9-基甲氧基)氨基胆烷-24-酸(C)的 合成

向在0℃下搅拌的(3β，5β)-3-氨基胆烷-24-酸B(1.0g；2.66mmol)在10％含水Na₂CO₃(16mL)和1，4-二噁烷(9mL)中的悬浮液中滴加9-芴基甲氧基羰基氯化物(0.76g；2.93mmol)的1，4-二噁烷(9mL)溶液。在室温下6小时搅拌后，添加水(90mL)，用Et₂O(2×90mL)洗涤水相，然后添加2M HCl(15mL)(最终pH：1.5)。用EtOAc(2×100mL)提取水相，有机相用Na₂SO₄干燥并蒸发。通过急骤色谱法纯化粗产物得到白色的固体的C(1.2g；2.0mmol)。收率69％。

C.L62(N-[(3β，5β)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10- 四氮杂环十二烷-1基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-胆烷-24-基]-L- 谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-缬氨酰-甘氨酰-L-组氨酰-L-亮氨 酰-L-甲硫氨酰胺)合成

用在DMA(7mL)中的50％吗啉在固相肽合成容器中振动树脂A(0.5g；0.3mmol)10分钟，倒空溶液并添加新鲜的在DMA(7mL)中的50％吗啉。振动悬浮液20分钟，然后倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗涤树脂。向树脂中添加(3β，5β)-3-(9H-芴-9基甲氧基)氨基胆烷-24-酸C(0.72g；1.2mmol)、N-羟基苯并三唑(HOBT)(0.18g；1.2mmol)、N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)，在室温下振动混合物24小时，然后倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗涤树脂。然后用在DMA(7mL)中的50％吗啉振动树脂10分钟，倒空溶液，添加新鲜的在DMA(7mL)中的50％吗啉并振动混合物另外20分钟。然后倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗涤树脂。向树脂中添加N-α-Fmoc-甘氨酸(0.79g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)。在室温下振动混合物3小时，然后倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗涤树脂。然后用在DMA(7mL)中的50％吗啉振动树脂10分钟，倒空溶液，添加新鲜的在DMA(7mL)中的50％吗啉并振动混合物另外20分钟。倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗涤树脂，接着向树脂中添加1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸三(1，1-二甲基乙基)酯与NaCl(0.79g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL：1.2mmol)、DIEA(0.40mL；2.4mmol)和DMA(7mL)的加合物。在室温下振动混合物24小时，然后倒空溶液并用DMA(5×7mL)、CH₂Cl₂(5×7mL)洗涤树脂并真空干燥。在具有试剂B(25mL)的烧瓶中振动树脂4.5小时。过滤树脂并在减压下蒸发溶液得到用Et₂O(20mL)研制的油状粗产物。通过离心收集沉淀并用Et₂O(3×20mL)洗涤，然后通过HPLC分析并通过制备性HPLC纯化。冷冻干燥含有产物的级分得到白色的固体的L62(6.6mg；3.8×10^-3mmol)。收率4.5％。

实施例IX-图7A-E

L67的合成

概要：用NaOH水解(3β，5β)-3-氨基-12-氧代胆烷-24-酸甲基酯A得到相应的酸B，然后将B与Fmoc-甘氨酸反应得到中间体C。随后将用八肽Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂(BBN[7-14][SEQ IDNO：1])功能化的Rink酰胺树脂与C和DOTA三-叔丁基酯反应。用试剂B裂解和脱保护后，通过HPLC纯化粗产物得到L67。总收率：5.2％。

A.合成(3β，5β)-3-氨基-12-氧代胆烷-24-酸，B(图7A)

在45℃下，向(3β，5β)-3-氨基-12-氧代胆烷-24-酸甲基酯A(2.1g；5.1mmol)在MeOH(15mL)中的溶液中滴加1M NaOH溶液(6.6mL；6.6mmol)。在45℃下搅拌3小时后，将混合物浓缩至25mL，然后添加H₂O(25mL)和1M HCl(8mL)。过滤、用H₂O(2×30mL)洗涤并真空干燥沉淀的固体，得到白色的固体的B(1.7g；4.4mmo1)。收率88％。

B.(3β，5β)-3-[[(9H-芴-9基甲氧基)氨基]乙酰基]氨基-12- 氧代胆烷-24-酸(C)的合成(图7A)

向在0℃下搅拌的N-α-Fmoc-甘氨酸(0.9g；3.1mmol)的THF(25mL)的溶液中滴加三丁基胺(0.7mL；3.1mmol)。随后添加氯甲酸异丁基酯(0.4mL；3.1mmol)，10分钟后，1小时内，向冷却的溶液中滴加三丁基胺(0.6mL；2.6mmol)和(3β，5β)-3-氨基-12-氧代胆烷-24-酸B(1.0g；2.6mmol)在DMF(30mL)中的悬浮液。让混合物温热并在6小时将溶液浓缩至40mL，然后添加H₂O(50mL)和1M HCl(10mL)(最终pH：1.5)。过滤、用H₂O(2×50mL)洗涤、真空干燥并通过急骤色谱法纯化沉淀的固体，得到白色的固体的C(1.1g；1.7mmol)。收率66％。

C.L67(N-[(3β，5β)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10- 四氮杂环十二烷-1基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-12，24-二氧代胆 烷-24-基]-L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-缬氨酰-甘氨酰-L- 组氨酰-L-亮氨酰-L-甲硫氨酰胺)的合成(图7B和7E)

用在DMA(7mL)中的50％吗啉在固相肽合成容器中振动树脂D(045g；0.3mmol)10分钟，倒空溶液并添加新鲜的在DMA(7mL)中的50％吗啉。搅拌悬浮液20分钟，然后倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗涤树脂。向树脂中添加(3β，5β)-3-[[(9H-芴-9基甲氧基)氨基]乙酰基]氨基]-12-氧代胆烷-24-酸C(0.80g；1.2mmol)、N-羟基苯并三唑(HOBT)(0.18g；1.2mmol)、N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)，在室温下振动混合物24小时，然后倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗涤树脂。用在DMA(7mL)中的50％吗啉振动树脂10分钟，倒空溶液，添加新鲜的在DMA(7mL)中的50％吗啉并振动混合物另外20分钟。然后倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗涤树脂。向树脂中添加1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸三(1，1-二甲基乙基)酯与NaCl(0.79g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL：1.2mmol)、DIEA(0.40mL；2.4mmol)和DMA(7mL)的加合物。在室温下振动混合物24小时，倒空溶液，用DMA(5×7mL)、CH₂Cl₂(5×7mL)洗涤树脂并真空干燥。在具有试剂B(25mL)的烧瓶中振动树脂4.5小时。过滤树脂并在减压下蒸发溶液得到用Et₂O(20mL)研制的油状粗产物。L67包含与胆酸衍生物接头连接的诊断部分(金属螯合剂)，其与导向肽(BBN[7-14])连接。

实施例X-图8A-H

L63和L64的合成

概要：用NaOH水解(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羟基胆烷-24-酸甲基酯1b得到中间体2b，然后将2b与Fmoc-甘氨酸反应得到3b。将用八肽Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂(BBN[7-14][SEQ ID NO：1])功能化的Rink酰胺树脂与3b反应，然后与DOTA三-叔丁基酯反应。用试剂B裂解和脱保护后，通过制备性HPLC纯化粗产物得到L64。从已经获得的中间体2a开始，重复上述相同步骤，得到L63。总收率：分别为9和4％。

A.(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羟基胆烷-24-酸(2b) 的合成(图8A)

向在45℃下加热的(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羟基胆烷-24-酸甲基酯1b(42.1g；0.1mol)在MeOH(300mL)中的溶液中滴加1M NaOH溶液(130mL；0.13mol)。在45℃下搅拌3小时后，将混合物浓缩至150mL并添加H₂O(350mL)。用CH2Cl2(2×100mL)提取后，将水相浓缩至200mL并添加1M HCl(150mL)。过滤、用H₂O(2×100mL)洗涤并真空干燥沉淀的固体，得到白色的固体2b(34.8g；0.08mol)。收率80％。

B.(3β，5β，12α)-3-[[(9H-芴-9基甲氧基)氨基]乙酰基]氨 基-12-羟基胆烷-24-酸，(3a)的合成(图8A)

向在0℃下搅拌的N-α-Fmoc-甘氨酸(6.0g；20.2mmol)的THF(120mL)的溶液中滴加三丁基胺(4.8mL；3.1mmol)。随后添加氯甲酸异丁基酯(0.4mL；3.1mmol)，10分钟后，1小时内，向冷却的溶液中滴加三丁基胺(2.6mL；20.2mmol)并且，10分钟后，1小时内向冷却的溶液中滴加(3β，5β，12α)-3-氨基-12-羟基胆烷-24-酸2a(6.6g；16.8mmol)在DMF(120mL)中的悬浮液。让混合物温热并在6小时将溶液浓缩至150mL，然后添加H₂O(250mL)和1N HCl(40mL)(最终pH：1.5)。过滤、用H₂O(2×100mL)洗涤、真空干燥并通过急骤色谱法纯化沉淀的固体，得到白色的固体3a(3.5g；5。2mmol)。收率31％。

C.(3β，5β，7α，12α)-3-[[(9H-芴-9基甲氧基)氨基]乙酰基] 氨基-7，12-二羟基胆烷-24-酸，(3b)的合成(图8B)

向在0℃下搅拌的N-α-Fmoc-甘氨酸(6.0g；20.2mmol)的THF(120mL)的溶液中滴加三丁基胺(4.0g；13.5mmol)。随后添加氯甲酸异丁基酯(1.7mL；13.5mmol)，10分钟后，1小时内向冷却的溶液中滴加三丁基胺(2.6mL；11.2mmol)和(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-羟基胆烷-24-酸3a(6.6g；16.8mmol)在DMF(80mL)中的悬浮液。让混合物温热并在6小时将溶液浓缩至120mL，然后添加H₂O(180mL)和1N HCl(30mL)(最终pH：1.5)。过滤、用H₂O(2×100mL)洗涤、真空干燥并通过急骤色谱法纯化沉淀的固体，得到白色的固体3a(1.9g；2.8mmol)。收率25％。

在一种替代方法中，(3β，5β，7α，12α)-3-[[(9H-芴-9基甲氧基)氨基]乙酰基]氨基-7，12-二羟基胆烷-24-酸，(3b)可被制备如下：

向搅拌的Fmoc-Gly-OH(4.0g，13.45mmol)的二氯甲烷(15mL)溶液中连续添加N-羟基琥珀酰亚胺(1.70g，14.77mmol)和DIC(1.87g，14.77mmol)；在室温下搅拌得到的混合物4小时。通过过滤去除形成的N，N’-二异丙基脲并用乙醚(20mL)洗涤固体。去除挥发性物质并用乙醚(3×20mL)洗涤形成的Fmoc-Gly-琥珀酰亚胺基酯。然后将Fmoc-Gly-琥珀酰亚胺基酯重溶解在无水DMF(15mL)中并向澄清的溶液中添加3-氨基脱氧胆酸(5.21g，12.78mmol)。在室温下搅拌反应混合物4小时。添加水并过滤、用水洗涤、干燥和通过硅胶色谱法(TLC(硅胶)：(Rf：0.50，硅胶，CH₂Cl₂/CH₃OH，9∶1)(洗脱剂：CH₂Cl₂/CH₃OH，(9∶1))纯化沉淀的固体，得到为无色固体的Fmoc-Gly-3[[(9H-芴-9基甲氧基)氨基]乙酰基]氨基-7，12-二羟基胆烷-24-酸，(3b)。收率7.46g(85％)。

D.L63(N-[(3β，5β，12α)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基) -1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-12-羟 基-24-氧代胆烷-24-基]L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-缬氨酰 -甘氨酰-L-组氨酰-L-亮氨酰-甲硫氨酰胺)的合成(图8B和8G)

用在DMA(7mL)中的50％吗啉在固相肽合成容器中振动树脂A(0.5g；0.3mmol)10分钟，倒空溶液并添加新鲜的在DMA(7mL)中的50％吗啉。搅拌悬浮液20分钟然后倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗涤树脂。向树脂中添加(3β，5β，12α)-3-[[(9H-芴-9基甲氧基)氨基]乙酰基]氨基-12-羟基胆烷-24-酸3a(0.82g；1.2mmol)、N-羟基苯并三唑(HOBT)(0.18g；1.2mmol)、N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)，在室温下振动混合物24小时，倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗涤树脂。然后用在DMA(7mL)中的50％吗啉振动树脂10分钟，倒空溶液，添加新鲜的在DMA(7mL)中的50％吗啉并振动混合物20分钟。倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗涤树脂。向树脂中添加1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸三(1，1-二甲基乙基)酯与NaCl(0.79g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)、DIEA(0.4mL；2.4mmol)和DMA(7mL)的加合物。在室温下振动混合物24小时，倒空溶液并用DMA(5×7mL)、CH₂Cl₂(5×7mL)洗涤并真空干燥树脂。在具有试剂B(25mL)的烧瓶中振动树脂4小时。过滤树脂并在减压下蒸发溶液得到油状粗产物，该粗产物用Et₂O(5mL)处理后得到沉淀。通过过滤收集并用Et₂O(5×5mL)洗涤，然后通过HPLC分析和纯化沉淀。冷冻干燥含有产物的级分得到为白色蓬松固体形式的L63(12.8mg；0.0073mmol)。收率9％。L63包含与胆酸衍生物接头连接的诊断部分(金属螯合剂)，其与导向肽(BBN[7-14])连接。

E.L64(N-[(3β，5β，12α)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基) -1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-7，12- 二羟基-24-氧代胆烷-24-基]L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-缬 氨酰-甘氨酰-L-组氨酰-L-亮氨酰-甲硫氨酰胺)的合成(图8C和8H)

用在DMA(7mL)中的50％吗啉在固相肽合成容器中振动树脂A(0.5g；0.3mmol)10分钟，倒空溶液并添加新鲜的在DMA(7mL)中的50％吗啉。搅拌悬浮液20分钟然后倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗涤树脂。搅拌悬浮液20分钟，倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗涤树脂。向树脂中添加(3β，5β，12α)-3-[[(9H-芴-9基甲氧基)氨基]乙酰基]氨基-7，12-二羟基胆烷-24-酸3b(0.81g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)，在室温下振动混合物24小时，倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗涤树脂。用在DMA(7mL)中的50％吗啉振动树脂10分钟，倒空溶液，添加新鲜的在DMA(7mL)中的50％吗啉并振动混合物20分钟。倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗涤树脂。向树脂中添加1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸三(1，1-二甲基乙基)酯与NaCl(0.79g；1.2mmol)、H0BT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)、DIEA(0.4mL；2.4mmol)和DMA(7mL)的加合物。在室温下振动混合物24小时，倒空溶液并用DMA(5×7mL)、CH₂Cl₂(5×7mL)洗涤并真空干燥树脂。在具有试剂B(25mL)的烧瓶中振动树脂4小时。过滤树脂并在减压下蒸发溶液得到用Et₂O(5mL)研制的油状粗产物。通过过滤收集并用Et₂O(5×5mL)洗涤沉淀。然后将沉淀溶解在H₂O(5mL)中，添加Na₂CO₃(0.10mg；0.70mmol)；在室温下搅拌得到的混合物4小时。通过HPLC纯化该溶液。冷冻干燥含有产物的级分得到为白色蓬松固体形式的L64(3.6mg；0.0021mmol)。收率4％。L64包含与胆酸衍生物接头连接的诊断部分(金属螯合剂)，其与导向肽(BBN[7-14])连接。

实施例XI-用于细胞结合和生物分布研究的 ¹⁷⁷ Lu-L64的制备：

在90℃下通过培育10μg L64配体(10μl1mg/mL的水溶液)、100μl乙酸铵缓冲液(0.2M，pH5.2)和～1-2mCi的在0.05N HCl中的¹⁷⁷LuCl₃(MURR)15分钟，合成了这种化合物。通过添加20μl1％ Na₂EDTA.2H₂O(Aldrich)的水溶液清除游离的¹⁷⁷Lu。得到的放射化学纯度(RCP)是～95％。用HPLC将放射标记的产物与未标记的配体和其它杂质分离，所述HPLC使用YMC碱性C8柱[4.6×150mm]，30℃的柱温和1mL/min的流速，梯度为30分钟内68％A/32％B至66％A/34％B，其中A是柠檬酸盐缓冲液(0.02M，pH3.0)，以及B是80％CH₃CN/CH₃OH。分离的化合物具有～100％的RCP和23.4分钟的HPLC保留时间。

通过在体内研究的30分钟内将需要的HPLC峰收集到1000μl柠檬酸盐缓冲液(0.05M，pH5.3，含有1％抗坏血酸钠和0.1％HSA)中至50μCi/mL的终浓度，制备了用于生物分布和细胞结合研究的样品。关于细胞结合研究，在体内研究的30分钟内用细胞结合培养基稀释纯化的样品至1.5μCi/mL的浓度。关于生物分布研究，在体内研究的30分钟内用柠檬酸盐缓冲液(0.05M，pH5.3，含有1％抗坏血酸钠和0.1％HSA)稀释纯化的样品至50μCi/mL的终浓度。

实施例XII-用于放射治疗研究的 ¹⁷⁷ Lu-L64的制备：

在85℃下通过培育70μg L64配体(70μl1mg/mL的水溶液)、200μl乙酸铵缓冲液(0.2M，pH5.2)和～30-40mCi的在0.05N HCl中的¹⁷⁷LuCl₃(MURR)10分钟，合成了这种化合物。冷却至室温后，通过添加20μl 2％ Na₂EDTA.2H₂O(Aldrich)的水溶液清除游离的¹⁷⁷Lu。得到的放射化学纯度(RCP)是～95％。用HPLC将放射标记的产物与未标记的配体和其它杂质分离，所述HPLC使用300VHP阴离子交换柱(7.5×50mm)(Vydac)，用水、50乙腈/水，然后用1g/L乙酸铵水溶液以1mL/min的流速洗脱所述柱。用50％CH₃CN从柱中洗脱期望的化合物并将它与含有5％抗坏血酸、0.2％HSA和0.9％(v∶v)苄醇的～1ml柠檬酸盐缓冲液(0.05M，pH5.3)。通过自旋真空40分钟去除分离级分的有机部分，在体内研究的30分钟内含有5％抗坏血酸、O.2％HSA和0.9％(v∶v)苄醇的～1ml柠檬酸盐缓冲液(0.05M，pH5.3)将浓缩的溶液(～20-25mCi)调节至7.5mCi/mL的浓度。得到的化合物具有＞95％的RCP。

实施例XIII- ¹¹¹ In-L64的制备：

在85℃下通过培育10μg L64配体(5μl 2mg/mL的0.01N HCl溶液)、60μl乙醇、在0.05N HCl中的1.12mCi/mL¹¹¹In Cl₃和155μl乙酸钠缓冲液(0.5M，pH4.5)30分钟，合成了这种化合物。通过添加20μl 1％ Na₂EDTA.2H₂O(Aldrich)的水溶液清除游离的¹¹¹In。得到的放射化学纯度(RCP)是87％。用HPLC将放射标记的产物与未标记的配体和其它杂质分离，所述HPLC使用Vydac C18柱，[4.6×250mm]，50℃的柱温和1.5mL/min的流速。梯度为20分钟内75％A/25％B至65％A/35％B，其中A是TFA的水，B是0.085％TFA的乙腈。用该系统，¹¹¹In-L64的保留时间是15.7分钟。分离的化合物具有96.7％的RCP。

实施例XIV- ¹⁷⁷ Lu-L63的制备：

通过将L63配体(如美国申请公开No.2002/0054855和WO02/87637中所述进行制备)溶解在0.01N HCl中至1mg/mL的浓度，制备了肽的储备溶液。通过以所示次序混合如下试剂制备了¹⁷⁷Lu-L63。

0.2M NH4OAc，pH 6.8                    100μl

肽储备液，1mg/mL，在0.01N HCl中        5μl

在0.01M HCl中的¹⁷⁷LuCl₃(MURR)          1.2μl(1.4mCi)

在85℃下培育反应混合物10分钟。在水浴中冷却至室温后，添加20μl 1％EDTA溶液和20μl EtOH。通过使用C18柱(VYDACCat#218TP54)的HPLC分析化合物，用20分钟内30-34％B的梯度以1mL/min的流速洗脱所述柱，其中溶剂是A.0.1％TFA/H₂O和B是0.1％TFA/CH₃CN。形成的¹⁷⁷Lu-L63在该系统上具有97.8％的RCP和～14.2分钟的HPLC保留时间。

实施例XV-Gd-L64的松弛性(Relaxivity)和HAS结合-图11A-C

Gd-L64在约1045Mm^-1s^-1的HEPES中表现出松弛性，它与基于分子量的期望的值是一致的。

如在图11A中所显示的，用HAS滴定Gd-L64的HEPES溶液显示相对强的结合(Ka＝1.2×10⁴M^-1；R_b＝20mM^-1s^-1)。拟合实验曲线得到1.2×10⁴M^-1的Ka值和约20mM^-1s^-1的完全结合核素的松弛性。

如在图11B中所显示的，通过比较在HEPES和在血清中的NMRD特征证实了Gd-L64于HAS的结合，其中在HAS的存在下在10-30MHz的频率处看到了结合核素的特征峰。这些结果显示，尽管在24位缺乏游离的羧酸，含有本发明接头的化合物与HAS结合。

实施例XVI-体内药物动力学研究

A.示踪物剂量生物分布：

在异种移植的、携带PC3肿瘤的小鼠([Ncr]-Foxn1<nu>)中，使用本发明下文鉴定的化合物和L134，一个对照，进行了低剂量药物动力学研究。L134室DO3A单胺-氨基辛烷基-BBN[7-14]。在全部研究中，每组(n＝3-4)以200μmCi/kg，静脉内注射，给予小鼠100μL的¹⁷⁷Lu标记的测试化合物，停留时间为1和24小时。用合适的标准物在LKB1282 CompuGamma计数仪中分析组织。

表2

与对照比较，本发明的Lu-177标记的化合物在携带PC3肿瘤的裸小鼠(200μmCi/kg；值为％ID/g)中在第1和第24天的药物动力学比较

有鉴于L64注射后，在血液、肝和肾中的放射性的分布与对照化合物，L134的相似，L64在第1和第24天在肿瘤中的摄取要更大得多。虽然在更早的时间具有增加的血液和肝值，L63也显示了高肿瘤摄取。L64和L63在小鼠胰(已知具有GRP受体的正常器官)中的摄取比L134的大得多。

实施例XVII-放射治疗研究-图12A-B

A.短程功效研究：

使用携带PC3肿瘤的裸小鼠模型进行放射治疗研究。将本发明的Lu-177标记的化合物L64、L63和处理对照化合物L134与未处理的对照组比较。(每个处理组的n＝12以及未处理组的n＝36)。关于第一项研究，在灭菌的条件下，以30μmCi/kg，静脉内或皮下注射，给予小鼠100μL的¹⁷⁷Lu标记的测试化合物。将受试动物养在栅栏环境中直到30天。每周对每只动物收集体重和肿瘤大小(通过测径规测量)达研究的持续时间。早期终止的标准包括：死亡；总体重减轻等于或大于20％；肿瘤大小等于或大于2cm³。结果显示在图12A中。这些结果显示，相对于未被给予处理的对照动物和那些被给予相同剂量的L134的动物，用L64或L63处理的动物增加了存活。

使用与前面相同的剂量，但每个化合物使用更多的动物(n＝46)并跟踪它们更长的时间，用L64进行了重复实验。重复实验的结果显示在图12B中。相对于与以前相同的对照(n＝36)，L64处理得到显著增加的存活(p＜0.0001)。

实施例XVIII

LHRH肽的合成

使用Applied Biosystems Peptitde Synthesizer，433A型合成了线性肽。将Fmoc-Pal-Peg-PS树脂用于肽合成，应用正交Fmoc策略。用三甲苯基-(用于组氨酸)、叔丁基(用于丝氨酸和酪氨酸)、boc-(用于色氨酸)、甲基三甲苯基-(用于D-赖氨酸)和Pmc-(用于精氨酸)基团保护氨基侧链。肽的裂解和建立进行如下：在室温下用88％三氟乙酸(TFA)/5％苯酚/5％水/2％三异丙基硅烷(TIS)(试剂‘B’)处理装载有目的肽的树脂4小时和随后的在乙醚中的蒸发和沉淀提供了粗肽。然后将灰白色的固体溶解在水中、过滤并通过HPLC纯化，所述HPLC使用具有反相C-18柱(YMC-Pack ODS/A柱)的Shimadzu系统，使用水和具有0.1TFA的乙腈作为洗脱剂。

A.Fmoc-Gly-3-氨基脱氧胆酸的合成

(3β，5β，7α，12α)-3-[[(9H-芴-9基甲氧基)氨基]乙酰基]氨基-7，12-二羟基胆烷-24-酸

向Fmoc-Gly-OH(4.0g，13.45mmol)的二氯甲烷(15mL)溶液中添加N-羟基琥珀酰亚胺(1.70g，14.77mmol)，接着添加DIC(二异丙基碳二亚胺)(1.87g，14.77mmol)并在室温下搅拌混合物4小时。通过过滤去除形成的脲并用乙醚(20mL)洗涤固体。在旋转蒸发器上蒸发合并的滤液以去除溶剂并用乙醚(3×20mL)洗涤形成的固体，Fmoc-Gly-琥珀酰亚胺基酯。然后将Fmoc-Gly-琥珀酰亚胺基酯重溶解在无水DMF(15mL)中，然后向澄清的溶液中添加3-氨基脱氧胆酸(5.21g，12.78mmol)。在室温下搅拌反应混合物4小时。将反应混合物加至水(200mL)中并过滤、用水洗涤、干燥和通过硅胶色谱法：(Rf：0.50，硅胶，CH₂Cl₂/CH₃OH，9∶1)(洗脱剂：CH₂Cl₂/CH₃OH，(9∶1))纯化沉淀的固体，得到为无色固体形式的Fmoc-Gly-3-氨基脱氧胆烷酸。收率7.46g(85％)。

MS(API-ES，正离子)：710.2(M+Na)，687.7(M+H)。

B.Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-DLys(DOTA-Gly-Adca3)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂：

向Fmoc-Gly-3-氨基脱氧胆酸(20mg，0.029mmol)的二氯甲烷(0.2mL)溶液中添加N-羟基琥珀酰亚胺(4.0mg，0.035mmol)，接着添加DIC(二异丙基碳二亚胺)(5.0mg，0.039mmol)并在室温下搅拌4小时。蒸发溶剂后，用乙醚(5×1.0mL)洗涤固体并干燥固体。然后将然后将Fmoc-Gly-3-氨基脱氧胆酸琥珀酰亚胺基酯溶解在无水DMF(0.5mL)中并向澄清的溶液中添加纯的H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-DLys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂：(30mg；0.024mmol)和二异丙基乙胺(7.5mg；0.058mmol)，在室温下搅拌反应混合物18小时。向反应混合物中添加哌啶(0.1mL)并搅拌20分钟以去除Fmoc保护基团。用水稀释，用TFA酸化溶液至pH4.0并装载在YMC-Pack ODS/A，30×250mm柱。使用水和具有0.1％TFA的乙腈作为洗脱剂洗脱所述柱，收集含有需要的肽的级分(基于MS结果)并冷冻干燥以得到纯的无色蓬松固体形式的Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-DLys(H-Gly-Adca3)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂(15mg；41％)。MS(API-ES，正离子)：1700.4(M+H)，851.5[M+H]/2。

向预先激活的DOTA-三叔丁基酯(25.3mg；0.04mmol)、HBTU(15.2mg；0.04mmol)和二异丙基乙胺(12mg；0.09mmol)在无水DMF(0.2mL)的溶液中添加Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-DLys(H-Gly-Adca3)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂(15mg；0.01mmol)并搅拌反应混合物15小时。真空蒸发溶剂后，用TFA-苯甲醚(95∶5，2mL)处理残留物5小时。在旋转蒸发器上蒸发挥发性物质后，通过添加乙醚沉淀肽。通过离心获得粗肽，用乙醚洗涤并分离出所需要的无色固体形式的肽Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-DLys(DOTA-Gly-Adca 3)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂。收率：12.5mg(68％)。

MS(API-ES，正离子)：2086.5(M+H)，1044.3[M+H]/2。

实施例XIX- ¹²⁵ I-标记的化合物的制备

使用本领域技术人员已知的或其适合的改进的标记和纯化方法，用放射性卤素例如¹²⁵I、¹³¹I或¹²³I标记本发明的化合物。A.E.Bolton，Comparative Methods For The Radiolabeling Of Peptides，在“Methods in Enzymology”，1986，Vol.124，第18-29页中描述了使用Bolton-Hunter试剂、乳过氧化物酶、碘原和氯胺T试剂，用放射碘(或其它放射性卤素)标记的典型方法。例如，可通过使未标记的化合物在(例如)事先使用例如具有无水Bolton-Hunter试剂的二异丙胺调节至pH8.5-9.0的小体积硼酸盐缓冲液或DMF中反应，用¹²⁵I标记本发明的化合物。振动所述瓶然后在冰上培育约30分钟，偶尔振动。此后，可以选择性地用(例如)甘氨酸溶液猝灭反应，然后使用例如反相HPLC纯化以从杂质和从未标记的化合物中去除游离的标记化合物。或者，可以将化合物溶解在磷酸盐缓冲液中至pH接近7，可以添加碘化物(如Na¹²⁵I)，用缓冲的氯胺T溶液处理上述溶液以影响碘化，然后用还原剂例如焦亚硫酸钠处理以猝灭反应。通过离子交换色谱法可以去除游离的I-并且使用HPLC方法例如C8或C18反相色谱法可以去除未标记的化合物。

实施例XX-L69的合成-图13A和13B

概要：(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羟基胆烷-24-酸A与Fmoc-C1反应得到中间体B。随后将用八肽GlnTrpAlaValGlyHisLeuMetNH₂(BBN[7-14](A)功能化的Rink酰胺树脂与B、Fmoc-8-氨基-3，6-二氧杂辛酸和DOTA三-叔丁基酯反应。用试剂B(2)裂解和脱保护后，通过制备性HPLC纯化粗产物得到L69。总收率：4.2％。

A.(3β，5β，7α，12α)-3-(9H-芴-9基甲氧基)氨基-7，12-二 羟基胆烷-24-酸，B(图13A)

向在0℃下搅拌的(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羟基胆烷-24-酸A(2.0g；4.9mmol)在10％含水Na₂CO₃(30mL)和1，4-二噁烷(18mL)中的悬浮液中滴加9-芴基甲氧基羰基氯化物(1.4g；5.4mmol)的1，4-二噁烷(18mL)溶液。在室温下搅拌6小时后，添加水(100mL)，用Et₂O(2×90mL)洗涤水相，然后添加2M HCl(15mL)(最终pH：1.5)。过滤、用H₂O(3×100mL)洗涤、真空干燥然后通过急骤色谱法纯化沉淀的固体得到白色的固体形式的B(2.2g；3.5mmol)。收率71％。

B.N-[(3β，5β，7α，12α)-3-[[[2-[2-[[[4，7，10-三(羧甲基) -1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰 基]氨基]-7，12-二羟基-24-氧代胆烷-24-基]-L-谷氨酰胺酰-L-色氨 酰-L-丙氨酰-L-缬氨酰-甘氨酰-L-组氨酰-L-亮氨酰-L-甲硫氨酰胺)， L69(图13B)

用在DMA(7mL)中的50％吗啉在固相肽合成容器中振动树脂A(0.5g；0.3mmol)10分钟，冲洗掉溶液并添加新鲜的在DMA(7mL)中的50％吗啉。搅拌悬浮液另一个20分钟，然后冲洗掉溶液并用DMA(5×7mL)洗涤树脂。向树脂中添加(3β，5，7α，12α)-3-(9H-芴-9基甲氧基)氨基-7，12二羟基胆烷-24-酸B(0.75g；1.2mmol)、N-羟基苯并三唑(HOBT)(0.18g；1.2mmol)、N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)，在室温下振动混合物24小时，倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗涤树脂。然后用在DMA(7mL)中的50％吗啉振动树脂10分钟，倒空溶液，添加新鲜的在DMA(7mL)中的50％吗啉并振动混合物另外20分钟。倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗涤树脂。向树脂中添加Fmoc-8-氨基-3，6二氧杂辛酸(0.79g；1.2mmol)(7)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)。在室温下振动混合物3小时，然后倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗涤树脂。然后用在DMA(7mL)中的50％吗啉振动树脂10分钟，清洗掉溶液，并用DMA(5×7mL)洗涤树脂，向树脂中添加1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸三(1，1-二甲基乙基)酯与NaCl(0.79g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL：1.2mmol)、N-乙基二异并基胺(0.40mL；2.4mmol)和DMA(7mL)的加合物。在室温下振动混合物24小时，清洗掉，用DMA(5×7mL)、CH₂Cl₂(5×7mL)洗涤树脂并真空干燥。在具有试剂B(25mL)的烧瓶中振动树脂4.5小时。过滤树脂并在减压下蒸发溶液得到油状粗产物。用Et₂O(20mL)处理该粗产物后得到沉淀。通过离心收集沉淀并用Et₂O(3×20mL)洗涤沉淀得到固体(124mg)，通过HPLC分析所述固体。通过制备性HPLC纯化一定量的粗产物(50mg)。冷冻干燥含有产物的级分得到白色的固体的L69(6.5mg；3.5×10^-3mmol)(图13B)。收率5.8％。

贯穿本发明的前面描述，引用或参考了不同的专利、论文和其它出版物。由此通过参考将每篇专利、论文和其它出版物并入本主题申请中。

序列表

<110>De Haen等

<120>用于药物化合物的改进的接头

<130>57637-1042

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>8

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人工序列的说明：该肽被称为铃蟾肽(即，BBN(7-14))并且与胃泌素释放肽(GRP)

     受体结合

<400>1

Gln Trp Ala Val Gly His Leu Met

1               5

Claims (55)

1.如下通式的化合物：

M-N-O-P-Q

其中

M是诊断部分；

N是0、α氨基酸、取代的胆汁酸或其它连接基团；

O是α氨基酸或取代的胆汁酸；

P是0、α氨基酸、取代的胆汁酸或其它连接基团；以及

Q是导向部分；

其中N、O或P的至少一个是取代的胆汁酸；

其中所述取代的胆汁酸是具有3-氨基、24-羧基官能并且任选在7位和12位被氢、羟基或酮基官能度取代的胆汁酸；并且

其中所述其它连接基团选自两个或更多个氨基酸、R₁-(CH₂)_n-R₂烃链或其组合，其中n是0-10，R₁是H₂N-、HS-或-COOH，并且R₂是激活的COOH基团。

2.权利要求1的化合物，其中所述导向部分与取代的胆汁酸的氨基或取代的胆汁酸的羧基连接，其中所述取代的胆汁酸是具有3-氨基、24-羧基官能并且任选在7位和12位被氢、羟基或酮基官能度取代的胆汁酸。

3.权利要求1的化合物，其中所述导向部分与取代的胆汁酸的氨基连接，其中所述取代的胆汁酸是具有3-氨基、24-羧基官能并且任选在7位和12位被氢、羟基或酮基官能度取代的胆汁酸。

4.权利要求1的化合物，其中所述导向部分与取代的胆汁酸的羧基连接，其中所述取代的胆汁酸是具有3-氨基、24-羧基官能并且任选在7位和12位被氢、羟基或酮基官能度取代的胆汁酸。

5.权利要求1的化合物，其中所述诊断部分与取代的胆汁酸的氨基连接并且所述导向部分与取代的胆汁酸的羧基连接，其中所述取代的胆汁酸是具有3-氨基、24-羧基官能并且任选在7位和12位被氢、羟基或酮基官能度取代的胆汁酸。

6.权利要求1的化合物，其中所述诊断部分与取代的胆汁酸的羧基连接并且所述导向部分与取代的胆汁酸的氨基连接，其中所述取代的胆汁酸是具有3-氨基、24-羧基官能并且任选在7位和12位被氢、羟基或酮基官能度取代的胆汁酸。

7.权利要求1的化合物，其中所述诊断部分与取代的胆汁酸的氨基连接并且所述导向部分与取代的胆汁酸的所述氨基连接，其中所述取代的胆汁酸是具有3-氨基、24-羧基官能并且任选在7位和12位被氢、羟基或酮基官能度取代的胆汁酸。

8.权利要求1～7中任一项的化合物，其中M选自由X-射线成像剂、磁共振成像剂、超声成像剂、荧光剂、放射性核素成像剂和光学成像剂组成的组。

9.权利要求8的化合物，其中M是光学成像剂。

10.如下通式的化合物：

M-N-O-P-Q

其中

M是治疗部分；

N是0、α氨基酸、取代的胆汁酸或其它连接基团；

O是α氨基酸或取代的胆汁酸；

P是0、α氨基酸或取代的胆汁酸或其它连接基团；以及

Q是导向部分；

其中N、O或P的至少一个是取代的胆汁酸；

其中所述取代的胆汁酸是具有3-氨基、24-羧基官能并且任选在7位和12位被氢、羟基或酮基官能度取代的胆汁酸；并且

其中所述其它连接基团选自两个或更多个氨基酸、R₁-(CH₂)_n-R₂烃链或其组合，其中n是0-10，R₁是H₂N-、HS-或-COOH，以及R₂是激活的COOH基团。

11.权利要求10的化合物，其中所述导向部分与取代的胆汁酸的氨基或取代的胆汁酸的羧基连接，其中所述取代的胆汁酸是具有3-氨基、24-羧基官能并且任选在7位和12位被氢、羟基或酮基官能度取代的胆汁酸。

12.权利要求10的化合物，其中所述导向部分与取代的胆汁酸的氨基连接，其中所述取代的胆汁酸是具有3-氨基、24-羧基官能并且任选在7位和12位被氢、羟基或酮基官能度取代的胆汁酸。

13.权利要求10的化合物，其中所述导向部分与取代的胆汁酸的羧基连接，其中所述取代的胆汁酸是具有3-氨基、24-羧基官能并且任选在7位和12位被氢、羟基或酮基官能度取代的胆汁酸。

14.权利要求10的化合物，其中所述治疗部分与取代的胆汁酸的氨基连接并且所述导向部分与取代的胆汁酸的羧基连接，其中所述取代的胆汁酸是具有3-氨基、24-羧基官能并且任选在7位和12位被氢、羟基或酮基官能度取代的胆汁酸。

15.权利要求10的化合物，其中所述治疗部分与取代的胆汁酸的羧基连接并且所述导向部分与取代的胆汁酸的氨基连接，其中所述取代的胆汁酸是具有3-氨基、24-羧基官能并且任选在7位和12位被氢、羟基或酮基官能度取代的胆汁酸。

16.权利要求10的化合物，其中所述治疗部分与取代的胆汁酸的氨基连接并且所述导向部分与取代的胆汁酸的所述氨基连接，其中所述取代的胆汁酸是具有3-氨基、24-羧基官能并且任选在7位和12位被氢、羟基或酮基官能度取代的胆汁酸。

17.权利要求10～16中任一项的化合物，其中M选自由放射治疗剂、光治疗剂、抗生素、激素、酶、抗体和生长因子组成的组。

18.权利要求17的化合物，其中M是胰岛素。

19.如下通式的化合物：

M-N-O-P-M

其中

每个M独立地是诊断或治疗部分；

N是0、α氨基酸、取代的胆汁酸或其它连接基团；

O是α氨基酸或取代的胆汁酸；以及

P是0、α氨基酸、取代的胆汁酸或其它连接基团；

其中N、O或P的至少一个是取代的胆汁酸；

其中所述取代的胆汁酸是具有3-氨基、24-羧基官能并且任选在7位和12位被氢、羟基或酮基官能度取代的胆汁酸；并且

其中所述其它连接基团选自两个或更多个氨基酸、R₁-(CH₂)_n-R₂烃链或其组合，其中n是0-10，R₁是H₂N-、HS-或-COOH，以及R₂是激活的COOH基团。

20.权利要求19的化合物，其中一个M与取代的胆汁酸的氨基连接并且第二个M与取代的胆汁酸的羧基连接，其中所述取代的胆汁酸是具有3-氨基、24-羧基官能并且任选在7位和12位被氢、羟基或酮基官能度取代的胆汁酸。

21.权利要求19的化合物，其中第一个M与取代的胆汁酸的氨基连接并且第二个M与取代的胆汁酸的所述氨基连接，其中所述取代的胆汁酸是具有3-氨基、24-羧基官能并且任选在7位和12位被氢、羟基或酮基官能度取代的胆汁酸。

22.权利要求19的化合物，其中第一个M与第二个M相同或不同。

23.权利要求19的化合物，其中第一个M与第二个M相同。

24.权利要求19的化合物，其中第一个M与第二个M不同。

25.一种改善药物化合物的半衰期的方法，该方法包括使用具有式N-O-P的接头，使诊断部分、治疗部分、金属螯合剂或放射性卤素与导向肽连接的步骤，其中

N是0、α氨基酸、取代的胆汁酸或其它连接基团；

O是α氨基酸或取代的胆汁酸；以及

P是0、α氨基酸、取代的胆汁酸或其它连接基团；

其中N、O或P的至少一个是取代的胆汁酸；

其中所述取代的胆汁酸是具有3-氨基、24-羧基官能并且任选在7位和12位被氢、羟基或酮基官能度取代的胆汁酸；并且

其中所述其它连接基团选自两个或更多个氨基酸、R₁-(CH₂)_n-R₂烃链或其组合，其中n是0-10，R₁是H₂N-、HS-或-COOH，以及R₂是激活的COOH基团。

26.权利要求25的方法，其中所述取代的胆汁酸选自由下列物质组成的组：

(3β，5β)-3-氨基胆烷-24-酸；

(3β，5β，12α)-3-氨基-12-羟基胆烷-24-酸；

(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羟基胆烷-24-酸；

赖氨酸-(3，6，9)-三氧杂十一烷-1，11-二羰基-3，7-二脱氧-3-氨基胆酸；

(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羟基-12-氧代胆烷-24-酸；以及

(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羟基胆烷-24-酸。

27.如下通式的化合物：

M-N-O-P-Q

其中

M是金属螯合剂；

N是0、α氨基酸、取代的胆汁酸或其它连接基团；

O是α氨基酸或取代的胆汁酸；

P是0、α氨基酸、取代的胆汁酸或其它连接基团；以及

Q是导向肽；

其中N、O或P的至少一个是取代的胆汁酸；

其中所述取代的胆汁酸是具有3-氨基、24-羧基官能并且任选在7位和12位被氢、羟基或酮基官能度取代的胆汁酸；并且

其中所述其它连接基团选自两个或更多个氨基酸、R₁-(CH₂)_n-R₂烃链或其组合，其中n是0-10，R₁是H₂N-、HS-或-COOH，以及R₂是激活的COOH基团。

28.权利要求27的化合物，其中Q是选自由下列物质组成的组的肽激素：黄体生成素激素释放激素、胰岛素、催产素、促生长素抑制素、神经激肽-1、血管活性肠肽、P物质、神经肽Y、内皮缩血管肽A、内皮缩血管肽B、缓激肽、白细胞介素-1、表皮生长因子、缩胆囊肽、甘丙素、促黑素、兰瑞肽、奥曲肽、Phe-Cys-Thr-DTrp-Lys-Val-Cys-Thr-ol、精氨酸升压素。

29.权利要求27的化合物，其中所述取代的胆汁酸选自由下列物质组成的组：

(3β，5β)-3-氨基胆烷-24-酸；

(3β，5β，12α)-3-氨基-12-羟基胆烷-24-酸；

(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羟基胆烷-24-酸；

赖氨酸-(3，6，9)-三氧杂十一烷-1，11-二羰基-3，7-二脱氧-3-氨基胆酸；

(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羟基-12-氧代胆烷-24-酸；以及

(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羟基胆烷-24-酸。

30.如下通式的化合物：

M-N-O-P-Q

其中

M是金属螯合剂；

N是0、α氨基酸、取代的胆汁酸或其它连接基团；

O是α氨基酸或取代的胆汁酸；

P是0、α氨基酸、取代的胆汁酸或其它连接基团；以及

Q是下式的黄体生成素激素释放激素类似物：

PGlu-His-Trp-W-Tyr-DLys-X-Y-Pro-Z，

其中

W＝Ser、NMeSer或Thr；

X＝Leu、NMeLeu、叔丁基Gly；

Y＝Arg、ArgEt₂、Cit、Lys异丙基；以及

Z＝Gly-NH₂、NH乙基、氮杂Gly-NH₂；

其中N、O或P的至少一个是取代的胆汁酸；

其中所述取代的胆汁酸是具有3-氨基、24-羧基官能并且任选在7位和12位被氢、羟基或酮基官能度取代的胆汁酸；并且

其中所述其它连接基团选自两个或更多个氨基酸、R₁-(CH₂)_n-R₂烃链或其组合，其中n是0-10，R₁是H₂N-、HS-或-COOH，以及R₂是激活的COOH基团。

31.权利要求30的化合物，其中Q是下式的黄体生成素激素释放激素类似物：

PGlu-His-Trp-W-Tyr-DLys-X-Y-Pro-Z，

其中

W＝Ser、NMeSer或Thr；

X＝Leu、NMeLeu、叔丁基G1y；

Y＝Arg、ArgEt₂、Cit、Lys异丙基；以及

Z＝Gly-NH₂、NH乙基、氮杂Gly-NH₂。

32.如下通式的化合物：

Glu-His-Trp-W-Tyr-DLys(M-N-O-P)-X-Y-Pro-Z，

其中

M是螯合剂；

N是0、α氨基酸、取代的胆汁酸或其它连接基团；

O是α氨基酸或取代的胆汁酸；以及

P是0、α氨基酸、取代的胆汁酸或其它连接基团，

W＝Ser、NMeSer或Thr；

X＝Leu、NMeLeu、叔丁基Gly；

Y＝Arg、ArgEt₂、Cit、Lys异丙基；以及

Z＝Gly-NH₂、NH乙基、氮杂Gly-NH₂；

其中N、O或P的至少一个是取代的胆汁氨基酸；

其中所述取代的胆汁酸是具有3-氨基、24-羧基官能并且任选在7位和12位被氢、羟基或酮基官能度取代的胆汁酸；并且

其中所述其它连接基团选自两个或更多个氨基酸、R₁-(CH₂)_n-R₂烃链或其组合，其中n是0-10，R₁是H₂N-、HS-或-COOH，以及R₂是激活的COOH基团。

33.权利要求30的化合物，其中M是DOTA-Gly。

34.权利要求30或31的化合物，其中所述取代的胆汁酸选自由下列物质组成的组：

(3β，5β)-3-氨基胆烷-24-酸；

(3β，5β，12α)-3-氨基-12-羟基胆烷-24-酸；

(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羟基胆烷-24-酸；

赖氨酸-(3，6，9)-三氧杂十一烷-1，11-二羰基-3，7-二脱氧-3-氨基胆酸；

(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羟基-12-氧代胆烷-24-酸；以及

(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羟基胆烷-24-酸。

35.权利要求22的化合物，其中至少一个M是胰岛素。

36.权利要求27的化合物，其中Q是胰岛素。

37.化合物牛N^εB29-[4-[[(3β，5β，12α)-23-羧基-12-羟基-24-降胆烷-3-基]氨基]-4-氧代丁酰基]-胰岛素。

38.化合物4-[[(3β，5β，12α)-23-羧基-12-羟基-24-降胆烷-3-基]氨基]-4-氧代丁酸N-羟基琥珀酰亚胺基酯。

39.化合物牛1-[[(3β，5β，12α)-23[(1，1-二甲基)乙氧羰基]-12-羟基-24-降胆烷-3-基]氨基]羰基-3，5-双[[4-(胰岛素-N^eB29-基)-1，4-二氧代丁基]氨基]苯。

40.化合物牛1-[[(3β，5β，12α)-23-[(1，1-二甲基)乙氧羰基]-12-羟基-24-降胆烷-3-基]氨基]羰基-3-[[4-(胰岛素-N^εB29-基)-1，4-二氧代丁基]氨基]-5[[[[2-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷基]乙酰基]氨基]乙基]氨基]-1，4-二氧代丁基]氨基]苯。

41.权利要求40的化合物，其中所述化合物被用¹¹¹铟标记。

42.如下通式的化合物

M-N-O-P-Q

其中

M是放射性卤素；

N是0、α氨基酸、取代的胆汁酸或其它连接基团；

O是α氨基酸或取代的胆汁酸；

P是0、α氨基酸、取代的胆汁酸或其它连接基团；以及

Q是导向肽；

其中N、O或P的至少一个是取代的胆汁氨基酸；

其中所述取代的胆汁酸是具有3-氨基、24-羧基官能并且任选在7位和12位被氢、羟基或酮基官能度取代的胆汁酸；并且

其中所述其它连接基团选自两个或更多个氨基酸、R₁-(CH₂)_n-R₂烃链或其组合，其中n是0-10，R₁是H₂N-、HS-或-COOH，以及R₂是激活的COOH基团。

43.权利要求42的化合物，其中Q是选自由下列物质组成的组的肽激素：黄体生成素激素释放激素、胰岛素、催产素、促生长素抑制素、神经激肽-1、血管活性肠肽、P物质、神经肽Y、内皮缩血管肽A、内皮缩血管肽B、缓激肽、白细胞介素-1、表皮生长因子、缩胆囊肽、甘丙素、促黑素、兰瑞肽、奥曲肽、Phe-Cys-Thr-DTrp-Lys-Val-Cys-Thr-ol、精氨酸升压素。

44.权利要求42的化合物，其中所述取代的胆汁酸选自由下列物质组成的组：

(3β，5β)-3-氨基胆烷-24-酸；

(3β，5β，12α)-3-氨基-12-羟基胆烷-24-酸；

(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羟基胆烷-24-酸；

赖氨酸-(3，6，9)-三氧杂十一烷-1，11-二羰基-3，7-二脱氧-3-氨基胆酸；

(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羟基-12-氧代胆烷-24-酸；以及

(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羟基胆烷-24-酸。

45.权利要求42的化合物，其中Q是胰岛素。

46.与诊断放射性核素络合的权利要求22或34的化合物在制备用于将患者成像的诊断成像剂中的用途。

47.一种制备诊断成像剂的方法，该方法包括向可注射的介质中添加包含权利要求26或29的化合物的物质的步骤。

48.一种用于制备诊断成像剂的试剂盒，该试剂盒包括含有可注射治疗介质的第一瓶和含有权利要求26的化合物的第二瓶。

49.与治疗放射性核素络合的权利要求26或29的化合物在制备放射治疗剂中的用途。

50.一种制备放射治疗剂的方法，该方法包括向可注射的治疗介质中添加包含权利要求26或29的化合物的物质的步骤。

51.一种用于制备放射性药物物质的试剂盒，该试剂盒包括含有可注射治疗介质的第一瓶和含有权利要求26的化合物的第二瓶。

52.权利要求49的用途，其中还包括给予治疗剂。

53.权利要求1的化合物，其中所述取代的胆汁酸选自由下列物质组成的组：

(3β，5β)-3-氨基胆烷-24-酸；

(3β，5β，12α)-3-氨基-12-羟基胆烷-24-酸；

(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羟基胆烷-24-酸；

赖氨酸-(3，6，9)-三氧杂十一烷-1，11-二羰基-3，7-二脱氧-3-氨基胆酸；

(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羟基-12-氧代胆烷-24-酸；以及

(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羟基胆烷-24-酸。

54.一种改善药物化合物的半衰期的方法，该方法包括使具有式N-O-P的接头与诊断部分、治疗部分、金属螯合剂或放射性卤素连接的步骤

其中

N是0、α氨基酸、取代的胆汁酸或其它连接基团；

O是α氨基酸或取代的胆汁酸；以及

P是0、α氨基酸、取代的胆汁酸或其它连接基团，

其中N、O或P的至少一个是取代的胆汁酸；

其中所述取代的胆汁酸是具有3-氨基、24-羧基官能并且任选在7位和12位被氢、羟基或酮基官能度取代的胆汁酸；并且

其中所述其它连接基团选自两个或更多个氨基酸、R₁-(CH₂)_n-R₂烃链或其组合，其中n是0-10，R₁是H₂N-、HS-或-COOH，并且R₂是激活的COOH基团。

55.权利要求54的方法，其中所述取代的胆汁酸选自由下列物质组成的组：

(3β，5β)-3-氨基胆烷-24-酸；

(3β，5β，12α)-3-氨基-12-羟基胆烷-24-酸；

(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羟基胆烷-24-酸；

赖氨酸-(3，6，9)-三氧杂十一烷-1，11-二羰基-3，7-二脱氧-3-氨基胆酸；

(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羟基-12-氧代胆烷-24-酸；以及

(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羟基胆烷-24-酸。

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